Moleculair onderzoek naar de effecten van X-stralen bij ...

Moleculair onderzoek naar de effecten van

X-stralen bij patiënten na een contrast CT-

onderzoek

Ans ROMBOUT

Verhandeling ingediend tot

het verkrijgen van de graad van

Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. H. Thierens

Vakgroep Medische Basiswetenschappen

Academiejaar 2009-2010

I

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stel-

len en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen

van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te ver-

melden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”

25 mei 2010

Ans Rombout Prof. Dr. H. Thierens

II

Voorwoord

Wetenschappelijk onderzoek is een voltijdse job. Het verzamelen van data, de verwerking van

resultaten en het rapporteren van deze resultaten in een masterproef zijn opdrachten die veel

tijd en energie vragen. Met enige trots kan ik u hier mijn masterproef presenteren, de bekro-

ning op mijn opleiding Biomedische Wetenschappen. Niet alle lof komt echter mijzelf toe,

alleen was mij dit immers nooit gelukt.

Gelukkig heb ik beroep kunnen doen op verschillende personen die mij hierbij enorm hebben

geholpen. In de eerste plaats wil ik mijn promotor, Prof. Dr. H. Thierens, bedanken om mij de

mogelijkheid te bieden dit onderzoek te doen. Hierdoor is mijn interesse voor medische stra-

lingswetenschappen en wetenschappelijk onderzoek enorm gegroeid. Daarnaast wil ik mijn

begeleidster M. Sc. Laurence Beels uitdrukkelijk bedanken voor zowel haar professionele als

persoonlijke steun. Haar hulp bij het aanleren van de nodige technieken, de statistische ver-

werking van de resultaten en het schrijven van mijn thesis was onmisbaar. Graag wil ik ook

Dr. Ir. Kim De Ruyck bedanken voor haar hulp bij het real-time PCR werk. Mijn oprechte

dank gaat ook uit naar het personeel werkzaam op de dienst medische fysica van het instituut

voor nucleaire wetenschappen. Zij maakten het labo tot een leuke werkomgeving waar ik al-

tijd op hulp kon rekenen. Uiteraard ook een dankjewel aan mijn mede-thesisstudenten Iris en

Marlies, voor hun luisterend oor, hun steun, hun hulp en voor de vele leuke momenten in ons

lokaaltje.

Mijn dank gaat ook uit naar alle patiënten die bereid waren deel te nemen aan deze studie.

Uiteraard wil ik ook het UZ-personeel dat mij geholpen heeft bij het verzamelen van de

bloedstalen bedanken voor hun onbaatzuchtige inzet en interesse voor mijn studie en voor de

leuke sfeer tijdens het wachten.

Ten slotte wil ik mijn vrienden en familie en in het bijzonder mijn ouders en mijn vriend Yuri

bedanken. Zonder hun vertrouwen, hun steun en peptalk nu en dan, zou ik de voorbije vijf

jaar nooit zo soepel hebben doorlopen.

Aan iedereen die zijn steentje heeft bijgedragen tot deze masterproef: bedankt!

III

Inhoudstafel

Samenvatting ....................................................................................................................... - 1 -

1 Inleiding.......................................................................................................................... - 2 -

1.1 Introductie ................................................................................................................. - 2 -

1.2 Computer tomografie ................................................................................................ - 2 -

1.3 Risico’s van lage dosis ioniserende straling .............................................................. - 3 -

1.3.1 Het LNT model ................................................................................................. - 4 -

1.3.2 Gamma-H2AX foci als biomerker voor stralingsschade .................................. - 7 -

1.3.3 Moleculaire biomerkers voor stralingsschade ................................................. - 10 -

1.4 Kwantitatieve real-time PCR .................................................................................. - 12 -

1.4.1 Principe ............................................................................................................ - 12 -

1.4.2 Targetgenen GADD45A en CDKN1A ........................................................... - 13 -

1.4.3 Referentiegenen ............................................................................................... - 14 -

1.5 Doelstelling ............................................................................................................. - 15 -

2 Materialen en Methoden ............................................................................................. - 17 -

2.1 Inleiding .................................................................................................................. - 17 -

2.2 Onderzoekspopulatie ............................................................................................... - 17 -

2.3 Gamma-H2AX foci scoring .................................................................................... - 17 -

2.3.1 Staalafname en lymfocyt isolatie .................................................................... - 17 -

2.3.1.1 Staalafname ............................................................................................ - 17 -

2.3.1.2 Lymfocyt isolatie ................................................................................... - 18 -

2.3.1.3 Tellen van de lymfocyten ....................................................................... - 18 -

2.3.2 Immunofluorescentiekleuring ......................................................................... - 19 -

2.3.3 Scoring van gamma-H2AX foci ...................................................................... - 20 -

2.3.4 Data analyse en statistische verwerking .......................................................... - 20 -


2.4.1 RNA isolatie .................................................................................................... - 20 -

2.4.1.1 Bloedafname en stabilisatie van RNA in RNAlater solutie .................. - 20 -

2.4.1.2 Cellyse en initiële RNA zuivering ......................................................... - 21 -

IV

2.4.1.3 RNA isolatie ........................................................................................... - 21 -

2.4.1.4 DNase I behandeling .............................................................................. - 22 -

2.4.1.5 Opbrengst en kwaliteit RNA .................................................................. - 22 -

2.4.2 cDNA synthese ................................................................................................ - 22 -

2.4.2.1 Reactiemix voor cDNA synthese ........................................................... - 22 -

2.4.2.2 cDNA synthese ...................................................................................... - 23 -

2.4.3 Primers ............................................................................................................ - 23 -

2.4.3.1 Primerdesign .......................................................................................... - 23 -

2.4.3.2 Primers oplossen in buffer ..................................................................... - 24 -

2.4.4 Real-time PCR ................................................................................................. - 24 -

2.4.4.1 Reactiemix voor real-time PCR ............................................................. - 24 -

2.4.4.2 Real-time PCR ....................................................................................... - 25 -

2.4.5 In vitro real-time PCR experiment .................................................................. - 25 -

2.4.6 Data analyse en statistische verwerking .......................................................... - 26 -

2.4.6.1 Primerefficiëntie .................................................................................... - 26 -

2.4.6.2 Stabiliteit van de referentiegenen ........................................................... - 27 -

2.4.6.3 Relatieve kwantificatie ........................................................................... - 27 -

3 Resultaten ..................................................................................................................... - 28 -


3.1.1 Optimalisatie protocol voor gamma-H2AX foci scoring ................................ - 28 -

3.1.2 In vivo dosis-respons curve ............................................................................. - 28 -

3.1.3 Vergelijking in vivo – in vitro data .................................................................. - 32 -


3.2.1 Primer design ................................................................................................... - 33 -

3.2.2 Primerefficiëntie .............................................................................................. - 34 -

3.2.3 In vitro real-time PCR experiment .................................................................. - 37 -

3.2.3.1 Stabiliteit van de referentiegenen ........................................................... - 37 -

3.2.3.2 Effect van dosis en tijd op de genexpressie van de targetgenen ............ - 37 -

4 Bespreking .................................................................................................................... - 40 -


4.1.1 Optimalisatie protocol voor gamma-H2AX foci scoring ................................ - 40 -

4.1.2 In vivo dosis-respons curve ............................................................................. - 40 -


V

Algemeen besluit ................................................................................................................ - 47 -

Referentielijst ..................................................................................................................... - 48 -

VI

Afkortingen

53BP1 53 binding protein 1

A Adenine

acc acceleration

Alu Arthrobacter luteus

ATM Ataxia Telangiectasia Mutated

ATR ATM and Rad3-related

B2M Beta-2-Microglobulin

bp baseparen

BRCT BRCA1 C-terminus

BSA Bovine Serum Albumine

C Cytosine

CDKN1A Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor 1

cDNA complementary DNA

cm centimeter

CT Computer Tomografie

Cq cycling quantity

DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole

DLP dose length product

DNA DeoxyriboNucleicAcid

DNA-Pk DNA-Dependent Protein Kinase

dNTP deoxynucleotidetrisphosphate

DSB dubbelstrengbreuk

EDTA EthyleenDiamineTetraAcetaat

ETBD equivalent total body dose

FCS Foetal Calfs Serum

G Guanine

× g times gravity

GADD45A Growth Arrest and DNA Damage A

GAPDH Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase

gDNA genomic DNA

VII

Gy Gray

HMBS HydroxyMethylBilane Synthase

IRIF Ionizing Radiation Induced Foci

kVp peak kilovoltage

L lengte

LNT linear-no-treshold

LSS Life Span Study

min minute

µg microgram

µl microliter

µM micromolair

Mdc1 Mediator of DNA damage checkpoint protein 1

mGy milliGray

ml milliliter

MRe11 Meiotic Recombination 11

MRI Magnetic Resonance Imaging

mSv milliSievert

MWU Mann-Whitney U

Nbs1 Nijmegen Breakage Syndrome 1

NF normalization factor

ng nanogram

NO Nitric Oxide

NRQ normalized relative quantification

nt nucleotide

NT controle no template controle

nr nummer

PBS Phosphate Buffered Saline

PCR Polymerase Chain Reaction

PIKK Phosphatidylinositol 3-Kinase Protein Kinase-like

RAM-TRITC rabbit anti-mouse antibody conjugated with Tetramethyl Rhodamine

Isothiocyanate

RNA RiboNucleicAcid

ROS Reactive Oxygen Species

rpm Rounds Per Minute

VIII

RPMI Roswell Park Memorial Institute medium

RT-mins Reverse Transcriptase minus

RQ relative quantification

SE standard error

SEM standard error of the mean

sec seconden

SNP Single Nucleotide Polymorfisme

SPSS Statistical Package for the Social Sciences

SYBR Synergy Brands

T Thymine

Ta annealingstemperatuur

TE Tris EDTA

U/ml units/ml

UCSC University of California Santa Cruz

UZ Gent Universitair Ziekenhuis Gent

V volume

v15 versie 15

qRT-PCR kwantitatieve real-time PCR

- 1 -

Samenvatting

Ioniserende straling kan verschillende schadelijke effecten induceren bij de mens. Stralingsge-

induceerde dubbelstrengige DNA breuken vormen de kritische lesies die bijdragen tot een

verhoogd risico op kanker. Risico’s op stralingsgeïnduceerde kanker bij blootstelling aan lage

dosissen ioniserende straling worden geschat door extrapolatie van hoge dosis data met be-

hulp van het ‘linear-no-treshold’ model. De validiteit van dit model wordt echter in vraag ge-

steld door een aantal radiobiologische fenomenen zoals het bystander effect, lage dosis hyper-

sensitiviteit en adaptieve respons. Recent kon lage dosis hypersensitiviteit aangetoond worden

bij kinderen in de interventionele cardiologie. In deze masterproef werd onderzocht of deze

hypersensitiviteit in het lage dosis gebied ook aangetoond kon worden bij volwassen patiënten

die een CT-onderzoek hebben ondergaan. Hiervoor werd gebruik gemaakt van γ-H2AX foci

als gevoelige biomerker voor DNA dubbelstrengbreuken in de lage dosis regio. Daarnaast

werd getracht de condities te optimaliseren voor in vivo kwantitatief real-time PCR onder-

zoek, dat tot doel heeft de onderliggende oorzaken van de lage dosis hypersensitiviteit te ach-

terhalen.

Voor deze masterproef werden 61 volwassen patiënten beschouwd die een abdominaal of

thoracaal contrast CT-onderzoek ondergingen. Van elke patiënt werd een bloedstaal verza-

meld kort voor en kort na het CT-onderzoek. Op elk bloedstaal werd achtereenvolgens een

lymfocytscheiding en een immuunkleuring voor γ-H2AX foci uitgevoerd. Bij het uitzetten

van het geïnduceerd aantal γ-H2AX foci ten opzicht van de DLP-waarde, werd hypersensitivi-

teit in het lage dosis gebied geobserveerd.

Voor het qRT-PCR luik van deze masterproef werden de targetgenen GADD45A en CD-

KN1A en de referentiegenen HMBS, B2M, GAPDH en Alu-repeats beschouwd. Voor deze

genen werden primers gezocht en werd de primerefficiëntie bepaald. Vervolgens werd een in

vitro qRT-PCR experiment gedaan om de stabiliteit van de referentiegenen en het tijdstip van

maximale genexpressie van de targetgenen te bepalen. De expressie van beide genen werd

gemoduleerd door in vitro bestraling met lage dosissen X-stralen maar aangezien de genex-

pressie daarnaast ook beïnvloed werd door de in vitro experimentele condities, zijn de geob-

serveerde dosis-respons en tijd-respons relaties zeer complex.

Trefwoorden: Computer tomografie / γ-H2AX foci / qRT-PCR

- 2 -

1 Inleiding

1.1 Introductie

De gemiddelde effectieve dosis ioniserende straling in België wordt geschat op 4,6 mSv per

jaar per inwoner, waarvan 2,1 mSv afkomstig is van toepassingen van ioniserende straling,

voornamelijk in de medische beeldvorming [1]. Het grootste deel van deze dosis kan toege-

schreven worden aan computer tomografie (CT) [2]. Het gebruik van CT is de laatste jaren

sterk gestegen. CT laat immers toe een snelle en accurate diagnose te stellen van een groot

aantal pathologieën die dikwijls niet zichtbaar zijn met conventionele beeldvormings-

technieken [3]. Hoewel CT voor een enorme vooruitgang heeft gezorgd in de medische

beeldvorming en in de gezondheidszorg van de patiënt, mag er niet uit het oog verloren wor-

den dat een CT-scan gepaard gaat met een blootstelling aan X-stralen. De biologische effecten

van X-straling worden reeds jaren uitgebreid bestudeerd via epidemiologische studies. Er be-

staat geen twijfel over het feit dat intermediaire en hoge dosissen schadelijke effecten veroor-

zaken bij de mens, zoals blijkt uit studies van de overlevenden van de atoombommen van

Hiroshima en Nagasaki. Voor lage dosissen is de situatie echter niet zo duidelijk [4]. Het zijn

echter de effecten van deze lage dosissen die van belang zijn voor de populatie, en in het bij-

zonder voor patiënten blootgesteld aan X-stralen voor medische doeleinden.

1.2 Computer tomografie

Bij een CT-scan wordt de patiënt op een gemotoriseerde tafel doorheen een cirkelvormige

opening (de gantry) van de CT-scanner geschoven. In de CT-scanner bevindt zich een X-

stralenbron die synchroon met een set van X-straaldetectoren roteert. Deze detectoren bevin-

den zich aan de tegenovergestelde zijde van de X-stralenbron in de gantry [5]. De beeld-

vorming gebeurt op basis van de attenuatie van de straling door het lichaam van de patiënt.

Tijdens de rotatie van de X-stralenbron en de detectoren, wordt de hoeveelheid straling geme-

ten, geabsorbeerd door de verschillende weefsels en organen die doorkruist worden door de

X-stralenbundel. Al deze datapunten worden verwerkt door de computer tot twee dimensione-

le cross-sectionele beelden. Deze beelden kunnen vervolgens gebruikt worden om een drie-

dimensioneel beeld van het bestudeerde weefsel of orgaan van de patiënt te reconstrueren [6].

- 3 -

Bepaalde anatomische structuren hebben een gelijkaardige densiteit als het omgevend weef-

sel, waardoor ze zeer moeilijk te onderscheiden zijn van de achtergrond. In dat geval kan men

een contraststof introduceren in de patiënt om de verschillen in absorptievermogen van de

verschillende structuren te vergroten en zo het weefsel van interesse op te lichten. Veel ge-

bruikte contraststoffen zijn barium en iodine, die onder andere via intraveneuze injectie wor-

den toegediend. Deze contraststoffen hebben een hogere densiteit dan het normale weefsel.

Als gevolg wordt de X-stralenbundel meer verzwakt door het weefsel dat de contraststof heeft

opgenomen, waardoor dit weefsel wit of grijs gekleurd is en beter te onderscheiden is van

omgevende donkergrijs of zwart gekleurde structuren [7].

CT is een onmisbaar diagnostisch hulpmiddel en heeft een revolutie teweeg gebracht in de

medische praktijk. Toch worden er soms onnodige scans uitgevoerd en herhaald zonder reke-

ning te houden met de gevolgen voor de patiënt [2]. Een CT-scan stelt patiënten immers bloot

aan hogere dosissen ioniserende straling dan de meeste andere radiologische onderzoeken. In

vergelijking met een posterior-anterior borstradiografie met een effectieve dosis van 0,02

mSv, gaat een abdominale of thoracale CT-scan gepaard met een dosis van 5-10 mSv. Boven-

dien is het aantal CT-scans dat per jaar uitgevoerd wordt de laatste 20 jaar sterk gestegen.

Deze hoge frequentie in het gebruik van CT en de relatief hoge dosissen die daarmee gepaard

gaan, leiden echter tot een verhoogde blootstelling aan ioniserende straling voor de populatie.

Hoewel de voordelen van CT meestal opwegen tegen de schadelijke effecten van blootstelling

aan ioniserende straling, moet er rekening gehouden worden met het feit dat geen enkele

blootstelling aan ioniserende straling zonder risico is. Recente technologische verbeteringen

en stralingsprotectie maatregelen hebben reeds geleid tot optimalisatie van de dosis in functie

van de vereiste diagnostische kwaliteit. Verdere inspanningen moeten geleverd worden om

het aandeel van CT in de stralingsdosis per jaar per inwoner in België te reduceren [8].

1.3 Risico’s van lage dosis ioniserende straling

Risico’s geassocieerd met blootstelling aan ioniserende straling kunnen onderverdeeld wor-

den in 2 categorieën; deterministische effecten en stochastische effecten. Deterministische

effecten, zoals erytheem en cataract, worden veroorzaakt door celdood. Voor deze effecten

stijgt de ernst met stijgende dosis en bestaat er een drempeldosis die moet overschreden wor-

den opdat deze effecten zouden optreden. Deterministische effecten worden zelden gezien bij

diagnostische X-straal onderzoeken, waaronder CT, daar de dosissen die hiermee gepaard

- 4 -

gaan de drempeldosis voor deterministische effecten niet overschrijden. De belangrijkste risi-

co’s geassocieerd met CT-onderzoeken, zijn de risico’s op stochastische effecten, zoals de

inductie van kanker en genetische schade. Voor de stochastische effecten neemt niet de ernst,

maar wel de kans op optreden van het effect toe met toenemende dosis. Bovendien bestaat er

voor deze effecten geen drempeldosis. Als gevolg brengt elke kleine dosis ioniserende stra-

ling een bepaald risico op stochastische effecten met zich mee. Eén enkele CT-scan verhoogt

dus het risico op kanker voor de patiënt [8].

1.3.1 Het LNT model

Schattingen van kankerrisico’s voor dosissen typisch gebruikt bij CT-onderzoeken zijn moei-

lijk te verkrijgen via epidemiologische data. Om voldoende statistische power te behouden,

stijgt de noodzakelijke sample size immers zeer sterk met dalende dosis. Als gevolg zijn zeer

grote epidemiologische studies noodzakelijk om deze lage dosis risico’s te kwantificeren.

Indien er bijvoorbeeld 500 personen nodig zijn om het effect van 1000 mSv te bestuderen,

zouden er ongeveer 5 miljoen personen nodig zijn voor een dosis van 10 mSv [4]. Daarom

worden risico estimaties voor deze relatief lage dosissen gebaseerd op extrapolatie van be-

staande hoge dosis data afkomstig van epidemiologische studies van de overlevenden van de

atoombommen van Hiroshima en Nagasaki (LSS); het linear-no-treshold (LNT) model. Dit

model veronderstelt dat het risico op stralingsgeïnduceerde kanker en genetische effecten li-

neair stijgt met stijgende dosis zonder drempelwaarde. Volgens het LNT model kan elke klei-

ne dosis ioniserende straling dus biologische effecten induceren en veroorzaakt elke toename

in dosis in de lage dosis regio een proportionele toename in biologisch effect [9].

Hoewel het LNT model algemeen gebruikt wordt, zijn er twijfels over de validiteit van dit

model bij lage dosissen. Niet iedereen is het eens met de lineaire vorm van de dosis-respons

relatie van het LNT model [10]. Brenner et al. vatten de verschillende mogelijke scenario’s

die afwijken van het LNT model samen in figuur 1.1.

- 5 -

Figuur 1.1: Schematische voorstelling van de verschillende mogelijke dosis-repons relaties, door extra-

polatie van hoge dosis epidemiologische data naar het lage dosis gebied. Uit [5].

Volgens sommige bronnen zou de assumptie van lineariteit de lage dosis risico’s overschatten

(curves c en d). Enerzijds wordt het bestaan van een tresholddosis gesuggereerd (d). Dit houdt

in dat zolang de dosis onder een bepaalde drempeldosis blijft, het risico op stralings-

geïnduceerde gezondheidseffecten gelijk is aan nul. Daarnaast is er in de literatuur ook sprake

van het bestaan van een adaptieve respons (c). Zeer lage dosissen ioniserende straling zouden

mechanismen induceren waardoor cellen zich beter kunnen wapenen tegen daaropvolgende

blootstellingen aan hoge dosissen. Deze geïnduceerde stralingsresistentie in bestraalde cellen

heeft als gevolg dat de schade geïnduceerd door de hoge dosis blootstelling minder groot is in

vergelijking met cellen die vooraf niet werden bestraald [10].

Andere bronnen suggereren dat de vorm van de dosis-repons relatie eerder een neerwaarts

buigende kromme zou zijn in plaats van een rechte (curve b). Dit wil zeggen dat de respons in

het lage dosis gebied veel sterker zou stijgen dan verwacht op basis van het LNT model [4].

Recent kon dit worden aangetoond door Beels et al. Uit de bloeddosis van kinderen die een

cardiologische catheterisatie ondergingen (dosis soms lager dan 1 mGy) en het aantal γ-

H2AX foci geïnduceerd door deze blootstelling, kon vastgesteld worden dat het LNT model

niet overeenstemt met de werkelijk geïnduceerde schade. In het lage dosis gebied werd im-

mers een sterke stijging in het aantal foci waargenomen (zie figuur 1.2) [11].

- 6 -

Figuur 1.2: γ-H2AX foci per cel geïnduceerd door in vivo blootstelling aan X-stralen in functie van de

dosis bij pediatrische patiënten (○). Dosis-respons curve van γ-H2AX foci na in vitro bestra-

ling van bloedstalen met X-stralen (●). De stippellijn geeft de lineaire extrapolatie van het

aantal γ-H2AX foci geïnduceerd door in vitro bestraling met hoge dosis (0.5 Gy) volgens het

LNT model weer. Uit [11].

Deze hypersensitiviteit in het lage dosis gebied kon ook reeds door andere onderzoeksgroepen

worden aangetoond. In een studie van Ojima et al. werd de dosis-respons relatie voor het aan-

tal DNA dubbelstrengbreuken (DSB), geïnduceerd in bestraalde humane fibroblasten (dosis

1,2 tot 200 mGy), onderzocht. De inductie van DSBs vertoonde eveneens een supralineaire

dosis-respons relatie. Stralingsgeïnduceerde non-targeted effecten, ook gekend als bystander

effecten zouden dit fenomeen kunnen verklaren [12].

Een bystander effect duidt op het doorgeven van schade signalen van bestraalde naar niet be-

straalde cellen, wat resulteert in stralingsschade in deze niet bestraalde ‘bystander’ cellen. Dit

effect werd reeds geobserveerd voor verschillende eindpunten en stralingskwaliteiten. Hoewel

het onderliggende mechanisme nog niet helemaal gekend is, wordt er verondersteld dat de

signalen worden doorgegeven via de secretie van oplosbare factoren, zoals ROS (reactive

oxygen species), NO (nitric oxide) en cytokines, door de bestraalde cellen en/of door intercel-

lulaire communicatie via gap-junctions [13].

Om te testen of deze lage dosis hypersensitiviteit toe te schrijven is aan bystander effecten,

werd in bovenvermelde studie van Ojima et al. het aantal DSBs onderzocht in cellen behan-

deld met lindaan, een inhibitor van stralingsgeïnduceerde bystander effecten. In dit geval

werd er geen supralineaire dosis-respons relatie gevonden. Meer nog, het aantal DSBs beko-

- 7 -

men door het aantal foci in lindaan behandelde cellen af te trekken van het aantal foci in on-

behandelde cellen, was proportioneel met de dosis is het gebied van 1,2-5 mGy en satureerde

bij dosissen van 10-200 mGy. De toename in aantal DSBs in de regio 1,2-5 mGy was dus

grotendeels toe te schrijven aan stralingsgeïnduceerde bystander effecten. Bij dosissen hoger

dan 10 mGy werden de DSBs hoofdzakelijk geïnduceerd door dosis afhankelijke directe stra-

lingseffecten en deels door dosis afhankelijke stralingsgeïnduceerde bystander effecten [12].

Bystander effecten zijn dus vooral relevant bij blootstelling aan lage dosissen ioniserende

straling, daar bij hoge dosissen deze bystander respons gemaskeerd wordt door de respons van

de bestraalde cellen zelf [13].

Aangezien stralingsgeïnduceerde bystander effecten celschade kunnen verhogen, is het moge-

lijk dat de dosis-respons relatie voor biologische effecten in de lage dosis regio niet consistent

is met een lineair dosis-respons model. Als gevolg kan het bystander effect een significante

impact hebben op de risico bepaling bij lage dosis straling. Omwille van het toenemende ge-

bruik van radio-diagnostische procedures, is verder onderzoek naar de validiteit van de geob-

serveerde hypersensitiviteit in het lage dosis gebied en de mogelijke rol van een bystander

effect van groot belang.

1.3.2 Gamma-H2AX foci als biomerker voor stralingsschade

Naast epidemiologische studies, die gebruikt worden om de biologische effecten van lage

dosissen ioniserende straling te bestuderen, kan er ook gebruik gemaakt worden van biomer-

kers. Ioniserende straling induceert een breed spectrum van schade, waarvan DNA DSBs de

belangrijkste vorm van schade is die kan leiden tot stochastische effecten zoals kankerinductie

[9,14]. Deze DNA dubbelstrengbreuken (DSBs) kunnen indien niet of foutief hersteld aanlei-

ding geven tot celdood, mutaties, vorming van chromosoomaberraties en micronuclei. Derge-

lijke stralingsgeïnduceerde chromosomale aberraties en micronuclei in perifere bloedlymfocy-

ten kunnen gebruikt worden als biomerkers voor evaluatie van de opgelopen schade bij bloot-

stelling aan ioniserende straling [15]. Deze cytogenetische testen zijn echter niet gevoelig

genoeg voor de individuele biologische dosimetrie van patiënten blootgesteld aan de lage do-

sissen ioniserende straling die typisch gepaard gaan met CT-onderzoeken.

Recent werd echter een andere test voor de evaluatie van de opgelopen stralingsschade be-

schreven, die toelaat rechtstreeks de geïnduceerde DNA dubbelstrengbreuken te visualiseren;

de γ-H2AX foci scoring. DNA dubbelstrengbreuken zijn de belangrijkste vorm van schade

- 8 -

aan het genoom. Aangezien onherstelde DSBs genomische instabiliteit en carcinogenese kun-

nen induceren, leidt de inductie van DSBs onmiddellijk tot de activatie van een DNA schade

respons. Die schade respons zal uiteindelijk leiden tot activatie van celcyclus checkpoints

en/of herstel van schade [16,17]. Eén van de vroegste gebeurtenissen in deze cellulaire res-

pons, is de specifieke fosforylatie van histon H2AX. Het H2AX eiwit is een variant van de

H2A familie van histoneiwitten, die deel uitmaken van het histon octomeer in de nucleoso-

men [14]. Het humane DNA, bestaande uit 6,4 x 109

baseparen, is georganiseerd in een com-

pacte structuur opdat het zou passen in de celkern. De dubbele DNA helix windt zich om een

centrale kern van acht histoneiwitten (histon octomeer) in de nucleosomen, die op hun beurt

georganiseerd zijn in verschillende hogere orde structuren met vorming van chromatine. Een

nucleosoom bestaat uit 145 bp DNA en 8 histoneiwitten; 2 van elk van 4 histoneiwit families

H4, H3, H2B en H2A [18].

Figuur 1.3: Model voor de vorming van γ-H2AX foci. Uit [19].

In figuur 1.3 wordt een model voor γ-H2AX foci vorming voorgesteld. Een onherstelde DNA

DSB wordt herkend door verscheidene eiwitten, waaronder deze van het MRN complex;

Mre11, Nbs1 en RAD50. Het MRN complex rekruteert dan het ATM (ataxia telangiectasia

mutated) eiwit via een directe interactie tussen ATM en het BRCT-domein van Nbs1. Hoe

ATM geactiveerd wordt, is voorlopig nog niet duidelijk. Het ATM eiwit behoort samen met

ATR en DNA-PK tot de familie van de PIKK (phosphatidylinositol 3-kinase protein kinase-

like) eiwitten. Naast betrokkenheid in onder andere celcyclus checkpoints en apoptose, regu-

leert fosforylatie door PIKKs ook nucleaire foci vorming. Eén van de onmiddellijke targets

van de PIKKs is het histon H2AX eiwit. Enkele seconden na de generatie van een DSB wor-

den duizenden H2AX moleculen in de nabijheid van de DSB gefosforyleerd ter hoogte van de

serineresidu’s (serine 139) in hun unieke carboxy-terminus. Hierdoor ontstaat een gemodifi-

- 9 -

ceerde vorm; γ-H2AX. Elk van de PIKK eiwitten is in staat γ-H2AX eiwitten te genereren,

maar bij de mens gebeurt dit vooral door het ATM eiwit [19,20].

De gefosforyleerde γ-H2AX eiwitten zijn niet homogeen verspreid in de kern, maar vormen

foci; IRIF of ionizing radiation induced foci. Na fosforylatie worden de γ-H2AX eiwitten her-

kend en gebonden door Mdc1. Mdc1 beschermt op deze manier de H2AX eiwitten tegen de-

fosforylering door fosfatasen en doet daarnaast ook dienst als docking plaats voor de binding

van additionele MRN eiwitten. Interacties tussen ATM en MRN en/of tussen ATM en Mdc1

leiden dan tot de verdere rekrutering van geactiveerde ATM moleculen naar chromatine re-

gio’s die de DNA breuk flankeren. De vorming van γ-H2AX eiwitten verspreidt zich op deze

manier over het chromatine dat de breuk flankeert en geeft aanleiding tot de vorming van een

zichtbare γ-H2AX focus [19].

Naast de binding van het MRN eiwit complex ter hoogte van het beschadigde DNA, leidt de

inductie van een DNA DSB ook tot de decondensatie van het chromatine. Hoe dit gebeurt is

tot nu toe nog niet duidelijk, maar deze verandering in het chromatine is van functioneel be-

lang. Behandelingen die chromatine decondensatie verhinderen, interfereren immers met de

accumulatie van DNA herstel eiwitten ter hoogte van beschadigde DNA regio’s. Chromatine

decondensatie leidt onder andere tot de expositie van modificaties van histon eiwitten zoals de

methylatie van histon H3 op lysine 79. De verhoogde toegankelijkheid van deze histonme-

thylatie, als gevolg van de decondensatie, zou leiden tot de binding van 53BP1 (p53 binding

protein 1) op het chromatine, wat betrokken is in DNA schade herstel [21,22].

Het uiteindelijke gevolg van al deze gebeurtenissen is dat DNA repair gestimuleerd wordt

door de concentratie van de noodzakelijke hersteleiwitten ter hoogte van het beschadigde

DNA. γ-H2AX is niet vereist voor de initiële rekrutering van deze eiwitten, maar zorgt ervoor

dat deze eiwitten kunnen binden ter hoogte van plaatsen met DSBs en kunnen accumuleren

tot zichtbare foci. γ-H2AX is dus betrokken in de retentie van herstelfactoren in de buurt van

de breuk [16, 20]. Daarnaast heeft de vorming van IRIF ook een belangrijke rol in de activatie

van DNA-schade checkpoints. De amplificatie van IRIF eiwitten zorgt ervoor dat het schade

signaal gecreëerd door slechts enkele DSBs, zoals na blootstelling aan lage dosissen ionise-

rende straling, voldoende versterkt wordt om een celcyclus arrest te bekomen. Op deze manier

is er voldoende tijd voor herstel van de DNA schade vooraleer de cel een volgende fase in de

celcyclus bereikt [19].

- 10 -

De vorming van γ-H2AX foci is een snelle en gevoelige cellulaire respons op het optreden

van DNA dubbelstrengbreuken [18]. Gebruik van fluorescente antilichamen specifiek voor

deze γ-H2AX eiwitten en fluorescentie microscopie laten toe deze nucleaire foci te visualise-

ren. Aangezien het aantal γ-H2AX foci sterk gerelateerd is aan het aantal dubbelstrengbreu-

ken (verhouding 1:1), zijn deze foci bruikbare en betrouwbare biomerkers voor dubbelstren-

gige DNA breuken [17,23]. Bovendien kunnen foci reeds waargenomen worden bij zeer lage

stralingsdosissen (1 mGy), wat deze test geschikt maakt om de opgelopen stralingsschade bij

lage dosis blootstelling te bestuderen zowel in vitro als in vivo [11].

1.3.3 Moleculaire biomerkers voor stralingsschade

Afhankelijk van de dosis kan ioniserende straling vitale fysiologische functies van blootge-

stelde individuen ernstig beschadigen binnen uren of weken na de blootstelling, wat kan lei-

den tot levenslange gezondheidsgevolgen. In het geval van een stralingsaccident zijn snelle en

betrouwbare bioassays dan ook noodzakelijk om blootgestelde individuen te identificeren en

hun opgelopen stralingsdosis te bepalen. Dit is voornamelijk van belang in de eerste uren na

de blootstelling, wanneer de dosisinformatie cruciaal is voor snelle triage1 van slachtoffers.

Hoewel stralingsbiomerkers, gebaseerd op cytogenetische assays, beschouwd worden als de

gouden standaard voor detectie van de stralingsschade, hebben deze methoden een aantal

praktische beperkingen voor gebruik in triage biodosimetrie. Aangezien het meerdere dagen

of weken kan duren eer de resultaten van deze assays bekend zijn, is een snelle schatting van

de individuele stralingsdosis, noodzakelijk voor triage doeleinden, niet mogelijk. Als gevolg

is de interesse in snellere, automatische en weinig arbeidsintensieve testen voor detectie van

stralingsschade de laatste jaren sterk gegroeid. Het toenemend inzicht in de vroege biochemi-

sche respons van bestraalde cellen en weefsels, laat toe moleculaire biomerkers voor straling-

blootstelling te ontwikkelen [24].

Humane cellen hebben een complexe moleculaire respons op fysiologische en genotoxische

stressfactoren ontwikkeld. Deze stressfactoren omvatten onder andere trauma, oxidatieve

stress, metabole toxines en agentia die het DNA beschadigen zoals chemische mutagenen en

ioniserende straling. Blootstelling van humane cellen aan ioniserende straling activeert dus

verschillende signaaltransductiepathways, die opgebouwd worden door verschillende over-

1 Triage is het onderverdelen van slachtoffers in verschillende categorieën naargelang de ernst van de verwon-

dingen of het ziektebeeld bij grote ongevallen of rampen.

http://nl.wikipedia.org/wiki/Slachtoffer

- 11 -

lappende componenten, zoals cytokines, groeifactoren, oncogenen en genen betrokken bij de

celcyclus, apoptose en DNA herstel. De activatie van deze pathways resulteert in een verande-

ring in de regulatie en expressie van verschillende targetgenen (GEC of gene expression

changes). Het uiteindelijke lot van een bestraalde cel is immers grotendeels afhankelijk van de

veranderingen in genexpressie, die als gevolg van blootstelling aan ioniserende straling zijn

opgetreden. Genexpressie veranderingen in deze stralingsresponsieve genen kunnen dus ge-

bruikt worden als moleculaire merkers voor blootstelling aan ioniserende straling [25-27].

Aangezien bovenvermelde stressrespons zeer complex is en uit verschillende overlappende

componenten bestaat, is het duidelijk dat de klassieke aanpak voor het bestuderen van indivi-

duele genen niet langer volstaat. Moleculair biologische technieken die in staat zijn om de

expressie van meerdere genen simultaan te meten in één experiment zijn hiervoor beter ge-

schikt. Hierbij gaat de aandacht vooral uit naar micro-array en kwantitatieve real-time PCR

technieken die toelaten up- of downregulatie van genen op te sporen. Gecombineerd met bio-

informatica methoden, kan men genexpressie profielen ontwikkelen die dienst kunnen doen

als bruikbare biologische indicatoren van stralingsschade over een grote dosisrange

[25,26,28].

Verschillende studies konden reeds transcriptionele veranderingen aantonen na blootstelling

aan ioniserende straling zowel in vitro als in vivo [29,30]. Uit de literatuur blijkt bovendien

dat er zowel kwantitatieve als kwalitatieve verschillen in genexpressie bestaan afhankelijk van

de dosis [31]. Daarnaast is er ook een verschil in pathway activatie na hoge of lage dosis

blootstelling. In tegenstelling tot celproliferatie en apoptose bij hoge dosis, is de meest domi-

nante biologische respons na lage dosis bestraling cel-cel communicatie, DNA schade respons

en signaaltransductie betrokken bij herstel van DNA breuken. Activatie van genen betrokken

in cel-cel communicatie bij lage dosissen is van groot belang vanuit het standpunt van een

bystander effect [32]. Hoewel de betrokkenheid van verschillende signaalmoleculen zoals

cytokines, ROS, NO, calcium, cyclooxygenase-2 en MAP kinasen in het bystander proces

reeds aangetoond kon worden, werden de regulatorische mechanismen die aan de basis liggen

van deze non-targeted effecten nog niet volledig opgehelderd [33]. Om inzicht te verwerven

in de signaal pathways en de sleutelfactoren die betrokken zijn in de bystander respons, kan

men ook gebruik maken van genexpressie analyse via micro-array en kwantitatieve real-time

PCR (qRT-PCR) [31].

- 12 -

1.4 Kwantitatieve real-time PCR

1.4.1 Principe

De polymerase chain reaction of PCR is één van de meest krachtige technologieën in de mo-

leculaire biologie. PCR wordt gebruikt om specifieke sequenties in een DNA of cDNA tem-

plate, bepaald door de gebruikte primers, duizenden tot miljoenen keren te kopiëren of ampli-

ficeren.

Een PCR reactie bestaat uit drie stappen; de denaturatie-, de annealing- en de extensiestap. In

de eerste stap, de denaturatiestap, wordt het dubbelstrengige cDNA geïncubeerd bij hoge

temperatuur (90-98°C), wat leidt tot denaturatie. Hierna daalt de temperatuur tot de annealing-

of smelttemperatuur van de primers (Tm) zodat de specifieke synthetische primers kunnen

hybridiseren met het enkelstrengige DNA in de annealing stap. Vervolgens wordt de tempera-

tuur opnieuw verhoogd tot de optimale temperatuur voor elongatie van de primers door het

DNA polymerase (72°C).

Bij traditionele PCR gebeurt detectie en kwantificatie van de geamplificeerde sequentie op het

einde van de reactie, na de laatste PCR cyclus. Bij real-time PCR wordt de hoeveelheid PCR

product na elke cyclus gemeten door het gebruik van fluorescente merkers die geïncorporeerd

worden in de PCR producten. De toename van het gemeten fluorescent signaal is direct pro-

portioneel aan het aantal gegenereerde PCR product moleculen (amplicons). Real-time PCR

laat dus simultane amplificatie en kwantificatie toe. Deze kwantificatie kan absoluut zijn of

relatief. In het geval van een absolute kwantifcatie kan men op basis van een standaardcurve

het aantal kopies van een onbekend staal berekenen. In het geval van een relatieve kwantifica-

tie wordt de expressie van verschillende stalen vergeleken, om up- of downregulatie te detec-

teren.

Er zijn twee verschillende fluorescente detectiemethoden die gebruikt kunnen worden voor de

detectie van PCR producten in real-time PCR. Beide methoden zijn gebaseerd op de generatie

van een fluorescent signaal dat proportioneel is met de hoeveelheid PCR product die gevormd

wordt. Men kan gebruik maken van niet-specifieke kleurstoffen die fluoresceren wanneer ze

binden op het geproduceerde dubbelstrengige DNA, zoals SYBR Green. Daarnaast kan er ook

gewerkt worden met sequentie-specifieke DNA probes, zoals TaqMan probes, die bestaan uit

- 13 -

oligonucleotiden gelabeld met een fluorescente reporter die enkel detectie toelaat na hybridi-

satie van de probe met zijn complementaire DNA target.

De verandering in fluorescentie over het verloop van de RT-PCR reactie wordt gemeten door

een instrument dat PCR technologie combineert met scanning. De software van het RT-PCR

toestel genereert een amplificatieplot door de fluorescentie uit te zetten tegenover het aantal

cycli (zie figuur 1.4). Deze amplificatieplot geeft de accumulatie van PCR product weer over

de duur van de volledige PCR reactie. In de exponentiële fase van de PCR reactie wordt een

fluorescentiedrempel of treshold (T) bepaald. Deze drempel wordt berekend als functie van de

hoeveelheid achtergrondfluorescentie en bevindt zich bij dat punt waar het fluorescentiesig-

naal significant hoger is dan het achtergrondsignaal of de baseline. Het aantal PCR cycli dat

nodig is om voldoende fluorescentie te genereren om deze drempelwaarde te bereiken, wordt

de Cq (cycling quantity) waarde genoemd. De Cq waarden zijn direct proportioneel met de

hoeveelheid starttemplate en worden gebruikt om de RNA expressie levels of het aantal DNA

kopies te berekenen [34,35].

Figuur 1.4: De qRT-PCR amplificatieplot van drie RNA stalen met aanduiding van de drie bijhorende

Cq waarden en de treshold. Uit [35].

1.4.2 Targetgenen GADD45A en CDKN1A

Cellen hebben, zoals reeds vermeld, uitgebreide en complexe mechanismen ontwikkeld om de

genomische integriteit te controleren (checkpoints) en correcte transmissie van genetische

informatie te verzekeren. Ioniserende straling is in staat dubbelstrengige DNA breuken te in-

duceren, wat leidt tot de activatie van DNA schade checkpoints. Eén van de sleuteleiwitten in

de checkpointpathways is de tumorsupressor TP53. TP53-afhankelijke effecten in respons op

- 14 -

DNA schade worden gemedieerd door TP53 zelf of via transcriptionele controle (up- of

downregulatie) van targetgenen. Deze targetgenen beïnvloeden verschillende responspath-

ways en bepalen het uiteindelijke lot van de cel; celoverleving via inductie van groeiarrest

gevolgd door herstel van DNA schade of celdood via inductie van irreversibele groeiarrest of

apoptose. Twee belangrijke targetgenen van TP53 die upgereguleerd worden als reactie op

ioniserende straling zijn GADD45A (growth arrest and DNA damage A) en CDKN1A (cy-

clin-dependent kinase inhibitor 1A) [36].

Verschillende onderzoeksgroepen vonden een stralingsgeïnduceerde upregulatie van beide

genen. De meerderheid van deze studies die de regulatie van genexpressie in respons op stra-

lingsgeïnduceerde stress onderzoeken, maken echter gebruik van hoge tot zeer hoge dosissen.

De transcriptionele respons bij deze hoge dosissen voorspelt echter niet noodzakelijk de res-

pons bij meer biologisch relevante dosissen. In vitro studies konden wel reeds een significante

upregulatie van beide genen na lage dosis blootstelling aantonen. De humane in vivo trans-

criptionele respons bij lage dosissen ioniserende stralingen werd echter nog niet uitgebreid

bestudeerd [37].

In een onderzoek naar de moleculaire basis van de bystander respons, kon bovendien met be-

hulp van qRT-PCR een upregulatie van CDKN1A gevonden worden in zowel de direct be-

straalde cellen als in de bystander cellen. Deze en andere studies wijzen erop dat de

TP53/CDKN1A pathway betrokken zou zijn in de bystander respons [38]. Andere studies

concludeerden echter dat de TP53 respons hoofdzakelijk beperkt is tot direct bestraalde cellen

en weinig of niet aanwezig is in niet-bestraalde bystander cellen [32]. Analyse van genexpres-

sieprofielen laat toe de rol van de TP53 targetgenen CDKN1A en GADD45A in de bystander

respons en de betrokkenheid van deze respons in de hypersensitiviteit in het lage dosis gebied

te bepalen.

1.4.3 Referentiegenen

De gemeten variatie in genexpressie tussen verschillende stalen is de som van de echte biolo-

gische variatie en verschillende confounding factoren die leiden tot niet specifieke variatie in

expressie. Het doel van normalisatie is deze niet-biologische variatie te beperken door de con-

founding factoren zo veel mogelijk te controleren. Verschillende normalisatie strategieën zijn

gekend, maar het gebruik van één of meer referentiegenen is de huidige gouden standaard

- 15 -

voor normalisatie. Deze strategie wordt verkozen boven andere omdat referentiegenen dienst

doen als interne controles die onderworpen worden aan alle mogelijke bronnen van variatie

gedurende het hele experiment, op dezelfde manier als de genen van interesse [39]. Bij de

selectie van referentiegenen, is het belangrijk dat men erop toeziet dat de expressie van deze

interne controles stabiel blijft onder de experimentele condities [40].

In deze masterproef worden de genen B2M (beta-2-microglobulin), HMBS (hydroxymethyl-

bilane synthase) en GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) onderzocht op hun

bruikbaarheid als referentiegenen voor de gebruikte experimentele set-up. Arenz et al. bestu-

deerden de stabiliteit van deze en andere frequent gebruikte referentiegenen voor genexpres-

siestudies met vergelijkbare studie-opzet. Deze drie genen behoorden tot de groep van refe-

rentiegenen met de laagste variatie in expressie [41].

Naast bovenvermelde genen, zal ook de bruikbaarheid van Alu-repeats als referentiegen voor

qRT-PCR onderzocht worden. Alu repeats zijn, met meer dan één miljoen kopieën, de meest

abundante repeatsequenties in het humane genoom. Ongeveer 75% van alle humane genen

bevatten tenminste één Alu in hun introns en/of onvertaalde regio’s (UTRs). Recent werd

door Vandesompele et al. een nieuwe strategie voor RNA normalisatie gebaseerd op EAR of

expressed alu repeat amplificatie voorgesteld. De keuze van stabiele referentiegenen is niet

eenvoudig in (pathologische) condities die gekarakteriseerd worden door transcriptionele dis-

regulatie. Veranderde activiteit van transcriptiefactoren beïnvloedt niet alleen de expressie

van de targetgenen, maar kan eveneens de stabiliteit van RNA expressie van de geselecteerde

referentiegenen beïnvloeden, wat kan leiden tot een fout in de kwantificatie van het RNA van

interesse. Aangezien Alu repeats echter zo sterk verspreid voorkomen over het hele humane

genoom, zal de differentiële expressie van een aantal genen de totale hoeveelheid geëxpres-

seerde Alu repeats niet beïnvloeden. Dit principe vormt de basis voor de ontwikkeling van

deze normalisatiestrategie gebaseerd op EAR amplificatie, die een snelle en precieze kwanti-

ficatie van RNA met qRT-PCR in humane biologische stalen zou toelaten [40].

1.5 Doelstelling

Deze masterproef kadert binnen een multicentrische studie waarvoor het departement Medi-

sche Basiswetenschappen van de Universiteit Gent samenwerkt met het Belgian Nuclear Re-

- 16 -

search Center SCKCEN in Mol. Het doel van deze studie is onderzoeken of de hypersensiti-

viteit in het lage dosis gebied, recent geobserveerd bij kinderen in de interventionele cardiolo-

gie, ook aangetoond kan worden bij kinderen die een CT-onderzoek ondergaan. Hiervoor zal

gebruik gemaakt worden van γ-H2AX foci als kwantitatieve biomerker in de lage dosis regio.

Daarnaast zal met behulp van kwantitatieve real-time PCR en micro-array getracht worden de

onderliggende oorzaken van de hypersensitiviteit in het lage dosis gebied te achterhalen. De

γ-H2AX foci scoring en de real-time PCR experimenten zullen uitgevoerd worden in Gent,

het onderdeel van de studie dat gebaseerd is op micro-array zal uitgevoerd worden in Mol.

Onderstaand schema geeft de experimentele set-up van de multicentrische studie weer.

(Gent) (Gent) (Mol)

Deze masterproef is een pilootstudie die als doel heeft de proefopzet voor deze multicentri-

sche studie bij kinderen te optimaliseren. Hiertoe zal de hypersensitiviteit in het lage dosis

gebied onderzocht worden bij volwassenen die een contrast CT-onderzoek ondergaan met

behulp van de γ-H2AX foci scoring. Deze techniek werd in de onderzoeksgroep reeds geop-

timaliseerd en succesvol toegepast in de studie op interventionele cardiologie. Daarnaast zul-

len in vitro kwantitatieve real-time PCR experimenten gedaan worden ter voorbereiding op

het in vivo real-time PCR werk.

CT onderzoek

bloedafname 5 minu-

ten na CT

bloedafname x uur na

CT

lymfocyt isolatie &

immunofluorescentie-

kleuring

RNA-isolatie

&

cDNA synthese

gamma-H2AX foci

scoring

kwantitatieve real-

time PCR

micro-array

Figuur 1.5: Overzicht van de experimentele set-up van de multicentrische studie.

bloedafname vóór CT

- 17 -

2 Materialen en Methoden

2.1 Inleiding

Bloedstalen van patiënten die een contrast CT-onderzoek ondergaan in het Universitair Zie-

kenhuis (UZ) in Gent worden verzameld. Op elk staal wordt achtereenvolgens een lymfocyt-

isolatie en een imuunofluorescentiekleuring uitgevoerd in het labo van de vakgroep. Vervol-

gens worden γ-H2AX foci gescoord in 100 tot 150 cellen met behulp van de Metafer micro-

scoop. Voor het qRT-PCR luik worden primers voor real-time PCR gezocht voor de target- en

referentiegenen en worden de primerefficiënties bepaald. Vervolgens wordt een in vitro expe-

riment gedaan om de stabiliteit van de referentiegenen en het tijdstip van maximale genex-

pressie van de targetgenen te bepalen.

2.2 Onderzoekspopulatie

De onderzoekspopulatie voor deze masterproef bestaat uit 61 volwassen patiënten die een

thoracaal of abdominaal contrast CT-onderzoek ondergaan in het UZ Gent met de Toshiba

Aquillon 32 (generatie 2005) CT-scanner of met de Siemens Somatom Definition Flash (ge-

neratie 2010) CT-scanner. Patiënten die behandeld worden voor kanker, hetzij via radiothera-

pie, hetzij via chemotherapie worden niet opgenomen in de studie. Aan alle deelnemers van

de studie werd gevraagd een ‘informed consent’ te ondertekenen. Het onderzoeksproject werd

goedgekeurd door de ethische commissie van het UZ Gent.

2.3 Gamma-H2AX foci scoring

2.3.1 Staalafname en lymfocyt isolatie

2.3.1.1 Staalafname

Van elke patiënt worden twee bloedstalen afgenomen via de catheter en gecollecteerd in hepa-

rinebuisjes (Venosafe). Er wordt één bloedstaal afgenomen voor de start van de procedure en

één ongeveer vijf minuten na het onderzoek. De bloedstalen worden na afname in een warm-

waterbad (Fisher Scientific) geplaatst bij 37°C gedurende 15 minuten om enige repair toe te

laten. De keuze voor een repairtijd van 15 minuten is gebaseerd op gegevens uit de literatuur

waaruit blijkt dat het maximum aantal γ-H2AX foci gevormd wordt tussen 15 en 30 minuten

- 18 -

na blootstelling aan ioniserende straling. Om de DNA repair te stoppen, worden de bloedsta-

len vervolgens gedurende 10 minuten in ijswater afgekoeld.

2.3.1.2 Lymfocyt isolatie

Als de bloedstalen verzameld zijn, worden ze getransporteerd naar het labo. Daar wordt de

RosetteSep bloedscheiding (StemCell Technologies) uitgevoerd om de T-lymfocyten te isole-

ren. Aan 2 ml bloed wordt 100 μl RosetteSep Human T-cell Enrichment Cocktail toegevoegd.

Dit wordt 20 minuten geïncubeerd op kamertemperatuur. Vervolgens wordt deze suspensie

toegevoegd aan 2 ml PBS + 2% foetaal kalfserum (FCS) (Invitrogen). Nadien wordt dit

mengsel traag, onder een hoek van 45° toegevoegd aan 3 ml RosetteSep DM-L en gedurende

20 minuten gecentrifugeerd (Eppendorf) op 1200xg (acc is 2 en brake is 0). De cellaag met de

lymfocyten wordt vervolgens verwijderd en toegevoegd aan een 5 ml PBS + 2% FCS oplos-

sing. Hieraan wordt nogmaals 5 ml PBS + 2% FCS toegevoegd en vervolgens wordt er gedu-

rende 10 minuten gecentrifugeerd op 300xg (acc is 7 en brake is 7). Het supernatans wordt

verwijderd en deze wasstap wordt herhaald. De cellen worden nadien opgelost in 8 ml com-

pleet RPMI medium voor lymfocyten (84% RPMI-1640, 15% FCS, 1% L-glutamine, 50

U/mL penicilline, 50 µg/mL streptomycine; Life Technologies) waarin de cellen kunnen be-

waard blijven.

2.3.1.3 Tellen van de lymfocyten

Voor de immuunkleuring zijn ongeveer 200 000 cellen per 500 μl nodig. Hiervoor worden de

T-cellen geteld met behulp van de Bürker telkamer (Assistent). Er wordt een ½ verdunning

van 30 μl celoplossing en 30 μl trypaan blauw (Sigma) gemaakt. Van deze verdunning wordt

een kleine hoeveelheid op de Bürker telkamer gebracht. Het aantal levende lymfocyten in 16

vakjes wordt geteld met behulp van een lichtmicroscoop (Axiolab, ZEISS). De cellen aanwe-

zig in de uiterste rechterrand en de uiterste onderrand worden niet meegeteld.

Het aantal lymfocyten aanwezig in het bloedstaal wordt dan berekend door het aantal lymfo-

cyten in 16 vakjes te vermenigvuldigen met 2 (de verdunning), met 8 (het totaal aantal ml

waarin de cellen opgelost zijn) en met 10 000 (een conversiefactor om over te schakelen van

diepte (0,1 mm² = 0,1 μl) naar ml ( = 1x10³ μl)).

- 19 -

Figuur 2.1: Bürker-telkamer. De witte bolletjes worden meegeteld, de zwarte niet.

2.3.2 Immunofluorescentiekleuring

Na de bloedscheiding wordt een immunofluorescentiekleuring gedaan om de foci te visualise-

ren. Hiervoor zijn ongeveer 200 000 cellen per 500 μl nodig. Indien blijkt dat de cellen in

minder dan 8 ml RPMI medium moeten verdeeld worden, moet de falcon voor 6 minuten bij

1000 rpm gecentrifugeerd worden. Hierdoor wordt een celpellet verkregen en kan het teveel

aan medium verwijderd worden.

Vervolgens wordt 500 μl van de cellen in compleet RPMI medium op de polysine slides

(VWR International) gedruppeld, waarna deze (in de houders) voor 10 minuten bij 1200 rpm

gecentrifugeerd worden. Men laat de cellen kort drogen aan de lucht. De cellen worden ge-

fixeerd op de slides door ze in 3% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich) te plaatsen voor 15

minuten. Het teveel aan fixatief wordt verwijderd en nadien worden de slides voor 5 minuten

in PBS geplaatst. Na het drogen van de slides, worden ze op ijs geplaatst, waarna op elke slide

100 μl permeabilisatie-oplossing TritonX-100 (0.2%; Sigma-Aldrich) gebracht wordt. Na 5

minuten incubatie worden de slides 3 maal gewassen gedurende 10 minuten in het blocking-

serum PBS (1% BSA; Roche diagnostics). Vervolgens worden de slides in een vochtige ka-

mer gebracht. Er wordt 100 μl anti-fosfo-histone H2AX als primair antilichaam (1:1000; Bio-

Legend) op de slides gedruppeld en men laat het geheel 1 uur incuberen op een bewegende

plaat.

Hierna worden de slides opnieuw 3 maal gewassen en wordt 100 μl RAM-TRITC als secun-

dair (fluorescent) antilichaam (1:1000; DakoCytomation) op de slides gebracht. Na een incu-

batieperiode van 1 uur in een donkere vochtige kamer op een bewegende plaat, worden de

slides 4 maal gewassen in PBS (in het donker) gedurende 10 minuten. Tenslotte worden de

slides gedroogd en wordt 35 μl (2%) DAPI gelmount mounting medium (Sigma-Aldrich) op

de cellen gedruppeld. Na het aanbrengen van een dekglaasje, worden de slides in de ijskast (2-

4°C) gedroogd.

- 20 -

2.3.3 Scoring van gamma-H2AX foci

Op elke slide worden 1000 cellen opgenomen met behulp van de automatische slide scanning

fluorescentie Metafer microscoop (Metasystems). Hierbij worden beelden opgenomen in 10

verschillende vlakken volgens de z-as (Z-stack 10). Op de gescande beelden wordt het aantal

γ-H2AX foci per cel automatisch geteld voor 1000 cellen. Daarnaast worden γ-H2AX foci

ook manueel gescoord voor 150 cellen. Het aantal foci geïnduceerd door de CT-scan wordt

berekend door het gemiddeld aantal foci per cel in het bloedstaal voor het onderzoek af te

trekken van het gemiddeld aantal foci per cel in het bloedstaal na het onderzoek.

2.3.4 Data analyse en statistische verwerking

Voor de statistische verwerking van de resultaten zal Microsoft Office Excel 2007 en het

SPSS (Statistical Package for Social Sciences) v15 software pakket gebruikt worden. De Wil-

coxon signed-rank test voor gepaarde waarden wordt gebruikt om te onderzoeken of het ge-

middeld aantal γ-H2AX foci voor en na het CT-onderzoek significant verschillend is. Als de

p-waarde kleiner is dan 0,05, is het resultaat statistisch significant.

Om te bepalen of er een significant verschil is in geïnduceerd aantal γ-H2AX foci en in DLP-

waarden tussen de CT-scanner generatie 2005 en de CT-scanner generatie 2010 na een gelijk-

aardig onderzoek, wordt gebruik gemaakt van de Mann-Whitney U test. Als de p-waarde

kleiner is dan 0,05, is het verschil statistisch significant.


2.4.1 RNA isolatie

Voor de isolatie van RNA uit bloed en de DNase behandeling wordt gebruik gemaakt van de

RiboPure Blood Kit (Ambion).

2.4.1.1 Bloedafname en stabilisatie van RNA in RNAlater solutie

Er wordt bloed afgenomen en gecollecteerd in EDTA-buisjes (BD Vacutainer). De bloedsta-

len worden gemixt door de buisjes enkele keren om te keren. Vervolgens wordt 500 µl onge-

stold bloed toegevoegd aan 1,3 ml RNAlater in een 2 ml RNase-vrij buisje. Dit geheel wordt

eveneens goed gemixt. Men laat de stalen nu 1 uur rusten bij kamertemperatuur.

- 21 -

2.4.1.2 Cellyse en initiële RNA zuivering

De stalen worden gecentrifugeerd gedurende 1 minuut. Hierdoor vormen de bloedcellen en de

plasma-eiwitten een pellet. Het supernatans wordt verwijderd. Om de bloedcellen te lyseren,

wordt 800 μl Lysis Solution en 50 μl Sodium Acetate Solution toegevoegd aan de celpellet.

Vervolgens worden de stalen gevortext tot de volledige pellet is losgekomen. Hierna wordt

500 μl Acid-Phenol:Chloroform toegevoegd aan het cellysaat, waarna het staal gevortext

wordt gedurende 30 seconden. Vervolgens wordt het mengsel 5 minuten op kamertempera-

tuur geïncubeerd. Om de waterige en organische fase te scheiden worden de stalen gecentri-

fugeerd gedurende 1 minuut. De bovenste waterige fase, die het RNA bevat, wordt overge-

bracht in een nieuw 2 ml epje. Hieraan wordt 600 μl 100% ethanol (Sigma-Aldrich) toege-

voegd en er wordt kort maar krachtig gevortext en zeer kort gecentrifugeerd.

2.4.1.3 RNA isolatie

De Elution Solution (100 µl per staal) wordt opgewarmd tot ~ 75°C in een RNase-vrij epje.

Het staal (waterige fase + ethanol) wordt op de filter gebracht en kort gecentrifugeerd gedu-

rende 5-10 seconden om de vloeistof doorheen de filter te brengen. Het filtraat in de Collecti-

on Tube wordt weggegooid. Vervolgens wordt 700 μl Wash Solution 1 op de filter gebracht

en wordt er opnieuw kort gecentrifugeerd gedurende 5-10 seconden om de solutie doorheen te

filter te brengen. Het filtraat wordt weggegooid en de filter wordt op dezelfde Collection Tube

geplaatst, waarna er 700 μl Wash Solution 2/3 op de filter wordt gebracht. Na kort te centrifu-

geren gedurende 5-10 seconden, wordt het filtraat in de Collection Tube weggegooid en wordt

bovenstaande stap herhaald met een tweede 700 μl Wash Solution 2/3. Nadat het laatste fil-

traat weggegooid is, wordt de filter op dezelfde Collection Tube geplaatst en wordt er nog-

maals gecentrifugeerd gedurende 1 minuut om de resterende vloeistof van de filter te verwij-

deren. Hierna wordt de Filter Cartridge overgebracht in de tweede Collection Tube. Op het

midden van de filter wordt 50 μl van de voorverwarmde (75°C) Elution Solution gebracht. De

gesloten Collection Tube wordt nu 20 seconden bij kamertemperatuur geïncubeerd. Vervol-

gens wordt de Collection Tube met Filter Cartridge gecentrifugeerd gedurende 20-30 secon-

den bij maximale snelheid om het RNA te recupereren. Deze stap wordt herhaald met een

tweede 50 μl Elution Solution. De Collection Tube met Filter Cartridge wordt nogmaals ge-

centrifugeerd gedurende 1 minuut om alle Elution Solution in de Collection Tube (II) te ver-

zamelen.

- 22 -

2.4.1.4 DNase I behandeling

De DNase I digestie wordt uitgevoerd om contaminerend gDNA van het geëlueerde RNA te

verwijderen. Hiervoor wordt 1/20 volume 20X DNase buffer en 1 μl DNase I aan het geëlu-

eerde RNA toegevoegd en het geheel wordt goed gemengd. Dit mengsel wordt gedurende 30

minuten bij 37°C geïncubeerd. Vervolgens wordt een hoeveelheid DNase Inactivation Rea-

gent toegevoegd dat gelijk is aan 20% van het RNA volume dat behandeld wordt. Er wordt

kort en krachtig gevortext en het geheel wordt 2 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur.

Hierna wordt het staal gecentrifugeerd gedurende 1 minuut zodat de DNase Inactivation Rea-

gent een pellet vormt. Tenslotte wordt de RNA solutie overgebracht in een nieuwe RNase-vrij

buisje. De RNA stalen worden bewaard bij -80°C.

2.4.1.5 Opbrengst en kwaliteit RNA

De concentratie of de opbrengst van het geïsoleerde RNA wordt gemeten met behulp van de

ND-1000 spectrofotometer (Nanodrop Technologies). Daarnaast is het ook belangrijk om de

kwaliteit van het geïsoleerde RNA te kennen. Deze wordt gemeten met behulp van de Experi-

on (Biorad). Aangezien deze toestellen niet ter beschikking stonden in het labo, werden deze

metingen op de dienst van de Medische Genetica van het UZ Gent uitgevoerd door een per-

soon die hiervoor opgeleid werd.

2.4.2 cDNA synthese

2.4.2.1 Reactiemix voor cDNA synthese

Om het RNA om te zetten in cDNA wordt gebruik gemaakt van de iScript cDNA Synthesis

Kit (Biorad). Aan een RNase-vrij epje worden volgende componenten toegevoegd:

Tabel 2.1: Reactiemix voor cDNA synthese.

Componenten Volume per reactie

5x iScript reactie mix 4 µl

iScript reverse transcriptase 1 µl

Nuclease-vrij water x µl

RNA x µl

Totaal volume 20 µl

- 23 -

De exacte hoeveelheden nuclease-vrij water en RNA zijn afhankelijk van de concentratie van

het RNA en de hoeveelheid cDNA die men wenst te synthetiseren. Er wordt doorgaans ge-

werkt met een totaal volume van 20 µl. Indien echter een grote hoeveelheid cDNA nodig is,

kan een eindvolume van 40 µl gebruikt worden.

2.4.2.2 cDNA synthese

De eigenlijke cDNA synthese gebeurt via een eenvoudige PCR reactie. De complete reactie-

mix wordt geïncubeerd gedurende 5 minuten bij 25°C, gedurende 30 minuten bij 42°C, gedu-

rende 5 minuten bij 85°C en vervolgens wordt het staal afgekoeld tot 4°C. Het gevormde

cDNA wordt bewaard bij -20°C.

2.4.3 Primers

2.4.3.1 Primerdesign

Een primerpaar bestaat uit een forward primer en een reverse primer, respectievelijk voor

amplificatie van de 5’- en de 3’ cDNA streng. Bij het zoeken naar de optimale primers moet

er rekening gehouden worden met de volgende regels [34]:

de primers mogen niet te lang zijn (18-28 nucleotiden)

de primers mogen geen grote herhalingen van nucleotiden bevatten

de primers morgen geen SNPs of secundaire structuren (vb. hairpins) bevatten, deze

kunnen efficiënte annealing van de primers en amplificatie van het DNA verhinderen

de smelttemperatuur van forward en reverse primer mag niet meer dan 5°C verschillen

en moet gelegen zijn rond 58-60°C

Eerst wordt er in de literatuur gezocht naar primers voor real-time PCR. Hierbij wordt er spe-

cifiek gezocht naar studies die, analoog aan de experimentele set-up van deze masterproef,

genexpressie van stralingsgevoelige genen bestuderen in bloed na blootstelling aan lage do-

sissen ioniserende straling met behulp van kwantitatieve real-time PCR. Daarnaast wordt er

ook gezocht naar primers via de RT primer database [42]. Deze databank geeft voor elk pri-

merpaar de lengte en sequentie van de primers en van het amplicon en geeft ook een aandui-

ding van de annealing temperatuur. Bovendien verkrijgt men hier ook informatie over de

eventuele aanwezigheid van SNPs in de primersequenties.

- 24 -

Indien een primerpaar van een gen van interesse gevonden is, wordt dit ingebracht in de

UCSC databank [43]. Deze databank voert een in silico PCR reactie uit, om te controleren of

de primers specifiek binden. Tevens verschaft deze databank ook informatie over de lengte

van het amplicon en de smelttemperatuur van beide primers.

2.4.3.2 Primers oplossen in buffer

Er wordt gebruik gemaakt van een werkoplossing met primerconcentratie 5 µM. Eerst wordt

er een stockoplossing bereid met een primerconcentratie van 50 µM. Afhankelijk van de gele-

verde primerconcentratie wordt de poedervormige primer verdund met TE buffer tot de ge-

wenste primerconcentratie van 50 µM bereikt is. Hierna wordt de stockoplossing 10 keer ver-

dund, zodat een werkoplossing met een primerconcentratie van 5 µM verkregen wordt. De

stock- en werkoplossingen worden bewaard bij -20°C.

2.4.4 Real-time PCR

2.4.4.1 Reactiemix voor real-time PCR

De standaard reactiemix voor de real-time PCR reactie wordt weergegeven in tabel 2.2.

Tabel 2.2: Reactiemix voor real-time PCR.

Componenten Volume per reactive

Mastermix (2X) 7.5 µl

Forward primer (5µM) 0.75 µl

Reverse primer (5µM) 0.75 µl

Sigma H2O x µl

cDNA x µl

Totaal volume 20 µl

De mastermix is een bufferoplossing die het DNA polymerase, de SYBR Green probe en de

deoxynucleotiden (dNTP’s) bevat. De mastermix wordt in het donker bewaard bij -20°C. Al-

vorens de mastermix toe te voegen dient deze ontdooid en gecentrifugeerd te worden. Ook de

primers, het sigma H2O en het cDNA worden bewaard bij -20°C en moeten eerst ontdooien

alvorens ze kunnen worden toegevoegd aan de mix. De primers en het cDNA worden kort

gevortext en gecentrifugeerd.

Het totaalvolume van de real-time PCR reactie bedraagt doorgaans 15 µl per well van de 96

well plaat. De mix wordt aangevuld met sigma H2O tot dit volume bereikt is. Om accuraat-

- 25 -

heid en reproduceerbaarheid van de resultaten te verzekeren, wordt elk staal in drievoud gela-

den op de plaat. Alle experimenten bevatten een negatieve controle (NT of non template con-

trol; sigma H2O ipv cDNA) en een RT-minus controle (gDNA ipv cDNA) om genomische

contaminatie te detecteren. Bij het maken van de reactiemix en het vullen van de plaat wordt

continu op ijs gewerkt.

2.4.4.2 Real-time PCR

Nadat de plaat gevuld wordt met reactiemix voor real-time PCR, wordt deze afgedekt met een

seal, gevortext en gecentrifugeerd. Vervolgens wordt de plaat in het real-time PCR toestel

gebracht. Voor deze masterproef wordt gewerkt met het Applied Biosystems 7500 Fast toe-

stel en de geassocieerde Applied Biosystems software v2.0. Het real-time PCR programma

wordt hieronder weergegeven (tabel 2.3).

Tabel 2.3: Real-time PCR programma.

Holding stage 95°C 10' DNA polymerase activatie

Cycling stage 95°C 15'' Denaturatie aantal cycli: 45

60°C 45'' Annealing/extensie startcyclus: 2

Melt curve stage 95°C 15''

60°C 01'

95°C 30''

15°C Afkoelen

2.4.5 In vitro real-time PCR experiment

De up- of downregulatie van de targetgenen na bestraling zal slechts na enige incubatietijd

gezien kunnen worden. Via een in vitro experiment wordt het tijdstip na bestraling waarop de

genexpressie maximaal is, bepaald. Dit tijdstip is immers belangrijk om te weten op welk

moment na het CT-onderzoek de bloedafname bij de patiënt moet gebeuren. Bovendien kan

aan de hand van dit experiment bepaald worden welke van de kandidaat referentiegenen het

meest stabiel blijven onder de gebuikte experimentele condities.

Voor dit experiment werd bloed van drie gezonde donoren gebruikt. Het bloed werd verdeeld

over 3 buisjes waarvan één dienst doet als controle, één bestraald werd met 50 mGy en één

met 100 mGy X-stralen. Voor de bestraling wordt gebruik gemaakt van een stralingskwaliteit

van 100 kVp en een filtratie van 2 mm Al met een Philips MG420 X-straal generator gekop-

- 26 -

peld aan een MCN420 buis. Vervolgens wordt het bloed bij elk dosispunt verdeeld over vijf

buisjes die men respectievelijk 0, 1, 2, 3 of 4 uur laat incuberen op een schuddende plaat,

waarbij de buisjes in een hoek van 45° worden geplaatst. Na de incubatietijd wordt 500 µl

bloed toegevoegd aan 1,3 ml RNAlater en wordt de RNA isolatie met de RiboPure Blood kit

gestart. Na de RNA isolatie wordt het RNA omgezet in cDNA met behulp van de iScript cD-

NA synthesis kit. Dit cDNA wordt vervolgens gebruikt voor de RT-PCR reactie.

2.4.6 Data analyse en statistische verwerking

2.4.6.1 Primerefficiëntie

Een primerefficiëntie van 100% wijst op een perfecte verdubbeling van de template bij elke

cyclus gedurende de exponentiële amplificatiefase. Indien de efficiëntie 90% bedraagt, zal de

template vermenigvuldigd worden met een factor 1,9 bij elke cyclus, voor efficiënties van

80% en 70% wordt dit respectievelijk een factor 1,8 en 1,7. Hieruit blijkt dat een klein ver-

schil in efficiëntie een groot verschil in de totale hoeveelheid product teweeg brengt. Na 10

cycli zal de toename van de template 210

zijn bij een efficiëntie van 100% en 1,910

bij een ef-

ficiëntie van 90%. Algemeen kan men stellen dat na n cycli de hoeveelheid template gelijk zal

zijn aan [1 + efficiëntie]n. Bij het berekenen van de relatieve hoeveelheid (RQ waarde) van

een staal aan de hand van de Cq waarde, moet de primerefficiëntie in rekening gebracht wor-

den.

De primerefficiëntie wordt bepaald aan de hand van een standaard curve, die gebaseerd is op

een verdunningsserie van gekende template concentraties. In de standaard curve wordt het

logaritme van de concentraties in de verdunningsserie uitgezet tegenover de bijhorende Cq

waarde. De helling van de curve is een maat voor de primerefficiëntie. Een efficiëntie van

100% komt overeen met een helling van -3,32, berekend volgens de formule: Efficiëntie = 10

-1/helling -1. Primerefficiënties tussen 90 en 110% zijn aanvaardbaar. Dit komt overeen met een

helling van de standaardcurve van -3,6 tot -3,1. Verschillende experimentele factoren kunnen

de efficiëntie beïnvloeden en resulteren in efficiënties die buiten de aanvaardbare range vallen

[34, 35].

- 27 -

2.4.6.2 Stabiliteit van de referentiegenen

De stabiliteit van de referentiegenen wordt bepaald met behulp van het geNorm algoritme. Dit

algoritme, gebaseerd op het principe dat de expressieratio van twee ideale referentiegenen

identiek zou moeten zijn in alle stalen, duidt de referentiegenen met de meest stabiele expres-

sie aan en geeft het optimaal aantal referentiegenen aan. Het programma berekent de ‘gene

expression stability mesaure M’ of M waarde van een referentiegen gebaseerd op de gemid-

delde paarsgewijze variatie tussen alle onderzochte referentiegenen. Hoe lager de M waarde,

hoe groter de stabiliteit van het beschouwde referentiegen [35].

2.4.6.3 Relatieve kwantificatie

Voor de relatieve kwantificatie wordt gebruik gemaakt van de Cq waarden. Eerst wordt van

elk staal de gemiddelde Cq waarde van de drie replicaten berekend. Vervolgens worden de

gemiddelde Cq waarden geconverteerd naar relatieve hoeveelheden of RQ waarden. De RQ

waarde duidt de hoeveelheid input van elk staal bij het begin van de real-time PCR reactie

aan, relatief ten opzichte van een referentiestaal. Indien de efficiëntie 100% bedraagt, wordt

de RQ waarde als volgt berekend: RQ = 2 ΔCq

waarbij ΔCq het verschil is tussen de Cq waar-

de van het referentiestaal en de gemiddelde Cq waarde van het beschouwde staal. Welke refe-

rentie Cq men kiest heeft geen effect op de RQ waarde van de stalen. Om de fout te beperken,

wordt het gemiddelde van alle Cq waarden gebruikt als referentie Cq. Indien de primereffici-

entie 90% bedraagt in plaats van 100% wordt bovenstaande formule herleidt tot RQ = 1,9 ΔCq

.

De algemene formule voor de berekening van de RQ waarde wordt dus: RQ = [1 + efficiën-

tie]ΔCq

.

Verschillen in RQ waarde tussen stalen kunnen te wijten zijn aan verschillen in genexpressie,

maar daarnaast ook aan experimentele en technische variatie, zoals verschillen in kwaliteit en

kwantiteit van het startmateriaal. Om te corrigeren voor deze experimentele en technische

variatie, wordt de expressie van een targetgen genormaliseerd ten opzicht van de expressie

van één of meerdere referentiegenen. Deze normalisatie laat directe vergelijking van de ‘nor-

malized RQ’ of NRQ waarden tussen verschillende stalen toe. Voor elk staal wordt een nor-

malisatiefactor (NF) berekend door het geometrisch gemiddelde van de RQ-waarden van de

door geNorm gekozen referentiegenen te nemen. De NRQ waarde wordt dan als volgt bere-

kend: NRQ = RQ/NF. Vervolgens wordt deze NRQ waarde herschaald tot de ‘rescaled NRQ’

waarde. Deze rescaled NRQ waarde wordt verder gebruikt om de resultaten te analyseren [34,

35].

- 28 -

3 Resultaten


3.1.1 Optimalisatie protocol voor gamma-H2AX foci scoring

Het protocol voor γ-H2AX foci scoring werd binnen de onderzoeksgroep reeds geoptimali-

seerd voor de manuele scoring met behulp van de Olympus BX60 fluorescentie microscoop.

Voor het eerste antilichaam (anti-fosfo-histon H2AX) werd gebruik gemaakt van een 1:300

concentratie. In deze masterproef worden de foci echter zowel manueel als automatisch ge-

scoord met de Metafer scanning microscoop. Wanneer we bovenvermelde concentratie voor

het eerste antilichaam gebruiken, is het aantal foci vóór CT geteld door de Metafer micro-

scoop onrealistisch hoog. Dit is mogelijks te wijten aan het feit dat er bij een 1:300 concentra-

tie van antilichaam 1 te veel achtergrondkleuring is, die eventueel verkeerdelijk als foci ge-

scoord zou kunnen worden door de Metafer microscoop. Om dit te testen, werden voor een

aantal patiëntstalen drie immuunkleuringen met variabele antilichaamconcentraties (1:300,

1:500, 1:1000) uitgevoerd. Bij een 1:1000 concentratie van antilichaam 1 bleek de achter-

grondkleuring voldoende laag te zijn, zodat het aantal foci vóór CT realistischer was in verge-

lijking met het aantal bij de andere concentraties (1:300 en 1:500). Als gevolg werd er beslist

om voor de andere patiëntstalen te werken met een 1:1000 concentratie, zowel voor de manu-

ele als voor de automatische scoring.

3.1.2 In vivo dosis-respons curve

In figuur 3.1 werd het gemiddeld aantal γ-H2AX foci per cel geïnduceerd door de in vivo X-

straal blootstelling van de individuele patiënten uitgezet tegenover de DLP-waarde (dose

length product) van het CT-onderzoek (data in bijlage A.1). De DLP-waarde is een radiodia-

gnostische eenheid die proportioneel is met zowel de lokale dosis als de blootgestelde lengte

van het lichaam.

Voor bijna alle patiënten werd een stijging in het aantal foci gezien als gevolg van blootstel-

ling aan X-stralen gedurende het CT-onderzoek. De in vivo dosis-respons curve heeft een bi-

fasisch verloop met hypersensitiviteit in het lage dosis gebied.

- 29 -

Figuur 3.1: Het gemiddeld aantal foci per cel geïnduceerd door in vivo X-straal blootstelling in functie

van de DLP-waarde van de individuele patiënten bij een contrast CT-onderzoek uitgevoerd

met de CT-scanner generatie 2005 () of de CT-scanner generatie 2010 (●).

Voor de foutbalken werd gebruik gemaakt van de SE waarde of de standaard error (aantal foci

± SE). De SE wordt als volgt berekend: )2

SEM2

SEM(SE NAVOOR met SEM (standard error

of the mean) (n)fwijking/standaarda waarbij n het aantal cellen voorstelt waarin foci werden

gescoord (±150).

Om te bepalen of het gemiddeld aantal γ-H2AX foci voor en na het CT-onderzoek significant

verschillend is, werd de Wilcoxon signed-rank test gebruikt, waarvan het resultaat wordt

weergegeven in tabel 3.1. De p-waarde is kleiner dan 0,05 wat erop wijst dat het verschil in

aantal foci voor en na het CT-onderzoek statistisch significant is.

Tabel 3.1: Resultaat van Wilcoxon signed-rank test ter vergelijking van het aantal foci voor en na het

CT-onderzoek.

Wilcoxon signed-rank Test

gemiddelde p-waarde

waarde

gemiddeld # foci voor 0,65

0,000 -

gemiddeld # foci na 1,22

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0 1000 2000 3000 4000 5000

Geï

nd

uce

erd

aa

nta

l fo

ci/c

el

DLP (mGycm)

In vivo dosis-respons curve

- 30 -

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

0 1000 2000 3000 4000 5000Geï

nd

cuee

rd a

an

tal

foci

/cel

DLP (mGycm)

A. In vivo dosis-respons, Abdomen

Voor deze masterproef werden bloedstalen verzameld van patiënten die een contrast CT-

onderzoek ondergingen met een CT-scanner generatie 2005 (patiënten 1 – 35) of met een du-

al-energy CT-scanner generatie 2010 (patiënten 36 - 61). De dual-energy CT-scanner is uitge-

rust met twee X-straalbuizen die simultaan roteren rond de patiënt en straling uitzenden van

een verschillende energie. Het gebruik van twee X-straalbuizen heeft als belangrijkste gevolg

dat de scantijd sterk vermindert, wat aanleiding geeft tot een reductie van de dosis waaraan de

patiënten blootgesteld worden.

Om te zien of er inderdaad een verschil in dosis is tussen beide CT-scanners, werden de in

vivo dosis-respons curves voor beide CT-scanners vergeleken met elkaar. Belangrijk hierbij is

dat de patiënten gegroepeerd werden naargelang het soort onderzoek (thoracale CT of abdo-

minale CT) dat zij ondergingen. In figuur 3.2 worden de in vivo dosis-respons curves van de

CT-scanner generatie 2005 () en generatie 2010 () weergegeven voor de patiënten die een

abdominale CT-scan (A) ondergingen en voor patiënten die een thoracale CT-scan ondergin-

gen (B).

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

0 1000 2000 3000 4000 5000

Geï

nd

uce

erd

aan

tal

foci

/cel

DLP (mGycm)

A. In vivo dosis-respons, Abdomen

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

0 1000 2000 3000 4000 5000

Geï

nd

uce

erd

aan

tal

foci

/cel

DLP (mGycm)

B. In vivo dosis-respons, Thorax

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

0 1000 2000 3000 4000 5000

Geï

nd

uce

erd

aan

tal

foci

/cel

DLP (mGycm)

B. In vivo dosis-respons, Thorax

Figuur 3.2: In vivo dosis-repons curves van patiënten die een abdominale (A) of een thoracale (B) CT-

scan ondergingen voor de CT-scanner generatie 2005 (

- 31 -

Zoals blijkt uit bovenstaande figuur, zijn de DLP-waarden gegenereerd door de CT-scanner

generatie 2010 inderdaad gelegen bij lagere waarden in vergelijking met de CT-scanner gene-

ratie 2005 voor gelijkaardige onderzoeken. Om te bepalen of dit verschil in DLP-waarden

tussen beide scanners statistisch significant is, werd een MWU test uitgevoerd voor beide

onderzoeksgroepen afzonderlijk (abdominaal en thoracaal) en voor alle onderzoeken samen.

Daarnaast werd ook een MWU test gedaan voor de 3 bovenvermelde groepen om te evalueren

of ook het geïnduceerd aantal foci tussen beide toestellen significant verschillend is. De resul-

taten van deze testen worden weergegeven in onderstaande tabel (tabel 3.2).

Tabel 3.2: Resultaten van de Mann-Whitney U Test ter vergelijking van de CT scanner generatie 2005 en

de CT-scanner generatie 2010.

Mann-Whitney U Test

CT-scanner gemiddelde p-waarde

waarde

Alle onderzoeken gemiddelde delta foci 2005 0,74 0,001

2010 0,34

gemiddelde DLP 2005 1693,78 0,014

2010 806,65

Abdominale gemiddelde delta foci 2005 0,63 0,063

onderzoeken

2010 0,36

gemiddelde DLP 2005 1496,33 0,163

2010 827,38

Thoracale gemiddelde delta foci 2005 0,90 0,019

onderzoeken

2010 0,27

gemiddelde DLP 2005 1989,95 0,034

2010 719,60

Wanneer alle soorten onderzoeken samen worden beschouwd, is zowel de gemiddelde DLP-

waarde als het gemiddeld aantal foci significant lager bij de CT-scanner generatie 2010 (p <

0,05). Ook voor de groep van thoracale onderzoeken zijn beide variabelen significant ver-

schillend tussen beide CT-toestellen. Voor de groep van abdominale onderzoeken is het ver-

schil in DLP-waarden tussen beide toestellen echter niet significant, wat bevestigd wordt door

het feit dat er ook voor het geïnduceerd aantal foci geen significant verschil geobserveerd

wordt.

- 32 -

3.1.3 Vergelijking in vivo – in vitro data

Om de γ-H2AX foci dosis-respons na in vivo en in vitro bestraling te vergelijken, wordt ge-

bruik gemaakt van de in vitro dosis-respons curve bepaald in de studie van Beels et al. Deze

dosis-respons curve geeft het aantal foci geïnduceerd door in vitro bestraling weer in functie

van de dosis (in mGy), uitgemiddeld over 3 gezonde donoren. In de huidige studie werd ech-

ter gebruik gemaakt van DLP (in mGycm) als dosiseenheid. Om de vergelijking tussen in vivo

en in vitro dosis-respons curves te kunnen maken, werd de DLP (in mGycm) van de in vivo

dosis-respons curve geconverteerd naar equivalent total body dose (ETBD) (in mGy). Hier-

voor werd gebruik gemaakt van volgende formule: Equivalent total body dose = (DLP/Lromp)

x (Vromp / Vtotaal lichaam) waarbij L staat voor lengte (cm) en V voor volume (cm3). De waarden

van V en L voor mannen en vrouwen worden in tabel 3.3 weergegeven [44].

Tabel 3.3: Waarden voor lengte en volume van de romp en volume van het totale lichaam voor mannen en

vrouwen.

Lromp (cm) Vromp (cm3) Vtotaal lichaam (cm

3)

man 70 43982 69746

Vrouw 66 36642 58259

De equivalent total body dose wordt voor alle patiënten weergegeven in bijlage A.1.

Figuur 3.3 geeft het gemiddeld aantal γ-H2AX foci per cel geïnduceerd door de in vivo X-

straal blootstelling uitgezet in functie van de berekende ETBD. De in vitro dosis-respons cur-

ve bepaald door Beels et al. wordt eveneens weergegeven in figuur 3.3. Deze in vitro dosis-

respons curve heeft een bifasisch verloop; het geïnduceerd aantal foci stijgt sterk in het zeer

lage dosis gebied tot 6 mGy, gevolgd door een minder sterke stijging bij hogere dosissen.

Deze in vivo en in vitro data vertonen een min of meer gelijkaardige dosis-respons, maar het

aantal foci per cel geïnduceerd door de in vivo bestraling bij het contrast CT onderzoek is over

het algemeen lager dan het aantal na in vitro bestraling.

- 33 -

Figuur 3.3: γ-H2AX foci per cel geïnduceerd door in vivo blootstelling aan X-stralen in functie van de

equivalente total body dose van volwassen patiënten die een contrast CT ondergaan ( ). In

vitro dosis-respons curve ( ) (uit [11]). Voor de foutbalken van de in vitro data werd gebruik

gemaakt van de standaard afwijkingen voor de interindividuele variabiliteit tussen de 3 dono

ren.


3.2.1 Primer design

De primers voor de genen HMBS en B2M en voor de Alu repeats werden in de literatuur (re-

ferenties [41,45] ) gevonden. Via ‘RT primer database’ werden de primers voor de genen

GAPDH, CDKN1A en GADD45A gevonden. De gekozen primers worden weergegeven in

tabel 3.4.

Tabel 3.4: Primers voor real-time PCR.

Nr. Naam Sequentie Lengte Ta

(# nt) (°C)

127 HMBS/8.756F 5’ CAGCTTGCTCGCATACAGAC 3’ 20 60

128 HMBS/9.235R 5’ GAATCTTGTCCCCTGTGGTG 3’ 20 60

130 GAPDH/5.026F 5’ CGCTCTCTGCTCCTCCTGTT 3’ 20 60

131 GAPDH/5.346R 5’ CCATGGTGTCTGAGCGATGT 3’ 20 60

132 B2M/2.443F 5’ TGCTGTCTCCATGTTTGATGTATCT 3’ 25 60

133 B2M/2.528R 5’ TCTCTGCTCCCCACCTCTAAGT 3’ 22 60

134 CDKN1A/10.822F 5’ TGGAGACTCTCAGGGTCGAAA 3’ 21 60

135 CDKN1A/12.090R 5’ GGCGTTTGGAGTGGTAGAAATC 3’ 22 60

136 GADD45A/391F 5’ TCAGCGCACGATCACTGTC 3’ 19 60

- 34 -

137 GADD45A/473R 5’ CCAGCAGGCACAACACCAC 3’ 19 60

138 Alu-Sx-1-F 5’ TGGTGAAACCCCGTCTCTACTAA 3’ 23 60

139 Alu-Sx-1-R 5’ CCTCAGCCTCCCGAGTAGCT 3’ 20 60

Extra reverse primer voor GADD45A

164 GADD45A/465R 5’ CACAACACCACGTTATCGGG 3’ 20 62,2

3.2.2 Primerefficiëntie

Om accuraatheid van de data te verzekeren is het belangrijk dat alle primers gebruikt voor de

qRT-PCR experimenten een aanvaardbare efficiëntie hebben. De primerefficiëntie E wordt

bepaald aan de hand van de helling van de standaardcurve. Om voor alle genen een primeref-

ficiëntie te bekomen gelegen binnen de aanvaardbare range (90% - 110%), werd de stan-

daardcurve bepaald bij verschillende reactiecondities. De startconcentratie van het cDNA, de

verdunning, het aantal verdunningspunten in de standaardcurve en het aantal µl cDNA toege-

voegd aan de RT-PCR mix werden gevarieerd. Indien de startconcentratie van de verdun-

ningsreeks te hoog (60 ng en 40 ng) was, werd voor alle genen behalve CDKN1A en

GADD45A een efficiëntie gemeten hoger dan 110%. Dit wijst erop dat de amplificatie van

het cDNA op de een of andere manier geïnhibeerd werd bij de hoogste concentratiepunten.

Als de hoeveelheid startmateriaal in een staal hoger is, dan zijn de Cq waarden proportioneel

lager. Een lagere Cq waarde wijst erop dat er minder PCR cycli nodig zijn om voldoende flu-

orescentie te genereren om de treshold T te overschrijden. Men zou dus verwachten dat bij

stalen met een hogere cDNA startconcentratie, de amplificatiecurves vroeger verschijnen dan

deze van de stalen met een lagere startconcentratie. Dit was echter niet het geval voor de

hoogste concentratiepunten, zoals men kan zien in onderstaande figuur. Figuur 3.4 A geeft de

amplificatiecurve weer bij inhibitie, figuur 3.4 B geeft ter vergelijking de normale amplifica-

tiecurve weer zonder inhibitie.

- 35 -

Figuur 3.4 A: Amplificatieplot van de verdunningsserie (40 ng - 0,625 ng) van het gen HMBS met inhi

bitie. De rode amplificatiecurve van het staal met cDNA concentratie van 40 ng is gelegen

bij een groter aantal cycli en verschijnt dus later in vergelijking met de gele en groene

amplificatiecurves van de stalen met een lagere cDNA concentratie.

Figuur 3.4 B: Amplificatieplot van de verdunningsserie (20 ng - 0,312 ng) van het gen HMBS zonder

inhibitie. De rode amplificatiecurve van het staal met cDNA concentratie van 20 ng is ge-

legen bij een lager aantal cycli en verschijnt dus vroeger in vergelijking met de gele en

groene amplificatiecurves van de stalen met een lagere cDNA concentratie.

De inhibitoren kunnen aanwezig zijn in het staal zelf of afkomstig zijn van gecontamineerde

reagentia, epjes of ander laboratoriummateriaal. Een mogelijke bron van inhibitoren zou de

DNase I behandeling kunnen zijn die uitgevoerd wordt na de RNA isolatie om contaminerend

gDNA uit het geïsoleerde RNA te verwijderen. Om dit te onderzoeken werd een real-time

experiment gedaan startende van 40 ng cDNA dat na RNA isolatie geen DNase I behandeling

had gekregen. Ook hier werd opnieuw inhibitie gezien bij de hoogste concentratiepunten. De

oorzaak van inhibitie was dus niet gelegen bij de DNase I behandeling. Mogelijk was de inhi-

bitie afkomstig van reagentia gebruikt bij de RNA isolatie.

Aangezien inhibitie leidt tot efficiënties buiten de aanvaardbare range, werd getracht deze te

beperken door de standaardcurve te starten bij een lagere cDNA concentratie (20 ng). Op deze

manier werd ook de inhibitor verdund, waardoor deze zijn effect minder of niet kon uitoefe-

nen. Dit gaf inderdaard voor alle primers een verbetering van de efficiëntie.

40 ng

10 ng

2,5 ng

0,625 ng

20 ng

5 ng

1,25 ng

0,312 ng

- 36 -

Een bijkomende manier om het effect van inhibitie op de efficiëntie weg te werken, is door de

stalen met de hoogste cDNA concentratie te verwijderen en de standaardcurve te reanalyse-

ren. Dit werd gedaan om een aanvaardbare efficiëntie te bereiken voor de primers van de Alu-

repeats. Belangrijk hierbij is dat elk concentratiepunt dat verwijderd werd of niet opgenomen

werd in de standaardcurve niet gebruikt mag worden gedurende het effectieve experiment.

Naast deze efficiënties hoger dan 110% te wijten aan het optreden van inhibitie, werd voor

GADD45A steeds een efficiëntie gemeten lager dan 90%. Verschillende oorzaken kunnen aan

de basis liggen van deze lage efficiëntie, zoals suboptimale reagentconcentraties, lengte van

het amplicon of primerdesign. Door de standaardcurve te starten bij 20 ng cDNA werd reeds

enige verbetering van de efficiëntie gezien. Aangezien de oorzaak van de lage efficiëntie ook

aan de primers zelf te wijten kan zijn, werd een andere reverse primer voor GADD45A ge-

zocht via ‘RT primer database’ (zie tabel 3.4). Dit nieuwe primerpaar gaf echter geen hogere

efficiëntie in vergelijking met het eerste primerpaar, integendeel de bekomen efficiëntie was

nog lager. Daarom werd beslist om toch de oorspronkelijke reverse primer te behouden.

Een andere factor die de efficiëntie kan beïnvloeden, is technische variatie die ontstaat bij het

toevoegen van de reactieproducten in de wells van de plaat. Indien de Cq waarden van de re-

plicaten sterk verschillen, ziet men dat de efficiëntie daalt. Door de wells met slechte replica-

ten te verwijderen en de standaardcurve te reanalyseren, zien we doorgaans een verbetering

van de efficiëntie. Dit werd voor de genen GADD45A, CDKN1A en HMBS gedaan om de

efficiëntie verder te verbeteren [34, 35, 46].

De reactiecondities die een aanvaardbare primerefficiëntie gaven voor alle genen en de bijho-

rende primerefficiënties worden weergegeven in tabel 3.5.

Tabel 3.5: Primerefficiëntie van de target- en referentiegenen.

Gen Start Verdunning Aantal Aantal Primer-

concentratie

verdunnings- µl cDNA efficiëntie

(ng) punten (%)

HMBS 20 1 op 4 5 2 92,4

B2M 20 1 op 4 5 2 99,1

GAPDH 20 1 op 4 5 2 95,8

Alu 20 1 op 4 5 2 100,5

CDKN1A 20 1 op 4 5 2 94,3

GADD45A 20 1 op 4 5 2 88,8

- 37 -

De standaardcurves voor de verschillende genen met bovenstaande reactiecondities worden

weergegeven in bijlage B.1.

3.2.3 In vitro real-time PCR experiment

Aan de hand van de resultaten van het in vitro experiment werd onderzocht welke de meest

stabiele referentiegenen zijn. Daarnaast werd ook het effect van de dosis en de tijd na bestra-

ling op de genexpressie van de targetgenen CDKN1A en GADD45A geanalyseerd.

3.2.3.1 Stabiliteit van de referentiegenen

Voor de in vivo studie bij patiënten die een contrast CT-onderzoek ondergaan, zal er gewerkt

worden met drie referentiegenen. Normalisatie van qRT-PCR data met 3 referentiegenen

wordt immers beschouwd als de meest geschikte en universeel toegepaste methode [35]. Om

te bepalen welke van de kandidaat referentiegenen HMBS, B2M, GAPDH en Alu het meest

stabiel blijven onder invloed van straling, werden de RQ waarden van deze genen, resulterend

uit het in vitro experiment (zie bijlage B.2), ingevoerd in geNorm. De genen HMBS, B2M en

Alu werden door dit algoritme als beste referentiegenen aangeduid.

3.2.3.2 Effect van dosis en tijd op de genexpressie van de targetgenen

Met behulp van de door geNorm gekozen referentiegenen, werd het effect van de dosis en tijd

op de genexpressie van de targetgenen CDKN1A en GADD45A geanalyseerd. De data van

deze real-time PCR reactie worden weergegeven in bijlage B.3 en B.4.

Aangezien in dit in vitro experiment twee variabelen, de tijd en de dosis, getest worden, kan

herschaling van de NRQ waarde gebeuren naar de dosis of naar de tijd (zie bijlage B.3 (dosis)

en B.4 (tijd)). Wanneer we het effect van de dosis op de genexpressie van de targetgenen wil-

len bekijken, herschalen we naar de dosis. Hiertoe zal voor elk dosispunt (0, 50, 100 mGy) de

NRQ waarde van elk staal (0, 1, 2, 3 of 4 uur) gedeeld worden door de NRQ waarde van het

controlestaal (0 mGy) bij hetzelfde tijstip. Deze rescaled NRQ waarden worden vervolgens

voor elk tijdstip uitgezet ten opzichte van de dosis (zie figuur 3.5).

GAPDH

helling: -3.4

efficiëntie: 95.8%

- 38 -

Figuur 3.5 A: NRQ waarden herschaald naar de dosis uitgezet in functie van de dosis voor GADD45A.

De curves van 1, 2 en 3 uur stijgen in functie van de dosis. De expressie van GADD45A van

het staal dat men 4 uur laat incuberen daalt bij bestraling met 50 mGy en stijgt bij bestraling

met 100 mGy. Indien onmiddellijk na bestraling de RNA isolatie wordt gestart (0 uur incuba-

tie) blijft de genexpressie nagenoeg stabiel ongeacht de stralingsdosis.

Figuur 3.5 B: NRQ waarden herschaald naar de dosis uitgezet in functie van de dosis voor CDKN1A.

Enkel bij een incubatietijd van 2 uur stijgt de expressie in functie van de dosis. Bij een incu-

batietijd van 0, 1 of 3 uur zien we wel een stijging van de expressie onder invloed van bestra-

ling, maar niet in functie van de dosis (de expressie bij een dosis van 100 mGy stijgt wel,

maar niet zo sterk als bij een dosis van 50 mGy). De curve van 4 uur incubatietijd daalt in

functie van de dosis.

Een andere variabele waarvan we het effect op de genexpressie van de targetgenen willen

bekijken, is het effect van de tijd na bestraling. Hiervoor herschalen we naar de tijd door voor

0

1

2

3

4

5

0 50 100

Res

cale

d N

RQ

waard

e

Dosis (mGy)

A. GADD45A (dosis)

0 hrs

1 hrs

2 hrs

3 hrs

4 hrs

0

1

2

3

4

5

0 50 100

Res

cale

d N

RQ

waard

e

Dosis (mGy)

B. CDKN1A (dosis)

0 hrs

1 hrs

2 hrs

3 hrs

4 hrs

- 39 -

elk tijdstip (0, 1, 2, 3, 4 uur) de NRQ waarde van elk staal (0, 50 of 100 mGy) te delen door

de NRQ waarde van het controle staal (0 uur) bij dezelfde dosis. Deze rescaled NRQ waarden

worden vervolgens voor elk dosispunt uitgezet ten opzicht van de tijd (zie figuur 3.6).

Figuur 3.6 A: NRQ waarden herschaald naar de tijd uitgezet in functie van de tijd voor GADD45A.

De GADD45A expressie van het onbestraalde controlestaal daalt in functie van de tijd tot een

minimum wordt bereikt bij een incubatietijd van 3 uur. De curves van 50 mGy en 100 mGy

fluctueren over het hele tijdsverloop. Het tijdstip van maximale genexpressie wordt bereikt op

3 uur voor het staal bestraald met 50 mGy en op 4 uur voor het staal bestraald met 100 mGy.

Figuur 3.6 B: NRQ waarden herschaald naar de tijd uitgezet in functie van de tijd voor CDKN1A.

Indien het staal niet bestraald werd, stijgt de expressie van CDKN1A in functie van de tijd na

bestraling, met een maximum bij 2 uur. De expressie van het staal van 50 mGy stijgt ook in-

functie van de tijd met een maximum bij 3 uur. Bij bestraling met 100 mGy daalt de expressie

gedurende het eerste uur en stijgt vervolgens tot een maximum bij 2 uur.

0

1

2

3

4

0 1 2 3 4

Res

cale

d N

RQ

waard

e

Tijd (uur)

A. GADD45A (tijd)

0 mGy

50 mGy

100 mGy

0

1

2

3

4

0 1 2 3 4

Res

cale

d N

RQ

waard

e

Tijd (uur)

B. CDKN1A (tijd)

0 mGy

50 mGy

100 mGy

- 40 -

4 Bespreking


Het doel van deze masterproef is onderzoeken of de hypersensitiviteit in het lage dosis ge-

bied, recent geobserveerd in een studie bij kinderen in de interventionele cardiologie, ook

aangetoond kan worden bij volwassen die een CT-onderzoek ondergaan. Hiervoor werd ge-

bruik gemaakt van γ-H2AX foci als biomerker in de lage dosis regio.

4.1.1 Optimalisatie protocol voor gamma-H2AX foci scoring

De optimalisatie van het protocol voor γ-H2AX foci scoring bestond er vooral in de automati-

sche scoring van foci door de Metafer microscoop te optimaliseren. Zoals reeds vermeld werd

de concentratie van het eerste antilichaam aangepast van 1:300 naar 1:1000 om te vermijden

dat achtergrondsignalen verkeerdelijk als foci werden gescoord door de Metafer microscoop.

Deze 1:1000 antlichaam 1 concentratie leverde in vergelijking met de 1:300 en 1:500 concen-

tratie reeds meer realistische resultaten. Toch was het aantal foci vóór CT voor sommige sta-

len nog onrealistisch hoog in vergelijking met de manuele tellingen bij dezelfde concentratie

van antilichaam 1 (1:1000). Als gevolg werd beslist enkel de manuele foci scoring te be-

schouwen voor deze masterproef. Verdere optimalisatie van de automatische foci scoring

voor het lage tot zeer lage dosisgebied met behulp van de Metafer microscoop is noodzakelijk

om betrouwbare en realistische resultaten te bekomen.

4.1.2 In vivo dosis-respons curve

De berekening van risico’s op stralingsgeïnduceerde kanker is gebaseerd op het LNT model,

dat veronderstelt dat de DNA schade proportioneel is aan de dosis en dat cellulaire repairme-

chanismen even efficiënt werken bij lage en hoge stralingsdosissen. De validiteit van deze

extrapolatie van hoge naar lage dosissen wordt in vraag gesteld door een aantal radiobiologi-

sche fenomenen waaronder lage dosis hypersensitiviteit en het bystander effect.

In de huidige studie werd bewijs gevonden van bovenvermelde effecten die het LNT model in

vraag stellen. In figuur 3.1 werd het geïnduceerd aantal foci uitgezet in functie van de DLP-

waarde voor patiënten die een contrast CT-onderzoek ondergingen. Het aantal foci stijgt zeer

- 41 -

sterk bij DLP-waarden van 0-500 mGycm, gevolgd door een minder sterke stijging bij hogere

DLP-waarden. Voor bijna alle patiënten werd een stijging in aantal foci gezien, wat er op

wijst dat deze lage dosis CT-onderzoeken in bijna alle patiënten DNA schade induceren.

Reeds bij een DLP-waarde van 170 mGycm, wat overeenkomt met een equivalente total body

dose van 1,5 mGy, kon een significante stijging in aantal foci geobserveerd worden. Deze

resultaten bevestigen dus de lage dosis hypersensitiviteit geobserveerd in een studie van de

vakgroep bij kinderen die een cardiologische catheterisatie ondergingen. Hier werd reeds een

stijging in geïnduceerd aantal foci gezien bij een bloeddosis van 1 mGy. Ook andere in vivo

studies bevestigen deze resultaten. Löbrich et al. bestudeerden eveneens de stijging in aantal

γ-H2AX foci in lymfocyten geïnduceerd door thoracale of abdominale CT-onderzoeken bij

volwassen patiënten. Hier werd, overeenkomstig de resultaten van deze masterproef, reeds

een stijging in aantal foci geobserveerd bij een DLP-waarde van 150 mGycm. De in vivo do-

sis-respons curve gebaseerd op het aantal geïnduceerde γ-H2AX foci en de DLP-waarde heeft

hier echter een lineair verloop waardoor de lage dosis hypersensitiviteit niet teruggevonden

werd in de studie van Lobrich et al. [47]. Een mogelijke verklaring wordt verderop in deze

sectie besproken.

Om de γ-H2AX foci dosis-respons na in vivo en in vitro bestraling te kunnen vergelijken,

werd in figuur 3.3 de in vitro dosis-respons curve bepaald door Beels et al. vergeleken met de

in vivo dosis-respons curve van deze studie. Analoog aan de experimentele opzet in deze in

vivo studie, werd voor de in vitro dosis-respons curve vol bloed bestraald met lage dosissen

X-stralen en werd het geïnduceerd aantal γ-H2AX foci in T-lymfocyten bepaald. Beide dosis-

respons curves hebben een bifasisch verloop met hypersensitiviteit in het lage dosis gebied.

Het in vivo gedrag geobserveerd in de huidige studie wordt dus bevestigd door het in vitro

gedrag eerder geobserveerd binnen de vakgroep.

In figuur 3.3 is te zien dat het aantal foci geïnduceerd in vivo over het algemeen lager is dan in

vitro. Om de in vitro data te vergelijken met de in vivo data, werd de DLP geconverteerd naar

ETBD. De ETBD is echter niet helemaal representatief voor de fractie bloed die bestraald

werd gedurende het CT-onderzoek. Om de ETBD te berekenen, werd de fractie van het volu-

me van de romp tot het volume van het totale lichaam in rekening gebracht, waarbij veronder-

steld werd dat het bloed evenredig verdeeld is over het menselijk lichaam. De romp bevat, in

vergelijking met het hoofd en de benen echter het meeste bloed aangezien de grote bloedva-

ten, het hart en de grote organen hierin gelegen zijn. Indien de dosissen van het hart, de lon-

gen, de lever en de andere grote organen in de romp berekend zouden worden en indien er

- 42 -

rekening zou gehouden worden met de bloedinhoud, zouden de dosis-waarden nauwkeuriger

zijn en licht stijgen, met als gevolg dat de in vivo dosis-respons curve nauwer zou aansluiten

bij de in vitro dosis-respons curve.

Naast bovenvermelde studie zijn er ook andere onderzoeksgroepen die de dosis-respons curve

voor γ-H2AX foci na in vitro bestraling bestuderen. In een studie van Ojima et al. werden

ATM foci gescoord in fibroblasten bestraald met X-stralen met dosissen van 1,2 tot 200 mGy.

De dosis-respons curve vertoonde, analoog met de curve gevonden door Beels et al. een bifa-

sisch verloop met hypersensitiviteit in het lage dosis gebied (1,2 - 5 mGy) [12]. Ook bij be-

straling van fibroblasten met lage dosissen α-partikels werd een gelijkaardige bifasische do-

sis-respons curve geobserveerd [48]. Deze in vitro data ondersteunen dus ook het in vivo ge-

drag geobserveerd in deze studie.

Andere studies echter vonden een lineaire in vitro dosis-respons curve voor γ-H2AX foci

[9,14,23]. Zoals reeds vermeld, werd door Löbrich et al. ook in vivo een lineaire dosis-respons

curve gevonden [47]. Deze verschillen in resultaten kunnen te wijten zijn aan het soort celtype

dat bestudeerd wordt, aan de gebruikte dosissen en aan verschillen in gebruikte stralingskwa-

liteit. Daarnaast zou ook de omgeving van de cellen op het moment van bestraling een rol

kunnen spelen. Recent werd hiervoor bewijs geleverd in een studie uitgevoerd binnen de vak-

groep. Er werd immers aangetoond dat de lage dosis hypersensitiviteit geobserveerd bij be-

straling van geïsoleerde lymfocyten met X-stralen veel minder uitgesproken is als bij bestra-

ling van vol bloed. Daarnaast werd bij γ-bestraling van zowel geïsoleerde T-lymfocyten als

vol bloed een lineaire dosis-respons curve gezien, terwijl bij bestraling X-stralen een bifasis-

che dosis-respons curve met hypersensitiviteit in het lage dosis gebied werd geobserveerd

[49].

De geobserveerde lage dosis hypersensitiviteit in γ-H2AX foci inductie in vivo en in vitro

wordt door vele auteurs toegeschreven aan non-targeted effecten zoals het bystander effect bij

lage dosissen, waarbij niet alleen in de bestraalde maar ook in de naburige niet bestraalde ‘by-

stander’ cellen DNA schade optreedt [11,12,48,49]. Aangezien stralingsgeïnduceerde bystan-

der effecten aldus de DNA schade zouden kunnen verhogen, is het mogelijk dat het LNT mo-

del de kankerrisico’s bij lage dosis blootstelling onderschat.

Naast de globale in vivo dosis-respons curve van alle individuele patiënten, werd in deze mas-

terproef ook een vergelijking gemaakt tussen de in vivo dosis-respons curves van een CT-

- 43 -

scanner generatie 2005 en een CT-scanner generatie 2010 (zie figuur 3.2). In tabel 3.2 worden

de resultaten van de MWU test weergegeven, waarmee de significantie van het verschil in

zowel het geïnduceerd aantal γ-H2AX foci als het verschil in DLP-waarden tussen beide CT-

scanners werd geëvalueerd. Deze resultaten wijzen erop dat de geobserveerde reductie in de

DLP-waarde terug te vinden is in het effect, namelijk een significant lager geïnduceerd aantal

foci per cel.

Thoracale onderzoeken uitgevoerd met de CT-scanner generatie 2010 geven aanleiding tot

significant lagere DLP-waarden, wat zich uit in een significant lager geïnduceerd aantal foci

en dus minder schade voor de patiënt. Deze conclusie moet echter genuanceerd worden, ge-

zien het klein aantal patiënten dat een thoracaal CT-onderzoek op de CT-scanner generatie

2010 hebben ondergaan. Voor abdominale onderzoeken zijn de DLP-waarden niet significant

verschillend tussen beide CT-scanners, wat wordt weerspiegeld in het feit dat ook het verschil

in geïnduceerd aantal foci niet significant is. Een verklaring voor het feit dat het verschil tus-

sen beide CT-scanners niet significant is voor de abdominale onderzoeken, is dat er bij het

CT-toestel generatie 2005 toch ook een aantal onderzoeken zijn met een vrij lage DLP-waarde

en overeenkomstig een laag geïnduceerd aantal foci. Een verband met het soort onderzoek

werd niet gevonden.

De DLP-waarde geeft dus een goede indicatie voor lage dosis effecten. De significante daling

in geïndcueerd aantal foci wijst erop dat de dosisreductie van de nieuwe generatie CT-

scanners resulteert in een reductie in schade voor de patiënt. Als gevolg is het van groot be-

lang dat er in de toekomst meer geïnvesteerd wordt in deze nieuwe dosisreducerende CT-

scanners.

Besluit

De lage dosis hypersensitiviteit geobserveerd bij kinderen in de interventionele cardiologie

werd ook in deze masterproef bij volwassen patiënten die een contrast CT-onderzoek hebben

ondergaan teruggevonden. De in vivo dosis-respons curves van beide studies hebben een ge-

lijkaardig bifasisch verloop met een zeer sterke stijging in geïnduceerd aantal foci in het lage

dosis gebied. Deze data stellen dus eveneens het LNT model in vraag en duiden erop dat er

voorzichtig moet omgesprongen worden met het gebruik van ioniserende straling voor medi-

sche doeleinden.

- 44 -


Uit de resultaten van het in vitro experiment kan één ding met zekerheid gesteld worden, na-

melijk dat in vitro bestraling van vol bloed met lage dosissen X-stralen de expressie van de

targetgenen CDKN1A en GADD45A beïnvloedt. Er kunnen echter geen eenduidige besluiten

getrokken worden met betrekking tot de relatie tussen de dosis of de tijd en het niveau van

genexpressie. De curves van de dosis-respons en tijd-respons relatie weergegeven in figuur

3.5 en 3.6 hebben een complex, moeilijk te interpreteren patroon.

Genexpressie studies zijn het doorgaans eens over de genen of genfamilies waarvan de ex-

pressie gemoduleerd wordt door bestraling in verschillende celtypes. Over de richting en de

mate van deze transcriptionele modulatie bestaat echter geen eenduidig antwoord. Variabili-

teit in de transcriptionele respons wordt ook voor de bestudeerde targetgenen GADD5A en

CDKN1A geobserveerd door verschillende auteurs. De belangrijkste factoren verantwoorde-

lijk voor deze kwantitatieve en kwalitatieve variabiliteit zijn verschillen in bestudeerd species,

weefsel- en celtype en verschillen in experimentele condities (dosis, dosistempo, cultuurcon-

dities, tijd).

In een studie van Amundson et al. werd een gelijkaardig in vitro experiment uitgevoerd in

humane myeloïde tumor cellen bestraald met gamma stralen met dosissen van 20 tot 500

mGy. Voor zowel GADD45A als CDKN1A werd een stijgende dosis-respons relatie gevon-

den. Bovendien verlopen de curves voor alle dosissen ook stijgend in functie van de tijd tot

het moment van maximale genexpressie bereikt is, daarna dalen de curves opnieuw. Voor alle

bestudeerde dosispunten (20-50-100-250-500 mGy) is het punt van maximale genexpressie

bovendien gelijk (3 uur na bestraling voor beide genen) [50].

Vele van deze bevindingen worden niet teruggevonden in de resultaten van het in vitro qRT-

PCR experiment van deze masterproef. Wanneer we de grafiek beschouwen met de NRQ

waarden herschaald naar de dosis, kan men met zekerheid zeggen dat de expressie van beide

targetgenen inderdaad gemoduleerd wordt door in vitro bestraling met lage dosissen X-

stralen. Indien bestraling geen effect zou hebben op de genexpressie, zouden alle curves hori-

zontaal lopen bij een y-waarde van 1. Met betrekking tot de dosis-respons relatie kan geen

eenduidig besluit geformuleerd worden. Voor GADD45A werd enkel een min of meer stij-

gende dosis-respons relatie gevonden voor de curves van 1, 2 en 3 uur. Voor CDKN1A kon

dit enkel voor de curve van 2 uur geobserveerd worden.

- 45 -

Uit de grafiek met de NRQ waarden herschaald naar de tijd blijkt dat de modulatie van de

genexpressie inderdaad pas na een bepaalde incubatietijd optreedt. Indien dit niet het geval

zou zijn, zouden alle curves horizontaal lopen bij een y-waarde van 1. Het tijdstip van maxi-

male genexpressie zou bepaald kunnen worden aan de hand van het tijdstip waarop de ver-

schillende curves een maximum bereiken in deze grafiek of aan de hand van de curve die ge-

legen is bij de hoogste rescaled NRQ waarden in de grafiek met NRQ waarden herschaald

naar de dosis. Voor beide genen bestudeerd in deze masterproef kon niet één punt bepaald

worden waarbij de genexpressie maximaal is.

Bovendien zou men tenminste verwachten dat de curves van de onbehandelde controlestalen

(0 mGy) horizontaal zouden lopen bij een y-waarde van 1 in de grafiek van de NRQ waarden

herschaald naar de tijd. Voor GADD45A loopt deze curve nog min of meer horizontaal, maar

voor CDKN1A is dit helemaal niet het geval. Dit wijst er op dat het effect van de tijd moge-

lijks groter is dan het effect van de bestraling op de genexpressie. Incubatie van het controle-

staal bij 37°C zonder bijkomende behandeling gaf immers ook reeds aanleiding tot een veran-

dering in genexpressie, waardoor het effect van de bestraling zeer moeilijk te bepalen is. Aan-

gezien het tijdstip van bestraling niet voor alle stalen (0,1,2,3,4 uur incubatie) binnen een be-

paalde dosisgroep gelijk was, zou dit dus ook een mogelijke invloed kunnen hebben op de

genexpressie. Een poging om deze variatie te reduceren is poolen van het bloed. In plaats van

na bloedafname het bloed onmiddellijk te verdelen in vijf buisjes overeenkomstig de bestu-

deerde tijdspunten en deze buisjes afzonderlijk te bestralen, kan men één bloedstaal bestralen

en vervolgens het bloed uitverdelen om dit verschil in tijd te vermijden.

Ook andere artikels beschrijven zeer complexe relaties tussen de tijd en de expressie en tussen

de dosis en de expressie. In humane huidbiopsies bestraald met lage dosissen ioniserende stra-

ling (10-100-1000 mGy) werd de expressie van onder andere GADD45A en CDKN1A onder-

zocht na 1, 4 en 24 uur met behulp van real-time PCR. Ook hier werd geen lineaire dosis-

respons relatie voor expressie veranderingen van GADD45A en CDKN1A gevonden [51].

Hier werd ook reeds benadrukt dat de tijd een kritische parameter is bij de interpretatie van

genexpressie resultaten. Een klein verschil in tijd tussen bestraling van de verschillende stalen

kan aanleiding geven tot grote verschillen in expressie van niet alleen de targetgenen zelf

maar ook van de referentiegenen. Verschil in expressie van de referentiegenen gebruikt voor

normalisatie heeft uiteraard ook een grote invloed op de interpretatie van de resultaten. Kwan-

titatieve in vitro RT-PCR experimenten kunnen dus leiden tot belangrijke inzichten op cellu-

- 46 -

lair en moleculair niveau maar met de interpretatie van de resultaten moet voorzichtig omge-

sprongen worden omwille van de extreme gevoeligheid van deze techniek.

Besluit

Opdat er duidelijke conclusies getrokken zouden kunnen worden uit de resultaten van een

dergelijk in vitro experiment, moet de variatie tussen de verschillende stalen zoveel mogelijk

gereduceerd of vermeden worden. Een mogelijkheid om variatie in tijd te reduceren werd

reeds vermeld. Naast de tijd zijn er echter nog een groot aantal (oncontroleerbare) factoren die

de interpretatie van de resultaten bemoeilijken. De ideale oplossing zou een in vivo experi-

ment zijn, waarbij bloed van een vrijwilliger vóór (0 mGy) en 1, 2, 3 en 4 uur na bestraling

wordt afgenomen. Aan de hand van de resultaten van dergelijk in vivo experiment zou men de

beoogde optimalisatie voor het qRT-PCR luik van de multicentrische studie bij kinderen kun-

nen voltooien. In deze multicentrische studie zal via in vivo onderzoek naar de genexpressie

van GADD45A, CDKN1A en andere stralingsgevoelige genen bij kinderen getracht worden

de moleculaire basis van de lage dosis hypersensitiviteit te achterhalen.

- 47 -

Algemeen besluit

Het LNT model wordt algemeen beschouwd als de gouden standaard voor evaluatie van kan-

kerrisico’s na blootstelling aan lage dosissen ioniserende straling. De validiteit van dit model

wordt echter in vraag gesteld door de resultaten van de huidige studie bij volwassen patiënten

die een contrast CT-onderzoek hebben ondergaan. De dosis-respons curve gebaseerd op sco-

ring van γ-H2AX foci in perifere bloedlymfocyten is immers niet lineair, maar heeft een bifa-

sisch verloop met hypersensitiviteit in het lage dosis gebied. Dit zou erop kunnen wijzen dat

het LNT model de risico’s op stralingsgeïnduceerde kanker onderschat.

Hieruit blijkt duidelijk het belang van deze studie. Ondanks het veelvuldig gebruik van lage

dosissen ioniserende straling voor medische toepassingen, bestaat er immers nog geen con-

sensus omtrent de risico’s op stralingsgeïnduceerde kanker in dit dosisgebied. Verder onder-

zoek naar deze problematiek is dus een noodzaak. Bovendien duiden deze resultaten ook op

het belang van dosisreductie en rechtvaardiging van CT-onderzoeken. Al te dikwijls worden

er immers onnodige CT-scans uitgevoerd terwijl er alternatieven voorhanden zijn die gepaard

gaan met een veel lagere dosis aan ioniserende straling (radiografie) of helemaal geen ionise-

rende straling (MRI, ultrasonografie). In dit kader is het ook van groot belang dat radiologen

er zich van bewust worden dat CT-onderzoeken gepaard gaan met hogere dosissen ioniseren-

de straling en daarmee gepaard gaande hogere kankerrisico’s in vergelijking met andere ra-

diologische procedures.

- 48 -

Referentielijst

1 www.sckcen.be

2 Fayngersh, V, Passero M (2009). Estimating radiation risk from computed tomography scanning. Lung 187

(3): 143-148.

3 Voress M (2007). The increasing use of CT and its risks. Radiologic technology 79 (2): 186-190.

4 Brenner DJ, Doll R, Goodhead DT (2003). Cancer risks attributable to low doses of ionizing radiation:

assessing what we really know. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of

America 100 (24): 13761-13766.

5 Brenner DJ, Hall EJ (2007). Computed tomography – an increasing source of radiation exposure. The New

England journal of medicine 357: 2277-2284.

6 Bacher K (2010). Medische beeldvorming. Gent: Universiteit Gent.

7 Webb S (1988). The physics of medical imaging. Third edition. New York: Taylor & Francis Group.

8 Kalra MK, Maher MM, Toth TL, Hamberg LM, Blake MA, Shepard JA, Saini S (2004). Strategies for CT

radiation dose optimization. Radiology 230 (3): 619-628.

9 Rothkamm K, Lobrich M (2003). Evidence for a lack of DNA DSB repair in human cells exposed to very

low x-ray doses. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America 100 (9):

5057-5062.

10 Matsumoto H, Takahashi A, Ohnishi T (2004). Radiation-induced adaptive responses and bystander effects.

Biological sciences in space 18 (4): 247-254.

11 Beels L, Bacher K, De Wolf D, Werbrouck J, Thierens H (2009). Gamma-H2AX foci as a biomarker for

patient x-ray exposure in pediatric cardiac catheterization: are we underestimating radiation risks? Circula-

tion 120 (19): 1903-1909.

12 Ojima M, Ban N, Kai M (2008). DNA double-strand breaks induced by very low X-ray doses are largely

due to bystander effects. Radiation research 170 (3): 365-371.

13 Nuta O, Darroudi F (2008). The impact of the bystander effect on the low-dose hypersensitivity phenome-

non. Radiation and environmental biophysics 47 (2): 265-274.

14 Rothkamm K, Balroop S, Shekhdar J, Fernie P, Goh V (2007). Leukocyte DNA damage after multi-detector

row CT: A quantitative biomarker of low-level radiation exposure. Radiology 242 (1): 244-251.

15 Leonard A, Rueff J, Gerber GB, Léonard ED (2005). Usefulness and limits of biological dosimetry based on

cytogenetic methods. Radiation protection dosimetry 115 (1-4): 448-454.

16 Kobayashi J, Tauchi H, Chen B, Bruma S, Tashiro S, Matsuura S, Tanimoto K, Chen DJ, Komatsu K

(2009). Histone H2AX participates the DNA damage-induced ATM activation through interaction with

NBS1. Biochemical and biophysical research Communications 380 (4): 752-757.

17 Kuo LJ, Yang LX (2008). Gamma-H2AX – a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo 22

(3): 305-309.

18 Rogakou EP, Pilch DR, Orr AH, Ivanova VS, Bonner WM (1998). DNA double-stranded breaks induce

histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of biological chemistry 273 (10): 5858-5868.

19 Stucki M, Jackson SP (2006). γH2AX and MDC1: anchoring the DNA-damage-response machinery to

broken chromosomes. DNA repair 5 (5): 534-543.

20 Fernandez-Capetillo O, Celeste A, Nussenzweig A (2003). Focusing on foci: H2AX and the recruitment of

DNA-damage response factors. Cell cycle 2 (5): 426-427.

21 FitzGerald JE, Grenon M, Lowndes NF (2009). 53BP1: function and mechanisms of focal recruitment.

Biochemical society transactions 37 (4): 897-904.

22 Su TT (2006). Cellular responses tot DNA damage: one signal, multiple choices. Annual reviews of genetics

40: 178-208.

23 Suzuki K, Okada H, Yamauchi M, Oka Y, Kodama S, Watanabe M (2006). Qualitative and quantitative

analysis of phosphorylated ATM foci induced by low-dose ionizing radiation. Radiation research 165 (5):

499-504.

24 Marchetti F, Coleman MA, Jones IM, Wyrobek AJ (2006). Candidate protein biodosimeters of human

exposure to ionizing radiation. International journal of radiation biology 82 (9): 605-639.

25 Amundson SA, Fornace AJ (2001). Gene expression profiles for monitoring radiation exposure. Radiation

protection dosimetry 97 (1): 11-16.

26 Chaudhry MA (2008). Biomarkers for human radiation exposure. Journal of biomedical science 15 (5): 557-

563.

- 49 -

27 Paul S, Amundson SA (2008). Development of gene expression signatures for practical radiation biodosime-

try. International journal of radiation oncology, biology, physics 71 (4): 1236-1244.

28 Amundson SA, Bittner M, Meltzer P, Trent J, Fornace AJ (2001). Induction of gene expression as a monitor

of exposure to ionizing radiation. Radiation research 156 (5): 657-661.

29 Amundson SA, Do KT, Shahab S, Bittner M, Meltzer P, Trent J, Fornace AJ (2000). Identification of

potential mRNA biomarkers in peripheral blood lymphocytes for human exposure to ionizing radiation. Ra-

diation research 154 (3): 342-346.

30 Fachin AL, Mello SS, Sandrin-Garcia P, Junta CM, Ghilardi-Netto T, Donadi EA, Passos GA, Sakamoto-

Hojo ET (2009). Gene expression profiles in radiation workers occupationally exposed to ionizing radiation.

Journal of radiation research 50 (1): 61-71.

31 Ghandhi SA, Yaghoubian B, Amundson SA (2008). Global gene expression analyses of bystander and alpha

particle irradiated normal human lung fibroblasts: synchronous and differential responses. BMC medical

genomics 1: 63.

32 Ding LH, Shingyoji M, Chen F, Hwang JJ, Burma S, Lee C, Cheng JF, Chen DJ (2005). Gene expression

profiles of normal human fibroblasts after exposure to ionizing radiation: a comparative study of low and

high doses. Radiation research 164 (1): 17-26.

33 Nuta O, Darroudi F (2008). The impact of the bystander effect on the low-dose hypersensitivity phenome-

non. Radiation and environmental biophysics 47: 265–274.

34 www.invitrogen.com

35 www.biogazelle.com

36 Fei P, El-Deiry WS (2003). P53 and radiation responses. Oncogene 22: 5774–5783.

37 Snyder AR, Morgan WF (2004). Gene expression profiling after irradiation: clues to understanding acute

and persistent responses. Cancer metastasis reviews 23 (3-4): 259-268.

38 Chaudry MA (2006). Bystander effect: biological endpoints and microarray analysis. Mutation research 597:

98-112.

39 Logan J, Edwards K, Saunders N (2009). Real-time PCR: Current technology and applications. United

Kingdom: Caister Academic Press.

40 Marullo M, Zuccato C, Mariotti C, Lahiri N, Tabrizi SJ, Di Donato S, Cattaneo E (2010). Expressed Alu

repeats as a novel, reliable tool for normalization of real-time quantitative RT-PCR data. Genome biology

11.

41 Arenz A, Stojicic N, Lau P, Hellweg CE, Baumstark-Khan C (2007). Suitability of commonly used house-

keeping genes in gene expression studies for space radiation research. Advances in space research 39:1050-

1055.

42 medgen.ugent.be/rtprimerdb/

43 genome.ucsc.edu/

44 Kramer R, Zankl M, WilliamsG, Drexler G (1986). The calculation of dose from external photon exposures

using reference human phantoms and Monte Carlo Methods, Part I. München: Institut für Strahlenschutz.

45 Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, Speleman F (2002). Accurate

normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control

genes. Genome biology 3 (7): 1-11.

46 Wilson IG (1997). Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification. Applied and environmental

microbiology 10: 3741-3751.

47 Löbrich M, Rief N, Kühne M, Heckmann M, Fleckenstein J, Rübe C, Uder M (2005). In vivo formation and

repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations. Proceedings of the national

academy of sciences 25: 8984-8989.

48 Hu B, Han W, Wu L, Feng H, Liu X, Zhang L, Xu A, Hei TK, Yu Z (2005). In situ visualization of DSBs to

assess the extranuclear/extracellular effects induced by low-dose α-particle irradiation. Radiation research

164: 286–291.

49 Beels L, Werbrouck J, Thierens H (2010). Dose response and repair kinetics of γ-H2AX foci induced by in

vitro irradiation of whole blood and T-lymphocytes with X- and γ-radiation. International journal of radia-

tion biology [in press].

50 Amundson SA, Do KT, Fornace AJ Jr (1999). Induction of stress genes by low doses of gamma rays.

Radiation research 152 (3): 225-231.

51 Goldberg Z, Schwietert CW, Lehnert B, Stern R, Nami I (2004). Effects of low-dose ionizing radiation on

gene expression in human skin biopsies. International journal of radiation oncology, biology physics 58 (2):

567-574.

I

Bijlagen

II

Bijlage A

Resultaten γ-H2AX foci scoring

A.1 Data voor de in vivo dosis-respons curve

CT-scanner generatie 2005

Nr. Geslacht Onderzoeks- DLP ETBD # foci voor SD SEM # foci na SD SEM Delta foci SE categorie (mGycm) (mGy)

CT1 v abdomen 986,90 9,41 0,95 0,18 0,11 1,25 0,21 0,12 0,30 0,16

CT2 m thorax 438,00 3,95 0,96 0,17 0,11 1,79 0,25 0,16 0,83 0,19

CT3 m abdomen 1388,40 12,51 1,06 0,19 0,12 1,91 0,26 0,13 0,85 0,18

CT4 v thorax 1172,50 11,17 1,11 0,19 0,11 2,45 0,25 0,13 1,34 0,17

CT5 m abdomen 513,80 4,63 0,18 0,08 0,04 1,51 0,24 0,12 1,33 0,13

CT6 m thorax 1819,80 16,39 0,93 0,19 0,1 1,72 0,25 0,13 0,79 0,16

CT7 m abdomen 518,20 4,67 1,33 0,21 0,13 1,77 0,24 0,14 0,44 0,19

CT8 m thorax 2953,20 26,60 1,33 0,21 0,13 2,72 0,29 0,17 1,39 0,21

CT9 v abdomen 486,50 4,64 1,21 0,20 0,12 1,88 0,24 0,15 0,67 0,19

CT10 v abdomen 432,10 4,12 1,08 0,20 0,11 1,63 0,21 0,13 0,55 0,17

CT11 m abdomen 4338,50 39,08 0,73 0,14 0,09 2,59 0,30 0,17 1,86 0,19

CT12 v abdomen 558,90 5,33 0,52 0,13 0,09 1,01 0,18 0,12 0,49 0,15

CT13 m thorax 831,00 7,49 0,85 0,14 0,1 1,51 0,22 0,13 0,66 0,16

III

CT14 m abdomen 3078,30 27,73 0,85 0,17 0,09 1,98 0,24 0,16 1,13 0,18

CT15 v abdomen 551,50 5,26 0,97 0,17 0,11 1,39 0,20 0,12 0,42 0,16

CT16 m abdomen 2141,80 19,29 0,94 0,16 0,09 1,91 0,25 0,16 0,97 0,18

CT17 m abdomen 1801,60 16,23 0,70 0,12 0,07 1,24 0,20 0,11 0,54 0,13

CT18 m abdomen 4468,90 40,26 0,62 0,12 0,08 1,86 0,22 0,13 1,24 0,15

CT19 m thorax 4248,80 38,28 0,89 0,15 0,1 1,97 0,23 0,13 1,08 0,16

CT20 v abdomen 933,30 8,89 1,00 0,18 0,11 1,07 0,18 0,1 0,07 0,15

CT21 v thorax 398,80 3,80 0,67 0,12 0,07 1,64 0,23 0,11 0,97 0,13

CT22 v abdomen 1742,80 16,61 0,76 0,16 0,09 1,23 0,20 0,12 0,47 0,15

CT23 v thorax 1101,90 10,50 0,66 0,15 0,09 1,33 0,22 0,12 0,67 0,15

CT24 v abdomen 855,00 8,15 0,45 0,13 0,08 0,41 0,12 0,08 -0,04 0,11

CT25 v abdomen 477,00 4,55 1,04 0,19 0,09 1,02 0,15 0,1 -0,02 0,13

CT26 m abdomen 1335,80 12,03 0,66 0,15 0,09 0,76 0,16 0,08 0,10 0,12

CT27 m thorax 3073,60 27,69 0,23 0,09 0,06 1,19 0,19 0,11 0,96 0,13

CT28 v abdomen 945,30 9,01 0,26 0,10 0,05 0,45 0,12 0,07 0,19 0,09

CT29 v abdomen 3298,90 31,44 0,72 0,16 0,1 1,53 0,24 0,13 0,81 0,16

CT30 m thorax 4574,40 41,21 0,18 0,05 0,03 1,50 0,24 0,11 1,32 0,11

CT31 m thorax 3640,20 32,79 0,35 0,11 0,07 1,35 0,20 0,13 1,00 0,15

CT32 m thorax 613,90 5,53 1,23 0,22 0,14 1,24 0,13 0,1 0,01 0,17

CT33 v thorax 2599,00 24,77 0,22 0,07 0,05 1,45 0,20 0,12 1,23 0,13

CT34 m abdomen 569,40 5,13 0,51 0,09 0,08 1,35 0,16 0,13 0,84 0,15

CT35 m thorax 394,20 3,55 0,43 0,09 0,06 0,73 0,12 0,08 0,3 0,10

IV

CT-scanner generatie 2010

Nr. Geslacht Onderzoeks- DLP TBDE # foci voor SD SEM # foci na SD SEM Delta foci SE

categorie (mGycm) (mGy)

CT36 v abdomen 182,00 1,73 0,12 0,06 0,04 0,28 0,08 0,06 0,16 0,07

CT37 m abdomen 221,00 1,99 0,5 0,09 0,07 1,22 0,14 0,12 0,72 0,14

CT38 v abdomen 340,00 3,24 0,76 0,12 0,09 1,03 0,13 0,1 0,27 0,13

CT39 v abdomen 661,00 6,30 0,36 0,08 0,06 0,73 0,12 0,08 0,37 0,10

CT40 m thorax 767,00 6,91 0,62 0,1 0,07 1,55 0,16 0,13 0,93 0,15

CT41 v abdomen 660,00 6,29 0,88 0,12 0,1 1,18 0,14 0,11 0,3 0,15

CT42 v abdomen 735,00 7,00 0,49 0,08 0,06 1,12 0,14 0,09 0,63 0,11

CT43 m abdomen 254,00 2,29 0,98 0,13 0,09 1,01 0,13 0,09 0,03 0,13

CT44 v abdomen 1123,00 10,70 0,43 0,08 0,06 1,03 0,13 0,09 0,6 0,11

CT45 v abdomen 579,00 5,52 0,27 0,07 0,05 1,65 0,19 0,14 1,38 0,15

CT46 v abdomen 496,00 4,73 0,51 0,09 0,07 0,89 0,12 0,08 0,38 0,11

CT47 m abdomen 946,00 8,52 0,25 0,06 0,04 0,43 0,09 0,06 0,18 0,07

CT48 v abdomen 703,00 6,70 0,37 0,08 0,06 0,51 0,09 0,07 0,14 0,09

CT49 m thorax 2060,00 18,56 0,2 0,06 0,07 0,38 0,08 0,06 0,18 0,09

CT50 v abdomen 597,00 5,69 0,32 0,07 0,05 0,48 0,08 0,06 0,16 0,08

CT51 m abdomen 1066,00 9,60 0,31 0,07 0,05 0,73 0,11 0,08 0,42 0,09

CT52 m abdomen 1448,00 13,04 0,24 0,06 0,05 0,42 0,08 0,06 0,18 0,08

CT53 m thorax 348,00 3,13 0,16 0,05 0,03 0,21 0,06 0,04 0,05 0,05

CT54 m thorax 254,00 2,29 0,09 0,04 0,02 0,18 0,05 0,04 0,09 0,04

CT55 m thorax 169,00 1,52 0,19 0,05 0,04 0,28 0,07 0,05 0,09 0,06

CT56 m abdomen 1183,00 10,66 1,14 0,14 0,11 1,89 0,17 0,13 0,75 0,17

V

CT57 m abdomen 1566,00 14,11 1,37 0,18 0,12 1,74 0,2 0,15 0,37 0,19

CT58 m abdomen 1248,00 11,24 0,28 0,07 0,04 0,47 0,09 0,06 0,19 0,07

CT59 v abdomen 1727,00 16,46 0,71 0,11 0,08 1,24 0,14 0,1 0,53 0,13

CT60 m abdomen 1175,00 10,59 0,86 0,12 0,11 0,43 0,08 0,07 -0,43 0,13

CT61 v abdomen 465,00 4,43 0,78 0,11 0,09 1,02 0,13 0,1 0,24 0,13

VI

Bijlage B

Resultaten qRT-PCR experimenten

B.1 Standaardcurves voor de target- en referentiegenen

HMBS

helling: -3.5

efficiëntie: 92.4%

B2M

helling: -3.3

efficiëntie: 99.1%

VII

Alu

helling: -3,31

efficiëntie: 100,5%

CDKN1A

helling: -3.5

efficiëntie: 94.3%

GADD45A

helling: -3.6

efficiëntie: 88.8%

GAPDH

helling: -3,43

efficiëntie: 95,85%

VIII

B.2 Data van de referentiegenen

HMBS B2M Alu

Staal Cq gemiddelde

Cq RQ Cq

gemiddelde

Cq RQ Cq

gemiddelde

Cq RQ

0 mGy_0 u 21,83 21,932 0,811103015 17.16 17,159 0,708413852 14,96 15,222 0,566470385

0 mGy_0 u 21,70

17,26

15,26

0 mGy_0 u 22,26

17,06

15,45

0 mGy_1 u 22.39 22,389 0,601354393 15.95 15,953 1,625987673 14,96 14,507 0,931320456

0 mGy_1 u 22,42

15,93

14,46

0 mGy_1 u 22,36

15,98

14,11

0 mGy_2 u 21,00 21,313 1,216569304 16,17 16,263 1,313442802 14,16 14,600 0,873477454

0 mGy_2 u 21.31

16,20

15,02

0 mGy_2 u 21,63

16,42

14,62

0 mGy_3 u 21,38 21,376 1,167111867 15,97 16,146 1,423699598 13,95 13,640 1,702620136

0 mGy_3 u 21.38

16,15

13,50

0 mGy_3 u 21,37

16,31

13,47

0 mGy_4 u 20,67 21,089 1,408070255 17,27 17,092 0,742103374 15,10 15,247 0,556713022

0 mGy_4 u 21,14

16,54

15,40

0 mGy_4 u 21,46

17,46

15.24

50 mGy_0 u 21,77 21,690 0,95002987 16,01 16,116 1,453079761 14,50 14,280 1,091298057

50 mGy_0 u 21,84

16,31

14,34

IX

50 mGy_0 u 21,46

16,03

14,00

50 mGy_1 u 22,59 22,632 0,513054512 16,72 16,498 1,117129619 14,51 14,323 1,059054952

50 mGy_1 u 22.64

16,73

14,03

50 mGy_1 u 22,67

16,05

14,42

50 mGy_2 u 21,36 21,510 1,06884487 16,69 16,561 1,069768783 14,15 14,090 1,24499939

50 mGy_2 u 21,65

16,53

14,17

50 mGy_2 u 21,52

16,45

13,95

50 mGy_3 u 22,34 22,200 0,680501537 17,18 17,240 0,670154927 14,50 14,433 0,980767929

50 mGy_3 u 21,85

17,22

14,37

50 mGy_3 u 22,41

17,32

14,43

50 mGy_4 u 20,28 20,285 2,383129632 15,85 15,979 1,596577084 13,58 13,378 2,0426148

50 mGy_4 u 19,95

15,99

13,41

50 mGy_4 u 20,62

16,10

13,15

100 mGy_0 u 21,55 21,163 1,341690686 16,90 16,998 0,791582277 14,93 14,794 0,762749342

100 mGy_0 u 21,38

16,84

14,68

100 mGy_0 u 20,55

17,25

14,77

100 mGy_1 u 22,17 21,461 1,103695668 16,32 16,433 1,168206424 14,30 14,284 1,088004554

100 mGy_1 u 20,82

16,48

14,18

100 mGy_1 u 21,39

16,50

14,37

100 mGy_2 u 21,03 21,136 1,365560024 16,31 16,457 1,149266982 13.88 13,887 1,433464123

X

100 mGy_2 u 21,24

16,31

13,81

100 mGy_2 u 21.14

16,75

13,97

100 mGy_3 u 21,81 21,873 0,84277365 17,15 17,020 0,779722854 14,30 14,194 1,157875636

100 mGy_3 u 22,11

16,75

13,98

100 mGy_3 u 21,70

17,16

14,30

100 mGy_4 u 23,14 22,131 0,712203529 17,92 17,966 0,406328121 15,17 15,197 0,576604143

100 mGy_4 u 22,34

17,99

15,28

100 mGy_4 u 20,91

17,98

15,14

Referentie Cq 21,612 16,659 14,405

XI

B.3 NRQ waarden van de targetgenen herschaald naar de dosis

CDKN1A

Staal Cq Gemiddelde Cq RQ NF HMBS-B2M-Alu NRQ HMBS-B2M-Alu rescaled NRQ HMBS-B2M-Alu

0 mGy_0 u 24.21 24,208 0,226517245 0,687881173 0,329297056 1

0 mGy_0 u 24,16

0 mGy_0 u 24,25

0 mGy_1 u 22.62 22,254 0,829939274 0,969279348 0,856243637 1

0 mGy_1 u 22,39

0 mGy_1 u 22,11

0 mGy_2 u 21,77 21,713 1,188425885 1,117548996 1,063421728 1

0 mGy_2 u 21,66

0 mGy_2 u 21.71

0 mGy_3 u 21,88 21,765 1,148427912 1,41432604 0,811996583 1

0 mGy_3 u 21,79

0 mGy_3 u 21,62

0 mGy_4 u 22,75 22,724 0,607241705 0,834782566 0,727424997 1

0 mGy_4 u 22,99

0 mGy_4 u 22,44

XII

50 mGy_0 u 21,46 21,383 1,4796829 1,146366181 1,290759379 3,919741634

50 mGy_0 u 21,52

50 mGy_0 u 21,17

50 mGy_1 u 21,91 21,791 1,128448993 0,846697981 1,332764478 1,556524827

50 mGy_1 u 21,81

50 mGy_1 u 21,65

50 mGy_2 u 21,26 21,053 1,842798367 1,124927617 1,638148392 1,540450368

50 mGy_2 u 20,99

50 mGy_2 u 20,90

50 mGy_3 u 21,27 21,058 1,836455072 0,764757117 2,401357283 2,957349

50 mGy_3 u 21,05

50 mGy_3 u 20,85

50 mGy_4 u 21,61 21,507 1,362922145 1,98080327 0,688065375 0,94589185

50 mGy_4 u 21,50

50 mGy_4 u 21,41

100 mGy_0 u 22,28 21,968 1,003511547 0,932202156 1,076495631 3,269071533

100 mGy_0 u 21,91

100 mGy_0 u 21,71

100 mGy_1 u 21,78 21,728 1,176427645 1,119437575 1,050909556 1,227348748

100 mGy_1 u 21,79

100 mGy_1 u 21,62

XIII

100 mGy_2 u 20.58 20,573 2,534323242 1,310306365 1,934145562 1,818794474

100 mGy_2 u 20,56

100 mGy_2 u 20,58

100 mGy_3 u 21,67 21,517 1,353924688 0,912930485 1,483053431 1,826428167

100 mGy_3 u 21,51

100 mGy_3 u 21,37

100 mGy_4 u 24,46 24,353 0,205726912 0,550536672 0,373684302 0,51370836

100 mGy_4 u 23,57

100 mGy_4 u 25,03

Referentie Cq 21,973

GADD45A


0 mGy_0 u 28,63 28,562 0,856819106 0,687881173 1,245591737 1

0 mGy_0 u 28,46

0 mGy_0 u 28,59

0 mGy_1 u 29,28 28,696 0,786611094 0,969279348 0,811542199 1

0 mGy_1 u 28,66

0 mGy_1 u 28,14

XIV

0 mGy_2 u 29,33 29,027 0,637354336 1,117548996 0,570314445 1

0 mGy_2 u 28,88

0 mGy_2 u 28,87

0 mGy_3 u 29,17 28,836 0,719517761 1,41432604 0,508735426 1

0 mGy_3 u 28,96

0 mGy_3 u 28,38

0 mGy_4 u 28,99 28,631 0,819659188 0,834782566 0,981883453 1

0 mGy_4 u 28,62

0 mGy_4 u 28,29

50 mGy_0 u 28,46 28,170 1,099224409 1,146366181 0,958877214 0,769816614

50 mGy_0 u 28,16

50 mGy_0 u 27,89

50 mGy_1 u 28,78 28,618 0,826471157 0,846697981 0,976110933 1,202785184

50 mGy_1 u 28,45

50 mGy_1 u 28.62

50 mGy_2 u 28,70 28,381 0,961146598 1,124927617 0,854407504 1,498134076

50 mGy_2 u 28,42

50 mGy_2 u 28,02

50 mGy_3 u 28,86 28,481 0,902127178 0,764757117 1,179625738 2,318741093

50 mGy_3 u 28,43

50 mGy_3 u 28,16

XV

50 mGy_4 u 28,64 28,325 0,996140519 1,98080327 0,502897251 0,512176113

50 mGy_4 u 28,37

50 mGy_4 u 27,96

100 mGy_0 u 28,59 28,305 1,00852019 0,932202156 1,081868546 0,868557902

100 mGy_0 u 28,36

100 mGy_0 u 27,97

100 mGy_1 u 27,79 27,666 1,513807783 1,119437575 1,352293166 1,666325136

100 mGy_1 u 27,77

100 mGy_1 u 27,44

100 mGy_2 u 27,80 27,572 1,607143722 1,310306365 1,226540422 2,150638884

100 mGy_2 u 27,70

100 mGy_2 u 27,22

100 mGy_3 u 27,74 27,571 1,607947192 0,912930485 1,76130299 3,462119796

100 mGy_3 u 27,37

100 mGy_3 u 27,60

100 mGy_4 u 27,82 27,936 1,275032093 0,550536672 2,315980312 2,358712029

100 mGy_4 u 27,96

100 mGy_4 u 28,03


XVI

B.4 NRQ waarden van de targetgenen herschaald naar de tijd

CDKN1A


0 mGy_0 u 24.21 24,208 0,226517245 0,687881173 0,329297056 1

0 mGy_0 u 24,16

0 mGy_0 u 24,25

0 mGy_1 u 22.26 22,254 0,829939274 0,969279348 0,856243637 2,600216496

0 mGy_1 u 22,39

0 mGy_1 u 22,11

0 mGy_2 u 21,77 21,713 1,188425885 1,117548996 1,063421728 3,229369074

0 mGy_2 u 21,66

0 mGy_2 u 21.71

0 mGy_3 u 21,88 21,765 1,148427912 1,41432604 0,811996583 2,465848294

0 mGy_3 u 21,79

0 mGy_3 u 21,62

0 mGy_4 u 22,75 22,724 0,607241705 0,834782566 0,727424997 2,209023688

0 mGy_4 u 22,99

0 mGy_4 u 22,44

XVII

50 mGy_0 u 21,46 21,383 1,4796829 1,146366181 1,290759379 1

50 mGy_0 u 21,52

50 mGy_0 u 21,17

50 mGy_1 u 21,91 21,791 1,128448993 0,846697981 1,332764478 1,032542935

50 mGy_1 u 21,81

50 mGy_1 u 21,65

50 mGy_2 u 21,26 21,053 1,842798367 1,124927617 1,638148392 1,269135377

50 mGy_2 u 20,99

50 mGy_2 u 20,90

50 mGy_3 u 21,27 21,058 1,836455072 0,764757117 2,401357283 1,860422106

50 mGy_3 u 21,05

50 mGy_3 u 20,85

50 mGy_4 u 21,61 21,507 1,362922145 1,98080327 0,688065375 0,533070212

50 mGy_4 u 21,50

50 mGy_4 u 21,41

100 mGy_0 u 22,28 21,968 1,003511547 0,932202156 1,076495631 1

100 mGy_0 u 21,91

100 mGy_0 u 21,71

100 mGy_1 u 21,78 21,728 1,176427645 1,119437575 1,050909556 0,976232068

100 mGy_1 u 21,79

100 mGy_1 u 21,62

XVIII

100 mGy_2 u 20,58 20,573 2,534323242 1,310306365 1,934145562 1,796705446

100 mGy_2 u 20,56

100 mGy_2 u 20,58

100 mGy_3 u 21,67 21,517 1,353924688 0,912930485 1,483053431 1,37766786

100 mGy_3 u 21,51

100 mGy_3 u 21,37

100 mGy_4 u 24,46 24,353 0,205726912 0,550536672 0,373684302 0,347130347

100 mGy_4 u 23,57

100 mGy_4 u 25,03


GADD45A


0 mGy_0 u 28,63 28,562 0,856819106 0,687881173 1,245591737 1

0 mGy_0 u 28,46

0 mGy_0 u 28,59

0 mGy_1 u 29,28 28,696 0,786611094 0,969279348 0,811542199 0,651531457

0 mGy_1 u 28,66

0 mGy_1 u 28,14

XIX

0 mGy_2 u 29,33 29,027 0,637354336 1,117548996 0,570314445 0,457866272

0 mGy_2 u 28,88

0 mGy_2 u 28,87

0 mGy_3 u 29,17 28,836 0,719517761 1,41432604 0,508735426 0,40842871

0 mGy_3 u 28,96

0 mGy_3 u 28,38

0 mGy_4 u 28,99 28,631 0,819659188 0,834782566 0,981883453 0,788286743

0 mGy_4 u 28,62

0 mGy_4 u 28,29

50 mGy_0 u 28,46 28,170 1,099224409 1,146366181 0,958877214 1

50 mGy_0 u 28,16

50 mGy_0 u 27,89

50 mGy_1 u 28,78 28,618 0,826471157 0,846697981 0,976110933 1,017972812

50 mGy_1 u 28,45

50 mGy_1 u 28,62

50 mGy_2 u 28,70 28,381 0,961146598 1,124927617 0,854407504 0,891049962

50 mGy_2 u 28,42

50 mGy_2 u 28,02

50 mGy_3 u 28,86 28,481 0,902127178 0,764757117 1,179625738 1,230215633

50 mGy_3 u 28,43

50 mGy_3 u 28,16

XX

50 mGy_4 u 28,64 28,325 0,996140519 1,98080327 0,502897251 0,524464701

50 mGy_4 u 28,37

50 mGy_4 u 27,96

100 mGy_0 u 28,59 28,305 1,00852019 0,932202156 1,081868546 1

100 mGy_0 u 28,36

100 mGy_0 u 27,97

100 mGy_1 u 27,79 27,666 1,513807783 1,119437575 1,352293166 1,249960701

100 mGy_1 u 27,77

100 mGy_1 u 27,44

100 mGy_2 u 27,80 27,572 1,607143722 1,310306365 1,226540422 1,13372408

100 mGy_2 u 27,70

100 mGy_2 u 27,22

100 mGy_3 u 27,74 27,571 1,607947192 0,912930485 1,76130299 1,628019408

100 mGy_3 u 27,37

100 mGy_3 u 27,60

100 mGy_4 u 27,82 27,936 1,275032093 0,550536672 2,315980312 2,140722476

100 mGy_4 u 27,96

100 mGy_4 u 28,03


Moleculair onderzoek naar de effecten van X-stralen bij ...

Documents

Transcript of Moleculair onderzoek naar de effecten van X-stralen bij ...