NÚBIA CAROLINE COSTA DE ALMEIDA - ppgbaip.propesp.ufpa.br CAROLINE... · NÚBIA CAROLINE COSTA DE...

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS

MARCADORES DA INFECÇÃO POR CHLAMYDIA TRACHOMATIS, CHLAMYDIA

PNEUMONIAE E DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA E INFLAMATÓRIA NA

FORMAÇÃO DA PLACA DE ATEROMA E PROGRESSÃO À DOENÇA

CARDÍACA.

NÚBIA CAROLINE COSTA DE ALMEIDA

Belém-Pará 2014

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MARCADORES DA INFECÇÃO POR CHLAMYDIA TRACHOMATIS, CHLAMYDIA

PNEUMONIAE E DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA E INFLAMATÓRIA NA

FORMAÇÃO DA PLACA DE ATEROMA E PROGRESSÃO À DOENÇA

CARDÍACA.

Belém-Pará 2014

Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. Orientadora: Profa. Dra. Marluísa de Oliveira Guimarães Ishak

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Biblioteca Virtual em Saúde do Instituto Evandro Chagas (BVS IEC)

Almeida, Núbia Caroline Costa de. Marcadores da infecção por Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae e da resposta imunológica e inflamatória na formação da placa de ateroma e progressão à doença cardíaca / Núbia Caroline Costa de Almeida. - 2014

139 f.; 30 cm

Orientador: Profª. Drª. Marluísa de Oliveira Guimarães Ishak Tese (Doutorado em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários) – Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Agentes Infecciosos e Parasitários, 2014.

1. Chlamydia. 2. Doença cardíaca. 3. Susceptbilidade. 4. Infecções I. Ishak, Marluísa de Oliveira Guimarães, orient. II. Universidade Federal do Pará. III. Título.

CDD: 616.92

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MARCADORES DA INFECÇÃO POR CHLAMYDIA TRACHOMATIS, CHLAMYDIA PNEUMONIAE E DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA E INFLAMATÓRIA NA FORMAÇÃO DA PLACA DE ATEROMA E PROGRESSÃO À DOENÇA CARDÍACA.

Orientadora: Profa. Dra. Marluísa de Oliveira Guimarães Ishak

Laboratório de Virologia, UFPA Banca Examinadora:

Prof. Dr. Antônio Carlos Rosário Vallinoto Laboratório de Virologia, UFPA Prof. Dr. Ricardo Ishak Laboratório de Virologia, UFPA Profa. Dra. Maristela Gomes da Cunha Laboratório de Imunologia, UFPA Profa. Dra. Rosimar Neris Martins Feitosa Laboratório de Virologia, UFPA

Prof. Dr. Juarez Antônio Simões Quaresma Laboratório de Imunopatologia, NMT/UFPA(Suplente)

Belém, 20 de fevereiro de 2014

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários, do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários.

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À minha família, À profª. Dra. Marluísa de Oliveira Guimarães Ishak, Ao profº. Dr. Ricardo Ishak Ao grupo Pronex.

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“Nada neste mundo faz sentido se não tocarmos o coração das pessoas. Se a gente cresce com os golpes duros da vida, também podemos crescer com os toques suaves da alma.”

Cora Coralina

http://pensador.uol.com.br/autor/cora_coralina/

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AGRADECIMENTOS

Durante o desenvolvimento de um trabalho acadêmico, certamente contamos com

diferentes formas de apoio pelas quais eu tenho um profundo desejo de agradecer.

Agradeço primeiramente à minha orientadora profª. Dra. Marluísa de Oliveira

Guimarães Ishak, pela oportunidade e confiança entregue a mim para o desenvolvimento

deste trabalho. Ao profº Dr. Ricardo Ishak que além da impecável coordenação deste projeto,

direcionou este documento da melhor forma possível, colaborando, incentivando e corrigindo

com toda a dedicação.

Gostaria de agradecer a FAPESPA e ao CNPq pelo generoso financiamento do projeto

via Edital PRONEX. Ao Programa de Pós- Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e

Parasitários pelo apoio financeiro durante o período de execução do projeto.

Ao Hospital das Clínicas Gaspar Viana, ao Hospital da Ordem Terceira e ao Hospital

Beneficente Portuguesa, nossa sincera gratidão pela autorização e apoio na construção deste

trabalho, através dos cirurgiões Marco Antonio Ayin Fossa, Manuel Araújo Maneschy e

Marcelo Martins Zaninotto que disponibilizaram seu tempo para colaborar com a coleta de

amostras. Agradeço à Fundação HEMOPA pela autorização das coletas de doadores de

sangue.

Agradeço a todos os professores, alunos e funcionários do Laboratório de Virologia,

pelo incentivo e apoio durante este trabalho. Agradeço a colaboração fundamental de Sandra

Lima por todo o direcionamento estatístico deste projeto. Gostaria de registrar um

agradecimento especial à equipe de alunos do PRONEX incluindo Renata Hermes, Alice

Queiroz, Bárbara Santana, Suzanne Fernandes, Izete Machado, Samara Gomes, Larissa

Freitas, Érica Gomes, Felipe Bonfim e Ednelza Graça que com muita força de vontade,

solicitude e dedicação construíram comigo este trabalho, desde a coleta das amostras,

procedimentos laboratoriais até as difíceis reuniões técnicas e científicas.

Dedico o total agradecimento à minha família, pois ao lado deles: meu pai minha mãe,

minha irmã, meu filho e marido, eu fui descobrindo meus sonhos durante a vida. Obrigada

pela torcida e por sonharem comigo. Em especial, preciso eternizar meu agradecimento ao

Igor Brasil Costa que não mediu esforços para me apoiar com seu incentivo, confiança,

auxílio na padronização de técnicas, revisão e correção deste documento, em meus momentos

de extremo cansaço.

Não há nada que penetre mais suavemente no espírito do homem do que o exemplo.

Muito obrigada pelo exemplo de cada um de vocês.

5

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS 8

LISTA DE FIGURAS 10

RESUMO 15

ABSTRACT 16

1 INTRODUÇÃO..................................................................................... 17

1.1 CHLAMYDIA TRACHOMATIS E CHLAMYDIA PNEUMONIAE......... 17

1.1.1 Histórico e Classificação........................................................................ 17

1.1.2 Morfologia e Ciclo de Desenvolvimento............................................... 17

1.1.3 Organização Genômica.......................................................................... 19

1.1.4 Resposta Imunológica e Manifestações Clínicas.................................. 20

1.2 PROTEÍNA C REATIVA (PrtCR)........................................................... 22

1.3 FATOR DE NECROSE TUMORAL (TNF-α)....................................... 23

1.4 INTERLEUCINA - 6 (IL-6)..................................................................... 25

1.5 INTERLEUCINA - 8 (IL-8)..................................................................... 26

1.6 INTERLEUCINA - 10 (IL-10)................................................................. 26

1.7 ATEROSCLEROSE, INFECÇÕES POR C. TRACHOMATIS, C.

PNEUMONIAE E ASSOCIAÇÃO COM MARCADORES DE

RESPOSTA INFLAMATÓRIA............................................................... 28

1.8 OBJETIVOS............................................................................................. 37

1.8.1 Objetivo Geral......................................................................................... 37

1.8.2 Objetivos Específicos.............................................................................. 37

2 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................. 38

2.1 POPULAÇÃO EXAMINADA............................................................... 38

2.2 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS............................................................ 39

2.3 ENSAIOS SOROLÓGICOS PARA DETECÇÃO DE ANTICORPOS

PARA C. TRACHOMATIS E C. PNEUMONIAE.................................... 39

2.3.1 Ensaio Imunoenzimático (EIE)............................................................. 39

2.3.2 Microimunofluorescência (MIF)........................................................... 40

2.4 IDENTIFICAÇÃO DA INFECÇÃO POR C. TRACHOMATIS E C.

PNEUMONIAE......................................................................................... 41

2.4.1 Extração de DNA.................................................................................... 41

6

2.4.2 PCR em Tempo Real.............................................................................. 41

2.5 IDENTIFICAÇÃO DOS POLIMORFISMOS GENÉTICOS DE

MARCADORES DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA E

INFLAMATÓRIA.................................................................................... 42

2.5.1 Extração de DNA.................................................................................... 42

2.5.2 Identificação de Polimorfismo nos Genes da PrtCR, TNF-α e IL-6.. 42

2.5.3 Identificação de Polimorfismo nos Genes de IL-8 e IL-10.................. 46

2.6 DOSAGEM DE NÍVEIS PLASMÁTICOS DE PrtCR E IL-6............... 47

2.7 QUANTIFICAÇÃO RELATIVA DE mRNA de TNF-α, IL-8 e IL-10

PARA AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA................................ 47

2.7.1 Seleção de Amostras............................................................................... 47

2.7.2 Extração de RNA Total.......................................................................... 47

2.7.3 Transcrição Reversa para a Síntese de DNA Complementar (cDNA)..................................................................................................... 48

2.7.4 Teste de Eficiência dos Ensaios de PCR em Tempo Real................... 48

2.7.5 PCR em Tempo Real Quantitativo....................................................... 49

2.8 MÉTODOS ESTATÍSTICOS.................................................................. 50

2.9 ASPECTOS ÉTICOS............................................................................... 51

3 RESULTADOS....................................................................................... 52

3.1 CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO ESTUDADA....................... 52

3.1.1 Perfil demográfico e social dos pacientes com doença cardíaca e dos indivíduos do grupo controle.......................................................... 52

3.2 SOROPREVALÊNCIA DE ANTICORPOS PARA C.

TRACHOMATIS E C. PNEUMONIAE EM PACIENTES COM

DOENÇA CARDÍACA E NO GRUPO CONTROLE............................. 54

3.3 PRESENÇA DE DNA DE C. TRACHOMATIS E C. PNEUMONIAE

EM FRAGMENTOS TECIDUAIS DE PACIENTES COM DOENÇA

CARDÍACA............................................................................................. 55

3.4 CARACTERIZAÇÃO DOS POLIMORFISMOS DE PrtCR, TNF-α,

IL-6, IL-8 e IL-10 EM PACIENTES CARDÍACOS E NO GRUPO

CONTROLE............................................................................................. 57

3.5 NÍVEIS PLASMÁTICOS DE PrtCR EM PACIENTES CARDÍACOS

E GRUPO NO CONTROLE....................................................................

64

7

3.6 EXPRESSÃO GÊNICA DE TNF-α EM PACIENTES CARDÍACOS E

NO GRUPO CONTROLE........................................................................ 73

3.7 NÍVEIS PLASMÁTICOS DE IL-6 EM PACIENTES CARDÍACOS E


3.8 EXPRESSÃO GÊNICA DE IL-8 EM PACIENTES CARDÍACOS E

NO GRUPO CONTROLE. ...................................................................... 86

3.9 EXPRESSÃO GÊNICA DE IL-10 EM PACIENTES CARDÍACOS E


4 DISCUSSÃO........................................................................................... 96

4.1 PERFIL DEMOGRÁFICO E SOCIAL, SOROPREVALÊNCIA DE

ANTICORPOS E DETECÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO DE

C.TRACHOMATIS E C.PNEUMONIAE EM PACIENTES COM

DOENÇA CARDIOVASCULAR EM BELÉM, PA............................... 96

4.2 POLIMORFISMO DE MARCADORES DE RESPOSTA

IMUNOLÓGICA E INFLAMATÓRIA................................................... 100

4.3 NÍVEIS PLASMÁTICOS E DE EXPRESSÃO GÊNICA DE

MARCADORES DE RESPOSTA IMUNOLÓGICA E

INFLAMATÓRIA.................................................................................... 103

5 CONCLUSÕES....................................................................................... 107

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................. 109

APÊNDICES 132

ANEXOS 137

8

LISTA DE TABELAS Página Tabela 1 – Requisitos de amplificação de C. trachomatis e C. pneumoniae

por PCR em tempo real..................................................................................... 41 Tabela 2 – Sequências dos iniciadores utilizados na amplificação dos genes

de PrtCR, TNF-α e IL-6.................................................................................... 43 Tabela 3 – Protocolo de reação utilizada na amplificação dos genes de

PrtCR, TNF-α e IL-6......................................................................................... 43 Tabela 4 – Concentração de reagentes utilizados por reação para

amplificação dos genes de PrtCR, TNF-α e IL-6.............................................. 44 Tabela 5 – Endonucleases de restrição utilizadas na análise de RFLP para

caracterização de polimorfismos de PrtCR, TNF-α e IL-6.............................. 44 Tabela 6 – Ensaios utilizados para identificação de polimorfismos de região

promotora de IL-8 e IL-10................................................................................ 46 Tabela 7 – Identificação dos ensaios utilizados para PCR em Tempo Real

Quantitativo....................................................................................................... 49 Tabela 8 – Identificação de iniciadores e sonda para amplificação do gene

referência GAPDH............................................................................................ 49 Tabela 9 – Volumes (µL) de reagentes utilizados por reação na PCR em

Tempo Real Quantitativa.................................................................................. 50 Tabela 10 – Características demográficas e sociais de pacientes cardíacos

atendidos em três unidades hospitalares e um grupo controle em Belém, PA.. 53 Tabela 11 – Frequência de anticorpos para C. trachomatis e C. pneumoniae

entre pacientes e o grupo controle..................................................................... 54 Tabela 12 – Descrição dos resultados sorológicos para C. trachomatis em

pacientes cardíacos com amostras teciduais positivas para o DNA do

plasmídio críptico de C. trachomatis................................................................ 55 Tabela 13 – Distribuição genotípica e alélica dos polimorfismos de PrtCR,

TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10 entre pacientes cardíacos e um grupo controle em

Belém, PA......................................................................................................... 58 Tabela 14 – Distribuição genotípica e alélica dos polimorfismos de PrtCR,

TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10 de acordo com a presença de anticorpos para C.

trachomatis em pacientes cardíacos e um grupo controle em Belém,

PA......................................................................................................................

60

9

Tabela 15 – Distribuição genotípica e alélica dos polimorfismos de PrtCR,

TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10 de acordo com a ausência de anticorpos para C.

trachomatis em pacientes cardíacos e um grupo controle em Belém, PA... 61 Tabela 16 – Distribuição genotípica e alélica dos polimorfismos de PrtCR,

TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10 de acordo com a presença de anticorpos para C.

pneumoniae em pacientes cardíacos e um grupo controle em Belém,

PA...................................................................................................................... 62 Tabela 17 – Distribuição genotípica e alélica dos polimorfismos de PrtCR,

TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10 de acordo com a ausência de anticorpos para C.

pneumoniae em pacientes cardíacos e um grupo controle em Belém,

PA...................................................................................................................... 63

10

LISTA DE FIGURAS Página Figura 1 – Representação esquemática da multiplicação da Chlamydia no

interior da célula hospedeira................................................................................ 19 Figura 2 – Representação esquemática da localização do polimorfismo

rs2794521(−717 T>C) do gene da PrtCR............................................................ 23 Figura 3 – Representação esquemática da localização do polimorfismo

rs1800629 (−308 G>A) do gene do TNF-α......................................................... 24 Figura 4 – Representação esquemática da localização do polimorfismo

rs1800795 (−174 G>C) do gene da IL-6............................................................. 25 Figura 5 – Representação esquemática da localização do polimorfismo

rs4073 (−251 T>A) do gene da IL-8................................................................... 26 Figura 6 – Representação esquemática da localização do polimorfismo

rs1800896 (−1082 A>G) do gene da IL-10......................................................... 27 Figura 7 – Representação esquemática dos estágios de desenvolvimento da

aterosclerose........................................................................................................ 30 Figura 8 – Representação esquemática do papel da infecção por C.

pneumoniae na aterogênese................................................................................. 32 Figura 9 – Padrão de PCR-RFLP para o polimorfismo de PrtCR...................... 45 Figura 10 – Padrão de PCR-RFLP para o polimorfismo de TNF-α................... 45 Figura 11 – Padrão de PCR-RFLP para o polimorfismo de IL-6....................... 46 Figura 12 − Curva de amplificação de PCR em tempo real para C.

pneumoniae e C.trachomatis............................................................................... 56 Figura 13 – Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes cardíacos e um

grupo controle em Belém, PA............................................................................. 64 Figura 14 − Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes cardíacos e um

grupo controle, de acordo com genótipos para o polimorfismo rs279452 (−717

T>C), em Belém, PA........................................................................................... 65 Figura 15 − Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes cardíacos e um


T>C) e a presença de anticorpos para Chlamydia em Belém, PA....................... 66 Figura 16 − Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes cardíacos e um


11

T>C) e a presença de anticorpos para C.trachomatis em Belém, PA.................. 67 Figura 17 − Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes cardíacos e um


T>C) e a ausência de anticorpos para C.trachomatis em Belém, PA.................. 68 Figura 18 − Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes cardíacos e um

grupo controle, de acordo com genótipos para o polimorfismo rs279452

(−717T>C) e a presença de anticorpos para C. pneumoniae em Belém, PA...... 69 Figura 19 − Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes cardíacos e um


T>C) e a ausência de anticorpos para C. pneumoniae em Belém, PA................ 69 Figura 20 − Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes submetidos à

revascularização (RM) e um grupo controle de acordo com a presença ou

ausência de anticorpos para o gênero Chlamydia em Belém, PA....................... 70 Figura 21 − Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes submetidos à troca

de válvula (TV) e um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de

anticorpos para o gênero Chlamydia em Belém, PA........................................... 71 Figura 22 − Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes cardíacos e um

grupo controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para

C.trachomatis em Belém, PA.............................................................................. 72 Figura 23 − Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes cardíacos e um

grupo controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para

C.pneumoniae em Belém, PA.............................................................................. 73 Figura 24 − Níveis de mRNA de TNF-α entre pacientes e um grupo controle

em Belém, PA...................................................................................................... 74 Figura 25 − Níveis de mRNA de TNF-α entre pacientes cardíacos e um grupo

controle de acordo com genótipos para o polimorfismo rs1800629 (−308G>A)

em Belém, PA...................................................................................................... 75 Figura 26 − Níveis de mRNA de TNF-α entre pacientes cardíacos e um grupo

controle de acordo com genótipos para o polimorfismo rs1800629 (−308G>A)

e a presença de anticorpos para Chlamydia em Belém, PA................................ 76 Figura 27 − Níveis de mRNA de TNF-α entre pacientes submetidos à

revascularização (RM) e um grupo controle de acordo com a presença ou

ausência de anticorpos para Chlamydia em Belém, PA...................................... 77

12

Figura 28 − Níveis de mRNA de TNF-α entre pacientes submetidos à troca

de válvula (TV) e um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de

anticorpos para Chlamydia em Belém, PA.......................................................... 77 Figura 29 − Níveis de mRNA de TNF-α entre pacientes cardíacos e um grupo

controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para

C.trachomatis em Belém, PA.............................................................................. 78 Figura 30 − Níveis de mRNA de TNF-α entre pacientes cardíacos e um grupo


C.pneumoniae em Belém, PA.............................................................................. 79 Figura 31 – Níveis plasmáticos de IL-6 entre pacientes cardíacos e um grupo

controle em Belém, PA........................................................................................ 80 Figura 32 − Níveis plasmáticos de IL-6 entre pacientes cardíacos e um grupo

controle, de acordo com genótipos para o polimorfismo rs1800795

(−174G>C) em Belém, PA.................................................................................. 81 Figura 33 − Níveis plasmáticos de IL-6 entre pacientes cardíacos e um grupo

controle, de acordo com genótipos para o polimorfismo rs1800795

(−174G>C) e presença de anticorpos para Chlamydia em Belém, PA............... 82 Figura 34 − Níveis plasmáticos de IL-6 entre os pacientes submetidos à

revascularização do miocárdio (RM) e um grupo controle de acordo com

presença ou ausência de anticorpos para Chlamydia em Belém, PA.................. 83 Figura 35 − Níveis plasmáticos de IL-6 entre pacientes submetidos à troca de

válvula (TV) e um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de

anticorpos para Chlamydia em Belém, PA.......................................................... 84 Figura 36 − Níveis plasmáticos de IL-6 entre pacientes cardíacos e um grupo


C.trachomatis em Belém, PA..............................................................................

85 Figura 37 − Níveis plasmáticos de IL-6 entre pacientes cardíacos e um grupo


C.pneumoniae em Belém, PA.............................................................................. 85 Figura 38 − Níveis de mRNA de IL-8 entre pacientes cardíacos e um grupo

controle em Belém, PA........................................................................................ 86 Figura 39 − Níveis de mRNA de IL-8 entre pacientes cardíacos e um grupo

controle de acordo com genótipos para o polimorfismo rs4073 (−251T>A) em

13

Belém, PA............................................................................................................ 87 Figura 40 − Níveis de mRNA de IL-8 entre pacientes cardíacos e um grupo

controle de acordo com o polimorfismo rs4073 (−251T>A) e a presença de

anticorpos para Chlamydia em Belém, PA......................................................... 87 Figura 41 − Níveis de mRNA de IL-8 entre pacientes submetidos a

revascularização do miocárdio (RM) e um do grupo controle de acordo com

resultado a presença ou ausência de anticorpos para Chlamydia em Belém, PA 88 Figura 42 − Níveis de mRNA de IL-8 entre pacientes submetidos a troca de

válvula (TV) e um grupo controle de acordo com resultado a presença ou

ausência de anticorpos para Chlamydia em Belém, PA...................................... 89 Figura 43 − Níveis de mRNA de IL-8 entre pacientes cardíacos e um grupo


C.trachomatis em Belém, PA.............................................................................. 90 Figura 44 − Níveis de mRNA de IL-8 entre pacientes cardíacos em um grupo


C.pneumoniae em Belém, PA.............................................................................. 90 Figura 45 − Níveis de mRNA de IL-10 entre pacientes cardíacos e um grupo

controle em Belém, PA........................................................................................ 91 Figura 46 − Níveis de mRNA de IL-10 entre pacientes cardíacos e um grupo

controle de acordo com genótipos para o polimorfismo rs1800896

(−1082G>A) em Belém, PA................................................................................ 92 Figura 47 − Níveis de mRNA de IL-10 entre pacientes cardíacos e um grupo

controle de acordo com os genótipos para o polimorfismo rs1800896 (−1082

G>A) e a presença de anticorpos para Chlamydia em Belém, PA...................... 93 Figura 48 − Níveis de mRNA de IL-10 entre pacientes submetidos a

revascularização do miocárdio (RM) e um grupo controle de acordo com a

presença ou ausência de anticorpos para Chlamydia........................................... 93 Figura 49 − Níveis de mRNA de IL-10 entre pacientes submetidos a troca de

válvula (TV) e um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de

anticorpos para Chlamydia.................................................................................. 94 Figura 50 − Níveis de mRNA de IL-10 entre pacientes cardíacos e um grupo


C.trachomatis....................................................................................................... 95

14

Figura 51 − Níveis de mRNA de IL-10 entre pacientes cardíacos e um grupo


C.pneumoniae...................................................................................................... 95

15

RESUMO

As doenças cardiovasculares são uma das principais causas de morte e são associadas

a fatores ambientais, comportamentais tradicionais, fatores bioquímicos, genéticos,

imunológicos e infecciosos. O presente estudo avaliou a influência de infecções bacterianas

(C. trachomatis e C. pneumoniae) e de marcadores imunológicos e inflamatórios (PrtCR,

TNF−α, IL−6, IL−8 e IL−10) em 159 pacientes internados para realização de revascularização

do miocárdio (RM), 71 pacientes com doença de válvula mitral e aórtica internados para

realização de troca de válvula (TV) e 300 indivíduos saudáveis. Dos grupos RM e TV foram

coletadas amostras de sangue no pré-operatório e fragmentos de tecido cardiovascular durante

a cirurgia e amostras de sangue do grupo controle, entre novembro de 2010 a outubro de

2012, em três hospitais em Belém, PA. A detecção de anticorpos para C.trachomatis e

C.pneumoniae foi realizada por um ensaio imunoenzimático e confirmada pela

microimunofluorescência. Os fragmentos de tecido (placa de ateroma, válvula cardíaca e aorta

ascendente) foram submetidos à qPCR para detecção de DNA das duas espécies de

Chlamydia. Foi realizada a análise de polimorfismo da região promotora de cada marcador e a

quantificação relativa da expressão gênica de TNF-α, IL-8 e IL-10. As PrtCR e IL-6, tiveram

a dosagem medida no plasma. A prevalência de anticorpos para C.trachomatis foi de 30,6%,

20,3% e 36,7% e para C.pneumoniae foi de 83,6%, 84,5% e 80,3% (RM, TV e controle,

respectivamente). A presença de DNA do plasmídio críptico de C.trachomatis foi detectada

em 7,4% das amostras, mas não o DNA da C. pneumoniae. O genótipo GG (rs1800795) de

IL-6 demonstrou ser um fator de risco para o desenvolvimento de doença cardiovascular e o

genótipo AA (rs4073) de IL-8 um fator de risco para o desenvolvimento de valvulopatias. A

presença de anticorpos para C. pneumoniae foi um fator adicional ao risco de doença

cardiovascular. A concentração plasmática de PrtCR e IL-6 foi maior em pacientes do que no

grupo controle, associadas a presença do genótipo TT e GG, respectivamente. A presença de

anticorpos para Chlamydia foi associada a uma maior secreção de PrtCR em pacientes com

valvulopatias, assim como a de IL-6 e a presença de anticorpos para C.trachomatis. TNF-α e

IL-8 apresentaram baixa expressão gênica em pacientes. A maior expressão de IL-10 foi

associada à presença dos genótipos GG e AG. A suscetibilidade genética do hospedeiro e

presença de marcadores de infecção bacteriana (Chlamydia) representam um maior risco para

o desenvolvimento de doenças cardiovasculares.

16

ABSTRACT

Cardiovascular diseases are a major cause of death and are associated with traditional

environmental, behavioral, biochemical, genetic, immunological and infectious factors. This

study evaluated the influence of bacterial infections ( C. trachomatis and C. pneumoniae ) and

immunological and inflammatory markers (PrtCR, TNF− α, IL−6 , IL−8 and IL−10 ) in 159

patients admitted to conducting coronary artery bypass grafting (CABG ), 71 patients with

mitral and aortic valve disease admitted to conducting valve replacement (VR ) disease and

300 healthy individuals. For CABG and RV group blood samples before surgery and

cardiovascular tissue fragments were collected during surgery and blood samples from the

control group between November 2010 and October 2012 in three hospitals in Belém, PA.

The detection of antibodies to C. trachomatis and C. pneumoniae was performed using an

enzyme-linked immunosorbent assay and confirmed by microimmunofluorescence. The

fragments of tissue (atheroma, heart valve and ascending aorta) were subjected to qPCR to

detect DNA of two species of Chlamydia. The polymorphism analysis of the promoter region

of each marker and the relative quantification of gene expression of TNF−α, IL−8 and IL−10

were measured. The PrtCR and IL−6 concentration were measured in plasma. The prevalence

of antibodies to C. trachomatis was 30.6 %, 20.3% and 36.7 % and C. pneumoniae was 83.6

%, 84.5 % and 80.3 % (CABG, RV and control, respectively). The presence of the cryptic

plasmid DNA from C. trachomatis was detected in 7.4% of the samples, but not the DNA of

the C. pneumoniae. The GG (rs1800795) genotype of IL−6 was shown to be a risk factor for

developing cardiovascular disease and AA genotype (rs4073) of IL−8 a risk factor for the

development of valvular heart disease. The presence of antibodies to C. pneumoniae is an

additional risk factor for cardiovascular disease. The plasma concentration of PrtCR and IL−6

was higher in patients than in the control group, associated with the presence of genotype TT

and GG, respectively. The presence of antibodies to Chlamydia was associated with an

increased secretion of PrtCR in patients with valvular heart disease, as well as IL−6 and the

presence of antibodies to C. trachomatis. TNF−α and IL−8 showed low gene expression in

patients. The increased expression of IL−10 was associated with the presence of the GG and

AG genotypes. Genetic susceptibility and the presence of markers of bacterial infections

(Chlamydia) represent a higher risk for developing cardiovascular diseases.

17

1. INTRODUÇÃO 1.1. CHLAMYDIA TRACHOMATIS E CHLAMYDIA PNEUMONIAE

1.1.1. Histórico e Classificação

Manifestações clínicas associadas a infecções por espécies de Chlamydia, como o

tracoma, são consideradas antigas (Schachter & Caldwel, 1980). Em 1907, Halberstaedter e

von Prowazek descreveram inclusões intracelulares em raspados de células de conjuntiva de

orangotangos infectados experimentalmente com material de tracoma (Halberstaedter & von

Prowazek apud Thygeson, 1971). A etiologia do tracoma foi descrita, finalmente, em 1957,

quando a espécie Chlamydia trachomatis foi recuperada a partir do cultivo de material

biológico de tracoma cultivado em ovos embrionados (Tang et al., 1957). Na década de 1980,

outra espécie foi identificada sendo associada à doenças respiratórias (Grayston et al., 1986;

Grayston et al., 1989). As duas primeiras cepas isoladas receberam os nomes TW183T e AR-

39 os quais originaram na época a denominação da bactéria (cepa TWAR). Posteriormente ela

foi reconhecida como uma espécie distinta e recebeu o nome Chlamydia pneumoniae (Saikku

et al., 1985; Grayston et al., 1986; Grayston et al., 1989).

A classificação taxonômica das clamídias ainda apresenta controvérsias devido à

diversas sugestões de alteração, dentre elas a divisão do gênero Chlamydia em outros dois

gêneros, o Chlamydia e Chlamydophila (Everett et al., 1999). Porém, a nova classificação

ainda não está oficialmente aceita (Schachter et al., 2001; Greub, 2010). A caracterização

clássica obedece à seguinte sequência: ordem Chlamydiales, que contém a família

Chlamydiaceae no qual está inserido um único gênero Chlamydia com quatro espécies

conhecidas: Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci e

Chlamydia pecorum (Storz & Page, 1971; Moulder, 1984; Fukushi & Hirai, 1993).

1.1.2. Morfologia e Ciclo de Desenvolvimento

As clamídias são bactérias intracelulares obrigatórias com DNA e RNA, imóveis,

Gram-negativo, possuindo membrana trilaminar contendo lipossacarídeos e diversas proteínas

de membrana com estrutura e função semelhantes às de Escherichia coli (Moulder, 1966).

Duas principais proteínas são relacionadas ao diagnóstico e à patogenia da infecção:

(1) o lipopolissacarídeo (LPS), constituído principalmente por ácido cetodeoxietanóico e (2) a

MOMP (Major Outer Membrane Protein), que pertence ao grupo de proteínas de membrana,

ricas em cisteína, representando 60% do peso da membrana externa. As pontes dissulfeto que

estabilizam estas proteínas conferem uma maior rigidez e resistência da bactéria contra

18

mecanismos de estresse oxidativo. A MOMP é um importante sítio antigênico e é a proteína

responsável pela diferença entre os sorotipos de clamídia, pois é espécie e sorotipo-específica;

por isso são utilizadas na sorotipagem (caracterização realizada através de painel de

anticorpos monoclonais) (Caldwell et al., 1981; Hatch et al., 1986; Stephens et al., 1987;

Kariagina et al., 2009).

Duas formas distintas ocorrem dentro do seu ciclo de desenvolvimento: os corpos

elementares (CE), que são estruturas de aproximadamente 300 nm, metabolicamente inativos

e representam a forma extracelular altamente infecciosa e os corpos reticulados (CR), que são

maiores do que os CE, medem de 800 a 1.200 nm e possuem DNA fibrilar difuso, alta

concentração de ribossomos e são as formas metabolicamente ativas de reprodução

intracelular, ainda que tenham baixa infectividade (Matsumoto, 1982).

A clamídia infecta comumente células colunares não ciliadas (conjuntiva e trato

urogenital) e macrófagos e o ciclo de desenvolvimento tem duas fases (Figura 1). Na

primeira, os CE extracelulares são internalizados por uma célula hospedeira através de

receptores de superfície (Hatch et al., 1984; Stephens et al., 2001; Wyrick, 2000). Estudos

apontam que a família Chlamydiaceae apresenta um sistema conservado de proteínas de

secreção tipo III que permite a transferência eficaz de proteínas efetoras em todas as fases do

seu ciclo mostrando um papel fundamental na entrada destas bactérias bem como sua

multiplicação na célula do hospedeiro (Slepenkin et al., 2005).

Aproximadamente oito horas após a entrada da bactéria, os CE se reorganizam em CR

e iniciam a replicação por divisão binária que caracteriza a segunda fase do ciclo. Em 24 a 72

horas, os CR retornam à forma de CE. O tempo de duração deste ciclo bifásico não é exato,

porém se caracteriza por divisões que ocorrem no interior de um vacúolo da célula parasitada,

formando as chamadas inclusões citoplasmáticas perinucleares (Figura 1). No final do ciclo,

os vacúolos contêm de 100 a 1.000 CE e na medida em que estes vacúolos ocupam quase todo

o citoplasma da célula hospedeira, pode ocorrer lise ou exocitose com liberação dos novos CE

no meio extracelular, iniciando um novo ciclo (Moulder, 1991; Wyrick, 2000).

A inclusão representa um mecanismo importante de escape da clamídia garantindo a

sua circulação e maior sobrevivência dentro da célula. Em células epiteliais infectadas por C.

trachomatis, não ocorre a fusão da inclusão com componentes lisossômicos, fato que levaria a

degradação da partícula bacteriana. Foi demonstrado que para ocorrer a liberação da bactéria,

as inclusões fundem com vesículas secretórias do Complexo de Golgi e são liberadas por

exocitose (Hogan et al., 2004).

19

Figura 1 – Representação esquemática da multiplicação da Chlamydia no interior da célula hospedeira (Adaptado de http://www.chlamydiae.com/docs/biology/biol_devreg.as). 1.1.3. Organização Genômica

A clamídia possui um genoma constituído por um cromossomo circular que contém

1.042.519 pb das quais 58,7% correspondem a A+T (adenina e timina). Existe também um

elemento genético extracromossômico (plasmídio pCT) de 7.493 pares de bases (7.5 Kb). Os

resultados da análise do genoma da clamídia mostraram que existem 894 genes codificadores

de proteínas, e destas, são conhecidas os produtos de expressão de 604 (68%) (Stephens et al.,

1998).

Setenta genes representados no genoma da C. trachomatis não são representados no

genoma da C. pneumoniae. Estes genes estão organizados em blocos que contém entre 2 a 17

genes, além de 19 genes não agrupados dispersos pelo genoma. Destes 70 genes não

homólogos entre as duas espécies, 60 são classificados como possíveis áreas de codificação

de proteínas (Stephens et al., 1998). Os outros genes são referentes ao operon do triptofano

(trpA, trpB, trpR, trpC), dois genes protease thiol e quatro genes pertencentes a superfamília

da fosfolipase-D (Stephens et al., 1998; Kalman et al., 1999).

O plasmídio pCT foi isolado a partir de cepas de C. trachomatis sorotipo L2 e o seu

DNA foi detectado em todos os outros sorotipos da espécie. Este plasmídio é altamente

conservado e possui menos de 1% de variação na sequência nucleotídica (Thomas et al.,

1997, Palmer & Falkow, 1986). Estudos sugerem que a presença do plasmídio tem

importância no acúmulo de glicogênio no interior das inclusões, na capacidade de ativar a

resposta imunológica inata via TRL2 (Toll Like Receptor 2), um passo muito importante na

imunopatologia da infecção (Darville et al., 2003; O’Connell et al., 2007).

20

1.1.4. Resposta Imunológica e Manifestações Clínicas

A fase intracelular dentro do ciclo de desenvolvimento da clamídia influencia os tipos

de elementos do sistema imunológico estimulados durante uma infecção (Loomis &

Starnbach, 2002).

A patogênese é ocasionada primariamente, por uma resposta inflamatória que se inicia

e se propaga a partir das células infectadas (Stephens, 2003). A atração de células

inflamatórias como macrófagos e a subsequente liberação de citocinas pró-inflamatórias

parecem ser pontos fundamentais na resposta imunológica inata contra a Chlamydia

(Rasmussen et al., 1997; De Kruif et al., 2005). A resposta imunológica adaptativa se forma a

partir do reconhecimento de antígenos específicos da Chlamydia em infecções persistentes ou

repetidas (Loomis & Starnbach, 2002; Entrican et al., 2004).

O uso de cultura com células infectadas sugere que os mediadores da resposta

imunológica celular são os mais importantes nas infecções por Chlamydia e micro-

organismos intracelulares em geral (Ward, 1995, Entrican et al., 2004). Infecções em modelos

animais demonstraram que a ativação de células da linhagem T auxiliares 1 (Th1) possui um

papel central na eliminação da infecção sendo responsável também pelos danos teciduais

causados ao organismo. Enquanto o Fator de necrose tumoral α (TNF- α) e Interferon-γ (IFN-

γ) demonstram uma ação de controle da infecção, a produção de Interleucina-10 (IL-10)

antagoniza essa resposta diminuindo o número de células em apoptose, podendo levar a uma

infecção persistente (Cain & Rank, 1995; Geng et al., 2000; Shavlakadze & Gorgoshidze,

2010).

O processo de persistência da Chlamydia pode ser induzido por vários mecanismos

durante o seu ciclo de desenvolvimento. O tratamento com alguns antibióticos (por exemplo,

betalactâmicos) é um dos fatores relatados. A penicilina pode interferir na síntese de

peptideoglicanos alterando a estrutura da parede celular da bactéria. Consequentemente seu

ciclo de desenvolvimento ser torna mais lento devido à dificuldade de transição morfológica

do CR para o CE. O resultado disto é uma forma aberrante de CR que caracteriza a

persistência (Skilton et al., 2009). A forma aberrante pode também ser induzida pela presença

de alta quantidade de IFN-γ cujo papel principal é combater a infecção aguda através da

eliminação da célula infectada. Um dos efeitos do IFN-γ é diminuir a biodisponibilidade do

triptofano, aminoácido essencial dentro do ciclo de desenvolvimento das clamídias (Igietseme

et al., 1998; Xie et al., 2002).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shavlakadze%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gorgoshidze%20B%22%5BAuthor%5D

21

A C.trachomatis é um dos agentes mais comuns de infecções sexualmente

transmissíveis (IST) e possui 19 variantes antigênicas caracterizadas pelos sorotipos: A, B, Ba,

C, D, Da, E, F, G, Ga, H, I, Ia, J, Ja, K, L1, L2 , L2a e L3 (Morré et al.,1998). De acordo com o

sorotipo, as manifestações clínicas da infecção podem se apresentar de forma variada.

Os sorotipos A, B, Ba e C têm sido regularmente associados ao tracoma, doença que

leva à cegueira cerca de 500 milhões de pessoas no mundo (WHO, 2004). A doença ocorre

por infecções da conjuntiva e na sua forma aguda apresenta folículos e papilas conjuntivais. O

quadro clínico do tracoma se inicia com alterações inflamatórias agudas na conjuntiva e

córnea, manifestadas por lacrimejamento, secreção purulenta e hiperemia conjuntival. De

acordo com a gravidade e duração do processo inflamatório o quadro pode evoluir para cura

espontânea ou deixar cicatrizes conjuntivais (Jones, 1975; Behrens-Baumann, 2007).

Os sorotipos de D a K causam, aproximadamente, quatro milhões de novos casos de

IST nos Estados Unidos e 90 milhões de casos no mundo, sendo responsável por 30 a 50%

dos casos de uretrites não–gonocóccicas que podem levar à infertilidade (Honey &

Templeton, 2002; Manavi, 2006; Land et al., 2010). Estes mesmos sorotipos podem causar

infecções neonatais que são adquiridas durante a passagem do recém-nascido pelo canal de

parto e, a partir deste contato, pode ocorrer a infecção da conjuntiva ou da nasofaringe do

recém-nascido e subsequente conjuntivite neonatal, otite média, rinite ou pneumonia, dentre

outras manifestações (Schachter et al., 1986; Hammerschlag, 1993; Darville, 2005; Bekler et

al., 2012).

Os sorotipos L1, L2, L2a e L3 são responsáveis pela ocorrência do linfogranuloma

venéreo (LGV) o qual possui caráter endêmico em partes da África, Ásia, América do Sul e

Caribe, e é raro em países industrializados (Schachter & Caldwell, 1980; Schachter & Osoba,

1983; Collins, 2006).

A C. pneumoniae tem sido identificada nos últimos 20 anos como um importante

agente de infecções respiratórias com distribuição mundial e transmissão através das

secreções das vias aéreas (Agarwal & Chander, 2008). As manifestações clínicas relatadas

incluem pneumonia, bronquite, sinusite e asma (Saikku et al., 1985, Grayston et al., 1986)

sendo que a bactéria é responsável por aproximadamente 10% dos casos de pneumonia

adquirida em comunidade e 5% dos casos de faringite, bronquite e sinusite (Kuo et al., 1995;

Bergot, 2011).

A C. pneumoniae foi associada a quadros de artrite aguda com alguns pacientes

evoluindo para quadro crônico (Schumacher, 2000) e doenças cardiovasculares como infarto

do miocárdio e aterosclerose (Saikku et al., 1988, Grayston, 2000). Estudos

22

soroepidemiológicos têm associado doença arterio-coronariana com a presença de anticorpos

para C. pneumoniae (Saikku et al., 1988). Além disso, a bactéria já foi detectada na placa

aterosclerótica por meio de técnicas como a Reação em cadeia mediada pela polimerase

(PCR) e a imunocitoquímica (Kuo et al., 1995), e em outros estudos, isolada em cultura a

partir de ateromas (Gaydos & Quinn, 2000; Kuo & Campbell, 2000).

1.2. PROTEÍNA C REATIVA (PrtCR)

A mais precoce e fundamental fase da resposta imunológica do hospedeiro é a resposta

de fase aguda, onde existe uma rápida alteração na concentração de diversas proteínas

plasmáticas, incluindo a Proteína C Reativa (PrtCR) (Slazai, 2002). Esta foi inicialmente

descrita como uma proteína sérica que se ligava ao polissacarídeo C, um ácido teicóico de

Streptococcus pneumoniae (Tillet & Francis, 1930 apud Volanakis, 2001). A proteína,

composta por 224 aminoácidos (Woo et al., 1985), não é específica, sendo secretada pelos

hepatócitos geralmente sob influência de citocinas pró-inflamatórias, como a Interleucina-6

(IL-6) (Slazai, 2002).

A PrtCR pertence à família das pentraxinas, que reúne proteínas filogeneticamente

conservadas, assim chamadas por apresentarem cinco subunidades globulares idênticas. Estas

subunidades se ligam (de forma dependente de Ca+2) com alta afinidade a fosfolipídeos

bacterianos como a fosforilcolina (Anderson et al., 1978). Ela ainda pode funcionar como

opsonina de bactérias, protozoários e imunocomplexos, além de contribuir para ativação da

via clássica do complemento através da ligação com a proteína C1q (Volanakis, 1982). Esta

habilidade de reconhecer e mediar a eliminação de agentes infecciosos por meio do

recrutamento do sistema complemento e de células fagocíticas mostra que a PrtCR é um

importante constituinte da imunidade inata (Volanakis, 2001). Além disso, a proteína

desempenha um papel importante na eliminação de células apoptóticas e necróticas do

hospedeiro, contribuindo assim para a restauração do tecido lesado (Volanakis, 2001).

O gene codificador da PrtCR se localiza no cromossomo 1, na posição 1q23.2 (Floyd-

Smith et al., 1986), apresenta 2.301 pb e abriga dois éxons sendo o éxon 1 com 166 pb e o

éxon 2 com 1.850 pb (Woo et al., 1985). Entre os dois éxons existe um íntron de 278 pb

(Woo et al., 1985) (Figura 2).

Vários polimorfismos de nucleotídeos (SNP, small nucleotide polymorphisms) no gene

da PrtCR têm sido descritos e se mostraram associados à mudanças na concentração sérica da

proteína, como por exemplo o polimorfismo −757T>C (rs3093059), −717T>C (rs2794521),

23

−409G>A (rs3091244) e −309C>T>A (rs3093062) localizados na região promotora do gene

(Zee, et al., 2002; Brull et al., 2003; Hage & Szalai, 2007). Além desses, existe o

polimorfismo +1059G>C (rs1800847) no éxon 2 e +1444C>T (rs1130864) na região 3’ não

traduzida (Zee et al., 2004; Balistreri et al., 2006). Assim como outros elementos da resposta

imunológica, a secreção exacerbada da PrtCR pode desempenhar efeitos potenciais de

resposta, como foi demonstrado em seu envolvimento no processo de aterogênese (Sinning et

al., 2006).

Um estudo avaliou os níveis séricos de PrtCR momentos antes e depois dos indivíduos

se submeterem à exercícios de longa duração e da mesma forma em indivíduos que se

submeteriam à cirurgia de revascularização do miocárdio. O grupo não só identificou dois

novos polimorfismos (−717/T>C e +1444/C>T) como encontrou níveis séricos maiores de

PrtCR em homozigotos para o alelo 1444*T quanto comparado aos indivíduos heterozigotos,

sugerindo que esta variante genética pode estimular o aumento dos níveis séricos da PrtCR,

influenciando no risco de doenças cardiovasculares (Brull et al., 2003).

Figura 2 – Representação esquemática da localização do polimorfismo rs2794521 (−717 T>C) do gene da PrtCR (adaptado de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene).

1.3. FATOR DE NECROSE TUMORAL (TNF-α)

O TNF foi primeiramente identificado como uma substância que causava necrose de

tumores “in vivo” e estava presente no plasma de animais tratados com LPS bacteriano, ou

endotoxinas (Makhatadze, 1998). Esta citocina é secretada principalmente por macrófagos e

monócitos tendo como característica a mediação da resposta inflamatória aguda por bactérias

Gram-negativo e outros agentes (Hajeer & Hutchinson, 2000).

O TNF-α é uma proteína com peso molecular de 17 (kD), composta por 157

aminoácidos e contém uma ponte dissulfídica ligada a dois resíduos de cisteína (Shalaby et

al., 1986; Makhatadze, 1998). O gene TNF-α está localizado no cromossomo 6, na região

6p23.1, ao lado de gene codificador do TNF-β, na região de classe III do Complexo de

Histocompatibilidade Principal (MHC) (Beutler & Cerami, 1988).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/

24

As funções biológicas do TNF-α são complexas e relacionadas à concentração da

citocina bem como ao tempo de exposição a ela (Barbara et al., 1996). Em infecções agudas,

a secreção local de TNF-α é claramente benéfica. Ocorre a expressão de moléculas de adesão

no endotélio vascular, além do recrutamento de neutrófilos e monócitos para os locais da

infecção (Barbara et al., 1996). Ocorre também um estímulo das células endoteliais e

macrófagos a secretarem quimiocinas que provocam quimiotaxia e recrutamento dos

leucócitos (Makhatadze, 1998). No entanto, uma exposição prolongada ao TNF-α pode ser

prejudicial. Altos níveis de proteínas circulantes são associados a choque tóxico induzido por

endotoxinas bacterianas (Tracey et al., 1986).

O TNF-α estimula a secreção de IL-1 e IL-6, o que leva a um aumento de temperatura,

sonolência e a liberação de glicocorticóide. Estas podem ser de curto prazo para combater

determinadas infecções, mas os seus efeitos em longo prazo podem ser prejudiciais (Hajeer &

Hutchinson, 2000).

O MHC é a região mais densa e polimórfica de todo o genoma e vários polimorfismos

têm sido identificados no interior e ao redor do gene do TNF-α. Estudos mostram que estes

polimorfismos estão envolvidos na alteração dos níveis de produção do TNF-α, o que pode ter

um grande impacto na resposta inflamatória do indivíduo (Hajeer & Hutchinson, 2000).

Os polimorfismos no gene do TNF-α estão mais associados à regulação da produção

da citocina e coincidem com as regiões de ligação dos fatores de transcrição. As alterações

mais investigadas estão nas posições -308G>A (rs1800629) e -238G>A (rs361525) da região

promotora (Wilson et al., 1992; Kroeger et al., 1997) (Figura 3). Estudos mostram que o alelo

-308*A possui uma atividade de transcrição maior quando comparada com o alelo -308*G

(Braun et al., 1996; Wu & McClain, 1997) Em contrapartida, o polimorfismo na posição -238

apresenta controvérsias, pois já foi mostrado que está associado com maior transcrição do

TNF-α (Huizinga et al., 1997), fato que não foi repetido posteriormente (Pociot et al., 1995).

Figura 3 – Representação esquemática da localização do polimorfismo rs1800629 (−308 G>A) do gene do TNF-α (adaptado de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene).


25

1.4. INTERLEUCINA - 6 (IL-6)

A IL-6 foi identificada em 1986 primeiramente como um fator de regulação de

linfócitos B, mas, em seguida, ela foi caracterizada por apresentar atividade multifuncional

tanto na resposta imunológica inata como na adquirida (Hirano et al., 1986; Kishimoto,

2005). Na imunidade inata a IL-6 estimula a síntese de proteínas de fase aguda (como a

PrtCR) pelos hepatócitos, contribuindo para os efeitos sistêmicos da inflamação (Brennan &

Mclnnes, 2008). Na imunidade adquirida, a IL-6 estimula efeitos de maturação e ativação dos

linfócitos T e B (Brennan & Mclnnes, 2008), além de estimular a maturação de macrófagos,

osteoclastos, condrócitos, células endoteliais e participar do controle do sistema

hematopoiético (Kishimoto, 2005).

A IL-6 é produzida por monócitos, macrófagos, linfócitos, fibroblastos e células

endoteliais em resposta a diversos micro-organismos e outras citocinas como TNF e IL-1

(Kishimoto, 2005). Sua produção exacerbada está associada a uma diversidade de doenças

autoimunes e inflamatórias e outras condições como a artrite reumatóide, artrite juvenil

sistêmica, diabetes tipo II, doença de Crohn, obesidade, aterosclerose e infarto agudo do

miocárdio (Ishihara & Hirano, 2002; Abeywardena et al., 2009; Vakili et al., 2011).

O gene da IL-6 possui 4.803pb e se localiza no cromossomo 7, posição 7p15, sendo

constituído por 5 éxons (Sutherland et al., 1988) (Figura 4). Existem alguns polimorfismos na

região promotora que apresentam associação com níveis alterados de transcrição do gene,

como o rs1800795 (−174G>C), o rs1800796 (−572G>C), e rs1800797 (−597C>A)

(Kelberman et al., 2004).

Figura 4 – Representação esquemática da localização do polimorfismo rs1800795 (−174 G>C) do gene da IL-6 (adaptado de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene).


26


A IL-8 pertence à família das quimiocinas (CXC) e é secretada por diversas células

como macrófagos, neutrófilos, células epiteliais e células endoteliais (Grimm et al., 1996).

Esta interleucina pró-inflamatória é responsável por mediar a ativação e migração dos

neutrófilos do sangue periférico para os tecidos onde se iniciou um processo inflamatório e

geralmente o seu estímulo acentua a inflamação nestes locais (Harada et al., 1994).

O gene da IL-8 apresenta 5.191pb, está localizado do cromossomo 4, posição q12-q13

e possui quatro éxons separados por tres íntrons (Mukaida et al., 1989) (Figura 5). Muitos

polimorfismos no gene têm sido detectados, como o da posição 781C>T (rs2227306) no

primeiro íntron e o -251T>A (rs4073) na região promotora, cujo alelo 251*A, em

homozigose, é associado a uma maior atividade transcricional do gene (Hull et al., 2000;

Hacking et al., 2004).

Por ser uma forte mediadora do processo inflamatório, a IL-8 tem sido associada a

diversos processos inflamatórios como doença respiratória aguda, pancreatite aguda, asma

brônquica, artrite idiopática juvenil, gastrite induzida por Helicobacter pylori e aterosclerose

(Gross et al., 1992; Fujishima et al., 1993; De Benedetti et al., 1999; Boisvert et al., 2000;

Bäckhed et al., 2003).

Figura 5 – Representação esquemática da localização do polimorfismo rs4073 (−251 T>A) do gene da IL-8 (adaptado de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene).


A IL-10 se apresenta como uma citocina inibidora de diferentes tipos de reações

imunológicas, uma vez que possui a capacidade de bloquear a secreção de outras citocinas e

sua própria secreção (Moore et al., 1993). Ela representa um potente supressor da função de

células T, NK e, principalmente, macrófagos ativados. Esta ação sobre macrófagos está

direcionada para a inibição de citocinas como TNF, IL-12, IL-1, IL-6 e IL-8, além da inibição

de co-estimuladores e moléculas de MHC II nestas células (Moore et al., 2001; Couper et al.,

2008). Como consequência vai ocorrendo, gradativamente, um controle na liberação de


27

citocinas pró-inflamatórias, término de suas reações e o organismo retorna ao seu estado de

repouso à medida que a infecção vai sendo erradicada (Schumacher et al., 2005).

A descoberta do efeito inibidor da IL-10 ocorreu ao se observar que havia um produto

que inibia a proliferação, função efetora e desenvolvimento de células T helper 1 (Th1) da

mesma forma que o IFN-γ inibia as células T helper 2 (Th2) (Fernandez-Botran et al., 1988,

Fiorentino et al., 1989). A regulação direta das respostas Th1 e TH2 pela IL-10 ocorre pela

limitação tanto da ativação como diferenciação dos linfócitos T, suprimindo a resposta pró-

inflamatória. A relevância fisiológica, portanto, está na prevenção e limitação de reações

específicas e inespecíficas e, como resultado, a diminuição do dano tecidual (Couper et al.,

2008; Sabat et al., 2010).

O gene da IL-10 possui 5 éxons, totalizando aproximadamente 5,2 Kb de tamanho e

está localizado no cromossomo 1, posição 1q31-q32 (Kim et al., 1992) (Figura 6). O produto

codificado é um homodímero de 18 KDa que pertence ao grupo de citocinas com quatro

cadeias alfa-hélice e liga-se a um receptor de citocinas tipo II (Kim et al., 1992).

Dentro da região promotora foram descritos inúmeros polimorfismos funcionais

incluindo dois microssatélites dinucleotídicos de citosina e adenina localizado a

aproximadamente 4.000 pb anteriores ao início da transcrição; e tres polimorfismos

bialélicos: −1082G>A (rs1800896), −819C>T (rs1800871) e −592C>A (rs1800872) (Turner

et al., 1997; Eskdale et al., 1998).

Westendorp et al. (1997), verificaram que 70% das alterações na produção de IL-10

em familiares e gêmeos univitelinos eram devido a componentes genéticos. Em outro estudo,

células mononucleares do sangue periférico foram estimuladas com Concanavalina-A, e como

resultado foi observada uma diferença na secreção de IL-10 em associação com a presença ou

ausência de uma adenina na posição −1082 da região promotora (Turner et al., 1997).

Figura 6 – Representação esquemática da localização do polimorfismo rs1800896 (−1082 A>G) do gene da IL-10 (adaptado de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene).


28

Os genótipos referentes ao polimorfismo na região −1082 da IL-10 (AA, GA, GG)

correspondem, respectivamente, a níveis baixos, intermediários e altos na produção da

citocina, de forma independente dos outros polimorfismos citados (Eskdale et al., 1998;

Couper et al., 2008). A mudança de base pode levar a uma produção diminuída de até 30% da

proteína a partir de um estímulo definido (Turner et al., 1997).

1.7. ATEROSCLEROSE, INFECÇÕES POR C. TRACHOMATIS, C. PNEUMONIAE E

ASSOCIAÇÃO COM MARCADORES DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA

A aterosclerose é uma condição multifatorial caracterizada inicialmente como o

acúmulo de gordura (placas de ateroma) na parede das artérias (Schwenke et al., 1989). Este

processo pode ser desencadeado a partir de um dano no tecido endotelial promovendo um

processo inflamatório inicial que pode evoluir para lesões avançadas que obstruem a luz do

vaso resultando em processos agudos de isquemia que caracterizam a doença cerebrovascular,

vascular periférica e doença coronariana (Stary, et al., 1994, Stary et al., 1995, Zouridakis,

2004). De acordo com a Organização Mundial da Saúde, a doença coronariana é a principal

causa de morte em indivíduos a partir de 60 anos de idade no mundo e a segunda causa de

morte entre indivíduos de 15 a 59 anos de idade (WHO, 2004). Cerca de 3,8 milhões de

homens e 3,4 milhões de mulheres morrem a cada ano devido a esta doença (WHO, 2004).

Embora exista a influência de fatores genéticos, 80% a 90% das pessoas que morrem

de doença coronariana possuem um ou mais fatores de risco relacionados ao estilo de vida. As

taxas de mortalidade em geral podem ser afetadas pelas diferenças entre os países nos

principais fatores de risco que incluem taxa de colesterol no sangue, pressão sanguínea, o

tabagismo, obesidade, diabetes, sedentarismo e o tipo de dieta (Kiechl & Willeit, 1999; WHO,

2004; Nash et al., 2011).

Um dos principais fatores envolvidos no desenvolvimento da lesão aterosclerótica é a

lipoproteína de baixa densidade modificada pela oxidação (LDLox) (Van de Vijver et al.,

1998; Sun et al., 2000). Apesar disto, o processo de aterogênese não é mais considerado o

simples resultado de acúmulo de lipídeos na parede das artérias (Ross, 1999; Vigen et al.,

2005). As lesões ateroscleróticas são resultado de alterações oxidativas, hemodinâmicas,

bioquímicas e inflamatórias adicionadas a respostas celulares altamente específicas (Packard

& Libby, 2008; Galkina & Ley, 2009) (Figura 7). Observações fisiopatológicas em seres

29

humanos e animais mostram que a aterosclerose consiste em uma resposta a um dano tecidual

com enfoque para disfunção endotelial (Fan & Watanabe, 2003). O resultado final é o

acúmulo de células musculares lisas dentro da camada íntima do vaso, além de macrófagos,

fibras elásticas, colesterol e proteoglicanos (Packard & Libby, 2008; Galkina & Ley, 2009;

Nabel & Braunwald, 2012).

A Associação Americana do Coração e o Comitê de Lesões Vasculares aprovaram

uma classificação histológica das lesões ateroscleróticas em seis tipos. A lesão tipo I onde são

observadas poucas mudanças no tecido arterial e formação de um grupo pequeno e isolado de

macrófagos contendo gotículas de lipídeos (célula espumosa) (Figura 7A) (Stary, et al., 1994;

Nabel & Braunwald, 2012). A lesão tipo II é caracterizada pela observação de manchas,

pontos ou estrias de gordura que apresentam uma coloração amarela na superfície da camada

íntima (Stary, et al., 1994). A lesão tipo III é conhecida como intermediária, ou de transição,

ou pré-ateroma pois já podem ser visualizadas gotículas de lipídeos no meio extra-celular que

se acumulam entre as células do músculo liso promovendo o espessamento a camada íntima

(Stary, et al., 1994; Nabel & Braunwald, 2012) (Figura 7B). As lesões tipo IV, V e VI são

consideradas avançadas e denominadas de ateroma, onde já se observa uma intensa

desorganização da camada íntima devido a formação do núcleo lipídico bem definido (lesão

IV), podendo esta camada lipídica sofrer uma acúmulo de tecido conjuntivo fibroso (lesão V)

evoluindo para formação de fissuras, hematomas ou trombos (lesão VI) (Stary, et al., 1995)

(Figura 7C).

30

Figura 7 – Representação esquemática dos estágios de desenvolvimento da aterosclerose (Adaptado de Nabel & Braunwald, 2012).

Os estímulos que iniciam e sustentam o processo inflamatório nos vasos ainda não

foram totalmente identificados. Vários estudos retrospectivos e transversais sustentam a

hipótese de que uma infecção local ou sistêmica crônica possa contribuir para o processo de

aterogênese (Rupprecht et al., 2001; Pinar et al., 2004; Nazmi et al., 2010). Os micro-

organismos mais relatados são alguns vírus da família Herpesviridae (Herpesvírus humano 1

e Herpesvírus humano 5), o Vírus da hepatite A; e bactérias como o Mycoplasma pneumoniae

31

e a Chlamydia pneumoniae (Davidson et al., 1998; Gaydos & Quinn, 2000; Bason et al.,

2003; Maia et al., 2009; Nazmi et al., 2010).

O primeiro estudo que apresentou associação entre a C. pneumoniae e doença arterial

coronariana foi realizado na Finlândia, onde Saikku et al., em 1988, mostraram que pacientes

com doença coronariana apresentavam maior quantidade de anticorpos contra a bactéria do

que o grupo controle. Em 1992, o grupo encontrou os mesmos resultados em outro estudo

caso-controle (Saikku et al., 1992).

Após estes estudos iniciais, a associação da C. pneumoniae com doenças de coronária,

carótida e doença arterial periférica tem sido descrita. Já foi mostrada, in vitro, a habilidade da

bactéria de infectar células do músculo liso, endoteliais e macrófagos humanos (Godzik et al.,

1995; Gaydos et al., 1996) e com base nisso, diversas metodologias têm sido empregadas para

se elucidar mecanismos de associação e patogênese dessas doenças como estudos

soroepidemiológicos, anatomo-patológicos, experimentais ou de demonstração direta da

bactéria nas paredes arteriais (Melnick et al., 1993; Kuo et al., 1995; Laitinen et al., 1997,

Costa, 2002; Reszka et al., 2008; Bayram et al., 2011).

Estudos em modelos animais têm demonstrado resultados que reforçam o papel da C.

pneumoniae como agente envolvido na patogênese da aterosclerose. Na Finlândia, após

inoculação intranasal de C. pneumoniae, coelhos brancos da Nova Zelândia apresentaram

lesões aórticas e foi observado que estas foram mais frequentes naqueles que receberam duas

inoculações sequenciais da bactéria (Laitinen et al., 1997).

As evidências mais importantes de associação têm sido os estudos de detecção de

componentes bacterianos nas placas de ateroma. Esta demonstração direta da bactéria tem

sido realizada por imunocitoquímica (que utiliza anticorpo monoclonal espécie-específico) e

pela reação em cadeia mediada pela polimerase (PCR), além de microscopia eletrônica e

isolamento do organismo (Kuo et al., 1993; Reszka et al., 2008; Bayram et al., 2011).

A C. pneumoniae é raramente encontrada em artérias normais ou granuloma não

infeccioso e é relatada com mais frequência em ateromas do que em pulmão ou outros tecidos

no mesmo paciente (Campbell et al., 1998). Apesar da taxa de detecção variar de acordo com

a metodologia empregada, a C.pneumoniae é encontrada em muitas lesões (Gaydos & Quinn,

2000; Kuo & Campbell, 2000). Um estudo realizado no Alaska encontrou antígenos da

bactéria em artérias lesionadas de adultos jovens (grupo de baixo risco para aterosclerose)

reforçando o seu papel primário na patogênese da doença (Davidson et al., 1998).

A participação da C.pneumoniae no processo de formação da placa de ateroma pode

ocorrer por meio de indução da inflamação e oxidação do LDL colesterol conduzindo ao

32

dano, reparo e fibrose do tecido afetado (Vielma et al., 2004). Ao estabelecer uma infecção do

trato respiratório inferior, a bactéria infecta macrófagos alveolares e monócitos (Figura 8). Os

monócitos infectados atingem os vasos sanguíneos disseminando a infecção para tecidos

suscetíveis, incluindo as artérias (Ngeh et al., 2002), e produzem grande quantidade de

proteínas (como a HSP60-Heat Shock Protein - Proteína de Choque Térmico) que podem

induzir à secreção de fatores pró-coagulantes, citocinas, quimiocinas, moléculas de adesão de

leucócitos e a expressão da metaloproteinase de matriz, a qual produz uma cascata

inflamatória crônica que pode contribuir para o processo de aterogênese (Kol et al., 1998; Kol

et al., 1999; Ngeh et al., 2002).

Figura 8 – Representação esquemática do papel da infecção por C. pneumoniae na aterogênese (Fonte: http://www5.appliedbiosystems.com/tools/pathway/review.php? pathway=C. pneumoniae Infection in Atherosclerosis).

33

O processo inflamatório decorrente da infecção pode induzir a elevação do nível sérico

de vários marcadores imunológicos que associados aos polimorfismos genéticos de cada

indivíduo podem influenciar na instabilidade ou progressão das placas ateroscleróticas (Byrne

& Kalayoglu, 1999). Johnston et al. (2001) estudaram a associação entre os níveis séricos da

PrtCR e a infecção por C. pneumoniae em placas de ateroma localizadas na carótida. Foi

observado que os níveis séricos da PrtCR foram maiores nos indivíduos com placas infectadas

por C. pneumoniae do que no grupo sem infecção, sugerindo que presença da bactéria pode

estimular o aumento da proteína e, como consequência, o risco de doença cardiovascular.

Com relação ao gene do TNF-α, a maioria das observações sugere que seus

polimorfismos levam a uma variação na sua produção, fato que pode ter importância na

suscetibilidade ou gravidade de certas afecções como artrite, doenças auto-imunes e

infecciosas em geral (virais, bacterianas e parasitárias) (Wilson et al., 1994; McGuire et al.,

1994; Nadel et al., 1996, Hohler et al., 1998). Desta forma, o TNF pode ter um papel

importante na patogênese das infecções por Chlamydia, pois sua secreção pode ser induzida

pelo lipopolissacarídeo destas bactérias (Fong, 2003). Estudos dos polimorfismos do TNF têm

encontrando associação com a suscetibilidade a infecções por Chlamydia. A secreção do

TNF-α pode ser exacerbada dependendo da presença dos alelos polimórficos e este efeito

pode intensificar o quadro inflamatório e a progressão da lesão, uma vez que esta citocina

apresenta um papel prejudicial nos quadros de infecções crônicas (Fong, 2003; Burton et al.,

2004; Faal et al., 2005).

Altas concentrações de mRNA de citocinas pró-inflamatórias incluindo o TNF- α tem

sido encontradas em conjuntivas de pacientes com tracoma cicatricial (Burton et al., 2004;

Faal et al., 2005). Um estudo realizado em Gâmbia mostrou que o alelo 308*A estava

presente em proporção maior nos pacientes com tracoma cicatricial do que na população

controle e esta associação aumentou para os casos de homozigose (Conway et al., 1997).

Neste mesmo estudo, também foi mostrada uma frequência maior do alelo –238*A nos

pacientes do que na população controle, porém, este resultado não foi estatisticamente

significante (Conway et al., 1997).

Atik et al. (2008) mostraram que os alelos –308*A do TNF–α e o +252*A do TNF-β

se apresentaram como fatores de risco para o desenvolvimento de triquíase em pacientes

apresentando tracoma, enquanto que Natividad et al. (2007) encontraram os mesmo resultados

para o alelo –308*A.

Tanto os polimorfismos como os níveis plasmáticos do TNF-α têm se apresentado

como um risco de desenvolvimento ou complicações de aterosclerose em alguns estudos

34

como o de Bittar et al. (2006), onde se observou que pacientes apresentando homozigose para

o alelo -308*A possuíam níveis mais altos da citocina no plasma e isto foi associado à efeitos

desfavoráveis em situações após a cirurgia cardíaca. Na Grécia, Kaperonis et al. (2006)

mostraram níveis maiores de TNF-α em pacientes com doença arterial periférica do que no

grupo controle, além de encontrarem uma prevalência de anticorpos anti-C. pneumoniae em

50% do grupo. Na Índia, Goswamim et al. (2009), encontrou uma diferença significante nas

concentrações plasmáticas de TNF-α entre indivíduos que apresentaram infarto agudo do

miocárdio e os controles e também uma correlação entre o TNF-α e a lipoproteína A

sugerindo uma associação entre a resposta inflamatória e dislipidemia influenciando na

patogênese da aterosclerose.

O aumento nos níveis séricos da IL-6 possui um papel potencial na patogênese da

aterosclerose (Abeywardena et al., 2009). Desta maneira, o polimorfismo da posição –174 é

um dos mais estudados devido ao aumento dos níveis séricos e sua associação com

manifestações da doença arterial coronariana (Brull et al., 2001; Myśliwska et al., 2006;

Abeywardena et al., 2009).

Antonicelli et al. (2005) relataram que o genótipo 174*G em homozigose é um fator

de risco para homens de idade avançada desenvolverem infarto agudo do miocárdio e angina

instável. Outro estudo, realizado por Giacconi et al. (2004), mostrou que pacientes com

aterosclerose e homozigotos para o alelo 174*G apresentaram um grau maior de inflamação

nas artérias e níveis mais elevados de TNF-α e, consequentemente, maior risco de rutura da

placa do que os com genótipo CC ou CG de IL-6.

Em modelos animais, macrófagos e células espumosas da placa de ateroma produzem

IL-8 e este mecanismo pode ser induzido pela quantidade de colesterol existente no interior

dos macrófagos (Wang et al., 1996). Estudos in vitro e in vivo mostram o aumento nos níveis

séricos da IL-8 em indivíduos com doença arterial coronariana e também como efeito adverso

após infarto agudo do miocárdio (Kanda et al., 1996; Dominguez-Rodriguez et al., 2006;

Vogiatzi et al., 2008).

Pieniazek et al. (2001) encontraram níveis de IL-8 significativamente altos no plasma

de pacientes com doença arterial coronariana que apresentaram anticorpos para C.

pneumoniae. No mesmo estudo também foram encontrados níveis mais altos de PrtCR nos

pacientes, porém, sem um resultado estatisticamente significante. Simonini et al. (2000)

encontraram altos níveis de expressão do mRNA da IL-8 em indivíduos submetidos à

aterectomia coronariana.

35

Vogiatzi et al. (2008) pesquisaram a influência dos polimorfismos da IL-8 na

suscetibilidade à doença arterial coronariana e mostraram que o haplótipo AA251TT781 foi

mais frequente em pacientes com síndrome coronária aguda do que naqueles com doença

coronariana estável, sugerindo que a diversidade genética da IL-8 pode influenciar nas

manifestações clínicas da doença.

Com relação ao processo de aterosclerose, ainda não está totalmente esclarecido se a

variabilidade genotípica da IL-10 pode influenciar diretamente no grau de inflamação

presente nos pacientes com doença cardiovascular. Uyemura et al. (1996) observaram a

expressão de IL-10 em algumas placas de ateroma acompanhada de um equilíbrio na secreção

de IL-12 e redução dos danos teciduais. As atividades inibitórias desta citocina ocorrem por

meio de vias de sinalização que agem tanto no silenciamento de fatores de transcrição como

na desestabilização de mRNA (fase pós-transcricional) dos componentes inflamatórios do

sistema imunológico (O'Farrell et al., 1998).

O fato de a IL-10 apresentar uma função de bloqueio da maioria das citocinas pró-

inflamatórias chamou a atenção para a pesquisa cardiovascular. Estudos experimentais

observaram que a administração de IL-10 inibiu o desenvolvimento da aterosclerose em

camundongos, além de promover uma estabilidade de placas de ateroma em estágio avançado

(Caligiuri et al., 2003). Um intenso efeito anti-aterosclerótico foi observado no estudo de Von

der Thusen et al. (2001) quando descreveram que camundongos sem os receptores de LDL,

ao serem submetidos a uma hiper-expressão de IL-10 (seja endotelial ou sistêmica),

apresentaram um quadro de aterosclerose inibido.

Os achados de estudos experimentais são confirmados por alguns estudos in vitro que

mostram a IL-10 inibindo moléculas como CD18 e CD62-L, o que impede a adesão de

monócitos ao tecido endotelial. Esta adesão de monócitos é o primeiro passo para o

recrutamento e invasão da parede vascular por células do sistema imunológico (Girndt &

Kholer, 2003). Outra propriedade associada a IL-10 é o bloqueio de enzimas envolvidas com

a desestabilização da placa de ateroma como as metaloproteinases que são responsáveis por

degradar a matriz extracelular enfraquecendo os vasos e a placa (Lacraz et al., 1995).

Estudos em camundongos demonstram que a infecção por C. pneumoniae pode

estimular o aumento nos níveis de proteínas de fase aguda e citocinas como IL-10 em até 72h

após a infecção intranasal, contribuindo para a progressão de lesões ateroscleróticas

(Campbell et al., 2010). Schumacher et al. (2005) avaliaram a soropositividade para

Chlamydia em pacientes coronarianos e observaram que pacientes com anticorpos contra o

36

LPS de C.pneumoniae apresentaram altos níveis séricos de TNF-α, IL-10, IFN-γ e adesinas

enquanto paciente com anticorpos contra a MOMP não apresentaram elevação significante.

Todos estes achados sugerem uma influência dos polimorfismos genéticos da PrtCR,

TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10 no desenvolvimento da aterosclerose, assim como alguns estudos

associam também a infecção por Chlamydia como um fator associado a patogênese desta

doença, ainda que exista uma maior necessidade de avaliar de forma conjunta tanto a presença

destes polimorfismos, como a de marcadores de infecção pela bactéria com o objetivo de se

entender se este agente apresenta um papel causal ou de complicador no curso da

aterosclerose.

37

1.8. OBJETIVOS

1.8.1. Objetivo Geral

Investigar a participação da C. pneumoniae e da C. trachomatis e o perfil genético do

hospedeiro na etiologia da formação do ateroma em indivíduos com doença cardíaca.

1.8.2. Objetivos Específicos

- Descrever as características sociais e demográficas de pacientes com doença

cardíaca;

- Descrever e comparar a frequência de anticorpos contra C. trachomatis e C.

pneumoniae nos diferentes grupos populacionais estudados;

- Detectar a presença da infecção por C. trachomatis e C. pneumoniae em diferentes

tipos de amostras de pacientes apresentando doença cardíaca;

- Descrever os polimorfismos de região promotora dos genes de PrtCR, IL-6, TNF-α,

IL-8 e IL-10 nos diferentes grupos estudados;

- Buscar associação entre os diferentes genótipos encontrados com a presença de

anticorpos para C. trachomatis e C. pneumoniae;

- Quantificar os níveis plasmáticos de PrtCR e IL-6, e os níveis de expressão gênica

de TNF-α, IL-8 e IL-10;

- Buscar associação entre os níveis plasmáticos, expressão gênica, perfil genotípico e a

presença de anticorpos para C. trachomatis e C. pneumoniae.

38

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. POPULAÇÃO EXAMINADA

Neste estudo transversal do tipo caso-controle, foi incluído um grupo de pacientes com

doença arterial coronariana apresentando quadro de obstrução arterial grave com ou sem

isquemia (infarto) e outro grupo de pacientes com quadro de valvulopatia cardíaca,

apresentando um quadro de sobrecarga de volume e pressão cardíaca. Os pacientes com

doença coronariana possuíam indicação para cirurgia de revascularização miocárdica e os

pacientes com valvulopatia possuíam indicação cirúrgica para implante de prótese valvular

(mitral ou aórtica).

Os critérios de inclusão dos pacientes foram: indivíduos internados com indicação

para um dos procedimentos cirúrgicos pela primeira vez e a ausência do uso de antibióticos.

Foram excluídos indivíduos com quadros clínicos dentro do interesse do projeto, porém sem

indicação para cirurgia, indivíduos indicados para cirurgia de repetição e os que estavam

submetidos a antibióticos no pré-operatório.

As amostras foram coletadas obedecendo aos cálculos de amostragem usando o

programa BioEstat versão 5.3 (Ayres et al., 2011), utilizando o cálculo para o tamanho

amostral para proporções (uma amostra), com poder de teste de 0,90 e nível alfa de 0,01. A

estimativa do estudo foi de incluir pelo menos 100 pessoas apresentando quadro de doença

arterial coronariana e foi obtido um total de 159 pacientes deste grupo. Para o grupo de troca

de válvula a estimativa de coleta era de 50 pacientes, sendo que foram obtidos 71 pacientes

deste grupo.

Foi formado um grupo controle com 300 indivíduos doadores de sangue oriundos do

Centro de Hemoterapia e Hematologia do Pará – Fundação HEMOPA com finalidade de

comparar a freqüência da presença de anticorpos, dos polimorfismos, os níveis plasmáticos e

a expressão gênica. O grupo de doadores de sangue foi pareado por sexo e idade com o grupo

de pacientes do estudo e durante o exame clínico os indivíduos não apresentavam histórico e

sintomas sugestivos de doença cardíaca.

Todos os indivíduos do estudo (pacientes e controle) tomaram conhecimento sobre o

projeto e aqueles que concordaram em participar do estudo assinaram um Termo de

Consentimento Livre e Esclarecido, TCLE (Apêndice 01). O grupo de pacientes ainda

respondeu um questionário epidemiológico para obtenção de informações cadastrais,

demográficas, socioeconômicas e comportamentais (Apêndice 02).

39

2.2. OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS

As amostras de pacientes foram coletadas em tres hospitais da cidade de Belém:

Fundação Hospital das Clínicas Gaspar Viana, Hospital da Ordem Terceira e Hospital

Beneficente Portuguesa. O período de coleta destas amostras foi de novembro de 2010 a julho

de 2012. O grupo controle foi coletado no período de junho a outubro de 2012.

Para ambos os grupos (pacientes e controle), foi coletada uma amostra de sangue (10

mL) por punção venosa, utilizando tubos a vácuo com anticoagulante (EDTA), com a

finalidade de dosagens bioquímicas, quantificação de linfócitos T CD4+ e TCD8+, detecção

de anticorpos para C. trachomatis e C. pneumoniae, análise de polimorfismos, dosagens

plasmáticas e da expressão de mRNA de marcadores da resposta inflamatória.

Fragmentos de placa de ateroma, artéria aorta, bem como da válvula cardíaca foram

obtidos de determinados pacientes quando possível, durante o procedimento cirúrgico. Dos

159 pacientes submetidos à revascularização do miocárdio, foi possível coletar placas de

ateroma de 20 indivíduos (12,6%), através de endarterectomia de coronária. Foi possível

coletar fragmentos de aorta de outros 35 indivíduos (22%) durante o processo de anastomose

proximal da aorta ascendente. Dos 71 pacientes submetidos à troca de válvula, foi possível

coletar 26 fragmentos de válvula (36,6%), totalizando uma coleta total de 81 fragmentos de

tecido (35,2%). Tanto as amostras de sangue (pacientes e controle) como os fragmentos

cirúrgicos dos pacientes foram encaminhadas ao Laboratório de Virologia do Instituto de

Ciências Biológicas da UFPA, conservadas em um total de 1,2 mL de conservante de material

genético RNAlater® (Invitrogen, EUA), e estocadas a -70 oC até o momento do uso.

2.3. ENSAIOS SOROLÓGICOS PARA DETECÇÃO DE ANTICORPOS PARA C.

TRACHOMATIS E C. PNEUMONIAE

2.3.1. Ensaio Imunoenzimático (EIE)

Para a detecção de anticorpos anti-C. trachomatis e anti-C. pneumoniae foi utilizado o

ensaio imunoenzimático indireto qualitativo, do tipo ELISA – NovaLisa TM - Chlamydia

trachomatis IgG e IgM (NovaTec Immundiagnostica GmbH, Germany) e para Chlamydia

pneumoniae o teste - NovaLisa TM - Chlamydia pneumoniae IgG e IgM (NovaTec

Immundiagnostica GmbH, Germany) de acordo com as instruções do fabricante. O ensaio de

C. trachomatis utiliza antígenos purificados do sorotipo L2 (cepa 434) aderidos ao fundo da

placa. O ensaio de C. pneumoniae utiliza antígenos purificados da cepa TWAR-183.

40

2.3.2. Microimunofluorescência (MIF)

Uma amostragem de pacientes (35%) teve seus plasmas submetidos à confirmação do

resultado do ELISA através da MIF, em diluição inicial de 1:8 em solução salina tamponada.

Para realização da técnica, as lâminas foram preparadas no Laboratório de Virologia,

utilizando-se como antígenos, corpúsculos elementares e quinze sorotipos C. trachomatis e

antígeno da C. pneumoniae (Washington Research Foundation, Seatle, Washington, USA). O

teste seguiu uma metodologia padronizada e aplicada anteriormente (Ishak & Ishak, 2001).

Volumes de 0,1mL de suspensões de gema de ovo foram adicionado a iguais volumes

de suspensões antigênicas e homogeneizadas em vórtex com o objetivo de facilitar a fixação

da suspensão de antígeno sobre a lâmina e a visualização do material ao microscópio. Para

elaboração das lâminas, foi utilizado um molde com quinze pontos divididos, com um

espaçamento mínimo de 5 mm de distância, para orientar a distribuição dos antígenos. Com o

auxílio de uma pena para tinta nanquim (Hunt Artist’s Pens 104 n 9404), cada um dos quinze

antígenos foi distribuído sobre a lâmina e após 30 minutos de secagem, a temperatura

ambiente, as lâminas foram fixadas em acetona, durante 15 minutos, em temperatura

ambiente.

Após o preparo, o soro diluído a 1:8 foi depositado sobre cada um dos sorotipos; as

lâminas, então, foram incubadas a 37 °C, em câmara úmida, durante 30 minutos e após esse

período foram lavadas em PBS por quatro vezes por 5 minutos e em seguida lavadas tres

vezes em água destilada por 1 minuto. Após a lavagem, foi realizada a adição do conjugado

(previamente titulado), com atividade específica anti-IgG/IgM humana, acrescido com

isotiocianato de fluoresceína (FITC). Em seguida, as lâminas foram incubadas novamente e

sequencialmente submetidas a um novo ciclo de lavagens e montagem, utilizando glicerina

tamponada (pH 9,0). As lâminas foram visualizadas em microscópio de fluorescência

(Olimpus BX41, Brasil) e as amostras que mostraram fluorescência clara, nítida e esverdeada

frente a qualquer um dos sorotipos foram consideradas positivas. Foi levando em

consideração o número de CE apresentando fluorescência e a intensidade da mesma.

41

2.4. IDENTIFICAÇÃO DA INFECÇÃO POR C. TRACHOMATIS E C. PNEUMONIAE

2.4.1. Extração de DNA

Para a extração de DNA a partir dos fragmentos teciduais obtidos por cirurgia, foi

utilizado o kit de extração de ácido nucléico QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Germany)

seguindo as instruções do fabricante.

2.4.2. PCR em Tempo Real

A presença de C. pneumoniae e C. trachomatis nos 81 fragmentos de tecido foi

pesquisada por meio da técnica de PCR em tempo real utilizando o kit Real Time Q-PCR

Alert Kit (Nanogen Advanced Diagnostic, Italy). Para o kit de detecção de C. trachomatis, foi

feita uma reação de amplificação específica para a região do plasmídeo inerte (cryptic

plasmid) (cerca de 7-10 cópias/célula). Para a C. pneumoniae foi feita uma reação para uma

região específica do gene ompA. Todas as reações foram acompanhadas de um controle

positivo para cada espécie, controle negativo, além de um controle interno de β-globina. Os

parâmetros de amplificação aceitáveis do kit estão demonstrados na Tabela 1. O aparelho

utilizado nas reações foi o Step One PLUS Sequence Detector (PE Applied Biosystems,

Foster City, CA, E.U.A.) seguindo o protocolo do fabricante.

Tabela 1 – Requisitos de amplificação de C. trachomatis e C. pneumoniae por PCR em tempo real.

Ciclo limiar da amostra

Adequação da amostra Resultado do teste

DNA de C. trachomatis

C. pneumoniae

C. trachomatis C. pneumoniae

(FAM)

B- globina (VIC)

Indeterminado CT>35/indeterminado Inadequada Inválido ---

CT≤35 Adequada Válido, Negativo Não detectado

Determinado CT>35/indeterminado Adequada Válido, Positivo Presente

CT≤35 Adequada Válido, Positivo Presente

42

2.5. IDENTIFICAÇÃO DOS POLIMORFISMOS GENÉTICOS DE MARCADORES DA

RESPOSTA IMUNOLÓGICA E INFLAMATÓRIA

2.5.1. Extração de DNA

Todas as amostras de sangue foram submetidas à extração de DNA a partir de

leucócitos do sangue periférico. O método utilizado foi o de fenol-clorofórmio, cujo protocolo

foi adaptado (Sambrook & Russell, 2006), seguindo as etapas de lise celular, precipitação de

proteínas, precipitação e hidratação do DNA (Apêndice 3).

2.5.2. Identificação de Polimorfismo nos genes de PrtCR, TNF-α e IL-6

Para a análise de polimorfismos dos genes do PrtCR, TNF-α e IL-6, foi utilizada a

PCR convencional seguida de análise de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism),

em que o produto amplificado foi submetido a uma incubação com endonucleases de restrição

com posterior visualização e comparação dos tamanhos de fragmentos gerados. Foram

selecionadas para investigação regiões promotoras de cada gene. Para a PrtCR foi selecionado

o SNP rs2794521 (−717T>C); para o TNF-α foi selecionado o polimorfismo rs1800629

(−308G>A); para a IL-6 foi selecionado o polimorfismo rs1800795 (−174G>C).

As reações de amplificação foram adaptadas a partir de informações prévias (Allen et

al., 2000; Brull et al., 2003; Olomolaiye et al., 1998; Vogiatzi et al., 2008) (Tabelas 2, 3 e 4).

As amplificações foram realizadas no equipamento termociclador da Mastercycler Personal,

Eppendorf. Cada produto amplificado foi submetido à digestão enzimática com suas

respectivas endonucleases de restrição (Tabela 5) e foram visualizados após eletroforese (100

V/45 minutos) em gel de agarose a 3%, em tampão TAE 1x (TAE 40x estoque – TrisBase 1,6

M, Acetato de Na 0,8 M e EDTA-Na2 40 mM/1000 mL água desionizada), contendo 5 µL de

brometo de etídio (10mg/mL), mediante a utilização de transiluminador com fonte de luz

ultra-violeta.

43

Tabela 2 – Sequências dos iniciadores utilizados na amplificação dos genes de PrtCR, TNF-α e IL-6.

Sistema Sequência dos iniciadores

PrtCR -717 F: 5'-ACTGGACTTTTACTGTCAGGGC-3'

R: 5': -ATTCCCATCTATGAGTGAGAACCT-3'

TNF-α -308 F: 5'- AGG CAA TAG GTT TTG AGG GCC AT -3'

R: 5'- TCC TCC CTG CTC CGA TTC CG -3'

IL-6 -174 F: 5′-TTGTCAAGACATGCCAAGTGCT-3′

R: 5'-GCCTCAGAGACATCTCCAGTCC-3'

Tabela 3 – Protocolo de reação utilizada na amplificação dos genes de PrtCR, TNF-α e IL-6. Sistema Etapa 1 Etapa 2 Etapa 3 Etapa 4 Nº de Ciclos

Etapas 2-4

Etapa Final

PrtCR -717

95°C

5 min

95°C

30 seg

60°C

40 seg

72°C

1 min

40 ciclos 72°C

10 min

TNF-α -308 95°C

5 min

94°C

30 seg

53°C

30 seg

72°C

50 seg

30 ciclos 72°C

10 min

IL-6 -174 95°C

5 min

95°C

30 seg

59°C

45 seg

72°C

45 seg

35 ciclos 72°C

10 min

44

Tabela 4 – Concentração de reagentes utilizados por reação para amplificação dos genes de PrtCR, TNF-α e IL-6.

Reagentes TNF-α PrtCR IL-6

Tampão 1x 1x 1x

MgCl2 1,5mM 1,5mM 1,5mM

DNTP 200µM 200µM 200µM

Primer Direto

200nM 200nM 200nM

Primer Reverso

200nM 200nM 200nM

Taq 1,5U 2,5U 1,5U

DNA 100ng 100ng 100 ng

Tabela 5 – Endonucleases de restrição utilizadas na análise de RFLP para caracterização de polimorfismos de PrtCR, TNF-α e IL-6.

Sistema Enzima Genótipo Fragmentos gerados

PrtCR

BstUI

TT

CT

CC

297 e 244pb

541, 297 e 244pb

541pb

TNF-α

NcoI

GG

AG

AA

87 e 20pb

107, 87 e 20pb

107pb

IL-6

NlaIII

GG

GC

CC

169pb

169, 87 e 80pb

87 e 80pb

45

As Figuras 9, 10 e 11 demonstram os padrões de migração dos fragmentos após

amplificação, tratamento com enzimas de restrição e eletroforese, para os polimorfismos

genéticos de PrtCR, TNF-α e IL-6, respectivamente.

Figura 9 − Padrão de PCR-RFLP para o polimorfismo de PrtCR. (A): Produto da PCR de PrtCR em gel de agarose a 3%. 1) Marcador de peso molecular de 50 pb; 2-4) Produto amplificado apresentando 541 pb. (B): Produto de RFLP de PrtCR em gel de agarose 3%. 1) Marcador de peso molecular de 100 pb; 2) Padrão de migração para o genótipo TT ; 3) Padrão de migração para o genótipo CT; 4) Padrão de migração para o genótipo CC.

Figura 10 – Padrão de PCR-RFLP para o polimorfismo de TNF-α. (A): Produto da PCR de TNF-α em gel de agarose a 3%. 1) Marcador de peso molecular de 50 pb; 2-4) Produto amplificado apresentando 107 pb. (B): Produto de RFLP de TNF-α em gel de agarose 3%. 1) Marcador de peso molecular de 50 pb; 2) Padrão de migração para o genótipo GG ; 3) Padrão de migração para o genótipo AG; 4) Padrão de migração para o genótipo AA.

46

Figura 11 – Padrão de PCR-RFLP para o polimorfismo de IL-6. (A): Produto da PCR de IL-6 em gel de agarose a 3%. 1) Marcador de peso molecular de 50 pb; 2-4) Produto amplificado apresentando 169 pb. (B): Produto de RFLP de IL-6 em gel de agarose 3%. 1) Marcador de peso molecular de 50 pb; 2) Padrão de migração para o genótipo GG ; 3) Padrão de migração para o genótipo GC; 4) Padrão de migração para o genótipo CC. 2.5.3. Identificação de polimorfismo nos genes de IL-8 e IL-10

Para as citocinas IL-8 e IL-10, a metodologia utilizada para a caracterização dos

polimorfismos foi a PCR em Tempo Real usando ensaios pré-fabricados TaqMan® SNP

Genotyping Assays (Applied Biosystems, Foster City, CA, E.U.A.) (Tabela 6). Para IL-8 foi

selecionado o SNP rs4073 (−251T>A). Para a IL-10 foi selecionado o polimorfismo

rs1800896 (−1082A>G). As reações ocorreram no aparelho StepOnePLUS™Real-Time PCR

System (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). As temperaturas seguiram as orientações

do fabricante: 10 minutos a 95 °C, 15 segundos a 95 °C e 1 minuto a 60 °C, em um total de 40

ciclos.

Tabela 6 – Ensaios utilizados para identificação de polimorfismos de região promotora de IL−8 e IL−10.

Sistema Identificação do SNP (rs) Identificação do ensaio IL-8 rs4073 C_11748116_10

IL-10 rs1800896 C_1747360_10

47

2.6. DOSAGEM DE NÍVEIS PLASMÁTICOS DE PrtCR E IL-6

Todas as dosagens foram realizadas em amostra de plasma, os quais foram

descongelados apenas no momento do uso. A dosagem de PrtCR foi realizada nas 230

amostras de pacientes (159 de RM e 71 de TV) e em 196 indivíduos do grupo controle

selecionados aleatoriamente, por meio do método de imunoturbidimetria utilizando-se o kit

PCR-U hs DiaSys® em sistema automatizado Architect c8000/Abbott®. Os testes foram

realizados no Laboratório de Análises Clínicas do Hospital Universitário João de Barros

Barreto da UFPA, Belém, Pará.

A dosagen de IL-6 foi realizada em 33 amostras dos pacientes (19 de RM e 14 de TV)

e em 28 indivíduos do grupo controle em duplicata por meio de um ELISA do tipo sanduíche,

utilizando-se o kit Human IL-6 ELISA (Novex®, Life Technologies) que utiliza anticorpos

monoclonais específicos para IL-6 aderidos no fundo de cada poço da placa. Os testes foram

realizados no Laboratório de Virologia da UFPA, obedecendo as instruções do fabricante.

Todas as amostras foram selecionadas seguindo os critérios descritos na seção 2.7, exceto a

dosagem de PrtCR.

2.7. QUANTIFICAÇÃO RELATIVA DE mRNA de TNF-α, IL-8 e IL-10 PARA

AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA

2.7.1. Seleção de amostras

A quantificação relativa de mRNA de TNF-α, IL-8 e IL-10 foi feita a partir de uma

seleção de amostras, obedecendo critérios de presença de anticorpos para Chlamydia e o

perfil genotípico dos polimorfismos (amostras não-probabilísticas selecionadas por cotas). As

amostras foram categorizadas inicialmente em: 1) positivas apenas para C. trachomatis; 2)

positivas apenas para C. pneumoniae; 3) positivas para ambas as espécies; 4) negativas para a

presença de anticorpos para Chlamydia. Em cada um destes grupos foram selecionadas tres

amostras de cada genótipo, de forma aleatória, com o auxílio do programa BioEstat 5.3

(Ayres et al., 2011).

2.7.2. Extração de RNA Total

O RNA foi extraído a partir da camada leucocitária do sangue periférico utilizando-se

o kit de Extração de RNA Total RNA purification kit (Norgen, Biotek Corporation®, Canadá)

seguindo as instruções do fabricante.

48

A concentração do RNA extraído (ng/µL) foi obtida por análise no fluorímetro

QubitTM Quantitation Platform (Invitrogen®, EUA) de acordo com as especificações do

fabricante. A integridade do RNA foi observada em gel de agarose a 1% corado com brometo

de etídio. Após a verificação da concentração e integridade as amostras de RNA total tiveram

sua concentração igualadas a 60ng/µL para posterior síntese de cDNA.

2.7.3. Transcrição Reversa para a Síntese de DNA Complementar (cDNA)

O RNA extraído foi convertido em cDNA utilizando o kit High Capacity cDNA

Reverse Transcription with RNAse Inhibitor (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA).

Para cada reação foi utilizado o equivalente a 1µg do RNA total, 2µL de 10X RT Buffer, 0,8

µL de 25X dNTP Mix (100nM), 2µL de 10X RT Random Primer, 1 µL de MultiScribeTM

Reverse Transcriptase, 1 µL de RNaseOUTTM e 3,2 µL de água ultra-pura, totalizando um

volume final de 20 μL.

A reação ocorreu em termociclador da Mastercycler Personal, Eppendorf, com

programação para um ciclo de 10min a 25 °C seguido de duas horas a 37 °C, com temperatura

final de 85 °C por 5min. O cDNA foi posteriormente estocado a -20 °C até o momento do

uso.

2.7.4. Teste de Eficiência dos Ensaios de PCR em Tempo Real

A avaliação dos níveis de expressão dos genes de interesse ocorreu por meio da

quantificação relativa do mRNA de cada gene, utilizando-se como método a PCR em Tempo

Real. A quantificação relativa da expressão dos genes estudados foi feita utilizando-se o

método de CT comparativo ou ∆∆Ct (Livak & Schmittgen, 2001). Neste tipo de quantificação

são verificados os níveis de expressão gênica de uma determinada amostra em relação à outra

amostra (denominada de referência) (Livak & Schmittgen, 2001), sendo necessária a seleção

de um gene normalizador como referência de expressão constitutiva entre as diferentes

amostras testadas. Neste estudo, o gene de referência selecionado foi o Gliceraldeído-3-

fosfato desidrogenase (GAPDH).

Foram utilizados os ensaios Taqman® Gene Expression Assay (Applied Biosystems,

Foster City, CA, EUA) que são pré-fabricados e contém iniciadores e sondas específicos para

cada gene (Tabela 7). Os iniciadores e sondas para o gene GAPDH estão representados na

Tabela 8. Os ensaios foram submetidos a uma validação onde foi possível observar que a

eficiência das amplificações tanto dos genes alvos como do gene referência foram

49

aproximadamente iguais, condição que funciona como um requisito que para permitir o uso

do método CT comparativo na população examinada.

Para o cálculo da eficiência foi utilizada a equação E= 10(−1/slope), onde “E” representa

a eficiência; e slope representa um fator que mede a taxa de aumento do amplicon a cada ciclo

durante a fase exponencial de amplificação.

Tabela 7 – Identificação dos ensaios utilizados para PCR em Tempo Real Quantitativo.

Sistema Método Especificação do Método

TNF-α TaqMan Gene Expression Assays

Hs00174128_m1

IL-8 TaqMan Gene Expression Assays

Hs00174103_m1

IL-10 TaqMan Gene Expression Assays

Hs00174086_m1

Tabela 8 – Identificação de iniciadores e sonda para amplificação do gene referência GAPDH.

Sistema GAPDH Sequência nucleotídica

Iniciador Direto 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’

Iniciador Reverso 5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’

Sonda 5’-(F)-CAAGCTTCCCGTTCT CAGCC-(T) -3

2.7.5. PCR em Tempo Real Quantitativo

Os ensaios de expressão dos genes alvos e do gene referência, tanto dos pacientes

como do grupo controle, foram realizados em poços separados (singleplex), conforme

protocolo estabelecido pelo fabricante, sendo que cada amostra foi testada em triplicata.

Foram considerados valores de CT válidos somente naqueles em que o desvio padrão foi

encontrado nas triplicatas foi menor que 0,5. As reações ocorreram no aparelho

StepOnePLUS™Real-Time PCR System (Appllied Biosystems, Foster City, CA, EUA). A

tabela 9 demonstra os volumes utilizados em cada reação tanto para a amplificação dos genes

alvos como para amplificação do GAPDH. As condições de termociclagem estabelecidas pelo

50

fabricante foram: um ciclo de 2 min a 50 °C seguido de 10 min a 95 °C, e mais 40 ciclos de

95 °C por 15 seg e 60 °C por 1min.

Tabela 9 – Volumes (µL) de reagentes utilizados por reação na PCR em Tempo Real Quantitativa.

Reagentes TNF-α IL-8 IL-10 GAPDH

Água 10,5 10,5 10,5 9,5

TaqMan® Master Mix 15 15 15 15

Ensaio (Primer+Sonda)

1,5 1,5 1,5 -

Primer Direto - - - 1,0

Primer Reverso - - - 1,0

Sonda - - - 0,5

DNA 3,0 3,0 3,0 3,0

Total 30 µL 30 µL 30 µL 30µL

As análises de quantificação relativa pelo método de CT comparativo foram feitas

utilizando a equação RQ: 2-∆∆CT onde o ∆CT de uma determinada amostra, bem como da

amostra referência é:

∆CT: CT Gene de interesse - CTGAPDH

Portanto, o ∆∆CT: ∆CT da amostra - ∆CT da amostra referência. As análises foram

feitas no software Step One TM vs.2.0 (Appllied Biosystems, Foster City, CA, EUA).

2.8. MÉTODOS ESTATÍSTICOS

Todas as informações obtidas por meio do questionário epidemiológico foram

inseridas em um banco de dados criado no programa Microsoft Acess vs. 2007. Para comparar

os resultados sorológicos entre os diferentes grupos examinados foi realizado o teste de Qui-

quadrado. Para avaliar se as frequências genotípicas estavam dentro da uma distribuição

normal foi realizado o cálculo do equilíbrio de Hardy-Weinberg. A comparação entre os

diferentes genótipos de marcadores pró e anti-inflamatórios e os marcadores sorológicos de

51

infecção por C. trachomatis e C. pneumoniae foi feita pelo do Teste Odds Ratio. Para associar

os níveis plasmáticos, de expressão gênica de marcadores pró e anti-inflamatórios com os

marcadores sorológicos de infecção por C. trachomatis e C.pneumoniae foram utilizados os

testes não paramétricos Kruskall-Wallis e Mann-Whitney. Foram consideradas associações

significantes aquelas com valor de p<0,05. Todos os testes foram efetuados por meio do

programa BioEstat 5.3 (Ayres et al., 2011).

2.9. ASPECTOS ÉTICOS

O projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Centro de

Hemoterapia e Hematologia do Pará – Fundação Hemopa e obedeceu as resoluções vigentes

196/1996 e 347/2005, ambas do Conselho Nacional de Saúde, conforme cópia de parecer em

anexo (Anexo 01). Todas as amostras foram obtidas mediante a assinatura de um Termo de

Consentimento Livre e Esclarecido (Apêndice 01).

52

3. RESULTADOS

3.1. CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO ESTUDADA

3.1.1. Perfil demográfico e social dos pacientes com doença cardíaca e grupo controle

O grupo de pacientes coronarianos indicados para revascularização miocárdica (RM)

(n=159) foi constituído de 109 homens e 50 mulheres, enquanto o grupo submetido à cirurgia

para troca de válvula mitral ou aórtica (TV) (n=71) foi formado por 30 homens e 41 mulheres

(Tabela 10). A faixa etária do grupo RM variou de 36 a 79 anos, com média de 60,4 anos. No

grupo de TV, a idade variou de 14 a 80 anos, com média de 45,6 anos.

A maioria dos pacientes de RM (69,9% - 107/153) declarou seu estado civil como

casado. Para o grupo de TV, a maior frequência foi de solteiros (44,9% - 31/69) (Tabela 10).

Em ambos os grupos foi observado que a maior frequência possuía nível fundamental

incompleto (49,7% - 78/157 e 48,6% - 34/70, respectivamente) e a maioria relatou ser

paraense, (79,2% - 118/149 e 75,7% - 53/70, respectivamente). A renda familiar variou de

menos de um salário mínimo até quatro ou mais salários, sendo que a maioria foi incluída em

uma faixa de um a tres salários (Tabela 10).

O grupo controle foi constituído de 150 (50%) homens e 150 (50%) mulheres com

idade que variou de 24 até 68 anos com média de 40,3 anos.

53

Tabela 10 – Características demográficas e sociais de pacientes cardíacos atendidos em três unidades hospitalares e um grupo controle em Belém, PA.

*Não considerado para o cálculo estatístico

Características demográficas e sociais

Revascularização Miocárdica

(RM) n=159 n (%)

Troca de Válvula

(TV) n=71 n (%)

Grupo Controle

n=300 n(%)

Sexo Masculino 109 (68,5) 30 (42,3) 150(50,0) Feminino 50 (31,5) 41 (57,7) 150(50,0) Faixa etária <40 anos 4 (2,5) 28 (39,5) 182(60,7) 41 a 50 anos 21 (13,2) 16 (22,5) 72(24,0) >51 anos 134 (84,3) 27 (38,0) 46(15,3) Estado civil Solteiro 20 (13,1) 31 (44,9) --- Casado 107 (69,9) 28 (40,6) --- Divorciado/Viúvo 26 (17) 10 (14,5) --- Sem informação 6 2 --- Escolaridade Não alfabetizado 10 (6,4) 7 (10) --- Alfabetizado 16 (10,2) 3 (4,3) ---

Fundamental incompleto 78 (49,7) 34 (48,6) ---

Fundamental completo 20 (12,7) 4 (5,7) ---

Médio incompleto 10 (6,4) 9 (12,9) --- Médio completo 19 (12,1) 11 (15,7) --- Superior incompleto 0 (0,0) 1 (1,4) --- Superior completo 4 (2,5) 1 (1,4) --- Sem informação 2 1 --- Naturalidade Pará 118 (79,2) 53 (75,7) --- Outros 31 (20,8) 17 (24,3) --- Sem informação 10 1 ---

Renda familiar

<1 salário 22 (14,5) 18 (26,1) --- 1 a 3 salários 108 (71) 50 (72,5) --- ≥ 4 salários 22 (14,5) 1 (1,4) --- Sem informação 7 2 ---

54

3.2. SOROPREVALÊNCIA DE ANTICORPOS PARA C. TRACHOMATIS E C.

PNEUMONIAE EM PACIENTES COM DOENÇA CARDÍACA E NO GRUPO

CONTROLE

A soroprevalência de anticorpos para C. trachomatis e C. pneumoniae foram obtidas

por ELISA e confirmadas pela MIF, onde se observou total concordância entre as técnicas

descartando a possibilidade de reações cruzadas. Os resultados sorológicos estão

demonstrados na Tabela 11. Os casos com sorologia indeterminada foram excluídos na

realização de testes estatísticos.

A presença de anticorpos (IgG e/ou IgM) para C. trachomatis foi observada em

30,6% (48/157) dos pacientes submetidos à revascularização. Os pacientes submetidos à troca

de válvula apresentaram uma prevalência de 20,3% (14/69). No grupo controle foi observada

uma prevalência de 36,7% (103/281) que mostrou uma frequência de anticorpos

significativamente maior quando comparado aos pacientes com valvulopatias (p=0,014).

A prevalência de anticorpos (IgG e/ou IgM) para C. pneumoniae foi de 83,6%

(133/159) entre os pacientes submetidos à revascularização, 84,5% (60/71) entre os pacientes

de troca de válvula. O grupo controle apresentou uma prevalência de 80,3% (237/295).

Tabela 11 – Frequência de anticorpos para C. trachomatis e C. pneumoniae entre pacientes e o grupo controle.

Resultados Sorológicos

RM n=159 n(%)

TV n=71 n(%)

Controle n=300 n(%)

p1 p2 p3

Positivo 48(30,6) 14(20,3) 103(36,7) 0,2383 0,014 0,1516

C. trachomatis Negativo 109(69,4) 55(79,7) 178(63,3)

Indeterminado* 02(1,2) 02(2,8) 19(6,3)

Positivo 133(83,6) 60(84,5) 237(80,3) 0,4596 0,5240 0,9757

C. pneumoniae Negativo 26(16,4) 11(15,5) 58(19,7)

Indeterminado* - - 05(3,3)

* Não considerado para cálculo estatístico RM= Revascularização Miocárdica; TV= Troca de Válvula; p1= RM vs. Controle; p2= TV vs. Controle; p3= RM vs. TV

55

3.3. PRESENÇA DE DNA DE C. TRACHOMATIS E C. PNEUMONIAE EM

FRAGMENTOS TECIDUAIS DE PACIENTES COM DOENÇA CARDÍACA

Dentre as 81 amostras de fragmentos de tecido submetidas a PCR em tempo real, não

foi observada detecção de DNA de C. pneumoniae em nenhuma das amostras, entretanto, o

DNA do plasmídio críptico de C. trachomatis foi detectado em seis amostras (7,4%).

Dentre as seis amostras, quatro eram provenientes de fragmentos de aorta e duas de

válvula mitral (Tabela 12). Não foi detectada a presença de DNA em placas de ateroma. A

comparação entre os resultados moleculares e sorológicos é observada na tabela 12. As curvas

de amplificação dos controles e amostras tanto para o gene da β-globina como para o alvo das

clamídias está representado nas Figuras 12.

Tabela 12 – Descrição dos resultados sorológicos para C. trachomatis em pacientes cardíacos com amostras teciduais positivas para o DNA do plasmídio críptico de C. trachomatis.

RM= Revascularização Miocárdica; TV= Troca de Válvula

Paciente Amostra Resultado Sorológico

Resultado (qPCR) C. trachomatis IgG C.trachomatis IgM

RM Aorta positivo negativo positivo



RM Aorta negativo positivo positivo

TV V. Mitral negativo positivo positivo

TV V. Mitral positivo negativo positivo

56

Figura 12 – Curva de amplificação de PCR em tempo real para C. pneumoniae e C.trachomatis. (A): Controle positivo para C.pneumoniae e C.trachomatis, respectivamente. (B): Amostras negativas para C.trachomatis com amplificação do controle interno de β−globina. (C): Amostras negativas para C.pneumoniae com amplificação do controle interno de β−globina. (D): Amostras positivas para C.trachomatis.

57

3.4. CARACTERIZAÇÃO DOS POLIMORFISMOS DE PrtCR, TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10

EM PACIENTES CARDÍACOS E NO GRUPO CONTROLE

A distribuição da frequência de genótipos e alelos nos tres grupos investigados é

apresentada na Tabela 13. As frequências genotípicas tanto da população de pacientes (RM e

TV) como do grupo controle estavam em equilíbrio de Hardy-Weinberg (p>0,01); exceto o

polimorfismo de IL-6 (rs1800795) em que os dois grupos de pacientes cardíacos apresentaram

uma quantidade maior do genótipo GG em relação aos demais (p<0,0001). A frequência

observada de genótipo GC foi menor do que a frequência esperada (p<0,0001).

A análise de Odds Ratio (OR) mostra que para IL-6, existe um número muito maior do

genótipo GG nos grupos RM e TV quando comparado com o grupo controle (84,28%,

84,51% e 69%, respectivamente) e esta diferença indica que portadores do alelo G em

homozigose apresentam duas vezes mais chances de desenvolver doença cardíaca

(coronariana e valvulopatia) do que os portadores de outros genótipos. Observa-se ainda uma

diferença na distribuição do genótipo heterozigoto (GC) entre os mesmos grupos

(RM=11,95%, TV=9,86% e Controle=28,33%) que, apararentemente, protege o indivíduo e

diminui as chances de desenvolvimento de doença cardíaca (valores de OR menores que 1 e

significância estatística) (Tabela 13).

A distribuição dos genótipos para o polimorfismo de IL-8 (rs4073) mostrou uma

frequência proporcional maior do genótipo AT no grupo controle e que foi estatisticamente

significante (p=0,0200) quando comparado com o grupo de TV (50%, 33,80%,

respectivamente). A comparação de frequências do genótipo AA entre os grupos TV

(28,17%) e RM (15,09%) também se mostrou estatisticamente significativa (p=0,0318).

58

Tabela 13 – Distribuição genotípica e alélica dos polimorfismos de PrtCR, TNF-α, IL-6, Il-8 e IL-10 entre pacientes cardíacos e um grupo controle em Belém, PA.

n= número de indivíduos analisados; OR= valor de Odds Ratio; p1: valor de p da Revascularização vs. Grupo Controle; p2: valor de p da Troca de válvula vs. Controle; p3: valor de p da Revascularização vs. Troca de válvula.

Perfil Genotípico e Alélico

Revascularização (n:159) n (%)

Troca de válvula (n:71) n (%)

Controle (n:300) n (%)

OR (p1) OR (p2) OR (p3)

PrtCR rs2794521 (T>C) TT 98 (61,64) 41 (57,75) 189 (63,00) 0,9435 (0,8524) 0,8026 (0,4939) 1,1755 (0,6809) CT 54 (33,96) 29 (40,84) 103 (34,33) 0,9836 (0,9811) 1,0463 (0,9711) 0,7448 (0,3923) CC 7 (4,40) 1 (1,41) 8 (2,67) 1,6809 (0,4719) 1,3206 (0,3720) 3,2237 (0,4501) *T 250 (78,62) 111 (78,17) 481 (80,17) 0,9096 (0,6392) 0,8859 (0,6768) 0,9739 (0,9881) *C 68 (21,38) 31 (21,83) 119 (19,83)

TNF-a rs1800629 (G>A) GG 112 (70,44) 50 (70,42) 222 (74,00) 0,8373 (0,4808) 0,8366 (0,6429) 1,0009 (0,8779) AG 43 (27,04) 20 (28,17) 69 (23,00) 1,2410 (0,3977) 1,3129 (0,4457) 0,9453 (0,9867) AA 4 (2,52) 1 (1,41) 9 (3,00) 0,8344 (0,9985) 0,4619 (0,7360) 1,8065 (0,9661) *G 267 (83,96) 120 (84,51) 513 (85,5) 0,8879 (0,6008) 0,9250 (0,8660) 0,9598 (0,9923) *A 51 (16,04) 22 (15,49) 87 (14,5)

IL-6 rs1800795 (G>C) GG 134 (84,28) 60 (84,51) 207 (69,00) 2,4081 (0,0006) 2,4506 (0,0135) 0,9827 (0,8792) GC 19 (11,95) 7 (9,86) 85 (28,33) 0,3433 (0,0001) 0,2767 (0,0020) 1,2408 (0,8125) CC 6 (3,77) 4 (5,63) 8 (2,67) 1,4314 (0,7107) 2,1791 (0,3693) 0,6569 (0,7725) *G 287 (90,25) 127 (89,44) 499 (83,17) 1,8739 (0,0049) 1,7137 (0,0852) 1,0935 (0,9196) *C 31 (9,75) 15 (10,56) 101 (16,83)

IL-8 rs4073 (T>A) TT 59 (37,11) 27 (38,03) 96 (32,00) 1,2538 (0,3187) 1,3040 (0,4065) 0,9615 (0,9887) AT 76 (47,80) 24 (33,80) 150 (50,00) 0,9157 (0,7258) 0,5106 (0,0200) 1,7932 (0,0667) AA 24 (15,09) 20 (28,17) 54 (18,00) 0,8099 (0,5105) 1,7865 (0,0779) 0,4533 (0,0318) *T 194 (61,01) 78 (54,93) 342 (57,00) 1,1802 (0,2707) 0,9194 (0,7237) 1,2837 (0,2618) *A 124 (38,99) 64 (45,07) 258 (43,00)

IL-10 rs1800896 (A>G) AA 79 (49,69) 32 (45,07) 164 (54,67) 0,8189 (0,3581) 0,6804 (0,1854) 1,2035 (0,6141) AG 63 (39,62) 29 (40,85) 109 (36,33) 1,1499 (0,5542) 1,2099 (0,5682) 0,9504 (0,9768) GG 17 (10,69) 10 (14,08) 27 (9,00) 1,2105 (0,6751) 1,0504 (0,9379) 0,7303 (0,6054) *A 221 (69,5) 93 (65,49) 437 (72,83) 0,8498 (0,3219) 0,7079 (0,1015) 1,2004 (0,4570) *G 97 (30,5) 49 (34,51) 163 (27,17)

59

A tabela 14 mostra a comparação de genótipos e alelos levando em consideração os

diferentes grupos (RM, TV e controle) e a distribuição dos grupos de acordo com a presença

de anticorpos para C. trachomatis.

O genótipo GG de IL-6 apresentou frequência significativamente maior no grupo de

pacientes de RM quando comparados ao grupo controle (89,58%, 69,90%, respectivamente,

p=0,0148). Em contrapartida, o genótipo GC foi significativamente maior em sua frequência

no grupo controle do que no grupo de RM (28,16%, 6,25%, respectivamente, p=0,0043). A

frequência do alelo G foi significativamente maior no grupo de RM quando comparado com o

de TV (92,71%, 75%, respectivamente, p=0,0235).

A comparação entre indivíduos que não apresentavbam evidência de infecção prévia

por C. trachomatis, mostrou que o genótipo GG de IL-6 permaneceu em frequência

significativamente maior em pacientes do que no grupo controle (81,65%, 89,09% e 68,54%,

p=0,0211 e p=0,0045, respectivamente), enquanto este último grupo permaneceu

apresentando frequência significativamente maior do genótipo heterozigoto (14,68%, 7,27%,

28,65%, p=0,0101e p=0,0021, respectivamente) (Tabela 15). O genótipo AA de IL-8 mostrou

frequência significativamente maior nos pacientes submetidos a TV quando comparado aos

demais grupos (12,85%, 30,91% e 16,86%, p=0,0377). De forma contrária, o genótipo

heterozigoto estava em menor frequência no grupo de TV quando comparado aos demais

grupos (48,62%, 30,91% e 51,15%, p=0,0134 e p=0,0457).

A distribuição genotípica e alélica dos grupos de acordo com a presença de anticorpos

para C. pneumoniae está representada na tabela 16. O genótipo GG de IL-6 demonstrou

frequência significativamente maior no grupo de pacientes quando comparado com o grupo

controle (84,96%, 85,00% e 68,78%, p=0,0009 e p=0,0193, respectivamente), indicando um

risco duas vezes maior de desenvolvimento de doença cardíaca na presença de marcadores de

infecção prévia por C. pneumoniae. O genótipo GC foi significativamente maior em sua

frequência no grupo controle do que no grupo de RM e TV (11,28%, 8,83% e 28,69%,

p=0,0002 e p=0,0019).

O genótipo AT de IL-8 apresentou frequência significativamente maior no grupo

controle quando comparado com a o grupo de TV (49,37%, 30%, p=0,0109) enquanto o

genótipo AA teve maior frequência no grupo de TV do que no grupo de RM (30%, 15,79%,

p=0,0373). A comparação entre indivíduos que não apresentavam evidência de infecção

prévia por C.pneumoniae não demonstrou diferenças estatisticamente significantes entre os

diferentes grupos (Tabela 17).

60

Tabela 14 – Distribuição genotípica e alélica dos polimorfismos de PrtCR, TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10 de acordo com a presença de anticorpos para C.trachomatis em pacientes cardíacos e um grupo controle em Belém, PA.


Perfil Genotípico e Alélico

Revascularização C. trachomatis +

(n:48) n(%)

Troca de válvula C. trachomatis +

(n:14) n(%)

População Controle C. trachomatis +

(n:103) n(%)

OR (p1) OR (p2) OR (p3)

PrtCR rs2794521 (T>C) TT 31 (64,58) 7 (50,00) 65 (63,11) 1,0661 (0,9952) 0,5846 (0,5137) 1,8235 (0,5004) CT 14 (29,17) 7 (50,00) 35 (33,98) 0,8000 (0,6879) 1,9429 (0,3813) 0,4118 (0,2592) CC 3 (6,25) 0 (0,00) 3 (2,91) 2,2222 (0,5959) - - *T 76 (79,17) 21 (75,00) 165 (80,1) 0,9442 (0,9732) 0,7455 (0,7059) 1,2667 (0,8338) *C 20 (20,83) 7 (25,00) 41 (19,9)

TNF-a rs1800629 (G>A) GG 35 (72,91) 12 (85,71) 81 (78,64) 0,7312 (0,5693) 1,6296 (0,7931) 0,4487 (0,5292) AG 11 (22,91) 2 (14,29) 19 (18,45) 1,3144 (0,6730) 0,7368 (0,9924) 1,7838 (0,7452) AA 2 (4,16) 0 (0,00) 3 (2,91) 1,4493 (0,9304) - - *G 81 (84,38) 26 (92,86) 181 (87,86) 0,7459 (0,5153) 1,7956 (0,6450) 0,4154 (0,4032) *A 15 (15,63) 2 (7,14) 25 (12,14)

IL-6 rs1800795 (G>C) GG 43 (89,58) 9 (64,29) 72 (69,90) 3,7028 (0,0148) 0,7750 (0,9055) 4,7770 (0,0641) GC 3 (6,25) 3 (21,43) 29 (28,16) 0,1701 (0,0043) 0,6959 (0,8335) 0,2444 (0,2394) CC 2 (4,17) 2 (14,28) 2 (1,94) 2,1957 (0,8036) 8,4167 (0,1094) 0,2609 (0,4606) *G 89 (92,71) 21 (75,00) 173 (83,98) 2,4253 (0,0573) 4,0058 (0,2622) 4,2381 (0,0235) *C 7 (7,29) 7 (25,00) 33 (16,02)

IL-8 rs4073 (T>A) TT 16 (33,33) 5 (35,71) 30 (29,13) 1,2167 (0,7390) 1,3519 (0,8461) 0,9000 (0,8766) AT 23 (47,92) 7 (50,00) 51 (49,51) 0,9380 (0,9935) 1,0196 (0,8020) 0,9200 (0,8676) AA 9 (18,75) 2 (14,29) 22 (21,36) 0,8497 (0,8782) 0,6136 (0,7931) 1,3846 (0,9898) *T 55 (57,29) 17 (60,71) 111 (53,88) 1,1481 (0,6671) 1,3227 (0,6320) 0,8680 (0,9161) *A 41 (42,71) 11 (39,29) 95 (46,12)

IL-10 rs1800896 (A>G) AA 23 (47,92) 6 (42,86) 57 (55,34) 0,7425 (0,4991) 0,6053 (0,5529) 1,2267 (0,9765) AG 19 (39,58) 7 (50,00) 39 (37,86) 1,0752 (0,9820) 1,6410 (0,5615) 0,6552 (0,6986) GG 6 (12,50) 1 (7,14) 7 (6,80) 1,9592 (0,3942) 1,0549 (0,6058) 1,8571 (0,9383) *A 65 (67,71) 19 (67,86) 153 (74,27) 0,7263 (0,2949) 0,7263 (0,2949) 0,9932 (0,8298) *G 31 (32,29) 9 (32,14) 53 (25,73)

61

Tabela 15 – Distribuição genotípica e alélica dos polimorfismos de PrtCR, TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10 de acordo com a ausência de anticorpos para C.trachomatis em pacientes cardíacos e um grupo controle em Belém, PA.


Perfil Genótipico e alélico

Revascularização C. trachomatis −

(n:109) n(%)

Troca de válvula C. trachomatis −

(n:55) n(%)

População Controle C. trachomatis −

(n:178) n(%)

OR (p1) OR (p2) OR (p3)



IL-6 rs1800795 (G>C) GG 89 (81,65) 49 (89,09) 122 (68,54) 2,0426 (0,0211) 3,7486 (0,0045) 0,5449 (0,3149) GC 16 (14,68) 4 (7,27) 51 (28,65) 0,4284 (0,0101) 0,1953 (0,0021) 2,1935 (0,2646) CC 4 (3,67) 2 (3,64) 5 (2,81) 1,3181 (0,9544) 1,3057 (0,8905) 1,0095 (0,6674) *G 194 (88,99) 102 (92,73) 295 (82,87) 1,6715 (0,0595) 2,6364 (0,0168) 0,6340 (0,3791) *C 24 (11,01) 8 (07,27) 61 (17,13)

IL-8 rs4073 (T>A) TT 42 (38,53) 21 (38,18) 57 (32,02) 1,3307 (0,3183) 1,3111 (0,4949) 1,0149 (0,8994) AT 53 (48,62) 17 (30,91) 91 (51,12) 0,9048 (0,7722) 0,4277 (0,0134) 2,1155 (0,0457) AA 14 (12,85) 17 (30,91) 30 (16,86) 0,7270 (0,4555) 2,2070 (0,0377) 0,3294 (0,0099) *T 134 (62,84) 59 (53,64) 205 (57,58) 1,2185 (0,3031) 0,8521 (0,5351) 1,4300 (0,1645) *A 81 (37,16) 51 (46,36) 151 (42,42)

IL-10 rs1800896 (A>G) AA 54 (49,54) 25 (45,46) 96 (53,93) 0,8683 (0,5478) 0,7118 (0,3444) 1,1782 (0,7422) AG 44 (40,37) 21 (38,18) 67 (37,64) 1,1215 (0,7373) 1,0233 (0,9309) 1,0960 (0,9195) GG 11 (10,09) 9 (16,36) 15 (8,43) 1,2197 (0,7910) 2,1261 (0,1502) 0,5737 (0,3649) *A 152 (69,72) 71 (64,55) 259 (72,75) 0,8625 (0,4930) 0,6818 (0,1248) 1,2650 (0,4100) *G 66 (30,28) 39 (35,45) 97 (27,25)

62 Tabela 16 – Distribuição genotípica e alélica dos polimorfismos de PrtCR, TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10 de acordo com a presença de anticorpos para C.pneumoniae em pacientes cardíacos e um grupo controle em Belém, PA.


Perfil Genótipico e alélico Revascularização C. pneumoniae +

(n:133) n(%)

Troca de válvula C. pneumoniae +

(n:60) n(%)

População Controle C. pneumoniae +

(n:237) n(%)

OR (p1) OR (p2) OR (p3)



IL-6 rs1800795 (G>C) GG 113 (84,96) 51 (85,00) 163 (68,78) 2,5650 (0,0009) 2,5726 (0,0193) 0,9971 (0,8330) GC 15 (11,28) 5 (8,33) 68 (28,69) 0,3159 (0,0002) 0,2259 (0,0019) 1,3983 (0,7142) CC 5 (3,76) 4 (6,67) 6 (2,53) 1,5039 (0,7276) 2,7500 (0,2358) 0,5469 (0,6046) *G 242 (90,91) 107 (89,17) 394 (83,12) 2,0474 (0,0045) 1,6712 (0,1370) 1,2251 (0,7095) *C 24 (9,09) 13 (10,83) 80 (16,88)

IL-8 rs4073 (T>A) TT 46 (34,59) 24 (40,00) 75 (31,64) 1,1421 (0,6433) 1,4400 (0,2833) 0,7931 (0,5739) AT 66 (49,62) 18 (30,00) 117 (49,37) 1,0103 (0,9514) 0,4396 (0,0109) 2,2985 (0,0169) AA 21 (15,79) 18 (30,00) 45 (18,99) 0,8000 (0,5290) 1,8286 (0,0916) 0,4375 (0,0373) *T 158 (59,47) 66 (55,00) 267 (56,33) 1,1342 (0,4637) 0,9476 (0,8736) 1,1970 (0,4845) *A 108 (40,53) 54 (45,00) 207 (43,67)

IL-10 rs1800896 (A>G) AA 68 (51,13) 30 (50,00) 136 (57,38) 0,7769 (0,2928) 0,7426 (0,3770) 1,0462 (0,9916) AG 52 (39,10) 23 (38,33) 80 (33,76) 1,2599 (0,3595) 1,2199 (0,6074) 1,0327 (0,9532) GG 13 (9,77) 7 (11,67) 21 (8,86) 1,1143 (0,9168) 1,3585 (0,6766) 0,8202 (0,8854) *A 187 (70,45) 83 (69,17) 352 (74,26) 0,8204 (0,2818) 0,7775 (0,3122) 1,0552 (0,9164) *G 79 (29,55) 37 (30,83) 122 (25,74)

63

Tabela 17 – Distribuição genotípica e alélica dos polimorfismos de PrtCR, TNF-α, IL-6, IL-8 e IL-10 de acordo com a ausência de anticorpos para C.pneumoniae em pacientes cardíacos e um grupo controle em Belém, PA.


Perfil Genótipico e alélico

Revascularização C. pneumoniae−

(n:26) n(%)

Troca de válvula C. pneumoniae −

(n:11) n(%)

População Controle C. pneumoniae−

(n:58) n(%)

OR (p1) OR (p2) OR (p3)

PrtCR rs2794521 (T>C) TT 19 (73,08) 6 (54,55) 31 (53,45) 2,3641 (0,1460) 1,0452 (0,7927) 2,2619 (0,4737) CT 6 (23,08) 5 (45,45) 26 (44,83) 0,3692 (0,0980) 1,0256 (0,7701) 0,3600 (0,3332) CC 1 (3,84) 0 (0,00) 1 (1,72) 2,2800 (0,8538) − − *T 44 (84,62) 17 (77,27) 88 (75,86) 1,7500 (0,2824) 1,0818 (0,8963) 1,6176 (0,6712) *C 8 (15,38) 5 (22,73) 28 (24,14)

TNF-a rs1800629 (G>A) GG 19 (73,08) 5 (45,45) 44 (75,86) 0,8636 (1,0000) 0,2652 (0,0938) 3,2571 (0,2180) AG 6 (23,08) 6 (54,55) 14 (24,14) 0,9429 (0,8638) 3,7714 (0,0938) 0,2500 (0,1376) AA 1 (3,84) 0 (0,00) 0 (0,00) − − − *G 44 (84,62) 16 (72,73) 102 (87,93) 0,7549 (0,7327) 0,3660 (0,1268) 2,0625 (0,3850) *A 8 (15,38) 6 (27,27) 14 (12,07)

IL-6 rs1800795 (G>C) GG 21 (80,77) 9 (81,82) 41 (70,69) 1,7415 (0,4821) 1,8659 (0,6969) 0,9333 (0,7004) GC 4 (15,38) 2 (18,18) 15 (25,86) 0,5212 (0,4360) 0,6370 (0,8726) 0,8182 (0,7818) CC 1 (3,85) 0 (0,00) 2 (3,45) 1,1200 (0,5857) − − *G 46 (88,46) 20 (90,91) 97 (83,62) 1,5017 (0,5615) 1,9588 (0,5831) 0,7667 (0,9206) *C 6 (11,54) 2 (09,09) 19 (16,38)

IL-8 rs4073 (T>A) TT 13 (50,00) 3 (27,27) 19 (32,76) 2,0526 (0,2072) 0,7697 (0,9959) 2,6667 (0,3615) AT 10 (38,46) 6 (54,55) 31 (53,45) 0,5444 (0,3010) 1,0452 (0,7927) 0,5208 (0,5895) AA 3 (11,54) 2 (18,18) 8 (13,79) 0,8152 (0,9469) 1,3889 (0,9299) 0,5870 (0,9887) *T 36 (69,23) 12 (54,55) 69 (59,48) 1,5326 (0,3011) 0,8174 (0,8453) 1,8750 (0,3456) *A 16 (30,77) 10 (45,45) 47 (40,52)

IL-10 rs1800896 (A>G) AA 11 (42,31) 2 (18,18) 25 (43,10) 0,9680 (0,8648) 0,2933 (0,2240) 3,3000 (0,3038) AG 11 (42,31) 6 (54,55) 27 (46,55) 0,8420 (0,9012) 1,3778 (0,8749) 0,6111 (0,7476) GG 4 (15,38) 3 (27,27) 6 (10,35) 1,5758 (0,7680) 3,2500 (0,2983) 0,4848 (0,7004) *A 33 (63,46) 10 (45,45) 77 (66,38) 0,8797 (0,8476) 0,4221 (0,1045) 2,0842 (0,2391) *G 19 (36,54) 12 (54,55) 39 (33,62)

64

3.5. NÍVEIS PLASMÁTICOS DE PrtCR EM PACIENTES CARDÍACOS E GRUPO NO

CONTROLE

A figura 13 mostra a distribuição dos níveis plasmáticos nos pacientes (159 de RM e

71 de TV) e 196 indivíduos da população controle. A comparação estatística (valores de

mediana de cada grupo no interior do box) demonstrou que os dois grupos de pacientes

apresentam concentrações da proteína em quantidades significativamente maiores do que na

população controle (p<0,05).

Figura 13 – Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes cardíacos e um grupo controle em Belém, PA.

A comparação dos níveis plasmáticos de PrtCR, de acordo com os genótipos do

polimorfismo rs2794521 (−717T>C) mostra que pacientes de RM e TV portadores do

genótipo TT possuem níveis maiores quando comparados com os portadores do genótipo TT

e CT na população controle (p<0,05). O genótipo CC em determinadas análises se apresentou

com frequência insuficiente para a realização de análise estatística, razão pela qual sua

descrição não é feita em algumas figuras a seguir.

65

Figura 14 − Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes cardíacos e um grupo controle, de acordo com genótipos para o polimorfismo rs279452 (−717 T>C), em Belém, PA. TT: genótipo selvagem, CT: genótipo heterozigoto, CC: genótipo alterado.

As figuras 15 até a 19 mostram a comparação estatística das variáveis: níveis

plasmáticos, os grupos estudados (RM, TV e Controle), o perfil genotípico, além da presença

ou ausência de anticorpos para o gênero e espécies de Chlamydia.

A figura 15 mostra a comparação dos níveis plasmáticos dentre os diferentes grupos

levando em consideração o perfil genotípico e a presença de anticorpos para o gênero

Chlamydia. A concentração de PrtCR foi significativamente maior no grupo de RM e TV do

que no grupo controle (p<0,05). Os indivíduos com genótipo TT (RM e TV) apresentaram

níveis significativamente maiores da proteína quando comparados com os indivíduos do

grupo controle portadores do genótipo TT e CT (p<0,05).

66

Figura 15 − Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes cardíacos e um grupo controle, de acordo com genótipos para o polimorfismo rs279452 (−717 T>C) e a presença de anticorpos para Chlamydia em Belém, PA. TT: genótipo selvagem, CT: genótipo heterozigoto, CC: genótipo alterado.

A figura 16 mostra a concentração de PrtCR distribuída por genótipo e levando em

consideração a presença de anticorpos para C.trachomatis. O grupo de RM portador de

genótipo TT apresentou uma maior concentração da proteína do que o grupo controle

(p<0,05). O mesmo ocorre para o genótipo TT quando se comparamos o grupo de TV e

controle. Além disso, foi observada diferença estatisticamente significante entre o genótipo

CT do grupo de TV e o genótipo TT e CT do grupo controle (p<0,05).

67

Figura 16 − Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes cardíacos e um grupo controle, de acordo com genótipos para o polimorfismo rs279452 (−717 T>C) e a presença de anticorpos para C.trachomatis em Belém, PA. TT: genótipo selvagem, CT: genótipo heterozigoto.

Ao comparar as variáveis anteriores de acordo com a ausência de anticorpos para C.

trachomatis, a diferença entre o genótipo TT do grupo RM e TV permanecem

estatisticamente significantes em relação ao genótipo TT e CT do grupo controle (Figura 17).

68

Figura 17 − Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes cardíacos e um grupo controle, de acordo com genótipos para o polimorfismo rs279452 (−717 T>C) e a ausência de anticorpos para C.trachomatis em Belém, PA. TT: genótipo selvagem, CT: genótipo heterozigoto.

Os níveis plasmáticos de PrtCR foram comparados entre os grupos de acordo com a

presença ou ausência de anticorpos para C. pneumoniae (Figura 18 e 19, respectivamente). O

genótipo TT dos grupos RM e TV apresentaram uma concentração significativamente maior

da proteína em relação aos genótipos TT e CT do grupo controle (p<0,05) (Figura 18). Ao

analisar as variáveis dentre os grupos sem anticorpos para C.pneumoniae, houve diferença

estatisticamente significante entre o grupo de RM e TV portador do genótipo TT e o grupo

controle portador do genótipo TT e CT (p<0,05) (Figura 19).

69

Figura 18 − Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes cardíacos e um grupo controle, de acordo com genótipos para o polimorfismo rs279452 (−717T>C) e a presença de anticorpos para C.pneumoniae em Belém, PA. TT: genótipo selvagem, CT: genótipo heterozigoto, CC: genótipo alterado.

Figura 19 − Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes cardíacos e um grupo controle, de acordo com genótipos para o polimorfismo rs279452 (−717 T>C) e a ausência de anticorpos para C.pneumoniae em Belém, PA. TT: genótipo selvagem, CT: genótipo heterozigoto.

70

As figuras 20 até a 23 mostram as comparações entre os grupos de acordo com a

presença ou ausência de anticorpos para o gênero e espécies de Chlamydia sem levar em

consideração o perfil genotípico.

Na figura 20 o grupo de RM com e sem anticorpos para Chlamydia apresentou níveis

de PrtCR maiores do que o grupo controle, com resultados estatisticamente significantes

(p<0,05).

Figura 20 − Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes submetidos à revascularização (RM) e um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para o gênero Chlamydia em Belém, PA.

A figura 21 compara o grupo de TV e controle. O grupo de TV com anticorpos para

Chlamydia apresentaram níveis significativamente maiores da proteína em relação ao grupo

controle. A mesma diferença significante se observa entre o grupo de TV com sem anticorpos

e o controle (p<0,05).

71

Figura 21 − Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes submetidos à troca de válvula (TV) e um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para o gênero Chlamydia em Belém, PA.

A comparação entre os grupos de acordo com a presença ou ausência de anticorpos

para C. trachomatis estão demonstradas na figura 22. Tanto na presença como ausência de

anticorpos, o grupo de RM apresenta concentrações significativamente maiores de PrtCR do

que o grupo controle. O grupo de TV com anticorpos para C.trachomatis apresentou diferença

estatisticamente significante em relação ao grupo controle (p<0,05). Porém esta significância

estatística é perdida quando a comparação é feita entre o grupo TV sem anticorpos para C.

trachomatis e o grupo controle.

72

Figura 22 − Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes cardíacos e um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para C.trachomatis em Belém, PA.

A figura 23 demonstra a comparação dos grupos de acordo coma presença ou ausência

de anticorpos para C.pneumoniae. O grupo de RM com e sem anticorpos para C.pneumoniae

apresentou níveis de PrtCR significativamente maiores do que o grupo controle (p<0,05). O

grupo de TV com anticorpos para C.pneumoniae apresentou diferença estatisticamente

significante quando comparado ao grupo controle (p<0,05). Não houve diferença

estatisticamente significante entre o grupo sem anticorpos para C.pneumoniae e o controle.

73

Figura 23 − Níveis plasmáticos de PrtCR entre pacientes cardíacos e um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para C.pneumoniae em Belém, PA. 3.6. EXPRESSÃO GÊNICA DE TNF-α EM PACIENTES CARDÍACOS E NO GRUPO

CONTROLE

A quantificação do mRNA de TNF- α foi realizada em 22 amostras do grupo de RM,

17 amostras do grupo de TV e 28 amostras do grupo controle. A figura 24 demonstra que o

grupo controle apresentou uma expressão significativamente maior de TNF- α do que os dois

grupos de pacientes, sendo que a comparação com os indivíduos de RM resultou em

resultados estatisticamente significantes (p<0,05).

74

Figura 24 − Níveis de mRNA de TNF-α entre pacientes e um grupo controle em Belém, PA. RQ: valor de quantificação relativa.

A figura 25 demonstra a comparação dos níveis de expressão de TNF-α entre os

grupos de acordo com o perfil genotípico para o polimorfismo rs1800629 (−308G>A). O

genótipo AA, por se apresentar em frequência insuficiente para análise estatística, foi somado

com o genótipo heterozigoto (AG). O grupo controle portador do genótipo AG e AA

apresentou expressão significativamente maior do que os grupos de RM e TV portadores do

genótipo GG (p<0,05).

75

Figura 25 − Níveis de mRNA de TNF-α entre pacientes cardíacos e um grupo controle de acordo com genótipos para o polimorfismo rs1800629 (−308G>A) em Belém, PA. RQ: valor de quantificação relativa, GG: genótipo selvagem, AG: genótipo heterozigoto, AA: genótipo alterado.

Ao comparar a expressão e perfil genotípico entre os grupos de acordo com a presença

de anticorpos para Chlamydia, os níveis de mRNA do TNF-α permanecem significativamente

maiores em portadores dos genótipos AG/AA do grupo controle (p<0,05) (Figura 26).

76

Figura 26 − Níveis de mRNA de TNF-α entre pacientes cardíacos e um grupo controle de acordo com genótipos para o polimorfismo rs1800629 (−308G>A) e a presença de anticorpos para Chlamydia em Belém, PA. RQ: valor de quantificação relativa, GG: genótipo selvagem, AG: genótipo heterozigoto, AA: genótipo alterado.

Na figura 27, a comparação entre os grupos de RM e controle ocorre de acordo com a

presença ou ausência de anticorpos para Chlamydia. O grupo controle, com e sem anticorpos

apresentou níveis de expressão significativamente maiores quando comparado com o grupo

RM (p<0,05).

Na figura 28, a comparação com o grupo TV demonstra que na ausência de anticorpos

para Chlamydia, o grupo controle mostra uma maior quantificação de mRNA do que o grupo

RM (p<0,05).

77

Figura 27 − Níveis de mRNA de TNF-α entre pacientes submetidos à revascularização (RM) e um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para Chlamydia em Belém, PA. Figura 28 − Níveis de mRNA de TNF-α entre pacientes submetidos à troca de válvula (TV) e um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para Chlamydia em Belém, PA.

78

As figuras 29 e 30 representam a comparação da expressão de TNF-α de acordo com a

presença ou ausência de anticorpos para C.trachomatis e C.pneumoniae, respectivamente. Na

figura 29 as amostras do grupo controle sem anticorpos para C.trachomatis apresentaram

níveis significativamente maiores de expressão do que o grupo de RM e TV com anticorpos

para a espécie (p<0,05). Na figura 30 um resultado estatisticamente significante é observado

entre o grupo controle com anticorpos para C.pneumoniae e os grupos de RM e TV (p<0,05).

Figura 29 − Níveis de mRNA de TNF-α entre pacientes cardíacos e um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para C.trachomatis em Belém, PA.

79

Figura 30 − Níveis de mRNA de TNF-α entre pacientes cardíacos e um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para C.pneumoniae em Belém, PA.

3.7 NÍVEIS PLASMÁTICOS DE IL-6 EM PACIENTES CARDÍACOS E NO GRUPO

CONTROLE

A dosagem dos níveis plasmáticos foi realizada em 19 amostras de pacientes de RM,

14 amostras de pacientes de TV e 28 amostras de grupo controle (Figura 31). As

comparações entre os diferentes grupos (mediana no interior do box) demonstrou que as

concentrações de IL-6 foram significativamente maiores no grupo de pacientes (RM e TV) do

que no grupo controle (p<0,05).

80

Figura 31 – Níveis plasmáticos de IL-6 entre pacientes cardíacos e um grupo controle em Belém, PA.

A figura 32 demonstra a comparação dos níveis de IL-6 de acordo com os diferentes

genótipos para o polimorfismo rs1800795 (−174G>C). O genótipo CC se apresentou com

frequência insuficiente para a realização de análise estatística, razão pela qual foi unido ao

genótipo GC com o objetivo de aumentar a amostragem para a análise estatística. Ao inserir a

variável genótipo na comparação foi observado que existiu uma maior concentração de IL-6

no plasma de pacientes de RM portadores do genótipo GG quando comparado com o grupo

controle portador do genótipo GG e também dos genótipos GC/CC(p<0,05). Para o grupo de

TV, os indivíduos portadores dos genótipos GC/CC apresentaram maiores níveis da citocina

do que o grupo controle portador do genótipo GG (p<0,05).

81

Figura 32 − Níveis plasmáticos de IL-6 entre pacientes cardíacos e um grupo controle, de acordo com genótipos para o polimorfismo rs1800795 (−174G>C) em Belém, PA. GG: genótipo selvagem, GC: genótipo heterozigoto, CC: genótipo alterado.

A Figura 33 demonstra a comparação entre os diferentes grupos (RM, TV e controle)

de acordo com o perfil genotípico e presença de anticorpos para Chlamydia. O grupo de RM e

o de TV, ambos portadores do genótipo GG mostraram concentrações significativamente

maiores de IL-6 do que o grupo controle portador do mesmo genótipo (p<0,05).

82

Figura 33 − Níveis plasmáticos de IL-6 entre pacientes cardíacos e um grupo controle, de acordo com genótipos para o polimorfismo rs1800795 (−174G>C) e presença de anticorpos para Chlamydia em Belém, PA. GG: genótipo selvagem, GC: genótipo heterozigoto, CC: genótipo alterado.

A figura 34 representa a comparação dos níveis plasmáticos de IL-6 entre o grupo de

RM e controle, levando em consideração a presença ou ausência de anticorpos para

Chlamydia. Houve diferença estatisticamente significante entre o grupo de RM e o grupo

controle com anticorpos para Chlamydia, onde os pacientes apresentaram uma concentração

significativamente maior de IL-6 do que os controles (p<0,05). Resultado semelhante foi

encontrado quando comparamos o mesmo grupo de pacientes com o grupo controle sem

anticorpos para Chlamydia. Adicionalmente, ao comparar o grupo de RM e controle sem

anticorpos para Chlamydia, houve diferença estatisticamente significante (p<0,05).

83

Figura 34 − Níveis plasmáticos de IL-6 entre os pacientes submetidos à revascularização do miocárdio (RM) e um grupo controle de acordo com presença ou ausência de anticorpos para Chlamydia em Belém, PA.

A comparação dos níveis plasmáticos de IL-6 entre o grupo de TV e controle de

acordo com a presença ou ausência de anticorpos para Chlamydia estão representados na

Figura 35. De forma semelhante ao grupo de RM (Figura 34), os pacientes de TV com

anticorpos para Chlamydia apresentaram níveis significativamente maiores da citocina do que

o grupo controle com e sem anticorpos para Chlamydia (p<0,05). Os pacientes sem anticorpos

para Chlamydia demonstraram uma acentuada redução nos níveis plasmáticos de IL−6, razão

pela qual não foram observados resultados estatisticamente significativos.

84

Figura 35 − Níveis plasmáticos de IL-6 entre pacientes submetidos à troca de válvula (TV) e um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para Chlamydia em Belém, PA.

As figuras 36 e 37 representam a comparação das concentrações de IL-6 dentre os

grupos e de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para C.trachomatis e C.

pneumoniae, respectivamente. Na figura 36 o grupo de RM sem anticorpos para

C.trachomatis possui maiores concentrações de IL-6 do que o controle (p<0,05). O grupo de

TV com anticorpos mostrou níveis plasmáticos significativamente maiores do que o grupo

controle com e sem anticorpos para C.trachomatis (p<0,05).

Na figura 37 o grupo de RM com e sem anticorpos para C.pneumoniae apresentaram

maior concentração da citocina em relação ao grupo controle, com resultado estatisticamente

significante (p<0,05). Não houve diferença estatisticamente significante entre o grupo de TV

e o controle.

85

Figura 36 − Níveis plasmáticos de IL-6 entre pacientes cardíacos e um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para C.trachomatis em Belém, PA.

Figura 37 − Níveis plasmáticos de IL-6 entre pacientes cardíacos e um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para C.pneumoniae em Belém, PA.

86

3.8. EXPRESSÃO GÊNICA DE IL-8 EM PACIENTES CARDÍACOS E NO GRUPO

CONTROLE.

A quantificação do mRNA de IL-8 foi realizada em 27 amostras do grupo de RM, 21

amostras do grupo de TV e 32 amostras do grupo controle. A figura 38 demonstra que o

grupo controle apresentou uma expressão significativamente maior de IL-8 do que os dois

grupos de pacientes, com resultados estatisticamente significantes (p<0,05).

Figura 38 − Níveis de mRNA de IL-8 entre pacientes cardíacos e um grupo controle em Belém, PA. RQ: valor de quantificação relativa.

Na figura 39 os níveis de expressão foram comparados levando em consideração o

perfil genotípico para o polimorfismo rs4073(−251T>A). O grupo controle apresentou níveis

significativamente maiores de mRNA de IL-8 do que pacientes. Esta diferença foi observada

entre os genótipos TT e AA do grupo controle e os genótipos TT do grupo de RM (p<0,05).

Na figura 40 a comparação ocorre de acordo com o perfil genotípico e a presença de

anticorpos para Chlamydia, onde podemos verificar que o grupo controle com genótipo AT

apresentou níveis significativamente maiores de expressão do que o grupo RM e TV com

genótipo TT (p<0,05).

87

Figura 39 − Níveis de mRNA de IL-8 entre pacientes cardíacos e um grupo controle de acordo com genótipos para o polimorfismo rs4073 (−251T>A) em Belém, PA. RQ: valor de quantificação relativa, TT: genótipo selvagem, AT: genótipo heterozigoto, AA: genótipo alterado.

Figura 40 − Níveis de mRNA de IL-8 entre pacientes cardíacos e um grupo controle de acordo com o polimorfismo rs4073 (−251T>A) e a presença de anticorpos para Chlamydia em Belém, PA. RQ: valor de quantificação relativa, TT: genótipo selvagem, AT: genótipo heterozigoto, AA: genótipo alterado.

88

Na figura 41 avaliamos os níveis de mRNA de IL-8 entre os grupos de acordo com a

presença ou ausência de anticorpos para Chlamydia. O grupo controle com anticorpos para

Chlamydia apresentou níveis maiores do que os pacientes de RM (p<0,05). Na figura 42 não

foi observada diferença estatisticamente significante entre o grupo de TV e controle.

Figura 41 − Níveis de mRNA de IL-8 entre pacientes submetidos a revascularização do miocárdio (RM) e um do grupo controle de acordo com resultado a presença ou ausência de anticorpos para Chlamydia em Belém, PA.

89

Figura 42 − Níveis de mRNA de IL-8 entre pacientes submetidos a troca de válvula (TV) e um grupo controle de acordo com resultado a presença ou ausência de anticorpos para Chlamydia em Belém, PA.

As figura 43 e 44 demonstram a comparação da expressão de IL-8 entre os diferentes

grupos de acordo com a presença e ausência de anticorpos para a C.trachomatis e

C.pneumoniae, respectivamente. Na figura 43, o grupo de TV e grupo controle sem anticorpos

para C.trachomatis mostraram expressão significativamente maior do que o grupo de RM

(p<0,05). Na figura 44 o grupo controle com anticorpos para C.pneumoniae apresenta

diferença estatisticamente significante quando comparado ao grupo de RM. Adicionalmente,

o grupo de TV com anticorpos para C.pneumoniae mostrou uma expressão maior de IL-8

quando comparado com o grupo de RM sem anticorpos (p<0,05).

90

Figura 43 − Níveis de mRNA de IL-8 entre pacientes cardíacos e um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para C.trachomatis em Belém, PA.

Figura 44 − Níveis de mRNA de IL-8 entre pacientes cardíacos em um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para C.pneumoniae em Belém, PA.

91

3.9. EXPRESSÃO GÊNICA DE IL-10 EM PACIENTES CARDÍACOS E NO GRUPO

CONTROLE.

A quantificação do mRNA de IL-10 foi realizada em 27 amostras do grupo de RM, 20

amostras do grupo de TV e 33 amostras do grupo controle. A figura 45 demonstra a

distribuição dos níveis de expressão relativa, onde não se observa diferença estatisticamente

significante.

Figura 45 − Níveis de mRNA de IL-10 entre pacientes cardíacos e um grupo controle em Belém, PA.

A figura 46 demonstra uma diferença estatisticamente significante quando se compara

os níveis de expressão da citocina com o perfil genotípico para o polimorfismo rs1800896

(−1082A>G). O grupo de RM com genótipo AG apresentou níveis de expressão

significativamente maiores do que o grupo controle com genótipo AA (p<0,05). O grupo de

TV com genótipo GG também demonstrou maior expressão quando comparado com o grupo

controle portador do genótipo AA (p<0,05).

92

Figura 46 − Níveis de mRNA de IL-10 entre pacientes cardíacos e um grupo controle de acordo com genótipos para o polimorfismo rs1800896 (−1082G>A) em Belém, PA. RQ: valor de quantificação relativa, AA: genótipo selvagem, AG: genótipo heterozigoto, GG: genótipo alterado.

A figura 47 mostra a associação dos níveis de expressão de IL-10 com o perfil

genotípico e a presença de anticorpos para Chlamydia. Os genótipos AG e GG foram somados

para se obter um número amostral significativo para análise estatística. Os níveis de expressão

entre os grupos se mostraram iguais, não havendo resultado estatisticamente significante. De

forma semelhante, não foi observada diferença estatisticamente significante nas figuras 48 e

49, onde os níveis de expressão foram comparados de acordo com a presença ou ausência de

anticorpos para Chlamydia.

93

Figura 47 − Níveis de mRNA de IL-10 entre pacientes cardíacos e um grupo controle de acordo com os genótipos para o polimorfismo rs1800896 (−1082 G>A) e a presença de anticorpos para Chlamydia em Belém, PA. RQ: valor de quantificação relativa, AA: genótipo selvagem, AG: genótipo heterozigoto, GG: genótipo alterado.

Figura 48 − Níveis de mRNA de IL-10 entre pacientes submetidos a revascularização do miocárdio (RM) e um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para Chlamydia.

94

Figura 49 − Níveis de mRNA de IL-10 entre pacientes submetidos a troca de válvula (TV) e um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para Chlamydia.

As figuras 50 e 51 mostram a comparação da expressão de acordo com a presença ou

ausência de anticorpos para C.trachomatis e C.pneumoniae, respectivamente. Não foram

observadas diferenças significantes entre os níveis de expressão para IL-10 nestes grupos.

95

Figura 50 − Níveis de mRNA de IL-10 entre pacientes cardíacos e um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para C.trachomatis.

Figura 51 − Níveis de mRNA de IL-10 entre pacientes cardíacos e um grupo controle de acordo com a presença ou ausência de anticorpos para C.pneumoniae.

96

4. DISCUSSÃO

4.1. PERFIL DEMOGRÁFICO E SOCIAL, SOROPREVALÊNCIA DE ANTICORPOS E

DETECÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO DE C.TRACHOMATIS E C.PNEUMONIAE EM

PACIENTES COM DOENÇA CARDIOVASCULAR.

De acordo com a OMS, dentre um total de 16,7 milhões de mortes por ano devido a

doenças cardiovasculares, quase a metade destas mortes é em decorrência da doença arterial

coronariana, seguida de outras condições como o acidente vascular cerebral, doença cardíaca

hipertensiva, inflamatória e reumática (WHO, 2004).

Os fatores de risco para o desenvolvimento da doença arterial coronariana estão

divididos em modificáveis e não-modificáveis. Os fatores modificáveis incluem, dentre

outros, hipertensão, diabetes, tabagismo, sobrepeso, hipercolesterolemia. Os fatores não

modificáveis incluem o sexo, idade, etnia e herança genética (Gifford, 1993; WHO, 2004;

Safford et al., 2012). O surgimento das doenças cardiovasculares aumenta de acordo com o

avanço da idade, devido ao processo natural de envelhecimento celular que favorece o

surgimento alterações vasculares (Kovacic et al., 2011). Estas doenças também se apresentam

de forma mais frequente entre homens, particularmente quando as mulheres se encontram em

fase de pré-menopausa, pois a presença do estrógeno parece desempenhar um papel protetor

para o sexo feminino (Gifford, 1993; Clarkson et al., 2007). Outro fator que pode estar

relacionado a um maior risco de desenvolvimento de doenças cardiovasculares é a condição

socioeconômica da população, aqui incluídos a renda familiar, o nível de escolaridade e o tipo

de ocupação. A baixa renda, por exemplo, pode limitar o acesso a educação e aos cuidados

médicos de qualidade que auxiliam na conscientização e prevenção primária contra a doença

arterial coronariana. Dessa forma, o baixo nível socioeconômico pode interferir na realização

de práticas preventivas como o exercício físico, a alimentação de qualidade e exames médicos

anuais (Kaplan & Keil, 1993; Maynard et al., 2012).

Os pacientes coronarianos submetidos a revascularização do miocárdio (RM) deste

estudo apresentaram características epidemiológicas, em geral, concordantes com o relatado

na literatura (Virmani et al., 1991; Clarkson et al., 2007; Clark et al., 2009; Ruff

& Braunwald, 2011). A maioria pertenceu ao sexo masculino, idade média de 60,4 anos, com

baixo nível de escolaridade (sem conclusão do ensino fundamental) e baixa renda (1 a 3

salários). Todo o ciclo que costuma cercar os pacientes com doença coronariana se repetiram,

uma vez que a baixa escolaridade associada a baixa renda, não permitem, por vezes, o

97

entendimento adequado das maneiras básicas de proteção e cuidados associados com a

prevenção de doenças cardíacas.

O grupo de indivíduos submetidos à troca de válvula (TV) foi composto em sua

maioria por mulheres, idade média de 45,6 anos, estado civil solteiro, com baixo nível de

escolaridade (sem conclusão do ensino fundamental) e baixa renda (1 a 3 salários). Indivíduos

portadores de valvulopatia apresentam característica epidemiológica diferente, devido à

diversidade de fatores desencadeantes da doença tais como, desordens congênitas ou por uma

variedade de doenças adquiridas no decorrer da vida, como a febre reumática. (Fernandes et

al., 2012). A doença atinge indivíduos jovens, em idade reprodutiva e ativos para o trabalho,

representando um grande prejuízo socioeconômico em países em desenvolvimento (Okello et

al., 2012).

A prevalência de anticorpos contra C.trachomatis não é muito relatada em portadores

de doenças cardíacas. Em contrapartida, este agente é alvo de muitos estudos envolvendo

grupos como mulheres e homens sexualmente ativos, principalmente apresentando

anormalidades no sistema reprodutor, uma vez que a C. trachomatis é uma das principais

bactérias transmitidas através da via sexual (WHO, 2005). A soroprevalência pode variar de

4% a 10% em grupos de mulheres grávidas saudáveis (Salmani et al., 2011), 25% em

profissionais do sexo (Cravioto et al., 2003), 50% em mulheres com histórico desfavorável na

gravidez até 68% em mulheres apresentando infertilidade (Sharma et al., 2002). Os resultados

do presente estudo apontam uma soroprevalência de 30,6% no grupo de RM, 20,3% no grupo

de TV e 36,7% no grupo controle. Estes dados demonstram que independente da presença de

doença cardíaca, a população do estado do Pará apresenta uma alta exposição à C.

trachomatis que pode ser decorrente tanto da transmissão sexual como do contato com as

variantes causadoras do tracoma, que são endêmicas nesta região (Ishak & Ishak, 2001; Costa,

2002, Feitosa, 2010). Estudos soroepidemiológicos tanto de C. trachomatis como de C. pneumoniae são

difíceis para comparação devido a diferenças nos grupos populacionais estudados, mas

principalmente devido aos diferentes tipos de técnicas sorológicas empregadas, variações no

cut-off estabelecido etc.

A C. pneumoniae possui uma ampla disseminação no mundo devido sua transmissão

ocorrer através do contato com gotículas contaminadas das vias respiratórias. As estimativas

apontam que mais de 50% da população adulta e entre 10 a 20% de crianças apresentem

anticorpos contra a bactéria (Blasi et al., 1998; Koh et al., 2002; Burillo & Bouza, 2010).

98

O presente estudo demonstrou uma prevalência de anticorpos de 83,6% para o grupo

de RM, 84,5% para o grupo de TV e 80,3% para o grupo controle, dados estes considerados

semelhantes em outros grupos populacionais. Na Espanha, indivíduos com mais de 15 anos de

idade mostraram 75% de prevalência (Bellido-Casado et al., 2006). Em Singapura, homens

entre 18 e 69 anos apresentaram uma prevalência de 75% enquanto as mulheres 68,5% no

mesmo estudo (Koh et al., 2002). Na Índia, os pacientes coronarianos apresentam prevalência

de 76% (Argawal et al., 2007). Os dados de prevalência do presente estudo superam também

os dados relatados no Japão onde Myashita et al. (2002) analisando por dez anos as oscilações

de prevalência, observou a menor de 59% e a mais alta de 73,3%, sendo considerada uma

região de alta exposição.

De forma diferente deste estudo, no México foi observado que há uma associação

entre a soroprevalência de C. pneumoniae e a doença arterial coronariana, pois o grupo de

pacientes apresentou 94,3% de anticorpos contra apenas 37% do grupo controle (Elorriaga et

al., 2002). Thom et al. (1998) demonstraram uma prevalência de 67% em pacientes cardíacos

contra 48% na população controle afirmando que indivíduos com anticorpos anti

C.pneumoniae possuem 2,6 vezes mais risco de adquirir doença cardiovascular do que

indivíduos sem anticorpos. Não foi possível encontrar esta associação no presente estudo, pois

a população controle apresentou uma alta soroprevalência assim como a de pacientes (RM e

TV) demonstrando que nossa região apresenta uma maior disseminação bacteriana

independente dos grupos, assim como em outras regiões como Israel onde 74% de adultos

saudáveis para doenças respiratórias apresentaram anticorpos anti-C.pneumoniae (Ben

Yaakov et al., 2002). Estes dados também se assemelham ao de Sotiropoulos et al. (2006) que

também encontraram alta prevalência no grupo controle (86%) e pacientes coronarianos

(91%). O estudo de Meza-Junco et al. (2004) ressalta a grande e variada distribuição de

C.pneumoniae entre diferentes populações quando observou 70,5% de prevalência em seu

grupo controle e 66,3% em seus pacientes cardíacos.

Outras doenças cardiovasculares se tornaram alvo de pesquisas para associação com

Chlamydia, como as doenças de válvulas cardíacas. Os principais estudos não possuem como

foco a soroprevalência, mas sim a busca direta da bactéria no tecido valvular. A prevalência

de anticorpos anti-C.pneumoniae deste estudo são maiores do que o estudo de Turgeman et al.

(2006) que avaliou pacientes com diferentes níveis de estenose de válvula aórtica,

encontrando 42% de prevalência de IgG no grupo com grau moderado ou grave da doença. O

presente estudo encontrou uma prevalência concordante com o estudo de Atar et al. (2007)

99

que encontraram 84% de soropositividade para C.pneumoniae em pacientes com doença de

válvula aórtica e mitral.

A maioria dos estudos que afirma uma associação entre Chlamydia e doença cardíaca

utiliza metodologias de detecção de antígenos ou DNA no tecido cardíaco, como o trabalho de

Juvonen et al. (1998) que detectou 53% das válvulas aórticas contendo marcadores de

infecção por C.pneumoniae em indivíduos com idade avançada. No Brasil, Higuchi et al.

(2005) identificaram antígenos bacterianos nas válvulas apontando uma participação no

processo de calcificação deste tecido. O presente estudo, através de biologia molecular, não

identificou a presença de C.pneumoniae nos fragmentos de válvula, aortas e placas de

ateroma, concordando com os estudos que através de diferentes métodos, como biologia

molecular e cultura, não identificaram a presença de C.pneumoniae em tecidos

cardiovasculares mesmo em populações com alta prevalência de anticorpos (Andreasen et al.,

1998; Ong et al., 2001; Rose et al., 2002; Vainio et al., 2002; Ferrari et al., 2005; Satpathy et

al., 2008). Zhang et al. (2003) estudaram amostras de biópsia para detecção de C.pneumoniae

por imunohistoquímica e, apesar de ter encontrado marcação positiva, afirmaram que a sua

presença nas paredes de artéria coronária não estavam associadas a uma progressão na lesão

da camada íntima, existindo então uma associação limitada entre a bactéria e a patogênese da

aterosclerose. A partir dos dados de biologia molecular, não foi possível estabelecer uma

associação entre a infecção por C.pnemoniae e a patogênese da aterosclerose. Os diferentes

resultados encontrados na literatura dificultam uma associação consenso de Chlamydia

pneumoniae como um agente causal no desenvolvimento ou complicações das doenças

cardiovasculares.

Em contrapartida, o presente estudo é o primeiro que apresenta a amplificação de

DNA de C. trachomatis em amostras de tecido cardiovascular. Ainda que as células

endoteliais e do músculo cardíaco possam não ser um alvo natural para a infecção da C.

trachomatis, a bactéria pode alcançar a região por meio de monócitos/macrófagos infectados,

uma vez que estas células podem ser infectadas in vitro, apresentando inclusões intracelulares

características da multiplicação bacteriana. Análises de rRNA primário de C.trachomatis

demonstraram microrganismos viáveis e metabolicamente ativos no interior das inclusões

(Koehler, et al., 1997; Sun et al., 2012)

Apesar das aparentes diferenças no tropismo celular entre as espécies, tanto a C.

trachomatis, C.psittaci como C.pneumoniae já foram associadas com a manifestação de

miocardites sendo capazes de provocar infecção produtiva nas células endoteliais e do

músculo cardíaco resultando em danos significativos para o coração tanto em modelos

100

experimentais como em estudos humanos (Gaydos et al.,, 1996; Bachmaier et al., 1999;

Schinkel et al., 2000; Wang et al., 2002).

Alguns relatos de caso sustentam as afirmações anteriores como casos de

endocardite associada à infecção por C. trachomatis em paciente com resultado de cultura

negativa (Brearley & Hutchinson, 1981). Mavrogeni et al. (2008) documentaram um caso de

miocardite causada por C.trachomatis em paciente com histórico de prostatite. Dan et al.

(1987) descreveram o isolamento de C.trachomatis a partir de biópsia de fígado em um

paciente apresentando febre alta e prolongada.

4.2. POLIMORFISMO DE MARCADORES DE RESPOSTA IMUNOLÓGICA E

INFLAMATÓRIA

A distribuição alélica e genotípica da PrtCR, TNF-α e IL-10 não foram associadas ao

risco de desenvolvimento de doença cardiovascular após diferentes comparações entre

pacientes e controle, levando em consideração os resultados sorológicos para C.trachomatis e

C.pneumoniae. Apesar dos polimorfismos selecionados para este estudo serem os de maior

associação com doenças crônicas como a aterosclerose, diversos outros marcadores

(imunológicos, inflamatórios e bioquímicos) estão sendo identificados e associados com risco

baixo, moderado ou alto doença cardiovascular (Hage & Szalai et al., 2007; Perry et al.,

2009; Karaca et al., 2011; Nair et al., 2013). É importante considerar a condição multifatorial

destas doenças, cujo início e a evolução de lesões cardíacas e vasculares não dependem

somente de uma predisposição genética, mas também dos fatores ambientais envolvidos

(sedentarismo, fumo, tabagismo, hiperlipidemia etc) (Nash et al., 2011; Kiechl & Willeit,

1999; WHO, 2004).

De acordo com os resultados deste e de outros estudos, o polimorfismo de região

promotora rs1800795 (−174G>C) de IL-6 pode representar um fator de risco para doenças

cardiovasculares alterando os níveis de transcrição do gene, bem como os níveis plasmáticos

da citocina (Fishman et al., 1998; Shibata et al., 2002; Giacconi et al., 2004; Antonicelli et

al., 2005).

Este polimorfismo foi identificado pela primeira vez em um estudo com caucasianos

em Londres onde foi encontrada uma frequência do alelo G em torno de 60% e o alelo C em

torno de 40% (Fishman et al., 1998). Ao contrário, o presente estudo apresentou uma

frequência do alelo G muito maior nas tres populações estudadas (RM: 90,25%; TV: 89,44%;

Controle: 83,17%) e o alelo C em menor frequência (RM: 9,75%; TV: 10,56%; Controle:

101

16,83%) (Tabela 14). Ao comparar estas frequências com outras registradas em estudos na

população global, foi observada uma distribuição alélica heterogênea. Africanos e asiáticos

possuem uma frequencia alélica semelhante a do presente estudo, com frequência do alelo G

igual a 95,8% e 95,7%, respectivamente. Em contrapartida, europeus e norte-americanos

apresentam uma frequência do alelo G menor (46,5% e 35,3%, respectivamente) (SNP-NCBI,

2013). Estas diferenças podem ser decorrentes da contribuição genética de diferentes etnias

(africanos, ameríndios e europeus) na formação da população paraense (Santos et al., 2010).

Outros estudos apontam o alelo C foi associado com maiores níveis plasmáticos de IL-6

(Brull et al., 2001; Niu et al., 2012), tornando o papel do polimorfismo ainda controverso,

inclusive em estudos de metanálise (Yin et al., 2013).

Indivíduos portadores do genótipo GG (IL-6) possuem, neste estudo, um risco duas a

tres vezes maior de desenvolvimento de doença cardiovascular (doença coronariana e

valvulopatia) do que o indivíduo portador dos outros genótipos. Existem muitas associações

entre o genótipo GG e um maior risco de desenvolvimento de patologias diversas (Sarcoma

de Kaposi, hiperlipidemia, deficiência de crescimento em portadores de doença de Chron etc)

(Foster et al., 2000; Fernandez-Real et al., 2002; Sawczenko et al., 2005), incluindo doenças

cardiovasculares (Olivieri et al., 2002; Giacconi et al., 2004; Antonicelli et al., 2005). Assim

como no presente estudo, Myśliwska et al., em 2006 associaram o genótipo GG a um maior

risco de obstrução coronária. Do mesmo modo que na aterosclerose, a presença de uma lesão

no tecido das válvulas cardíacas pode estimular o processo inflamatório caracterizado por

ativação de macrófagos, linfócitos, infiltração de lipoptoteínas, acúmulo de cálcio, mediante a

secreção exacerbada de diversas citocinas pró-inflamatórias incluindo a IL-6 (Mazzone et al.,

2004).

O genótipo GC apresentou uma frequência significativamente maior na população

controle, representando um fator de proteção contra a doença cardiovascular (RM:11,95%;

TV:9,86%; Controle:28,33%). A presença do alelo C, que influencia em uma menor atividade

transcricional do gene da IL-6, pode trazer uma resposta mais equilibrada no que diz respeito

à secreção da citocina (Fishman et al., 1998), contrariando a resposta exacerbada inerente ao

alelo G. O papel do genótipo GC como protetor pode explicar o fato de somente os pacientes

(RM e TV) apresentarem suas frequências genotípicas em desequilíbrio de Hardy-Weinberg,

uma vez que a frequência observada de GC nos referidos grupo se mostrou menor do que a

esperada.

Em relação a IL-8, foi demonstrada uma frequência maior do genótipo AA na

população de TV quando comparada com a de RM (28,17% vs. 15,09%, respectivamente),

102

apresentando resultado estatisticamente significante (p=0,0318). Quando o grupo TV foi

comparado com a população controle para o mesmo genótipo, o resultado se aproximou

daquele considerado estatisticamente significante (p=0,07). Estes resultados são coerentes

com estudos que demonstram uma maior atividade transcricional do gene no grupo de

pacientes portadores do genótipo AA (Hull et al., 2000; Wang et al., 2012).

Da mesma forma que ocorreu para IL-6, o genótipo heterozigoto de IL-8 se mostrou

em maior frequência na população controle do que nos pacientes de TV (50% vs. 33,80%,

respectivamente), representando um papel de proteção contra o desenvolvimento de

valvulopatias (p=0,02). Isto ocorreu possivelmente devido a um equilíbrio na secreção da

quimiocina por conta da presença do alelo T que é associado a uma menor atividade

transcricional do gene (Hull et al., 2000; Wang et al., 2012). O papel da IL-8 no

desenvolvimento de valvulopatias pode ser explicado pelo processo inflamatório

característico em tecido cardíaco com lesões. Além da secreção de proteínas quimiotáticas de

monócitos (MCP-1), moléculas de adesão, fatores de crescimento de fibroblastos, as células

neste tecido podem estimular a quimiotaxia de neutrófilos através da secreção de IL-8

(Harada et al., 1994). Portanto o genótipo AA, neste estudo, mostrou se como um fator de

risco para o surgimento de valvulopatias.

Os resultados mostram também a persistência do genótipo GG de IL-6 como fator de

risco para o desenvolvimento de doença cardiovascular, independentemente do resultado

sorológico para C.trachomatis. Ainda que não seja observado de imediato o papel do genótipo

GC como fator de proteção tanto para doença coronariana como para valvulopatias

(informação que ficou parcialmente oculta na tabela 15), o aumento do tamanho amostral

evidenciado na tabela seguinte é suficiente para confirmar a observação.

Com relação a IL-8, dentre as amostras que apresentavam anticorpos para

C.trachomatis, foi observada uma perda na significância estatística, porém ao comparar as

amostras sem anticorpos, o genótipo AA demonstra novamente maior frequência no grupo de

TV do que no de RM e controle, assim como o genótipo AT se mostra mais frequente no

grupo controle.

Ao observar as mesmas análises relacionadas à presença de anticorpos para

C.pneumoniae, os resultados do genótipo GG de IL-6 e AA de IL-8 permanecem semelhantes

aos encontrados com C.trachomatis, reforçando a associação descrita anteriormente. Ao

retirar a variável soropositividade para C.pneumoniae, as frequências perdem sua

significância estatística, portanto, sugerindo que o histórico de infecção por C.pneumoniae

103

pode se comportar como um fator sinérgico influenciando na associação descrita com

polimorfismo de IL-6 e IL-8.

Com base nas comparações realizadas, é possível sugerir que o perfil genótípico de

IL−6 e IL−8 podem influenciar na suscetibilidade à doença cardiovascular de forma

independente da presença de marcadores de infecção por C.trachomatis. Entretanto, esta

associação é perdida ao comparar os grupos soronegativos para C.pneumoniae, nos

permintindo sugerir um papel sinérgico dos marcadores de infecção por esta bactéria,

acentuando os mecanismos de resposta imunológica através de estímulos inflamatórios

específicos. O perfil genético individual, para IL-6 e IL-8, pode se comportar com um fator de

risco para o desenvolvimento da doença cardiovascular, através da indução de diferentes

efeitos biológicos destas citocinas no organismo.

4.3. NÍVEIS PLASMÁTICOS E DE EXPRESSÃO GÊNICA DE MARCADORES DE

RESPOSTA IMUNOLÓGICA E INFLAMATÓRIA

O presente estudo não encontrou evidências de suscetibilidade genética associada a

PrtCR, levando em consideração os resultados do polimorfismo rs2794521 (−717T>C).

Apesar de o fator genético ser importante, ele é incapaz de influenciar de forma isolada os

níveis de PrtCR (Kathiresan et al., 2006; Hage & Szalai et al., 2007). A avaliação dos níveis

plasmáticos deste estudo reforçam a participação da PrtCR como fator de risco para a doença

cardiovascular. Tanto o grupo de RM como de TV apresentaram níveis plasmáticos maiores

do que o grupo controle, funcionando como um fator preditor de eventos coronários (angina

instável, estável, infarto agudo do miocárdio) e valvulares (Galante et al., 2001; Ridker et al.,

2002; Sinning et al., 2006).

O risco para doença cardíaca deve ser avaliado não só em populações adultas e com

comportamentos de risco, mas também em indivíduos com idade precoce (crianças e

adolescentes), pois estes grupos já demonstram um risco futuro, de acordo com a análise de

vários biomarcadores, como a PrtCR (Namburi et al., 2013). A interação da PrtCR com

células vasculares e cardíacas tem sido alvo de muitos estudos que buscam descrever o

mecanismo exato que explique sua alta sensibilidade e efeito inflamatório imediato. Foi

observado que altos níveis da proteína desencadeiam efeitos pro-inflamatórios através da

expressão de moléculas de adesão intercelular e vascular, citocinas, proteínas quimiotáticas,

fatores de coagulação, bem como o aumento da captação de LDL colesterol pelos macrófagos

(Venugopal et al., 2005; Peng et al., 2013).

104

A comparação dos níveis plasmáticos de PrtCR, com o perfil genético e a presença de

anticorpos para o gênero ou as espécies de Chlamydia, mostrou uma concentração dos níveis

plasmáticos significativamente maior nos grupos de pacientes portadores do genótipo TT do

que no grupo controle. Estes dados são semelhantes ao estudo de Chen et al. (2005), que

observaram o alelo T em maior frequência entre indivíduos com doença arterial coronariana e

infarto agudo do miocárdio do que nos controles. Isto pode ser explicado através do estudo de

Wang et al. (2009) que demonstraram uma atividade transcricional maior do gene de PrtCR

na presença do alelo T do que do alelo C. Pode-se sugerir que a presença do alelo T pode estar

associada a um aumento nos níveis plasmáticos de PrtCR promovendo um risco no

desenvolvimento de doença cardiovascular.

Ao analisar os níveis plasmáticos de PrtCR em relação a presença de anticorpos para o

gênero Chlamydia, pode ser observado que mesmo nos grupo soronegativos ainda são

encontrados níveis plasmáticos significativamente maiores no grupo de pacientes (RM e TV)

do que no grupo controle. Entretanto, quando se estratificou a comparação em nível de

espécie, os níveis da proteína em pacientes de TV sem anticorpos para C.trachomatis e

C.pneumoniae se torna bastante reduzido quando comparado com o grupo com anticorpos.

Portanto, a presença de marcadores de infecção pelas duas espécies pode funcionar como um

estímulo transcricional, juntamente com outros fatores, influenciando na maior secreção de

PrtCR em pacientes com valvulopatias (Skowasch et al., 2009).

Em relação a IL-6, os pacientes cardíacos possuem níveis da citocina maiores do que o

grupo controle, confirmando sua contribuição no processo inflamatório sistêmico relacionado

à doença. Os resultados encontrados correspondem ao esperado, uma vez que a IL-6

desempenha uma importante ação na indução da resposta de fase aguda, através da ativação

de proteínas do sistema complemento, outras citocinas próinflamatórias, diferenciação de

linfócitos B com formação de anticorpos, ativação de linfócito T e diferenciação de

macrófagos, bem como atividades relacionadas a sintomas locais como ativação de células

endoteliais, proliferação de sinoviócitos dentre outras células (Ishihara & Hirano, 2002;

Abeywardena et al., 2009; Vakili et al., 2011). Além de todas estas propriedades, é

importante ressaltar o papel da IL-6 no estímulo de outras proteínas de fase aguda, incluindo a

PrtCR cujos níveis plasmáticos também se mostraram significativos nos pacientes deste

estudo (Castell et al., 1990).

Ao analisar os níveis plasmáticos de IL-6 de acordo com o perfil genotípico de

pacientes e controles, foi observado que os portadores do genótipo GG de RM e TV

apresentaram concentrações maiores da citocina do que no grupo controle. Estes dados são

105

concordantes com resultados anteriormente descritos para o polimorfismo onde a frequência

do genótipo GG foi maior no grupo de pacientes (Giacconi et al., 2004; Antonicelli et al.,

2005).

Estes dados reforçam o estudo de Fishman et al., 1998, pois além de descreverem o

polimorfismo referido, avaliaram a atividade transcricional dos diferentes alelos após

exposição ao LPS in vitro. Foi observado que o gene portador do alelo G possui uma

atividade transcricional maior do que o gene portador do alelo C.

Os altos níveis de IL-6 nos pacientes de RM independem da presença de anticorpos

anti-Chlamydia, uma vez que uma diferença estatisticamente significante ainda é observada

mesmo entre o grupo sem anticorpos e o grupo controle. Entretanto, quando a comparação

ocorre entre o grupo de TV e o controle, se observou um padrão de associação diferente. O

grupo com anticorpos para Chlamydia apresentou níveis plasmáticos tres vezes mais elevados

da citocina do que o grupo sem anticorpos, ocorrendo uma perda na significância estatística

deste último grupo quando comparado com o controle. Estes dados são reforçados ao

subdividir a análise em nível de espécie, o grupo de TV apresenta significância estatística

apenas nas amostras positivas para C.trachomatis. Esta relação não é observada no grupo de

RM e TV quando testamos a soropositividade para C.pneumoniae. Portanto, é possível sugerir

que a presença de C.trachomatis pode acentuar a resposta imunológica em pacientes com

valvulopatia através do aumento nos níveis plasmáticos de IL−6 (Mazzone et al., 2004; Vats

et al., 2007).

O presente estudo analisou o perfil de expressão gênica de tres marcadores: TNF-α,

IL-8, IL-10. Para os genes do TNF-α e IL-8, foi observada uma baixa expressão entre os

pacientes cardíacos, quanto comparamos com o perfil genotípico e sorológico da população

controle. Mesmo apresentando uma atividade pro-inflamatória, é possível compreender que

estes marcadores possam apresentar uma baixa expressão, pois o controle da resposta

imunológica depende de diversos mecanismos de sinalização celular, incluindo o fato de

algumas vias de ativação de IL-8 depender da atividade do TNF- α agindo como ativador

pluripotente da inflamação (Vlahopoulos et al., 1999). Uma citocina com baixa expressão

pode deixar de estimular a expressão de outra através da interação entre diferentes fatores de

transcrição (Antoniv & Ivashkiv, 2011). Já foi demonstrado que o TGF-β1, uma citocina com

propriedades antiinflamatórias, participa inibindo a migração de neutrófilos para o tecido

lesionado através da inibição da expressão de IL-8 (Smith et al., 1996). O papel da IL-10,

como uma citocina imunossupressora, já está bem estabelecido podendo agir inibindo a

106

expressão do TNF-α, IL-8 e outras citocinas através da desestabilização do mRNA (Rajasingh

et al., 2006; Yilma et al., 2012).

A IL-10 é identificada como um fator de imunomodulação, inibindo diversas respostas

como a produção de citocinas com perfil Th1, e em outros momentos, agindo como

estimuladora de outras respostas celulares (linfócitos B, linfócitos T, células endoteliais etc)

(Couper et al., 2008). A análise dos níveis de expressão da IL-10 de acordo com o perfil

genotípico demonstrou uma maior expressão gênica relacionada aos genótipos GG e AG.

Estes resultados são reforçados pelo estudo de Turner et al. (1998), que observaram uma

variação na secreção da citocina de acordo com o perfil genotípico. Summers et al., 2000

observaram uma baixa produção de IL-10 entre o grupo portador do alelo A. Desta forma, o

presente estudo descreveu uma associação significante entre a expressão de IL-10 e o perfil

genotípico que nos permite sugerir que, mesmo com níveis basais de expressão, a citocina

pode influenciar na inibição de outros marcadores como TNF-α e IL-8 (Turner et al., 1997;

Eskdale et al., 1998).

Nas últimas décadas as informações mostram que os fatores de risco comportamentais

e ambientais não contribuem de forma isolada para o desenvolvimento das doenças

cardiovasculares. A patogênese da aterosclerose e valvulopatias se desenvolve por meio de

diversos mecanismos que, agindo sinergicamente, contribuem para evolução e desfechos

desfavoráveis, como o aumento da incidência das doenças e morte (Vigen et al., 2005).

Este trabalho faz parte de um projeto maior, que em seu final, poderá elucidar diversos

mecanismos envolvidos na evolução das doenças cardíacas. Ainda que este estudo não

apresente uma importância clínica em curto prazo, estes resultados são de extrema relevância

para a melhor compreensão da suscetibilidade genética, interação entre os biomarcadores pró

e antiinflamatórios, controle de expressão gênica e o papel de agentes infecciosos como

potencializadores da inflamação. Estes e outros marcadores imunogenéticos, de estresse

oxidativo, vasculares e inflamatórios auxiliam na identificação apropriada dos reais fatores de

risco, nos permitindo visualizar a natureza específica da doença cardiovascular.

A partir deste conhecimento, é importante levar em consideração a investigação

genética e o aprofundamento da pesquisa de uma etiologia infecciosa das doenças cardíacas

analisadas no presente estudo. Desta forma, podem ser criadas novas estratégias preventivas;

por exemplo, o agrupamento de pacientes de acordo com seus fatores de risco individuais

direcionando a abordagens terapêuticas tanto em nível de prevenção primária como

secundária, através da administração diferencial de fármacos, controle da evolução clínica e

aumento da sobrevida de pacientes com doenças cardiovasculares.

107

5 CONCLUSÕES

(i) Os pacientes com doença arterial coronariana deste estudo foram em sua maioria homens,

com (média de idade de 60,4 anos, casados, com nível fundamental incompleto,

paraenses, e renda até tres salários mínimos;

(ii) Os pacientes com valvulopatias foram em sua maioria mulheres, com média de idade de

45,6 anos, solteiros, com nível fundamental incompleto, paraenses, e renda até tres

salários mínimos;

(iii) A prevalência geral de anticorpos para C.trachomatis foi relativamente maior no grupo

controle, apontando uma disseminação igual entre pacientes cardíacos e indivíduos

saudáveis da cidade de Belém;

(iv) A prevalência geral de anticorpos para C.pneumoniae foi semelhantes entre os grupos

analisados, mostrando uma alta exposição à C.pneumoniae na cidade de Belém;

(v) Não houve associação entre a alta soroprevalência de C.pneumoniae e a presença da

bactéria em tecidos e placas, uma vez que não foi detectada a presença de DNA da

bactéria em tecido vascular e cardíaco;

(vi) O DNA do plasmídio críptico de C.trachomatis foi encontrado em 7,4% das amostras,

demonstrando pela primeira vez na nossa região a possibilidade de novas perspectivas

sobre a etiologia da doença cardiovascular;

(vii) Os polimorfismos para os gene de PrtCR, TNF-a e IL-10 não demonstraram associação

com o desenvolvimento de doença cardiovascular;

(viii) A análise do polimorfismo rs1800795(−174G>C) de IL-6 demonstrou que o genótipo

GG foi associado a um risco duas a tres vezes maior no desenvolvimento de doença

cardiovascular, quando comparado com outros genótipos;

(ix) A análise do polimorfismo rs1800795(−174G>C) de IL-6 demonstrou que o genótipo GC

(heterozigoto) foi associado a uma proteção no desenvolvimento de doença

cardiovascular, quando comparado com outros genótipos;

108

(x) A análise do polimorfismo rs4073(−251T>A) de IL-8 demonstrou que o genótipo AA foi

associado a um risco duas vezes maior no desenvolvimento de doença de válvula

cardíaca, quando comparado com outros genótipos;

(xi) A análise do polimorfismo rs4073(−251T>A) de IL-8 demonstrou que o genótipo AT foi

associado a uma proteção no desenvolvimento de doença de válvula cardíaca, quando

comparado com outros genótipos;

(xii) A suscetibilidade genética de IL-6 e IL-8 ocorreu de forma independente dos resultados

sorológicos para C.trachomatis, porém a presença de anticorpos para C.pneumoniae

demonstrou ser um fator adicional ao risco de doença cardiovascular;

(xiii) Os níveis plasmáticos de PrtCR foram mais elevados nos pacientes do que no grupo

controle, e uma maior concentração foi associada a presença do genótipo TT,

reforçando o papel desta proteína como marcador de processos inflamatórios e risco a

doença cardiovascular;

(xiv) A presença de anticorpos para C.trachomatis e C.pneumoniae pode estimular uma

maior secreção de PrtCR em pacientes do doença de válvula cardíaca;

(xv) Os níveis plasmáticos de IL-6 foram mais elevados nos pacientes do que no grupo

controle, e uma maior concentração foi associada à presença do genótipo GG,

ressaltando o papel desta citocina na indução das respostas pró-inflamatórias,

possivelmente estimulando a secreção de proteínas de fase aguda (PrtCR).

(xvi) A presença de anticorpos para C.trachomatis pode estimular uma maior secreção de IL-6

em pacientes com doença de válvula cardíaca;

(xvii) As citocinas TNF-α e IL-8 mostraram uma baixa expressão gênica entre os pacientes

cardíacos;

(xviii) Os níveis de expressão gênica de IL-10 não se mostraram diferentes entre pacientes e

grupo controle, entretanto, estão associados a uma maior atividade transcricional para os

genótipos GG e AG de pacientes;

109

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABEYWARDENA, M.Y., LEIFERT, W.R., WARNES, K.E., VARGHESE, J.N., HEAD, R.J. Cardiovascular biology of interleukin-6. Current Pharmaveutical Design 15 (15): 1809-1821, 2009.

AGARWAL, A., CHANDER, Y. Chronic Chlamydia pneumoniae Infection and Bronchial Asthma: Is There a Link? Indian Journal of Medical Microbiology 26 (4): 338-341, 2008.

AGARWAL, A., CHANDER, Y., NAGENDRA, A. Serological evidence of chronic Chlamydia pneumonia infection in coronary artery disease. Medical Journal Armed Forces India 63 (3): 229-232, 2007.

ALLEN, M.H., WAKELIN, S.H., HOLLOWAY, D., LISBY, S., BAADSGAARD, O., BARKER, J.N.W.N., MCFADDEN, J.P. Association of TNFA gene polymorphism at position P308 with susceptibility to irritant contact dermatitis. Immunogenetics 51: 201–205, 2000.

ANDERSON, J.K., STROUD, R.M., VOLANAKIS, J.E. Studies on the binding specificity of human C-reactive protein for phosphorylcholine. Federation Proccedings 37: 1495, 1978.

ANDREASEN, J.J., FARHOLT, S., JENSEN, J.S. Failure to detect Chlamydia pneumoniae in calcific and degenerative arteriosclerotic aortic valves excised during open heart surgery. APMIS: acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica 106 (7): 717-720, 1998.

ANTONICELLI, R., OLIVIERI, F., BONAFE`, M., CAVALLONE, L., SPAZZAFUMO, L., MARCHEGIANI, F., CARDELLI, M., RECANATINI, A., TESTARMATA, P., GALEAZZI, L., BOEMI, M., PARATI, G., FRANCESCHI, C. The interleukin-6 -174 G > C promoter polymorphism is associated with an higher risk of death after an acute coronary syndrome in male elderly patients. International Journal of Cardiology 103: 266-271, 2005.

ANTONIV, T.T., IVASHKIV, L.B. Interleukin-10-induced gene expression and suppressive function are selectively modulated by the PI3K-Akt-GSK3 pathway. Immunology 132 (4): 567-577, 2011.

ATAR, S., TOLSTRUP, K., CERCEK, B., SIEGEL, R.J. Chlamydia pneumoniae antibody titers and cardiac calcifications: a cross-sectional serological-echocardiographic correlative study. The Israel Medical Association journal 9 (7): 517-520, 2007.

ATIK, B., SKWOR, T.A, KANDEL, R.P., SHARMA, B., ADHIKARI, H.K., STEINER, L.,ERLICH, H., DEAN, D. Identification of Novel Single Nucleotide Polymorphisms in Inflammatory Genes as Risk Factors Associated with Trachomatous Trichiasis. PLoS One 3 (10): e3600, 2008.

AYRES, M., AYRES JR, M., AYRES, D.L., SANTOS, A.S. BioEstat 5.3: aplicações estatísticas nas áreas das Ciências Biológicas e Médicas. Belém, 2011. 364p.

BACHMAIER, K., NEU, N., DE LA MAZA, L.M., PAL, S., HESSEL, A., PENNINGER, J.M. Chlamydia infections and heart disease linked through antigenic mimicry. Science 283 (5406): 1335-1339, 1999.

110

BÄCKHED, F., TORSTENSSON, E., SEGUIN, D., RICHTER-DAHLFORS, A., ROKBI, B. Helicobacter pylori infection induces interleukin-8 receptor expression in the human gastric epithelium. Infection & Immunity 71: 3357-3360, 2003.

BALISTRERI, C.R., VASTO, S., LISTI, F., GRIMALDI, M.P., LIO, D., COLONNA-ROMANO, G., CARUSO, M., CAIMI, G., HOFFMANN, E., CARUSO, C., CANDORE, G. Association between -1059G/C CRP polymorphism and acute myocardial infarction in a cohort of patients from Sicily: a pilot study. Annals of New York Academy of Science 1067: 276-281, 2006.

BARBARA, J.A., VAN OSTADE, X., LOPEZ, A. Tumour necrosis factoralpha (TNF-alpha): the good, the bad and potentially very effective. Immunology and Cell Biology 74: 434-443, 1996.

BASON, C., CORROCHER, R., LUNARDI, C., PUCCETTI, P., OLIVIERI, O., GIRELLI, D., NAVONE, R., BERI, R., MILLO, E., MARGONATO, A., MARTINELLI, N., PUCCETTI, A. Interaction of antibodies against cytomegalovirus with heat-shock protein 60 in pathogenesis of atherosclerosis. Lancet 362: 1971-1977, 2003.

BAYRAM, A., ERDOGAN, M.B., EKSI, F., YAMAK, B. Demonstration of Chlamydophila pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Cytomegalovirus, and Epstein-Barr virus in atherosclerotic coronary arteries, nonrheumatic calcific aortic and rheumatic stenotic mitral valves by polymerase chain reaction. The Anatolian Journal of Cardiology 11 (3): 237-243, 2011.

BEHRENS-BAUMANN, W. Chlamydial diseases of the eye. A short overview. Ophthalmologe 104 (1): 28-34, 2007.

BEKLER, C., KULTURSAY, N., OZACAR, T., SAYINER, A., YALAZ, M., AKISU, M. Chlamydial Infections in Term and Preterm Neonates. Japanese Journal of Infectious Disease 65: 1-6, 2012.

BELLIDO-CASADO, J., MARTÍN-ESCUDERO, J.C., TASENDE-MATA, J., MENA-MARTÍN, J., SIMAL-BLANCO, F., ORTIZ DE LEJARAZU, R. Chlamydophila pneumoniae seroprevalence in adults from the general population. Medicina clínica (Barcelona) 126 (20): 765-767, 2006.

BEN-YAAKOV, M., ESHEL, G., ZAKSONSKI, L., LAZAROVICH, Z., BOLDUR, I. Prevalence of antibodies to Chlamydia pneumoniae in an Israeli population without clinical evidence of respiratory infection. Journal of clinical pathology 55 (5): 355-358, 2002.

BERGOT, E. Epidemiology and mechanisms of pneumonia in adults. La Revue du praticien 61 (8): 1064-1070, 2011.

BEUTLER, B., CERAMI, A. The history, properties, and biological effects of cachectin. Biochemistry 27: 7575-7582, 1988.

BITTAR, M.N., CAREY, J.A., BARNARD, J.B., PRAVICA, V., DEIRANIYA, A.K., YONAN, N., HUTCHINSON, I.V. Tumor Necrosis Factor Alpha Influences the Inflammatory Response after Coronary Surgery. Annals of Thoracic Surgery 81: 132-138, 2006.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bayram%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21466993

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Erdo%C4%9Fan%20MB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21466993

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ek%C5%9Fi%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21466993

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Yamak%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21466993

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21466993

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bergot%20E%22%5BAuthor%5D

111

BLASI, F., TARSIA, P., AROSIO, C., FAGETTI, L., ALLEGRA, L. Epidemiology of Chlamydia pneumoniae. Clinical microbiology and infection 4 Suppl 4: S1-S6, 1998.

BOISVERT, W.A., CURTISS, L.K., TERKELTAUB, R.A. Interleukin-8 and its receptor CXCR2 in atherosclerosis. Immunology Research 21: 129-137, 2000.

BRAUN, N., MICHEL, U., ERNST, B.P., METZNER, R., BITSCH, A., WEBER, F., RIECKMANN, P. Gene polymorphism at position -308 of the tumor necrosis-factor-alpha (TNF-alpha) in multiple sclerosis and it’s influence on the regulation of TNF-alpha production. Neuroscience Letters 215: 75-78, 1996.

BREARLEY, B.F., HUTCHINSON, D.N. Endocarditis associated with Chlamydia trachomatis infection. British heart journal 46 (2): 220-221, 1981.

BRENNAN, F.M., MCLNNES, I.B. Evidence that cytokines play a role in rheumatoid arthritis. Journal of Clinical Investigation 118 (11): 3537-3545, 2008.

BRULL, D.J., MONTGOMERY, H.E., SANDERS, J., DHAMRAIT, S., LUONG, L., RUMLEY, A., LOWE, G.D., HUMPHRIES, S.E. Interleukin-6 gene –174G_C and –572G_C promoter polymorphisms are strong predictors of plasma interleukin-6 levels after coronary artery bypass surgery. Arteriosclerosis, thrombosis and Vascular Biology 21: 1458-1463, 2001.

BRULL, D.J., SERRANO, N., ZITO, F., JONES, L., MONTGOMERY, H.E., RUMLEY, A., SHARMA, P., LOWE, G.D., WORLD, M.J., HUMPHRIES, S.E., HINGORANI, A.D. Human CRP gene polymorphism influences CRP levels: implications for the prediction and pathogenesis of coronary heart disease. Arteriosclerosis, thrombosis, and Vascular Biology 23 (11): 2063-2069, 2003.

BURILLO, A., BOUZA, E. Chlamydophila pneumonia. Infectious disease clinics of North America 24 (1): 61-71, 2010.

BURTON, M., BAILEY, R., JEFFRIES, D., MABEY, D., HOLLAND, M. Cytokine and fibrogenic gene expression in the conjunctivas of subjects from a Gambian community where trachoma is endemic. Infection and Immunity 72: 7352-7356, 2004.

BYRNE, G.I., KALAYOGLU, M.V. Chlamydia pneumoniae and atherosclerosis: links to the disease process. American Heart Journal 138: 488-490, 1999.

CAIN, T.K., RANK, R.G. Local Th1-Like responses are induced by intravaginal infection of mice with the mouse pneumonitis biovar of Chlamydia trachomatis. Infection and Immunity 63 (5): 1784-1789, 1995.

CALDWELL, H.D., KROMHOUT, J., SCHACHTER, J. Purification and partial characterization of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis. Infection and Immunity 31: 1161, 1981.

CALIGIURI, G., RUDLING, M., OLLIVIER, V., JACOB, M.P., MICHEL, J.B., HANSSON, G.K., NICOLETTI, A. Interleukin-10 deficiency increases atherosclerosis, thrombosis, and low-density lipoproteins in apolipoprotein E knockout mice. Molecular Medicine (Cambridge, Mass.) 9 (1-2): 10-7, 2003.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Brennan%20FM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18982160

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=McInnes%20IB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18982160


112

CAMPBELL, L.A., KUO, C.C, GRAYSTON, J.T. Chlamydia pneumoniae and cardiovascular disease. Emerging Infectious Disease 4: 571-579, 1998.

CAMPBELL, L.A., YARAEI, K., VAN LENTEN, B., CHAIT, A., BLESSING, E., KUO, C.C., NOSAKA, T., RICKS, J., ROSENFELD, M.E. The acute phase reactant response to respiratory infection with Chlamydia pneumoniae: implications for the pathogenesis of atherosclerosis. Microbes and infection 12 (8-9): 598-606, 2010.

CASTELL, J.V., GÓMEZ-LECHÓN, M.J., DAVID, M., FABRA, R., TRULLENQUE, R., HEINRICH, P.C. Acute-phase response of human hepatocytes: regulation of acute-phase protein synthesis by interleukin-6. Hepatology 12 (5): 1179-1186, 1990.

CHEN, J., ZHAO, J., HUANG, J., SU, S., QIANG, B., GU, D. -717A>G polymorphism of human C-reactive protein gene associated with coronary heart disease in ethnic Han Chinese: the Beijing atherosclerosis study. Journal of Molecular Medicine 83 (1): 72-78, 2005.

CLARK, A.M., DESMEULES, M., LUO, W., DUNCAN, A.S., WIELGOSZ, A. Socioeconomic status and cardiovascular disease: risks and implications for care. Nature reviews Cardiology 6 (11): 712-722, 2009.

COLLINS, L., WHITE, J.A., BRADBEER, C. Lymphogranuloma Venereum. British Medical Journal 332: 66, 2006.

CONWAY, D.J., HOLLAND, M.J., BAILEY, R.L., CAMPBELL, A.E., MAHDI, O.S.M., JENNINGS, R., MBENA, E., MABEY, D.C.W. Scarring Trachoma Is Associated with Polymorphism in the Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-a) Gene Promoter and with Elevated TNF-a Levels in Tear Fluid. Infection and Immunity 65 (3): 1003-1006, 1997.

COSTA, M.M. Soroepidemiologia da Chlamydia trachomatis e de Chlamydia pneumoniae em pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica e asma e em pacientes com doença coronariana isquêmica. Dissertação (Mestrado em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários) – Belém, Universidade Federal do Pará, 2002. 138p.

COUPER, K.N., BLOUNT, D.G., RILEY, E.M. IL-10: The master regulator of immunity to infection. Journal of Immunology 180: 5771-5777, 2008.

C.pneumoniae infection and atherosclerosis overview. Disponível em: < http://www5.appliedbiosystems.com/tools/pathway/review.php? pathway= C. pneumoniae Infection in Atherosclerosis. Acesso em: 15.01.2012.

CRAVIOTO MDEL, C., MATAMOROS, O., VILLALOBOS-ZAPATA, Y., PEÑA, O., GARCÍA-LARA, E., MARTÍNEZ, M., CASTELO, J., SIFUENTES-OSORNIO, J. Prevalence of anti- Chlamydia trachomatis and anti-Neisseria gonorrhoeae antibodies in Mexican populations. Salud pública de México 45 Suppl 5: S681-S689, 2003.

DAN, M., TYRRELL, L.D., GOLDSAND, G. Isolation of Chlamydia trachomatis from the liver of a patient with prolonged fever. Gut 28 (11): 1514-1516, 1987.

DARVILLE, T. Chlamydia trachomatis Infections in Neonates and Young Children. Seminars in Pediatric Infectious Diseases 16 (4): 235-244, 2005.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S104518700500066X

http://www.sciencedirect.com/science/journal/10451870

113

DARVILLE, T., O’NEILL, J.M., ANDREWS, C.W.JR., NAGARAJAN, U.M., STAHL L., OJCIUS, D.M. Toll-like receptor-2, but not toll-like receptor-4, is essential for development of oviduct pathology in Chlamydial genital tract infection. Journal of Immunology 171: 6187-6197, 2003.

DAVIDSON, M., KUO, C.C., MIDDAUGH, J.P., CAMPBELL, L.A., WANG, S.P. NEWMAN, W.P.3RD, FINLEY, J.C., GRAYSTON, J.T. Confirmed previous infection with Chlamydia pneumoniae (TWAR) and its presence in early coronary atheroschlerosis. Circulation 98: 628-633, 1998.

DE BENEDETTI, F., PIGNATTI, P., BERNASCONI, S., GERLONI, V., MATSUSHIMA, K., CAPORALI, R., MONTECUCCO, C.M., SOZZANI, S., FANTINI, F., MARTINI, A. Interleukin 8 and monocyte chemoattractant protein-1 in patients with juvenile rheumatoid arthritis. Relation to onset types, disease activity, and synovial fluid leukocytes. Journal of Rheumatology 26: 425-431, 1999.

DE KRUIF, M.D., VAN GORP, E.C., KELLER, T.T., OSSEWAARDE, J.M., TEN CATE, H. Chlamydia pneumoniae infections in mouse models: relevance for atherosclerosis research.Cardiovasc Research 65 (2): 317-327, 2005.

Developmental Cycle of Chlamydia trachomatis. Disponível em: <http: //www.chlamydiae.com/docs/biology/biol_devreg.asp>. Acesso em: 20/11/2011.

DOMINGUEZ-RODRIGUEZ, A., ABREU-GONZALEZ, P., GARCIA-GONZALEZ, M., FERRER, J. Prognostic value of interleukin-8 as a predictor of heart failure in patients with myocardial infarction and percutaneous intervention. International Journal of Cardiology 111: 158-160, 2006.

ENTRICAN, G., WATTEGEDERA, S., ROCCHI, M., FLEMING, D.C, KELLY, R.W., WATHNE, G., MAGDALENIC, V., HOWIE, S.E. Induction of inflammatory host immune response by organisms belonging to the genera Chlamydia/Chlamydophila. Veterinary Immunology and Immunopathology 100: 179-186, 2004.

EPI INFO™ VERSION 3.5.3. Atlanta: Centers for Disease Control and Prevention. Division of Public Health Surveillance and Informatics, 2004. Disponível em: <http://www.cdc.gov/epiinfo/Epi6/ei6.htm/>. Acesso em: 15/02/2012.

ESKDALE, J., GALLAGHER, G., VERWEIJ, C.L., KEIJSERS, V., WESTENDORP, R.G., HUIZINGA, T.W. Interleukin 10 secretion in relation to human IL-10 locus haplotypes. The Proceedings of the National Academy of Sciences 495 (16): 9465-9470, 1998.

ETIENNE, J., ORY, D., THOUVENOT, D., EB, F., RAOULT, D., LOIRE, R., DELAHAYE, J.P., BEAUNE, J. Chlamydial endocarditis: a report on ten cases. European Heart Journal 13 (10): 1422-1426, 1992.

EVERETT, K.D., BUSH, R.M., ANDERSEN, A.A. Emended description of the order Chlamydiales, proposal of Parachlamydiaceae fam. nov. and Simkaniaceae fam. nov., each containing one monotypic genus, revised taxonomy of the family Chlamydiaceae, including a new genus and five new species, and standards for the identification of organisms. International Journal of Systematic Bacteriology 49 (2): 415-440, 1999.

FAAL, N., BAILEY, R., SARR, I., JOOF, H., MABEY, D., HOLLAND, M.J. Temporal cytokine gene expression patterns in subjects with trachoma identify distinct

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22de%20Kruif%20MD%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22van%20Gorp%20EC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Keller%20TT%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ossewaarde%20JM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22ten%20Cate%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22ten%20Cate%20H%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Everett%20KD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10319462

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bush%20RM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10319462

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Andersen%20AA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=10319462


114

conjunctival responses associated with infection. Clinical & Experimental Immunology 142: 347-353, 2005.

FAN, J., WATANABE, T. Inflamatory reactions in the pathogenesis of atherosclerosis. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis 10 (2): 63-71, 2003.

FEITOSA, R.N.M. Associação entre marcadores da resposta inflamatória e a imunopatogênese de agentes infecciosos de natureza viral (Vírus da dengue, HTLV-1 e HTLV-2) e bacteriana (Chlamydia trachomatis e Chlamydia pneumoniae). Tese (Doutorado em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários) – Belém, Universidade Federal do Pará, 2010. 174p.

FERNANDES, A.M., BITENCOURT, L.S., LESSA, I.N., VIANA, A., PEREIRA, F., BASTOS, G., DE MACEDO, C.R., ARAS JÚNIOR, R. Impact of socio-economic profile on the prosthesis type choice used on heart surgery. Revista brasileira de cirurgia cardiovascular 27 (2): 211-216, 2012.

FERNANDEZ-BOTRAN, R., SANDERS, V.M., MOSMANN, T.R., VITETTA, E.S. Lymphokine-mediated regulation of the proliferative response of clones of T helper I and T helper 2 cells. Journal of Experimental Medicine, 168: 543-558, 1988.

FERNANDEZ-REAL, J.M., BROCH, M., VENDRELL, J., RICHART, C., RICART, W. Interleukin-6 gene polymorphism and lipid abnormalities in healthy subjects. The Journal of clinical endocrinology and metabolism 85: 1334-1339, 2000.

FERRARI, M., WERNER, G.S., RICHARTZ, B.M., OEHME, A., STRAUBE, E., FIGULLA, H.R. Lack of association between Chlamydia Pneumoniae serology and endothelial dysfunction of coronary arteries. Cardiovascular Ultrasound 3: 12, 2005.

FIORENTINO, D.F., BOND, M.W., MOSMANN, T.R. Two types of mouse helper T cell. IV. Th2 clones secrete a factor that inhibits cytokine production by Thl clones. Journal of Experimental Medicine 170: 2081-2095, 1989.

FISHMAN, D., FAULDS, G., JEFFERY, R., MOHAMED-ALI, V., YUDKIN, J.S., HUMPHRIES, S., WOO, P. The effect of novel polymorphisms in the interleukin-6 (IL-6) gene on IL-6 transcription and plasma IL-6 levels, and an association with systemic-onset juvenile chronic arthritis. Journal of Clinical Investigation 102: 1369-1376, 1998.

FLOYD-SMITH, G., WHITEHEAD, A.S., COLTEN, H.R., FRANCKE, U. The human C-reactive protein gene (CRP) and serum amyloid P component gene (APCS) are located on the proximal long arm of chromosome 1. Immunogenetics 24: 171-176, 1986.

FONG, I.W. Infecção e Aterosclerose: Evidência para Possíveis Associações. Geriatrics & Aging 6 (9): 1-9, 2003.

FOSTER, C.B., LEHRNBECHER, T., SAMUELS, S., STEIN, S., MOL, F., METCALF, J.A., WYVILL, K., STEINBERG, S.M., KOVACS, J., BLAUVELT, A., YARCHOAN, R., CHANOCK, S.J. An IL6 promoter polymorphism is associated with a lifetime risk of development of Kaposi sarcoma in men infected with human immunodeficiency virus. Blood 96: 2562-2567, 2000.

FUJISHIMA, S., SASAKI, J., SHINOZAWA, Y., TAKUMA, K., HORI, S., AIKAWA, N. Interleukin 8 in ARDS. Lancet 342: 237-238, 1993.

115

FUKUSHI, H., HIRAI, K. Proposal of Chlamydia pecorum sp. nov. for Chlamydia strains derived from ruminants. International Journal of Systematic Bacteriology 42: 306-308, 1993.

GALANTE, A., PIETROIUSTI, A., VELLINI, M., PICCOLO, P., POSSATI, G., DE BONIS, M., GRILLO, R.L., FONTANA, C., FAVALLI, C. C-reactive protein is increased in patients with degenerative aortic valvular stenosis. Journal of the American College of Cardiology 38 (4): 1078-1082, 2001.

GALKINA, E., LEY, K. Immune and Inflammatory Mechanisms of Atherosclerosis. Annual review of immunology 27: 165-197, 2009.

GANSTER, R.W., GUO, Z., SHAO, L., GELLER, D.A. Differential effects of TNF-alpha and IFN-gamma on gene transcription mediated by NF-kappaB-Stat1 interactions. Journal of interferon & cytokine research 25 (11): 707-719, 2005.

GARCÍA-ELORRIAGA, G.L., CALDERÓN-ABBO, M., GONZÁLEZ-BONILLA, C.R. Association between cardiovascular disease and anti-Chlamydia pneumoniae antibodies. Salud pública de México 44 (3): 243-246, 2002.

GAYDOS, C.A., QUINN, T.C. The role of Chlamydia pneumoniae in cardiovascular disease. Advanced Internal Medicine 45: 139-173, 2000.

GAYDOS, C.A., SUMMERSGILL, J.T., SAHNEY, N.N., RAMIREZ, J.A., QUINN, T.C. Replication of Chlamydia pneumoniae in vitro in human macrophages, endothelial cells, and aortic smooth muscle cells. Infection and Immunity 64: 1614-1620, 1996.

GENE DATABASE OF NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION (NCBI). Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/>. Acesso em: 09/11/2013.

GENG, Y., SHANE, R.B., BERENCSI, K., GONCZOL, E., ZAKI, M.H., MARGOLIS, D.J., TRINCHIERI, G., ROOK, A.H. Chlamydia pneumoniae inhibits apoptosis in human peripheral blood mononuclear cells through induction of IL-10. The Journal of immunology 164: 5522-5529, 2000.

GEORGE, J.A., PANCHATCHARAM, T.S., PARAMASIVAM, R., BALASUBRAMANIAN, S., CHAKRAPAM, V., MURUGAN, G. Evaluation of diagnostic efficacy of PCR methods for Chlamydia trachomatis infection in genital and urine specimens of symptomatic men and women in India. Journal Infectious Disease 56: 88-92, 2003.

GIACCONI, R., CIPRIANO, C., ALBANESE, F., BOCCOLI, G., SABA, V., OLIVIERI, F., FRANCESCHI, C., MOCCHEGIANI, E. The -174G/C polymorphism of IL-6 is useful to screen old subjects at risk for atherosclerosis or to reach successful ageing. Experimental Gerontology 39: 621-628, 2004.

GIFFORD, R.W.Jr. The role of multiple risk factors in cardiovascular morbidity and mortality. Cleveland Clinic Journal of Medicine 60 (3): 211-218, 1993.

GIRNDT, M., KÖHLER, H. Interleukin-10 (IL-10): an update on its relevance for cardiovascular risk. Nephrology, dialysis, transplantation 18: 1976-1979, 2003.


116

GODZIK, K.L., O’BRIEN, E.R., WANG, S.K., KUO, C.C. In vitro susceptibility of human vascular wall cells to infection with Chlamydia pneumoniae. Journal of Clinical Microbiology 33: 2411-2414, 1995.

GOSWAMIM, B., RAJAPPA, M., MALLIKA, V., SHUKLA, D.K., KUMAR, S. TNF-α/IL-10 ratio and C-reactive protein as markers of the inflammatory response in CAD-prone North Indian patients with acute myocardial infarction. Clinica Chimica Acta 10.1016/j.cca.2009.06.029: 1-5, 2009.

GRAYSTON, J.T. Background and current knowledge of Chlamydia pneumoniae and atherosclerosis. Journal of Infectious Disease 181 (3): S402-S410, 2000.

GRAYSTON, J.T., KUO, C.C., CAMPBELL, L.A., WANG, S.P. Chlamydia pneumoniae sp. nov. for Chlamydia sp. strain TWAR. International. Journal of Systematic Bacteriology 39: 88-90, 1989.

GRAYSTON, J.T., KUO, C.C., WANG, S.P., ALTMAN, J. A new Chlamydia psittaci strain, TWAR, isolated in acute respiratory tract infection. New England Journal of Medicine 315: 161-168, 1986.

GREUB, G. International Committee on Systematics of Prokaryotes Subcommittee on the taxonomy of the Chlamydiae: Minutes of the closed meeting, 21 June 2010, Hof bei Salzburg, Austria. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 60: 2694, 2010.

GRIMM, M.C., ELSBURY, S.K., PAVLI, P., DOE, W.F. Interleukin 8: cells of origin in inflammatory bowel disease. Gut 38: 90-98, 1996.

GRISELLI, M., HERBERT, J., HUTCHINSON, W.L., TAYLOR, K.M., SOHAIL, M., KRAUSZ, T., PEPYS, M.B. C-reactive protein and complement are important mediators of tissue damage in acute myocardial infarction. Journal of Experimental Medicine 190: 1733-1739, 1999.

GROSS, V., ANDREESEN, R., LESER, H.G., CESKA, M., LIEHL, E., LAUSEN, M., FARTHMANN, E.H., SCHÖLMERICH, J. Interleukin-8 and neutrophil activation in acute pancreatitis. European Journal of Clinical Investigation 22: 200-203, 1992.

HACKING, D., KNIGHT, J.C., ROCKETT, K., BROWN, H., FRAMPTON, J., KWIATKOWSKI, D.P., HULL, J., UDALOVA, I.A. Increased in vivo transcription of an IL-8 haplotype associated with respiratory syncytial virus disease susceptibility. Genes & Immunity 5: 274-282, 2004.

HAGE, F.G., SZALAI, A.J. C-reactive protein gene polymorphisms, C-reactive protein blood levels, and cardiovascular disease risk. Journal of the American College of Cardiology 50: 1115-1122, 2007.

HAJEER, A.H., HUTCHINSON, I.V. TNF-a Gene Polymorphism: Clinical and Biological Implications. Microscopy Research and Technique 50: 216-228, 2000.

HALL, T.A. BioEdit: a user-frendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleics Acids Symposium Series 41: 95-98, 1999.

HAMMERSCHLAG, M.R. Neonatal conjunctivitis. Pediatric Annals 22: 346-351, 1993.

117

HARADA, A., SEKIDO, N., AKAHOSHI, T., WADA, T., MUKAIDA, N., MATSUSHIMA, K. Essential involvement of interleukin-8 (IL-8) in acute inflammation. Journal of Leukocyte Biology 56: 559-564, 1994.

HATCH, T.P., ALLAN, I., PEARCE, J.H. Structural and polypeptide differences between envelopes of infective and reproductive life cycle forms of Chlamydia spp. Journal of Bacteriology 157 (1): 13-20, 1984.

HATCH, T.P., MICELI, M., SUBLETT, J.E. Synthesis of disulfide-bonded outer membrane proteins during the developmental cycle of Chlamydia psittaci and Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology 165: 379-385, 1986.

HIGUCHI-DOS-SANTOS, M.H., PIERRI, H., HIGUCHI, M.L., NUSSBACHER, A., PALOMINO, S., SAMBIASE, N.V., RAMIRES, J.A.F., WAJNGARTEN, M. Chlamydia pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae in calcified nodes of stenosed aortic valves. Arquivos brasileiros de cardiologia 84 (6): 443-448, 2005.

HIRANO, T., YASUKAWA, K., HARADA, H., TAGA, T., WATANABE, Y., MATSUDA, T., KASHIWAMURA, S., NAKAJIMA, K., KOYAMA, K., IWAMATSU, A., TSUNASAWA, S., SAKIYAMA, F., MATSUI, H., TAKAHARA, Y., TANIGUCHI, T., KISHIMOTO, T. Complementary DNA for a novel human interleukin (BSF-2) that induces B lymphocytes to produce immunoglobulin. Nature 324: 73-76, 1986.

HOGAN, R.J., MATHEWS, S.A., MUKHOPADHYAY, S., SUMMERSGILL, J.T., TIMMS, P. Chlamydial persistence: beyond the biphasic paradigm. Infection and Immunity 72 (4): 1843-1855, 2004.

HOHLER, T., KRUGER, A., GERKEN, G., SCHNEIDER, P.M., MEYER, Z.B.K., RITTNER, C. A tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) promoter polymorphism is associated with chronic hepatitis B infection. Clinical & Experimental Immunology 111: 579-582, 1998.

HONEY, E., TEMPLETON, A. Prevention of pelvic inflammatory disease by the control of C. trachomatis infection. International Journal of Gynecology and Obstetrics 78 (3): 257-261, 2002.

HUIZINGA, T.W., WESTENDORP, R.G., BOLLEN, E.L., KEIJSERS, V., BRINKMAN, B.M., LANGERMANS, J.A., BREEDVELD, F.C., VERWEIJ, C.L., VAN DE GAER, L., DAMS, L., CRUSIUS, J.B., GARCIA-GONZALEZ, A., VAN OOSTEN, B.W., POLMAN, C.H., PERIA, A.S. TNF-alpha promoter polymorphisms, production and susceptibility to multiple sclerosis in different groups of patients. Journal of Neuroimmunology 72: 149, 1997.

HULL, J., THOMSON, A., KWIATKOWSKI, D. Association of respiratory syncytial virus bronchiolitis with the interleukin 8 gene region in UK families. Thorax 55: 1023-1027, 2000.

IGIETSEME, J.U., ANANABA, G.A., CANDAL, D.H., LYN, D., BLACK, C.M. Immune control of chlamydia growth in the human epithelial cell line RT4 involves multiple mechanisms that include nitric oxide induction, tryptophan catabolism and iron deprivation. Microbial Immunology 42: 617-625, 1998.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hatch%20TP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Allan%20I%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pearce%20JH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hogan%20RJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15039303

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Mathews%20SA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15039303

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Mukhopadhyay%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15039303

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Summersgill%20JT%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15039303

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Timms%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15039303

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Timms%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15039303


118

ISHAK, M.O.G., ISHAK, R. O impacto da infecção por Chlamydia em populações indígenas da Amazônia brasileira. Cadernos de Saúde Pública (17): 385-396, 2001.

ISHIHARA, K., HIRANO, T. IL-6 in autoimmune disease and chronic inflammatory proliferative disease. Cytokine Growth Factor Review 13: 357-368, 2002.

JOHNSTON, S.C., MESSINA, L.M., BROWNER, W.S., LAWTON, M.T., MORRIS, C., DEAN, D. C-Reactive Protein Levels and Viable Chlamydia pneumoniae in Carotid Artery Atherosclerosis. Stroke 32: 2748-2752, 2001.

JONES, B.R. Prevention of blindness from Trachoma. Transactions of the Ophthalmological Society 95: 16-33, 1975.

JUVONEN, J., JUVONEN, T., LAURILA, A., KUUSISTO, J., ALARAKKOLA, E., SÄRKIOJA, T., BODIAN, C.A., KAIRALUOMA, M.I., SAIKKU, P. Can degenerative aortic valve stenosis be related to persistent Chlamydia pneumoniae infection? Annals of internal medicine 128 (9): 741-744, 1998.

KALMAN, S., MITCHELL, W., MARATHE, R., LAMMEL, C., FAN, J., HYMAN, R.W., OLINGER, L., GRIMWOOD, J., DAVIS, R.W., STEPHENS, R. Comparative genomes of Chlamydia pneumoniae and C. trachomatis. Nature Genetics 21: 385-389, 1999.

KANDA, T., HIRAO, Y., OSHIMA, S., YUASA, K., TANIGUCHI, K., NAGAI, R., KOBAYASHI, I. Interleukin-8 as a sensitive marker of unstable coronary artery disease. American Journal of Cardiology 77: 304-307, 1996.

KAPERONIS, E.A., LIAPIS, C.D., KAKISIS, J.D., DIMITROULIS, D., PAPAVASSILIOU, V.G., PERREA, D., KOSTAKIS, A.G. Inflammation and Chlamydia pneumoniae Infection Correlate with the Severity of Peripheral Arterial Disease. European Journal of Vascular and Endovascascular Surgery 31: 509-515, 2006.

KAPLAN, G.A., KEIL, J.E. Socioeconomic factors and cardiovascular disease: a review of the literature. Circulation 88: 1973-1998, 1993.

KARACA, E., KAYIKÇIOĞLU, M., ONAY, H., GÜNDÜZ, C., OZKINAY, F. The effect of interleukin-10 gene promoter polymorphisms on early-onset coronary artery disease. The Anatolian journal of cardiology 11 (4): 285-289, 2011.

KARIAGINA, A.S., ALEKSEEVSKIĬ, A.V., SPIRIN, S.A., ZIGANGIROVA, N.A., GINTSBURG, A.L. Effector proteins of Clamidia. Molecular Biology (Mosk) 43 (6): 963-983, 2009.

KATHIRESAN, S., LARSON, M.G., VASAN, R.S., GUO, C.Y., GONA, P., KEANEY, J.F. JR., WILSON, P.W., NEWTON-CHEH, C., MUSONE, S.L., CAMARGO, A.L., DRAKE, J.A., LEVY, D., O'DONNELL, C.J., HIRSCHHORN, J.N., BENJAMIN, E.J. Contribution of clinical correlates and 13 C-reactive protein gene polymorphisms to interindividual variability in serum C-reactive protein level. Circulation 113 (11): 1415-1423, 2006.

KELBERMAN, D., FIFE, M., ROCKMAN, M.V., BRULL, D.J., WOO, P., HUMPHRIES, S.E. Analysis of common IL-6 promoter SNP variants and the AnTn tract in humans and primates and effects on plasma IL-6 levels following coronary artery bypass graft surgery. Biochemica e Biophysica Acta 1688 (2): 160-167, 2004.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kariagina%20AS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20088373

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Alekseevski%C4%AD%20AV%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20088373

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Spirin%20SA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20088373

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Zigangirova%20NA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20088373

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gintsburg%20AL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20088373


119

KIECHL, S., WILLEIT, J. The Natural Course of Atherosclerosis : Part I: Incidence and Progression. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 19: 1484-1490, 1999.

KIM, J. M., BRANNAN, C I., COPELAND, N. G., JENKINS, N. A., KHAN, T. A., MOORE, K. W . Structure of the mouse interleukin- IO gene and chromosomal localization of the mouse and human genes. Journal of Immunology 148: 3618-23, 1992.

KISHIMOTO, T. Interleukin-6: from basic science to medicine - 40 years in immunology. Annual Reviews of Immunology 23: 1-21, 2005.

KOEHLER, L., NETTELNBREKER, E., HUDSON, A.P., OTT, N., GÉRARD, H.C., BRANIGAN, P.J., SCHUMACHER, H.R., DROMMER, W., ZEIDLER, H. Ultrastructural and molecular analyses of the persistence of Chlamydia trachomatis (serovar K) in human monocytes. Microbial pathogenesis 22 (3): 133-142, 1997.

KOH, W.P., TAYLOR, M.B., HUGHES, K., CHEW, S.K., FONG, C.W., PHOON, M.C., KANG, K.L., CHOW, V.T. Seroprevalence of IgG antibodies against Chlamydia pneumoniae in Chinese, Malays and Asian Indians in Singapore. International journal of epidemiology 31 (5): 1001-1007, 2002.

KOL, A., BOURCIER, T., LICHTMAN, A.H., LIBBY, P. Chlamydial and human heat shock protein 60s activate human vascular endothelium, smooth muscle cells, and macrophages. The Journal of Clinical Investigation 103: 571-577, 1999.

KOL, A., SUKHOVA, G.K., LICHTMAN, A.H., LIBBY, P. Chlamydial heat shock protein 60 localizes in human atheroma and regulates macrophage tumor necrosis factor alpha and matrix metalloproteinase expression. Circulation 98: 300-307, 1998.

KOVACIC, J.C., MORENO, P., HACHINSKI, V., NABEL, E.G., FUSTER, V. Cellular senescence, vascular disease, and aging: Part 1 of a 2-part review. Circulation 123 (15): 1650-1660, 2011

KROEGER, K.M., CARVILLE, K.S., ABRAHAM, L.J. The -308 tumor necrosis factor-alpha promoter polymorphism effects transcription. Molecular Immunology 34: 391-399, 1997.

KUO C.C., CAMPBELL, L.A. Detection of Chlamydia pneumoniae in arterial tissues. Journal of Infectious Disease 181 (3): 432-434, 2000.

KUO, C.C., CAMPBELL, L.A., FUKUSHI, H., PANTTON, D.L., GRAYSTON, J.T. Demonstration of Chlamydia pneumoniae in atherosclerotic lesions of coronary arteries. Journal of Infectious Disease 167: 841-849, 1993.

KUO, C.C., GRAYSTON, J.T., CAMPBELL, L.A., GOO, Y.A., WISSLER, R.W., BENDITT, E.P. Chlamydia pneumoniae (TWAR) in coronary arteries of young adults (15-34 years old). Proceedings of the National Academy of Sciences 92: 6911-6914, 1995.

LACRAZ, S., NICOD, L.P., CHICHEPORTICHE, R., WELGUS, H.G., DAYER, J.M. IL-10 inhibits metalloproteinase and stimulates TIMP-1 production in human mononuclear phagocytes. The Journal of clinical investigation 96: 2304-2310, 1995.

120

LAITINEN, K., LAURILA, A., PYHALA, L., LEINONEN, M., SAIKKU, P. Chlamydia pneumoniae infection induces inflammatory changes in the aortas of rabbits. Infection & Immunity 65: 4832-4835, 1997.

LAND, J.A., VAN BERGEN, J.E., MORRÉ, S.A., POSTMA, M.J. Epidemiology of Chlamydia trachomatis infection in women and the cost-effectiveness of screening. Human Reproduction Update 16 (2): 189-204, 2010.

LIMA, H.E., OLIVEIRA, M.B., VALENTE, B.G., AFONSO, D.A.F., DAROCHA, W.D., SOUZA, M.C.M., ALVIM, T.C. STACIOLI, E.F.B., NORONHA, F.S.M. Genotyping of Chlamydia trachomatis from endocervical specimens in Brazil. Sexually Transmitted Diseases 34: 709-717, 2007.

LIVAK, K.J., SCHMITTGEN T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(−Delta Delta CT) Method. Methods, 25 (4): 402-408, 2001.

LOOMIS, W.P., STARNBACH, M.N. T cell responses to Chlamydia trachomatis. Current Opinion in Microbiology 5: 87-91, 2002.

MAIA, I.L., NICOLAU, J.C., MACHADO, M.N., MAIA, L.N., TAKAKURA, I.T., ROCHA, P.R., CORDEIRO, J.A., RAMIRES, J.A. Prevalence of Chlamydia pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae in different forms of coronary disease. Arquivos Brasileiros de Cardioliologia 92(6): 439-445, 2009

MAKHATADZE, N.J. Tumor Necrosis Factor Locus: Genetic Organisation and Biological Implications. Human Immunology 59: 571-579, 1998.

MANAVI, K. A review on infection with Chlamydia trachomatis. Best Practice & Research Clinical Obstetrics and Gynecology 20 (6): 941-951, 2006.

MATSUMOTO, A. Electron microscopic observations of surface projections on Chlamydia psittaci reticulate bodies. Journal of Bacteriology 150: 358-364, 1982.

MAVROVENI, S., MANOUSSAKIS, M., SPARGIAS, K., KOLOVOU, G., SAROGLOU, G., COKKINOS, D.V. Myocardial involvement in a patient with chlamydia trachomatis infection. Journal of cardiac failure 14 (4): 351-353, 2008.

MAYNARD, J.W., FANG, H., PETRI, M. Low socioeconomic status is associated with cardiovascular risk factors and outcomes in systemic lupus erythematosus. The Journal of Rheumatology 39 (4): 777-783, 2012.

MAZZONE, A., EPISTOLATO, M.C., DE CATERINA, R., STORTI, S., VITTORINI, S., SBRANA, S., GIANETTI, J., BEVILACQUA, S., GLAUBER, M., BIAGINI, A., TANGANELLI, P. Neoangiogenesis, T-lymphocyte infiltration, and heat shock protein-60 are biological hallmarks of an immunomediated inflammatory process in end-stage calcified aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology 43 (9): 1670-1676, 2004.

MCGUIRE, W., HILL, A.V., ALLSOPP, C.E., GREENWOOD, B.M., KWIATKOWSKI, D. Variation in the TNF-alpha promoter region associated with susceptibility to cerebral malaria. Nature 371: 508-510, 1994.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Land%20JA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19828674

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Van%20Bergen%20JE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19828674

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Morr%C3%A9%20SA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19828674

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Postma%20MJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19828674



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=









121

MELNICK, S.L., SHAHAR, E., FOLSOM, A.R., GRAYSTON, J.T., SORLIE, P.D., WANG, S.P., SZKLO, M. Past infection by Chlamydia pneumonia strain TWAR and asymptomatic carotid atherosclerosis. Atherosclerosis Risk in Communities (ARIC) Study Investigators. American Journal of Medicine 95: 499-504, 1993.

MEZA-JUNCO, J., MONTAÑO-LOZA, A., CASTILLO-MARTÍNEZ, L., OREA-TEJEDA, A., REMES-TROCHE, J.M., VILLALOBOS-ZAPATA, I., PONCE-DE LEÓN-GARDUÑO, A., CALVA-MERCADO, J. High prevalence of Chlamydia pneumoniae seropositivity in Mexican patients with ischemic heart disease. Archives of medical research 35 (4): 318-323, 2004.

MILLER, M.P. Tools for population Genetic Analyses (TFPGA) 1.3v. A windows program for the analysis of allozyme and molecular population genetic data. Department of Biological Sciences Northern Arizona University. 1999.

MIYASHITA, N., FUKANO, H., YOSHIDA, K., NIKI, Y., MATSUSHIMA, T. Seroepidemiology of Chamydia pneomoniae in Japan between 1991 and 2000. Journal of clinical pathology 55 (2): 115-117, 2002.

MOORE, K.W., MALEFYT, R.W., COFFMAN, R.L., O’GARRA, A. Interleukin-10 and the interleukin-10 receptor. Annual Review of Immunology 19: 683-765, 2001.

MOORE, K.W., O'GARRAL, A., MALEFYT, R.W., VIEIRA, P., MOSMANN, T.R. Interleukin-10. Annual Review of Immunology 11: 165-190, 1993.

MORRÉ, S.A., OSSEWAARDE, J.M., LAN, J., VAN DOORNUM, G.J.J., WALBOOMERS, J.M.M., MACLAREN,D.M., MEIJER, C.J., VAN DEN BRULE, A.J. Serotyping and Genotyping of Genital Chlamydia trachomatis Isolates Reveal Variants of Serovars Ba, G, and J as Confirmed by omp1 Nucleotide Sequence Analysis. Journal of Clinical Microbiology 36 (2): 345-351, 1998.

MOULDER, J.W. Looking at Chlamydiae without looking at their hosts. American Society of Microbiology News 50: 353-362, 1984.

MOULDER, J.W. Interaction of Chlamydiae and host cells in vitro. Microbiological Reviews 55: 143-190, 1991.

MOULDER, J.W. The relation of the psittacosis group (chlamydiae) to bacteria and viruses. Annual Review of Microbiology 20: 107-130, 1966.

MUKAIDA, N., SHIROO, M., MATSUSHIMA, K. Genomic structure of the human monocytederived neutrophil chemotactic factor IL-8. Journal of Immunology 143: 1366-1371, 1989.

MYŚLIWSKA, J., WIECKIEWICZ, J., HAK, L., SIEBERT, J., ROGOWSKI, J., SZYNDLER, K., MYŚLIWSKI, A. Interleukin 6 polymorphism corresponds to the number of severely stenosed coronary arteries. European cytokine network 17 (3): 181-188, 2006.

NABEL, E.G., BRAUNWALD, E. A tale of coronary artery disease and myocardial infarction. New England Journal of Medicine 366 (1): 54-63, 2012.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Nabel%20EG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22216842

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Braunwald%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22216842


122

NADEL, S., NEWPORT, M.J., BOOY, R., LEVIN, M. Variation in the tumor necrosis factor-alpha gene promoter region may be associated with death from meningococcal disease. Journal of Infectious Disease 174: 878-880, 1996.

NAIR, J., SHANKER, J., JAMBUNATHAN, S., ARVIND, P., KAKKAR, V.V. Expression Analysis of Leukotriene-Inflammatory Gene Interaction Network in Patients with Coronary ArteryDisease. Journal of atherosclerosis and thrombosis 2013: ID: 20123, 2013.

NAMBURI, R.P., PONNALA, A.R., KARTHIK, T.S., RANI, P.R., MAHESHWARI, R. A study on metabolic variables and its association with high sensitive C-reactive protein in obese children and adolescents. Indian journal of endocrinology and metabolism 17(Suppl1): S360-S362, 2013.

NASH, S.D., CRUICKSHANKS, K.J., KLEIN, R., KLEIN, B.E., NIETO, F.J., RYFF, C.D., KRANTZ, E.M., SHUBERT, C.R., NONDAHL, D.M., ACHER, C.W. Socioeconomic status and subclinical atherosclerosis in older adults. Preventive Medicine 52 (3): 208-212, 2011.

NATARAJAN, S., LIAO, Y., CAO, G., LIPSITZ, S.R., MCGEE, D.L. Sex differences in risk for coronary heart disease mortality associated with diabetes and established coronary heart disease. Archives of Internal Medicine 163 (14): 1735-1740, 2003.

National center for biotechnology information. Blast Assembly Genomes. Disponível em <http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.>. Acesso em: 30/11/2013.

NATIVIDAD, A., HANCHARD, N., HOLLAND, M.J., MAHDI, O.S., DIAKITE, M., ROCKETT, K., JALLOW, O., JOOF, H.M., KWIATKOWSKI, D.P., MABEY, D.C., BAILEY, R.L. Genetic variation at the TNF locus and the risk of severe sequelae of ocular Chlamydia trachomatis infection in Gambians. Genes and Immunity 8 (4): 288-295, 2007.

NAZMI, A., DIEZ-ROUX, A.V., JENNY, N.S., TSAI, M.Y., SZKLO, M., AIELLO, A.E. The influence of persistent pathogens on circulating levels of inflammatory markers: a cross-sectional analysis from the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis. BMC Public Health 10: 706, 2010.

NGEH, J., ANAND, V., GUPTA, S. Chlamydia pneumoniae and atherosclerosis - what we know and what we don't. Clinical Microbiology and Infection 8 (1): 2-13, 2002.

NIU, W., LIU, Y., QI, Y., WU, Z., ZHU, D., JIN, W. Association of interleukin-6 circulating levels with coronary artery disease: a meta-analysis implementing mendelian randomization approach. International journal of cardiology 157 (2): 243-252, 2012.

O’CONNELL, C.M., INGALLS, R.R., ANDREWS JR, C.W., SKURLOCK, A.M., DARVILLE T. Plasmid-deficient Chlamydia muridarum fail to induce immune pathology and protect against oviduct disease. Journal of Immunology 179: 4027-4034. 2007.

O’FARRELL, A.M., LIU, Y., MOORE, K.W, MUI, A.L. IL-10 inhibits macrophage activation and proliferation by distinct signaling mechanisms: evidence for Stat3-dependent and -independent pathways. The EMBO Journal 17: 1006-1018, 1998.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Nash%20SD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21195728

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Cruickshanks%20KJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21195728

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Klein%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21195728

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Klein%20BE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21195728

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Nieto%20FJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21195728

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ryff%20CD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21195728

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ryff%20CD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21195728

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Krantz%20EM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21195728

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Shubert%20CR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21195728

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Nondahl%20DM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21195728

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Acher%20CW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21195728

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Anand%20V%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gupta%20S%22%5BAuthor%5D

123

OKELLO, E., KAKANDE, B., SEBATTA, E., KAYIMA, J., KUTEESA, M., MUTATINA, B., NYAKOOJO, W., LWABI, P., MONDO, C.K., ODOI-ADOME, R., JUERGEN, F. Socioeconomic and Environmental Risk Factors among Rheumatic Heart Disease Patients in Uganda. Public Library of Science One 7 (8): e43917, 2012.

OLIVIERI, F., BONAFÈ, M., CAVALLONE, L., GIOVAGNETTI, S., MARCHEGIANI, F., CARDELLI, M., MUGIANESI, E., GIAMPIERI, C., MORESI, R., STECCONI, R., LISA, R., FRANCESCHI, C. The -174 C/G locus affects in vitro/in vivo IL-6 production during aging. Experimental gerontology 37 (2-3): 309-314, 2002.

OLOMOLAIYE, O., WOOD, N.A., BIDWELL, J.L. A novel NlaIII polymorphism in the human IL-6 promoter. European Journal of Immunogenetics 25 (3): 267, 1998.

PACKARD, R.R.S., LIBBY, P. Inflammation in Atherosclerosis: From Vascular Biology to Biomarker Discovery and Risk Prediction. Clinical Chemistry 54: 124-138, 2008.

PALMER, L., FALKOW, S. A common plasmid of Chlamydia trachomatis. Plasmid 16: 52–62, 1986.

PENG, H., HAN, S.H., LIU, H.Y., CHANDNI, V., CAI, X.Q., ZHANG, Y.H. Relationship of Inflammation and Endothelial Dysfunction with Risks to Cardiovascular Disease among People in Inner Mongolia of China. Biomedical and environmental sciences 26 (10): 792-800, 2013.

PIENIĄŻEK, P., KARCZEWSKA, E., STĘPIEŃ, E., TRACZ, W., 1, KONTUREK, S.J. Incidence of Chlamydia pneumoniae infection in patients with coronary artery disease subjected to angioplasty or bypass surgery. Medical Science Monitor 7 (5): 995-1001, 2001.

PIENIAŻEK, P., KARCZEWSKA, E., STĘPIEŃ, E., TRACZ, W., KONTUREK, S.J. Incidence of Chlamydia pneumoniae infection in patients with coronary artery disease subjected to angioplasty or bypass surgery. Medical Science Monitor 7 (5): 995-1001, 2001.

PINAR, A., OÇ, M., AKYÖN, Y., FARSAK, B., KOÇYILDIRIM, E., US, D., ZORLUTUNA, Y., TOKGÖZOĞLU, L., BÖKE, E. The presence of Chlamydophila pneumoniae, Helicobacter pylori and cytomegalovirus in human atherosclerosis detected by molecular and serological methods. Mikrobiyollogy Bulletim 38 (3): 213-222, 2004.

POCIOT, F., D’ALFONSO, A., COMPASSO, S., SCORZA, R., RICHIARDI, P.M. Functional analysis of a new polymorphism in the human TNF alpha gene promoter. Scandinavian Journal of Immunology 42: 501-504, 1995.

RASMUSSEN, S.J., ECKMANN, L., QUAYLE, A.J. Secretion of proinflammatory cytokines by epithelial cells in response to Chlamydia infection suggests a central role for epithelial cells in chlamydial pathogenesis. Journal of Clinical Investigation 99 (1): 77-87, 1997.

RESZKA, E., JEGIER, B., WASOWICZ, W., LELONEK, M., BANACH, M., JASZEWSKI, R. Detection of infectious agents by polymerase chain reaction in human aortic wall. Cardiovascular Pathology 17 (5): 297-302, 2008.










http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Banach%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18402822

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Jaszewski%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18402822

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Jaszewski%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18402822


124

RIDKER, P.M., RIFAI, N., ROSE, L., BURING, J.E., COOK, N.R. Comparison of C-reactive protein and low-density lipoprotein cholesterol levels in the prediction of first cardiovascular events. The New England journal of medicine 347: 1557-1565, 2002.

ROSE, A.G. Failure to detect Chlamydia pneumoniae in senile calcific aortic stenosis or calcified congenital bicuspid aortic valve by immunofluorescence, polymerase chain reaction and electron microscopy. Cardiovascular pathology 11 (5): 300-304, 2002.

ROSS, R. Atherosclerosis: an inflammatory disease. New England Journal of Medicine 340: 115-126, 1999.

RUFF, C.T., BRAUNWALD, E. The evolving epidemiology of acute coronary syndromes. Nature reviews Cardiology 8 (3): 140-147, 2011.

RUPPRECHT, H.J., BLANKENBERG, S., BICKEL, C., RIPPIN, G., HAFNER, G., PRELLWITZ, W., SCHLUMBERGER, W., MEYER, J. Impact of Viral and Bacterial Infectious Burden on Long-Term Prognosis in Patients With Coronary Artery Disease. Circulation 104: 25-31, 2001.

SABAT, R., GRUTZ G., WARSZAWSKA, K., KIRSCH S., WITTE, E., WOLK, K., GEGINAT, J. Biology of interleukin-10. Cytokine Growth Factor Review 21 (5): 331-344, 2010.

SAFFORD, M.M., BROWN, T.M., MUNTNER, P.M., DURANT, R.W., GLASSER, S., HALANYCH, J.H., SHIKANY, J.M., PRINEAS, R.J., SAMDARSHI, T., BITTNER, V.A., LEWIS, C.E., GAMBOA, C., CUSHMAN, M., HOWARD, V., HOWARD, G. Association of race and sex with risk of incident acute coronary heart disease events. Journal of American Medical Associations 308 (17): 1768-1774, 2012.

SAIKKU, P., LEINONEN, M., MATTILA, K., EKMAN M.R., NIEMINEN M.S., MÄKELÄ P.H., HUTTUNEN J.K., VALTONEN, V. Serological evidence of an association of a novel Chlamydia, TWAR, with chronic coronary heart disease and acute myocardial infarction. Lancet (2): 983-986, 1988.

SAIKKU, P., LEINONEN, M., TENKANEN, L., LINNANMAKI, E., EKMAN, M.R., MANNINEN, V., MÄNTTÄRI, M., FRICK, M.H., HUTTUNEN, J.K. Chronic Chlamydia pneumoniae infection as a risk factor for coronary heart disease in the Helsinki Heart Study. Annals of Internal Medicine 116: 273-278, 1992.

SAIKKU, P., WANG, S.P., KLEEMOLA, M., BRANDER, E., RUSANEN, E., GRAYSTON, J.T. An epidemic of mild pneumonia due to an unusual strain of Chlamydia psittaci. Journal of Infectous Disease 151: 832-839, 1985.

SALAMON, P., SHOHAM, N.G., GAVRIELI, R., WOLACH, B., MEKORI, Y.A. Human mast cells release Interleukin-8 and induce neutrophil chemotaxis on contact with activated T cells. Allergy 60 (10): 1316-1319, 2005.

SALMANI, M.P., MINDOLLI, P.B., VISHWANATH, G. Seroprevalence of Chlamydia trachomatis infection in women with bad obstetric history and infertility. The Journal of communicable diseases 43 (4): 243-247, 2011.

SAMBROOK, J., RUSSELL, D.W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform. Cold Spring Harbor Protocols: doi:10.1101/pdb.prot4455, 2006.

125

SANGER, F., NICKLEN, S., COULSON, A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 74 (12): 5463-5467, 1977.

SANTOS, N.P., RIBEIRO-RODRIGUES, E.M., RIBEIRO-DOS-SANTOS, A.K., PEREIRA, R., GUSMÃO, L., AMORIM, A., GUERREIRO, J.F., ZAGO, M.A., MATTE, C., HUTZ, M.H., SANTOS, S.E. Assessing individual interethnic admixture and population substructure using a 48-insertion-deletion (INSEL) ancestry-informative marker (AIM) panel. Human mutation 31 (2): 184-190, 2010.

SATPATHY, G., BHAN, A., SHARMA, A., KAR, U.K. Detection of Chlamydophila pneumoniae (Chlamydia pneumoniae) in endarteroctomy specimens of coronaryheart diseases patients. The Indian journal of medical research 128 (5): 658-662, 2008.

SAWCZENKO, A., AZOOZ, O., PARASZCZUK, J., IDESTROM, M., CROFT, N.M., SAVAGE, M.O., BALLINGER, A.B., SANDERSON, I.R. Intestinal inflammation-induced growth retardation acts through IL-6 in rats and depends on the -174 IL-6 G/C polymorphism in children. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102: 13260-13265, 2005.

SCHACHTER, J., CALDWELL, H.D. Chlamydiae. Annual Reviews in Microbiology 34: 285-309, 1980.

SCHACHTER, J., GROSSMAN, M., SEET, R. L. Prospective study of perinatal transmission of Chlamydia trachomatis. Journal of American Medical Associations 225: 3374-3377, 1986.

SCHACHTER, J., OSOBA, A.O. Lymphogranuloma Venereum. British Medical Bulletim 39: 151-154, 1983.

SCHACHTER, J., STEPHENS, R.S., TIMMS, P., KUO, C., BAVOIL, P.M., BIRKELUND, S., BOMAN, J., CALDWELL, H., CAMPBELL, L.A., CHERNESKY, M., CHRISTIANSEN, G., CLARKE, I.N., GAYDOS, C., GRAYSTON, J.T., HACKSTADT, T., HSIA, R., KALTENBOECK, B., LEINONNEN, M., OCJIUS, D., MCCLARTY, G., ORFILA, J., PEELING, R., PUOLAKKAINEN, M., QUINN, T. C., RANK, R. G., RAULSTON, J., RIDGEWAY, G. L., SAIKKU, P., STAMM, W. E., TAYLOR- ROBINSON, D., WANG, S.P., WYRICK, P.B. Radical changes to chlamydial taxonomy are not necessary just yet. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 51: 251-253, 2001.

SCHINKEL, A.F., BAX, J.J., VAN DER WALL, E.E., JONKERS, G.J. Echocardiographic follow-up of Chlamydia psittaci myocarditis. Chest Journal 117 (4): 1203-1205, 2000.

SCHUMACHER, A., SELJEFLOT, I., LERKERØD, A.B., SOMMERVOL, L., OTTERSTAD, J.E., ARNESEN, H. Chlamydia LPS and MOMP seropositivity are associated with different cytokine profiles in patients with coronary heart disease. European Journal of Clinical Investigation 35: 431-437, 2005.

SCHUMACHER, H.R. Chlamydia-associated arthritis. Israel Medical Association Journal 2: 532-535, 2000.

126

SCHWENKE, D.C., CAREW, T.E. Initiation of atherosclerotic lesions in cholesterol-fed rabits, I: focal increases in arterial LDL concentration precede development of faty streak lesions. Arteriosclerosis 9: 895-907, 1989.

SHALABY, M.R., PENNICA, D., PALLADINO, M.A.JR. An overview of history and biologic properties of tumor necrosis factors. Springer Seminars Immunopathology 9: 33-37, 1986.

SHARMA, K., AGGARWAL, A., ARORA, U. Seroprevalence of Chlamydia trachomatis in women with bad obstetric history and infertility. Indian journal of medical sciences 56 (5): 216-217, 2002.

SHAVLAKADZE, N., GORGOSHIDZE, B. Primary Chlamydial infection correlates with high level of serum interleukin 12 (IL-12). Georgian Medical News 182: 46-50, 2010.

SHIBATA, N., OHNUMA, T., TAKAHASHI, T., BABA, H., ISHIZUKA, T., OHTSUKA, M., UEKI, A., NAGAO, M., ARAI, H. Effect of IL-6 polymorphism on risk of Alzheimer disease: genotype-phenotype association study in Japanese cases. American journal of medical genetics 114 (4): 436-439, 2002.

Short genetic variations. National Center for Biotecnology Information. Disponível em:< http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=1800795>. Acesso em 21/12/2013.

SIE, M.P., SAYED-TABATABAEI, F.A., OEI, H.H., UITTERLINDEN, A.G., POLS, H.A., HOFMAN, A., VAN DUIJN, C.M., WITTEMAN, J.C. Interleukin 6 –174 G/C promoter polymorphism and risk of coronary heart disease: results from the Rotterdam study and a meta-analysis. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 26: 212-217, 2006.

SIMONINI, A., MOSCUCCI, M., MULLER, D.W.M., BATES, E.R., PAGANI, F.D., BURDICK, M., STRIETER, R.M. IL-8 is an angiogenic factor in human coronary atherectomy tissue. Circulation 101: 1519-1526, 2000.

SINNING, J.M., BICKEL. C., MESSOW, C.M., SCHNABEL, R., LUBOS, E., RUPPRECHT, H.J., ESPINOLA-KLEIN. C., LACKNER, K.J., TIRET, L., MU¨NZEL3, T., BLANKENBERG, S. Impact of C-reactive protein and fibrinogen on cardiovascular prognosis in patients with stable angina pectoris: the AtheroGene study. European Heart Journal 27: 2962-2968, 2006.

SKILTON, R.J., CUTCLIFFEN, L.T., BARLOW, D., WANG, Y., SALIM, O., LAMBDEN, P.R.,CLARKE,I.N. Penicillin induced persistence in Chlamydia trachomatis: high quality time lapse video analysis of the developmental cycle. PLoS One 4 (11): e7723, 2009.

SKOWASCH, D., TULETA, I., STEINMETZ, M., PABST, S., PREUSSE, C.J., WELZ, A., NICKENIG, G., BAURIEDEL, G. Pathogen burden in degenerative aortic valves is associated with inflammatory and immune reactions. The Journal of heart valve disease 18 (4): 411-417, 2009.

SLAZAI, A.J. The biological functions of C-reactive protein. Vascular Pharmacology 39: 105-107, 2002.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shavlakadze%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gorgoshidze%20B%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Skilton%20RJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19893744

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Cutcliffen%20LT%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19893744

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Barlow%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19893744

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wang%20Y%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19893744

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Salim%20O%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19893744

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lambden%20PR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19893744

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lambden%20PR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19893744

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Clarke%20IN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19893744

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Penicillin+Induced+Persistence+in+Chlamydia+trachomatis%3A+High+Quality+Time+Lapse+Video+Analysis+of+the+Developmental+Cycle

127

SLEPENKIN, A., DE LA MAZA, L.M., PETERSON. E.M. Interaction between Components of the Type III Secretion System of Chlamydiaceae. Journal of Bacteriology 187 (2): 473-479, 2005.

SMITH, W.B., NOACK, L., KHEW-GOODALL, Y., ISENMANN, S., VADAS, M.A., GAMBLE, J.R. Transforming growth factor-beta 1 inhibits the production of IL-8 and the transmigration of neutrophils through activated endothelium. Journal of Immunology 157 (1): 360-368, 1996.

SOTIROPOULOS, A., GIKAS, A., SKOURTIS, S., MERKOURIS, P., PENTZERIDIS, P., POLYDOROU, A., PAPPAS, S. Seropositivity to Chlamydia pneumoniae or Helicobacter pylori and coronary artery disease. International journal of cardiology 109 (3): 420-421, 2006.

STARY, H.C., CHANDLER, A.B., DINSMORE, R.E., FUSTER, V., GLAGOV, S., INSULL W. JR., ROSENFELD, M.E., SCHWARTZ, C.J., WAGNER, W.D., WISSLER, R.W. A definition of advanced types of atherosclerotic lesions and a histological classification of atherosclerosis. A report from the Committee on Vascular Lesions of the Council on Arteriosclerosis, American Heart Association. Circulation 92 (5): 1355-1374, 1995.

STARY, H.C., CHANDLER, A.B., GLAGOV, S., GUYTON, J.R., INSULL, W. JR., ROSENFELD, M.E., SCHAFFER, S.A., SCHWARTZ, C.J., WAGNER, W.D., WISSLER, R.W. A definition of initial, fatty streak, and intermediate lesions of atherosclerosis. A report from the Committee on Vascular Lesions of the Council on Arteriosclerosis, American Heart Association. Ciculation 89 (5): 2462-2478, 1994.

STEPHENS, R.S. The cellular paradigm of chlamydial pathogenesis. Trends in Microbiology 11 (1): 44-51, 2003.

STEPHENS, R.S., KALMAN, S., LAMMEL, C., FAN, F., MARATHE, R., ARAVIND, L., MITCHELL, W., OLINGER, L., TATUSOV, R.L., ZHAO, Q., KOONIN, E.V., DAVIS, R.W. Genome Sequence of an Obligate Intracellular Pathogen of Humans: Chlamydia trachomatis. Science 282: 754-759, 1998.

STEPHENS, R.S., KOSHIYAMA, K., LEWIS, E., KUBO, A. Heparin-binding outer membrane protein of Chlamydiae. Molecular Microbiology 40: 691-699, 2001.

STEPHENS, R.S., SANCHEZ-PESCADOR, R., WAGAR, E.A. Diversity of Chlamydia trachomatis major outer membrane protein genes. Journal of Bacteriology 169: 3879-3885, 1987.

STONER, L., LUCERO, A.A., PALMER, B.R., JONES, L.M., YOUNG, J.M., FAULKNER, J. Inflammatory biomarkers for predicting cardiovascular disease. Clinical biochemistry 46 (15): 1353-1371, 2013.

STORZ, J., PAGE, L.A. Taxonomy of the Chlamydiae: reasons for classifying organisms of the genus Chlamydia, family Chlamydiaceae, in a separate order, Chlamydiales ord. nov. International Journal of Systematic Bacteriology 21: 332-334, 1971.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Slepenkin%20A%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=de%20la%20Maza%20LM%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Peterson%20EM%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Stary%20HC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7648691

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Chandler%20AB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7648691

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Dinsmore%20RE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7648691

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Fuster%20V%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7648691

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Glagov%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7648691

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Insull%20W%20Jr%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7648691


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rosenfeld%20ME%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7648691

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Schwartz%20CJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7648691

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wagner%20WD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7648691

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wissler%20RW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7648691


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Stary%20HC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8181179

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Chandler%20AB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8181179

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Glagov%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8181179

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Guyton%20JR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8181179


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rosenfeld%20ME%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8181179

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Schaffer%20SA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8181179

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Schwartz%20CJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8181179

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wagner%20WD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8181179

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wissler%20RW%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8181179

128

SUMMERS, A.M., SUMMERS, C.W., DRUCKER, D.B., BARSON, A., HAJEER, A.H., HUTCHINSON, I.V. Association of IL-10 genotype with sudden infant death syndrome. Human immunology 61: 1270-1273, 2000.

SUN, H.S., ENG, E.W., JEGANATHAN, S., SIN, A.T., PATEL, P.C., GRACEY, E., INMAN, R.D., TEREBIZNIK, M.R., HARRISON, R.E. Chlamydia trachomatis vacuole maturation in infected macrophages. Journal of leukocyte biology 92 (4): 815-827, 2012.

SUN, P., DWYER, K.M., MERZ, C.N.B., SUN, W., JOHNSON, C.A., SHIRCORE, A.M., DWYER, J.H. Blood Pressure, LDL Cholesterol, and Intima-Media Thickness A Test of the “Response to Injury” Hypothesis of Atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis Vascular Biology 20 (8): 2005-2010, 2000.

SUTHERLAND, G.R., BAKER, E., CALLEN, D.F., HYLAND, V.J., WONG, G., CLARK, S., JONES, S.S., EGLINTON, L.K., SHANNON, M.F., LOPEZ, A.F., VADAS, M.A. Interleukin 4 is at 5q31 and interleukin 6 is at 7p15. Human Geneticis 79: 335-337, 1988.

TANG, F.F., CHANG, H.L., HUANG, Y.T., WANG, K.C. Studies on the etiology of trachoma with special reference to isolation of the virus in chick embryo. Chinese Medical Journal 75 (6): 429-447, 1957.

THOM, D.H., GRAYSTON, J.T., SISCOVICK, D.S., WANG, S.P., WEISS, N.S., DALING, J.R. Association of prior infection with Chlamydia pneumoniae and angiographically demonstrated coronary artery disease. Journal of American Medical Associations 268 (1): 68-72, 1992.

THOMAS, N. LUSHER, S., M., STOREY, C.C., CLARKE, I.N. Plasmid diversity in Chlamydia. Microbiology 143: 1847-1854, 1997.

THYGESON, P. Etiology of inclusion blennorrhea. American Journal of Oftalmology 17: 1019, 1971.

TRACEY, K.J., BEUTLER, B., LOWRY, S.F., MERRYWEATHER, J., WOLPE, S., MILSARK, I.W., HARIRI, R.J., FAHEY, T.J., ZENTELLA, A., ALBERT, J.D. Shock and tissue injury induced by recombinant human cachectin. Science 234: 470-474, 1986.

TURGEMAN, Y., LEVAHAR, P., LAVI, I., SHNEOR, A., COLODNER, R., SAMRA, Z., BLOCH, L., ROSENFELD, T. Adult calcific aortic stenosis and Chlamydia pneumoniae: the role of Chlamydia infection in valvular calcification. The Israel Medical Association journal 8 (7): 464-468, 2006.

TURNER, D.M., WILLIAMS, D.M., SANKARAN, D., LAZARUS, M., SINNOTT, P.J., HUTCHINSON, I.V. An investigation of polymorphism in the interleukin-10 gene promoter. European Journal of Immunogenetic 24 (1): 1-8, 1997.

UYEMURA, K., DEMER, L.L., CASTLE, S.C., JULLIEN, D., BERLINER, J.A., GATELY, M.K., WARRIER, R.R., PHAM, N., FOGELMAN, A.M., MODLIN, R.L. Cross-regulatory roles of interleukin (IL)-12 and IL-10 in atherosclerosis. The Journal of clinical investigation 97: 2130-2138, 1996.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22TANG%20FF%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22CHANG%20HL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22HUANG%20YT%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22WANG%20KC%22%5BAuthor%5D

129

VAINIO, K., VENGEN, O., HOEL, T., FREMSTAD, H., ANESTAD, G. Failure to detect Chlamydia pneumoniae in aortic valves and peripheral blood mononuclear cells from patients undergoing aortic valve replacement in Norway. Scandinavian journal of infectious diseases 34 (9): 660-663, 2002.

VAKILI, H., GHADERIAN, S.M., AKBARZADEH NAJAR, R., TABATABAEI PANAH, A.S., AZARGASHB, E. Genetic polymorphism of interleukin-6 gene and susceptibility to acute myocardial infarction. Coronary artery disease 5: 299-305, 2011.

VAN DE VIJVER, L.P.L., KARDINAAL, A.F.M., DUYVENVOORDE, W.V., KRUIJSSEN, D.A.C.M., GROBBEE, D.E., POPPEL, G.V., PRINCEN, H.M.G. LDL Oxidation and Extent of Coronary Atherosclerosis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology 18: 193-199, 1998.

VATS, V., AGRAWAL, T., SALHAN, S., MITTAL, A. Primary and secondary immune responses of mucosal and peripheral lymphocytes during Chlamydia trachomatis infection. FEMS immunology and medical microbiology 49 (2): 280-287, 2007.

VENUGOPAL, S.K., DEVARAJ, S., JIALAL, I. Effect of C-reactive protein on vascular cells: evidence for a proinflammatory, proatherogenic role. Current opinion in nephrology and hypertension 14 (1): 33-37, 2005.

VIELMA, S.A., MIRONOVA, M., KU, J.R., LOPES-VIRELLA, M.F. Oxidized LDL further enhances expression of adhesion molecules in Chlamydophila pneumoniae-infected endothelial cells. Journal of Lipid Research 45 (5): 873-880, 2004.

VIGEN, C., HODIS, H.N., SELZER, R.H., MAHRER, P.R., MACK, W.J. Relation of progression of coronary artery atherosclerosis to risk of cardiovascular events (from the Monitored Atherosclerosis Regression Study). American Journal of Cardiology 95 (11): 1277-1282, 2005.

VIRMANI, R., AVOLIO, A.P., MERGNER, W.J., ROBINOWITZ, M., HERDERICK, E.E., CORNHILL, J.F., GUO, S.Y., LIU, T.H., OU, D.Y., O'ROURKE, M. Effect of aging on aortic morphology in populations with high and low prevalence of hypertension and atherosclerosis. Comparison between occidental and Chinese communitie. American Journal of Pathology 139 (5): 1119-1129, 1991.

VLAHOPOULOS, S., BOLDOGH, I., CASOLA, A., BRASIER, A.R. Nuclear factor-kappaB-dependent induction of interleukin-8 gene expression by tumor necrosis factor alpha: evidence for an antioxidant sensitive activating pathway distinct from nuclear translocation. Blood 94 (6): 1878-1889, 1999.

VOGIATZI, K., APOSTOLAKIS, S., VOUDRIS, V., THOMOPOULOU, S., KOCHIADAKIS, G.E., SPANDIDOS, D.A. Interleukin 8 and Susceptibility to Coronary Artery Disease: a Population Genetics Perspective. Clinical Immunology 28: 329-335, 2008.

VOLANAKIS, J.E. Complement activation by C-reactive protein complexes. Annals of the New York Academy of Sciences 389: 235-250, 1982.

VOLANAKIS, J.E. Human C-reactive protein: expression, structure, and function. Molecular Immunology 38: 189-197, 2001.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Vakili%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ghaderian%20SM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Akbarzadeh%20Najar%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tabatabaei%20Panah%20AS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tabatabaei%20Panah%20AS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Azargashb%20E%22%5BAuthor%5D

130

VON DER THUSEN, J.H., KUIPER, J., FEKKES, M.L., DE VOS, P., VAN BERKEL, T.J., BIESSEN, E.A. Attenuation of atherogenesis by systemic and local adenovirus-mediated gene transfer of interleukin-10 in LDLr–/– mice. Federation of American Societies for Experimental Biology journal 15: 2730-2732, 2001.

WANG, G., BURCZYNSKI, F., HASINOFF, B., ZHONG, G. Infection of myocytes with chlamydiae. Microbiology 148 (Pt 12): 3955-3959, 2002.

WANG, N., TABAS, I., WINCHESTER, R., RAVALLI, S., RABBANI, L.E., TALL A. Interleukin 8 is induced by cholesterol loading of macrophages and expressed by macrophage foam cells in human atheroma. Journal of Biological and Chemistry 271: 8837-8842, 1996.

WANG, N., ZHOU, R., WANG, C., GUO, X., CHEN, Z., YANG, S., LI, Y. -251 T/A polymorphism of the interleukin-8 gene and cancer risk: a HuGE review and meta-analysis based on 42 case-control studies. Molecular biology reports 39 (3): 2831-2841, 2012.

WARD M. The immunobiology and immunopathology of chlamydial infections. APMIS 103: 769-796,1995.

WARD, C., WARD, A.M. Acquired valvular heart-disease in patients who keep pet birds. The lancet 304 (7883): 734-736, 1974.

WESTENDORP, R.G.J., LANGERMANS, J.A.M., HUIZINGA, T.W.G., ELOUALI, A.H., BOOMSMA, D.I., VERWEIJ, C.L., VANDENBROUCKE, J.P. Genetic influence on cytokine production and fatal meningococcal disease. Lancet 349 (9046): 170-173, 1997.

WILSON, A.G., DI GIOVINE, F.S., BLAKEMORE, A.I., DUFF, G.W. Single base polymorphism in the human tumour necrosis factor alpha (TNF alpha) gene detectable by NcoI restriction of PCR product. Human Molecular Genetics 1 (5): 353, 1992.

WILSON, A.G., GORDON, C., DI GIOVINE, F.S., DE VRIES, N., VAN DE PUTTE, L.B., EMERY, P., DUFF, G.W. A genetic association between systemic lupus erythematosus and tumor necrosis factor alpha. European Journal of Immunology 24: 191-195, 1994.

WOO, P., KORENBERG, J.R., WHITEHEADS, A.S. Characterization of Genomic and Complementary DNA Sequence of Human C - reactive protein, and Comparison with the Cornpiementary DNA Sequence of Serum Amyloid P Component. The Journal of Biologica Chemistry 260 (24): 13384-13388, 1985.

WORLD HEALTH ORGANIZATION. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis: methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. Geneva, WHO, 2001.

WORLD HEALTH ORGANIZATION. The Atlas of Heart Disease and Stroke. Geneva, WHO, 2004: 14.

131

WU, W.S., MCCLAIN, K.L. DNA polymorphisms and mutations of the tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) promoter in Langerhans cell histiocytosis (LCH). Journal of Interferon & Cytokine Research 17: 631-635, 1997.

WYRICK, P.B. Intracellular survival by Chlamydia. Cellular Microbiology 2: 275-282, 2000.

XIE, G., BONNER, C.A., JENSEN, R.A. Dynamic diversity of the tryptophan pathway in chlamydiae: reductive evolution and a novel operon for tryptophan recapture. Genome Biology 3 (9): 51-57, 2002.

YILMA, A.N., SINGH, S.R., FAIRLEY, S.J., TAHA, M.A., DENNIS, V.A. The anti-inflammatory cytokine, interleukin-10, inhibits inflammatory mediators in human epithelial cells and mouse macrophages exposed to live and UV-inactivated Chlamydia trachomatis. Mediators of inflammation 2012: ID 520174, 2012.

YIN, Y.W., LI, J.C., ZHANG, M., WANG, J.Z., LI, B.H., LIU, Y., LIAO, S.Q., ZHANG, M.J., GAO, C.Y., ZHANG, L.L. Influence of interleukin-6 gene -174G>C polymorphism on development of atherosclerosis: a meta-analysis of 50 studies involving 33,514 subjects. Gene 529 (1): 94-103, 2013.

ZEE, R.Y., HEGENER, H.H., FERNANDEZ-CRUZ, A., LINDPAINTNER, K. C-reactive protein gene polymorphisms and the incidence of postangioplasty restenosis. Atherosclerosis 176: 393-396, 2004.

ZEE, R.Y., RIDKER, P.M., ZEE, R.Y., RIDKER, P.M. Polymorphism in the human C-reactive protein (CRP) gene, plasma concentrations of CRP, and the risk of future arterial thrombosis. Atherosclerosis 162: 217-219, 2002.

ZHANG, L., ISHIKAWA, Y., AKASAKA, Y., ITO, K., GREGORY, S., ISHII, T. Limited association of Chlamydia pneumoniae detection with coronary atherosclerosis. Atherosclerosis 167 (1): 81-88, 2003.

ZOURIDAKIS, E., AVANZAS, P., ARROYO-ESPLIGUERO, R., FREDERICKS, S., KASKI, J.C. Markers of inflammation and rapid coronary artery disease progression in patients with stable angina pectoris. Circulation 110: 1747-1753, 2004.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Xie%20G%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bonner%20CA%5Bauth%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Jensen%20RA%5Bauth%5D

132

APÊNDICE 1

SERVIÇO PÚBLICO FEDERAL

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

LABORATÓRIO DE VIROLOGIA

QUESTIONÁRIO EPIDEMIOLÓGICO 1. Projeto: Prontuário n°: Protocolo n°:

Data da coleta de dados: 2. Nome:

3. Endereço

4. Município:

5. Município de residência anterior (<05 anos no endereço atual):

6. Data da coleta de amostra:

7. Nascimento: ___ / ____/ ____ Idade:

8. Sexo: 1. Masculino 2. Feminino

9. Naturalidade:

10. Estado civil:

11. Naturalidade do pai: Naturalidade da mãe:

12. Naturalidade do avô: Naturalidade da avó:

13. Profissão: ____________ Renda familiar (salários): _______ a) < 1 b)

1-3 c) 4-7 d) 8-10 e) > 10

ESCOLARIDADE 14. a) Não alfabetizado b) Alfabetizado

c) Ens. Fundamental incompleto d) Ens. Fundamental completo

e) Ens. Médio incompleto f) Ens. médio completo

g) 3º grau incompleto h) 3º grau completo

INFORMAÇÕES CLÍNICAS 15. Foi obeso na infância 1. Sim 2. Não

16. Há pessoas obesas na família 1. Sim 2. Não Quantas?

17. Apresenta acúmulo de gordura na região abdominal? 1. Sim 2. Não

18. Possui histórico familiar de ataque cardíaco, infarto do miocárdio?

19. Peso atual:____________ altura:_________ Pressão arterial:_________

133

20. Consumo de bebida alcoólica? 1. Sim 2. Não

21. Hábitos de tabagismo 1. Sim 2. Não Quantos cigarros por dia?______

22. Pratica alguma atividade física? 1.Sim 2. Não Qual?__________

INFORMAÇÕES LABORATORIAIS HDL:_________ LDL:_________ Colesterol total:__________ Triglicerídeos:__________

Está usando alguma medicação: _______ Qual?____________________________________

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

25. A medicação foi tomada hoje? ______ Qual o horário?__________

25. Já apresentou alguma doença respiratória (pneumonia, bronquite, etc.)?______

26. Já apresentou hipertensão? 1. Sim 2. Não

27. Já apresentou hiperlipidemia? 1. Sim 2. Não

28. É diabético? 1. Sim 2. Não

29. Possui hábitos saudáveis de alimentação? (frutas, verduras, legumes, fibras)

1. Sim 2. Não

30. Evita o consumo de refrigerantes, frituras, e comidas gordurosas?

1. Sim 2. Não

COMPORTAMENTO SEXUAL ( ) Homossexual ( ) Heterossexual ( ) Bissexual Números de parceiros: ________

Uso de camisinhas: 1. Sempre 2. Às vezes 3. Nunca

História de IST: 1. Sim 2. Não Quais: ______________

Qual frequência:

134

APÊNDICE 2 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

1. Estou sendo convidado(a) a participar de uma pesquisa sobre “A participação da Chlamydia pneumoniae e C.trachomatis na geração de doença cardíaca”, que está sendo desenvolvida pela Universidade Federal do Pará e pela Universidade do Estado do Pará.

2. Para que eu decida em participar ou não da pesquisa me foram prestadas as seguintes informações:

3. O pesquisador responsável é o Prof. Dr. Ricardo Ishak, Biomédico, Professor Titular da Universidade Federal do Pará.

4. O objetivo da pesquisa é o de aumentar o conhecimento vigente acerca da infecção bacteriana e o aparecimento de doença vascular e cardíaca no hospedeiro.

5. Durante a pesquisa o paciente deverá responder a um questionário, depois será submetida a coleta de sangue para exame de laboratório; a placa de ateroma usada no projeto será àquela removida por meio do processo cirúrgico de rotina.

6. Essa pesquisa não oferece riscos; as práticas são de uso rotineiro e apenas uma pequena quantidade de sangue (10mL) será coletada para a detecção de anticorpos, marcadores da resposta inflamatória, imunológica e marcadores genéticos da bactéria e do hospedeiro.

7. Na colheita de material biológico serão utilizados materiais esterilizados descartáveis, como agulhas, seringas, que não oferecem risco para o sujeito da pesquisa; os procedimentos cirúrgicos obedecerão as práticas rotineiras de cirurgia cardíaca.

8. Ninguém é obrigado a participar da pesquisa, assim como poderá deixar a pesquisa no momento que quiser, pois não haverá prejuízo pessoal por esta causa.

9. Não haverá nenhum tipo de despesas para participação da pesquisa, assim como não haverá nenhuma forma de pagamento para participação.

10. O grande benefício desta pesquisa para todos os que participam, ou não, é possibilitar um melhor entendimento sobre o processo que leva à formação da placa de ateroma e a doença cardíaca seguindo-se às infecções por bactérias do gênero Chlamydia.

11. A participação na pesquisa é sigilosa, isto significa que, somente os pesquisadores ficarão sabendo de sua participação. Os dados utilizados na pesquisa terão uso exclusivo neste trabalho, sem a identificação individual do participante.

____________________________

Assinatura do Pesquisador Responsável

CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO Declaro que li as informações acima sobre a pesquisa, que me sinto perfeitamente esclarecido(a) acerca do conteúdo da mesma, assim como seus riscos e benefícios. Declaro que, por minha livre vontade, aceito participar da pesquisa cooperando com a coleta de material para exame. Belém, ____ / _____ / _____

Prontuário:______________ Protocolo:_________ Assinatura:______________________________________ Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Biológicas, Laboratório de Virologia, Fone: (91) 3201-7587 e-mail: [email protected]

135

APÊNDICE 3

Extração do DNA Foi utilizado o método de extração de DNA total a partir de células

mononucleadas do sangue periférico, de acordo com o protocolo do método Fenol-

Clorofórmio. O procedimento segue as etapas:

- LISE DE HEMÁCIAS (Solução A: Cloreto de Amônio [1.0M], EDTA [0.1M], H2O

destilada; Solução B: Bicarbonato de Amônio [1.0M], H2O destilada).

1. Em um tubo de 2mL adicionar 300 μL de sangue e 900 μL de solução de lise de

hemácias.

2. Agitar por inversão por 20 minutos.

3. Centrigugar (14.000 rpm) por 3 minutos.

4. Descartar o sobrenadante e acrescentar 900 μL de lise de hemácias novamente.


6. Centrigugar (14.000 rpm) por 3 minutos.

7. Descartar o sobrenadante.

- LISE DE LEUCÓCITOS (Tris-HCl [100mM], EDTA [20mM], NaCl [200mM], SDS

0,5 %, H2O destilada).

1. Acrescentar ao pellet 500 μL de lise de leucócitos.

2. Agitar no vortex até dissolver o pellet.

3. Incubar em banho-maria (55ºC) por 30 minutos.

- PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS (Acetato de Amônio [7,5M], H2O destilada).

1. Acrescentar 200 μL de Solução de Precipitação de Proteínas.

2. Agitar brevemente no vortex.

3. Levar ao banho maria (55ºC) por 30 minutos.

4. Centrifugar (14.000 rpm) por 10 minutos.

5. Transferir o sobrenadante para um tubo de 2ml limpo. (Descartar o tubo com o

precipitado de proteínas).

6. Adicionar 500 μL de Fenol-Clorofórmio álcool isoamílico.



9. Transferir o sobrenadante para um tubo de 2mL limpo.

10. Acrescentar ao sobrenadante 1,5mL de Isopropanol (2-propanol).

11. Visualizar o pellet de DNA. (Verificar conforme a quantidade de DNA formado a

quantidade de H2O para hidratá-lo).

136


13. Desprezar o sobrenadante.

14. Adicionar 200 μL de Etanol a 70% lavando a parede do tubo.

15. Desprezar o etanol e deixar secando até evaporar completamente o álcool.

16. Adicionar H2O para hidratá-lo.

137

ANEXO 1

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