8/18/2019 Purifikasi Protein

1/80

8/18/2019 Purifikasi Protein

2/80

Pedoman pemurnian protein : 1. Menentukan tujuan  Kemurnian, aktivitas, kuantitas yang diperlukan untuk

produk akhir untuk menghindari kelebihan atau kekurangan metode yang digunakan.

2. Menentukan sifat (properties) dari protein target

dan batas kritis pengotor, untuk menyederhanakan teknik seleksi dan optimasi.

3. Menentukan metode analisis yang tepat, untuk mempercepat deteksi aktivitas/recovery protein agar

pekerjaan efsien. 4. Meminimalkan penanganan sampel pada setiap

tahap

8/18/2019 Purifikasi Protein

3/80

8/18/2019 Purifikasi Protein

4/80

$lasan melakukan pemurnian

protein %ntuk menentukan &%'* protein

%ntuk menentukan +%K+% protein

 %ntuk penggunaan pemurnian pemurnian product -*'+*0*$+1 dalam alur reaksi/ processing

%ntuk memproduksi produk 232*$4

8/18/2019 Purifikasi Protein

5/80

+$+* P%'*$'

P3+*' • %ntuk penggunaan apa protein diproduksi5

• 0ari organisme apa, pada bagian mana 5

• $pakah protein intraseluler atau ekstraseluler5

•  6ika intraseluler terletak di bagianmana pada sel5

• 7agaimana menanganinya5

• 7erapa kemurnian yang dibutuhkan yang berhubungan dengan sumber protein dan produk akhir5

•  6ika dilakukan cale1up (skala besar) teknik apa yang diperlukan, berkaitan efsiensi 8 sumber dan ketersediaan peralatan.

8/18/2019 Purifikasi Protein

6/80

 +iga +ahap trategi

Purifkasi!ujuan utama untuk memurniakan proteinadalah untuk mengisolasi, mendapatkan konsentrasi dan stabiltas protein sesuai dengan tujuan pemurnian target.

"ase purikasi intermediate, bertujuan untuk membuang sebagian pengotor, misalnya protein lain, asam nukleat, endoto9in, dan virus.

"ase terakhir bertujuan untuk mendapatkan

kemurnian tinggi, menyingkirkan semua pengotor atau senyaa yang berhubungan dengan protein target.

8/18/2019 Purifikasi Protein

7/80

Kombinasi eleksi dan  +ahap Purifkasi yang 3ptimum : %ntuk menjamin perkembangan metode yang cepat, aktu yang

singkat untuk mendapatkan produk yang murni, dan keuntungan ekonomi.

8/18/2019 Purifikasi Protein

8/80

Preparasi #$%& (+ujuan akhir) : kemurnian dan kuantitas tinggi,

maintanace (pemeliharaan) aktivitas biologi, sehingga memenuhi syarat ekonomi dan aktu.

!entukan kemurnian yang dibutuhkan oleh produk akhir



2ontoh kemurnian yang dibutuhkan : Kemurnian angat +inggi ;

8/18/2019 Purifikasi Protein

9/80

*dentifkasi kontaminan kunci/utama

*dentifkasi kemungkinan kontaminansi alami yang

tersisa 4ebih baik kemurnian tinggi daripada kurang

Kontaminan yang mendegradasi atau menginakti"kan protein atau mengganggu dalam

analisis sebaiknya dihilangkan sejak aal Periksa stabilitas protein, minimal kaitannya

dengan pA dan kekuatan ionik

eleksi metode pengujian yang cepat dan reliabel.

8/18/2019 Purifikasi Protein

10/80

eleksi sumber protein aterial dapat berasal dari



$nimal tissue Plant material 7iological Buids (e.g. blood, milk, sera) 7acteria

237*'$'+ e9pression &ermentation cultures (yeast, "ungi, bacteria) 2ell cultures (animal cells, plant cells, insect cells)

8/18/2019 Purifikasi Protein

11/80

P'+*' C Konsentrasi Protein rendah dalam sumber

alami (natural sources), maka 

0ibutuhkan induksi ekspresi dalam ekspresinya$tau dalam teknik rekombinan diekspresikan dalam berbagai system ekspresi.

8/18/2019 Purifikasi Protein

12/80

2lassifcation o" proteins by structural characterisation

Structural characteristics Examples Comments

Monomeric Lysozyme, growth hormone Usually extracellular; often have disulphide bonds

Oligomeric with identical subunits Glyceralsehyde!phosphate dehydrogenas, catalase, hexo"inase

Mostly intracellular enzymes, rarely have disulphide bonds

Oligomeric with mixed subunits #etussis toxin $llosteric enzymes, different subunits have different functions

Membrane bound % peripheral Mitrochondrial $ase, al"aline  phosphatise

'eadily solubilised in detergents

Membrane bound % intergral #orins, insulin receptors 'e(uires lipid for stability

Membrane bound % con)ugated Glycoproteins, lipoproteins, nucleoproteins

Many extracellular proteins contain carbohydrate

8/18/2019 Purifikasi Protein

13/80

2lassifcation o" proteins by "unction

Function Examples

$mino acid storage *eed proteins +eg gluten-, mil" proteins +eg caesin-

*tructural % inert .ollagen, "eratin

*tructural % with activity $ctin, myosin, tubulin

/inding % soluble $lbumin, hemoglobin, hormones

/inding % insoluble *urface receptors +eg insulin receptor-, antigens +eg viral coat proteins-

/inding % with activity 0nzymes, membrane transporters +eg ion pumps

   ,   e    l  a    t    i  v   e

  a   b

  u   n    d   a   n   c   e

8/18/2019 Purifikasi Protein

14/80

Protein properties and their eDect on development o" purifcation strategies

Sample and target protein properties Influence on purification strategy

&emperature stability 1eed to wor" rapidly at lower temperatures

 p2 stability *election of buffers for extraction and purification +conditions for ion exchange, affinity or reverse phase chromatography-

Organic solvents *election of condition for reverse phase chromatography

3etergent re(uirements .onsider effects on chromatographic steps and the need for detergent removal consider choice of detergent

*alt +ionic strength- *election of conditions for precipitation techni(ues and hydrophobic interaction chromatography

.ofactors for stability or activity *election of additives, p2, salts and buffers

#rotease sensitivity 1eed for fast removal of proteases or addition of inhibitors

*ensitivity to metal ions 1eed to add 03&$ or 0G&$ in buffers

'edox sensitivity 1eed to add reducing agents

Molecular weight *election of gel filtration media

.harge properties *election of ion exchange conditions

/iospecific affinity *election of ligand for affinity medium

#ost translational modifications *election of group specific affinity medium

2ydrophobicity *election of medium for hydrophobic interaction chromatography

8/18/2019 Purifikasi Protein

15/80

 Eields "or multi1step protein purifcations

FG G

4 Minimal"an tahap purifi"asi

4 Optimiasi setiap tahap

4 2atihati terhadap hasil )i"a diperlu"an beberapa tahap

8/18/2019 Purifikasi Protein

16/80

 +ahap kunci dalam purifkasi emisahkan protein target dari material aal

emisahkan padatan dari protein yang ada

dalam supernatan Koncentration protein

embuang/membersihkan kontaminan untuk meningkatkan kemurnian

tabilisasi dari target protein

8/18/2019 Purifikasi Protein

17/80

 +hree phase purifcation strategy

#roses final purifi"asi yang ideal mela"u"an preparasi sampel , meliputi e"stra"si dan "larifi"asi yang dibutuh"an, melalui ! tahap utama  purifi"asi5umlah tahap purifi"asi ditenru"an oleh startegi purifi"asi, "emurnian yang dibutuh"an dan untu" tu)uan apa protein diguna"an

8/18/2019 Purifikasi Protein

18/80

$nalisis Protein Pekerjaan yang dilakukan berkaitan dengan

keperluan dan penentuan hasil selama purifkasi ditentukan oleh %ntuk tujuan apa protein tersebut

7ahan aal sumber diperolehnya protein tersebut.  Physical studies e.g. 91ray, ', 

 nd product - pharmaceuticals

8/18/2019 Purifikasi Protein

19/80

$nalysis kemurnian protein  +otal protein

pecifc Huantifcation 

$ctivity assays 7inding assays

0etection o" impurities AP42

el electrophoresis

Protein mass spectrometry

8/18/2019 Purifikasi Protein

20/80

$ssay method Useful range .omments

 1anoOrange assay 677ng8ml to 67ug8ml   •*amples can be read up to six hours later without any loss in the

sensitivity •Low protein to protein signal variability •3etection not influenced by reducing agents or nucleic acid

/.$ method +.u reduction-

79ug8ml to 69mgml   •*amples must be read within 67 mins

• 1ot compatible with reducing agents

/radford assay +dye  binding-

6ug8ml to 69 mg8ml   •#rotein precipitates over time

•2igh protein to protein signal variability • 1ot compatible with de