BIOCHEMIE II – zelfstudie vragen

Hoofdstuk 9 – Anatomie van een genoom

Geef een operationele definitie van het begrip ‘gen’.Een gen is een DNA-segment dat de nodige info bevat voor de synthese van een functioneel RNA-molecuul, dit RNA wordt dan vertaald tot eiwit.

Verklaar volgende begrippen: fenotype (overerfelijke uiterlijke kenmerken), locus (plaats waar het gen ligt op het chromosoom), allel (factor die fenotype beinvloed), linkage (koppeling van genen als ze worden doorgegeven naar een volgende generatie), recombinatie (uitwisseling van delen van chromosomen door crossing-over tijdens meiose), centiMorgan (afstand tussen gebruikte merker en ziektegen als graad voor koppeling), reverse genetics (directe DNA-sequentie analyse), syntenie (gelijkwaardige ordening van genen tussen verwante soorten), zusterchromatiden (juist gekopieerde zusterchromatiden), centromeer (punt waar chromatiden fysich verbonden zijn), telomeer, karyotype (lichtmicroscopische opname van metafase chromosomen), reciproke translocatie (uitwisseling van chromosomen), transfectie (extra chromosoom in de cel brengen), heterochromatine (sterk gecondenseerd dus opgerold), euchromatine (niet-gecondenseerd dus ontrold), Barr-lichaampje (heterochromatine door gecondenseerd X- chromosoom), lyonisatie (inactivatie van X-chromosoom), C-paradox (relatie tussen hoeveelheid DNA en complexiteit van organisme), pseudogen (gen dat door mutatie inactief is geworden), exon-shuffling (alternatieve mogelijkheden in het verwijderen van exons leiden tot verschillende eiwitten uit 1 gen), heteroplasmie (voorkomen van meer dan 1 type organellair genoom bijv mDNA), minisatelliet (VNTR Variable Number of Tandem-Repeats, hoge graad van polymorfisme), microsatelliet (zeer korte tandem-repeats van 2-4 bp), haplotype (een door koppeling overerfbare allelencombinatie op 1 chromosoom), genotype (verzameling eigenschappen van het individu die is overgeërfd van beide ouders)

Hoe kan koppelingsanalyse gebruikt worden voor het lokaliseren van menselijke aandoeningen die een mendeliaanse wijze van overerving vertonen? Geef hiervan enkele voorbeelden.Door een merker-gen in de buurt van een ziektegen te plaatsen en dan te kijken of en hoeveel er crossing-over optreedt kan men de afstand tussen merkergen en ziektegen bepalen. Met heel goede merkers die zeer dicht bij het ziektegen liggen (dus veel crossing-over) kan men zelfs het ziektegen identificeren.

Beschrijf in het kort de complementatie-analyse zoals uitgevoerd door Beadle en Tatum bij Neurospora crassa. Wat werd hierdoor aangetoond ?Dit experiment testte de functionele effecten van genen. Men onderzocht het fenotype van een organisme dat 1 voedingsstof extra nodig heeft om te kunnen groeien in een synthetisch kweekmedium. Door 2 mutanten bij elkaar te zetten die beide niet kunnen groeien zonder toevoeging van histidine aan het kweekmedium kon men kijken of ze elkaar konden complementeren. Groeien de cellen in afwezigheid van histidine dan liggen de mutaties op 2 verschillende genen en complementeren ze elkaar. Zo niet liggen de mutaties op hetzelfde gen en is er geen compelementatie.

Hoe kan het bepalen van het karyotype bijdragen tot de diagnose van chronische myeloide leukemie?In het geval van chronische myeloide leukemie is een deel van de lange arm van chromosoom 9 uitgewisseld met die van chromosoom 22 door reciproke translatie. In een karyogram zie je dankzij de kleuring dan deze uitwisseling.

Beschrijf de structuur en functie van CEN en ARS sequenties bij gistchromosomen.Dit zijn sequenties die het gedrag van chromosomen regelen. De ARS-sequentie is verantwoordelijk voor replicatie en is een AT-rijke sequentie van 250 bp. De CEN-sequentie zorgt voor de seggregatie van de zusterchromatiden. Hij is ook AT-rijk, 100 bp en ligt in het centromeer.

Wat is de moleculaire structuur van nucleosomen en van de 30-nm vezel (solenoïde) ?Nucleosoom onstaat doordat DNA zich 2 maal windt rond een kern van 8 histonen (de histonen octameer: 2x H2A, H2B, H3 en H4). De 30 nm solenoide ontstaat doordat histon H1 de kralenketting van nucleosomen (10nm diameter) en linker-DNA tot een soort spoel oprolt. Dit is een buisvormige structuur met 6 nucleosomen per winding.

Hoe kan histonacetylatie en –deacetylatie bijdragen tot (de)activatie van genen ?Transcriptionele gebieden vertonen een hogere graad van histon-acetylering dan niet-actieve gebieden. Geacetyleerde N-termini van histonen H2A, H2B, H3 en H4 binden niet op het DNA en laten transcriptiefactoren hun gang gaan. De acetylatie van de N-terminale lysineresidu’s wordt verzorgd door HAT’s (histon acetyl transferasen) en vindt plaats op de ε-aminogroep van de zijketen.

Geef enkele voorbeelden van niet-histoneiwitten.

Niet-histon eiwitten zijn vooral verantwoordelijk voor het eiwitskelet van het chromosoom (zowel tijdens metafase als interfase). Een voorbeeld is topoisomerase II dat de 1 van de ketens van DNA doorknipt, het doorgeknipte einde rond de andere keten doet draaien en vervolgens het weer aan elkaar plakt. Zo worden knopen in het DNA vermeden.

Beschrijf de menselijke β-globine genencluster.In een cluster zijn de spacers tussen genen aanzienlijk korter. De B-globinecluster op chromosoom heeft genen die op 10 kb van elkaar uit elkaar liggen. Verder komen de clusters vaak voor in de DNA-lussen van 10000 tot 100000 bp lang. Er zijn 2 relatief korte introns aanwezig.

Geef voorbeelden van tandem-repeat genenclusters. Wat is het functioneel belang hiervan?De histon- en rRNA-genenclusters zij tandem-repeat clusters. Doordat de cel zeer op zeer korte tijd veel ribosomen en histonen moet kunnen produceren is het goed dat er meerdere genen voor bestaan. De tandem-repeats van de rRNA-clusters liggen aan de uiteinden van enkele chromosomen (microscopisch te zien als nucleolus). De tandem-repeats van de histonen-clusters worden van elkaar gescheiden door spacer DNA.

Geef voorbeelden van exon-shuffling bij eiwitten betrokken bij de regulatie van de bloedstollingscascade.Een gevolg van exon-shuffling is de enorme variatie aan eiwitten die men uit 1 gen kan maken. Men vindt hetzelfde Kringle-domein in tissue-plasminogen-activator en in factor XII een bloed stollingseiwit.

Schets de organisatie van het menselijk nucleair genoom zowel wat betreft het voor genen als niet voor genen coderend DNA.Het humaan genoom bestaat uit het nucleair en mitochondriaal genoom. Het nucleair genoom bestaat uit 20-30 % uit genen dat dan in eiwitcoderend en in niet-eiwitcoderend (introns en flankerende sequenties) kan worden verdeeld. Het andere deel van het nucleair genoom bestaat uit 70-80% niet voor genen coderend DNA. Dit kan dan onderverdeeld worden in unieke spacers, pseudogenen, gen-fragmenten, ALU- of LINE repeats en tandem- en cluster-repeats.

Wat is satelliet-DNA? Geef hiervan voorbeelden bij het menselijk genoom.Dit is het eerst ontdekte sterk repetitief tandem-repeat-DNA en heeft onder andere een relatie met de functie van telomeren. Deze simpele sequenties worden veel na elkaar herhaald in het DNA.

Beschrijf de structuur, lengte en voorkomen van menselijk mitochondriaal DNA.Het cirkelvormig mitochondriaal DNA codeert voor 2 soorten rRNA, 22 tRNA’s en 13 soorten mRNA’s. De voor genen coderende informatie bestrijkt bijna 100% van het hele genoom zodat er bijna geen plaats is voor spacers of introns. de 2 complementaire DNA strengen (H- en L- keten) coderen coor functioneel RNA, maar vooral de H-keten codeert.

Welke genen worden gecodeerd door menselijk mitochondriaal DNA? Hoe gebeurt de overerving van dit DNA?De genen coderen voor 2 soorten rRNA, 22 tRNA’s en 13 soorten mRNA’s. De overerving gebeurt niet via mendeliaans patroon maar alleen de mitochondrien van de moeder worden doorgegeven. Deze bevinden zich in de eicel en worden niet meegedragen door de spermatozoiden.

Wat zijn mogelijke gevolgen van mutaties in menselijk mitochondriaal DNA? Dit worden mitochondriale ziekten; afwijkingen van het centraak zenuwstelsel (doofheid, aantasting van de oogzenuw) en vormen van suikerziekte.

Wat zijn de belangrijkste HLA-klasse I, -klasse II en –klasse III genen?De meest telomerische regio bevat HLA-klasse I (A-, B- en C-) genen. Deze regio komt tot expressie in vrijwel alle lichaamscellen. HLA-klasse I eiwitten presenteren antigene peptiden aan membraangebonden receptoren van cytotoxische T-cellen. Meestal zijn de peptiden van in stukjes geknipte lichaamseigencellen afkomstig (self) maar bij virale infectie worden de virale eiwitten in peptiden geknipt en laten zien. Dit start de immunologische respons.Expressie van HLA-klasse II (DR-, DQ-, en DP-) genen vindt plaats in antigeen presenterende cellen zoals macrofagen, dendritische cellen en ge-activeerde B-cellen. De gepresenteerde peptiden zijn afkomstig van gefagocyteerde eiwitten. Het HLA-eiwit functioneert als een membraaneiwit dat het antigene peptide aanbied aan een T-cel.Verder coderen de TAP1- en TAP2-genen voor transporteiwit van antigene peptiden, dat deze peptiden naar het ER-lumen brengt waar ze binden op lege klasse I moleculen. DE LMP-genen dragen bij tot het vormen van een proteasoondat cellulaire peptiden in stukjes hakt. De HLA-genen coderen ook nog voor eiwitten van het complement systeem, voor tumor necrosis factor (TNF, cytokine) en voor heat shock protein 70 (hsp70).

Wat zijn de belangrijkste soorten DNA polymorfisme in het mensgenoom, en wat zijn hun kenmerken?Het HLA-complex, de VNTR’s (minisatellieten) en de microsatellieten. Het zijn tandemrepeats en het ze hebben een vrij korte sequentie.

Schets in grote lijnen hoe de informatie uit het Menselijk Genoom Project kan aangewend worden in hetr actueel (bio)medisch onderzoek.

Hoofdstuk 10 – Continuïteit en verandering in de DNA-sequentie van het genoom

Beschrijf kort de verschillende fasen van de celcyclus van zoogdieren.De beslissing om te starten met de celdeling wordt genomen in de G1-fase, ook wordt de replicatie van het DNA voorbereid. De lengte van de G1-fase is zeer variabel. Hierna begint de S-fase waarin van het hele menselijke diploide genoom een kopie wordt gemaakt. De lente van deze fase bedraagt 10 uur voor een menselijke cel. Na de S-fase komt eerst nog de G2-fase voordat de cel overgaat tot mitose. De G1-, S- en G2-fase vormen samen de interfase. In de G2-fase wordt uiteindelijk de beslissing genomen om tot mitose over te gaan en wordt de mitose ook voorbereid. De echte celdeling (cytokinese) vindt plaats tijdens de mitose die slechts enkele procenten van de tijdsduur van celcyclus bestrijkt.De interfase wordt microscopisch gekenmerkt door de aanwezigheid van homogeen chromatine in een celkern. In de mitose worden de chromosomen zichtbaar, migreren ze naar 1 vlak en seggreren ze naar dochtercellen.

Wat is de functionele relatie tussen cyclines en cycline-afhankelijke proteïnekinasen bij de celcyclus?Het labiel cycline en stabiele proteine kinase (p34-eiwit) vormen samen het MPF (maturation promoting factor). Deze factor reguleerde de overgang tot mitose. De M-cyclines worden aangemaakt tijdens de G2-fase en afgebroken juist na de mitose. Tijdens de G2-fase vormt het cycline met het p34-eiwit het pre-MPF-complex. Het actieve MPF gaat eiwitten fosforyleren wat de mitose start.

Welke eiwitten zijn van belang voor de bewaking van de celcyclus ter hoogte van de moleculaire ‘checkpoints’?Dat zijn de eiwitten pRb en p53 tijdens de G naar S overgang.

Wat is de functie van telomerase?Telomerase herstelt het chromosoom-einde, de telomeer die bij elke celdeling ongeveer 100 bp korter wordt. Telomerase is actief in kankercellen en dit verklaart waarom deze zich oneindig kunnen delen. Dankzij telomerase wordt hun voor genen coderend DNA niet aangetast na vele celdelingen.

Noem de elementen op die nodig zijn voor de replicatie van DNA.Helicase openen de dubbel helix bij startpunten met de startsequentie ORI. Hierdoor ontstaan 2 replicatievorken. DNA-polymerase schuift over de matrijs, leest de basenvolgorde en katalyseert de aaneenschakeling van nieuwe bouwstenen tot een complementaire keten. Verder zijn er primers nodig om deze in de richting 5->3 te verlengen (primerelongatie). RNA-ligase is nodig om de Okazaki-fragmenten aan elkaar te lassen op de lagging strand. Verder zijn topo-isomerasen nog nodig om het superopgerolde DNA te ontspannen en knopen te voorkomen.

Beschijf de verschillen in DNA replicatie ter hoogte van de ‘leading’ en de ‘lagging’ streng.Aangezien DNA-polymerase alleen van ‘5 naar ‘3 kan werken moet er voor de lagging strand een oplossing worden gevonden. deze is om primers te plaatsen op verschillende afstanden van elkaar en het DNA-polymerase vanaf deze primers te laten werken. Zo krijg je allemaal losse fragmenten (Okazaki-fragmenten) die dan door een ligase aan elkaar moeten worden gelast.

Wat zijn de belangrijkste DNA-polymerasen van E. coli en bij eukaryoten?E. Coli bezit DNA-polymerase I dat belangrijk is bij DNA herstel en DNA-polymerase III dat voor replicatie zorgt.Bij mensen zorgen DNA-polymerasen α en δ voor replicatie van het nucleair DNA. DNA-polymerase β zorgt voor DNA-herstel en DNA-polymerase γ zorgt voor de replicatie van mitochondriaal DNA.

Welke hulpeiwitten zijn naast DNA-polymerase nodig voor een efficiënte DNA-replicatie?Hulpeiwitten zijn topoisomerase dat het superopgerold DNA doet ontspannen. DNA-Helicase katalyseert het ontrollen van de DNA-helix aan de replicatievork. De enkelstrengen worden meteen gestabiliseerd door single-strand binding proteins. Primase zorgt op de lagging strand voor de synthese van RNA-primers.

Beschrijf de rol van topo-isomerasen.Doordat de DNA-helix moet ontrollen op bepaalde plekken maar zijn uiteinden niet kunnen roteren ontstaan er naast de ontrolde plaatsen superwindingen. Deze superwindingen kunnen maar in een beperkte mate ontstaan omdat ze anders voor teveel spanning zorgen en de helix kan scheuren. De topoisomerasen lossen dit op door 1 of 2 ketens van de helix door te knippen, de losse einden rond elkaar te laten draaien en dan weer aan elkaar vast te lassen.

Wat is het functioneel belang van de 3’→5’ en van de 5’→3’ exonuclease activiteit van DNA-polymerase?De 3’→5’ exonuclease activiteit is nodig bij proofreading, het kijkt na of de nieuw aangebouwde base Watson-Crick complementariteit vertoont ten opzichte van de matrijs. De 5’→3’ exonuclease-activiteit wordt gebruikt om de primers van Okazaki-fragmenten te verwijderen.

Welke componenten dragen bij tot de grote betrouwbaarheid van DNA-replicatie?De 3 componenten zijn kieskeurige keuze van het substraat volgens de Watson-Crick basenparen regels, proofreading (correctie van een fout gekozen substraat) en het mismatch-herstel dat via knip- en plakwerk zeldzame fouten herstelt.

Wat is ‘mismatch’ herstel? Beschrijf de moleculaire mechanismen van dit type DNA-herstel bij E. coli.Kort na replicatie van het bacterieel chromosoom is de nieuw aangemaakte DNA-streng chemisch te onderscheiden van de matrijsstreng doordat alleen deze gemethyleerd op het adenine ter hoogte van GATC-sequenties. Wanneer de base van de nieuwe streng niet past wordt deze via hydroluuse verwijderd. Het kwaliteitscontrolerende MutS eiwit controleert de DNA-duplex. Indien er een basen-incompatibiliteit ontdekt wordt worden de eiwitten MutL en MutH naar de plaats van de fout gestuurd. MutH knipt dan met hulp van MutL de niet-gemethyleerde streng ter hoogte van 2 flankeerde GATC-sites. MutU ontrolt beide strengen in het gebied van de breuk, DNA-polymerase vult het gat en DNA-ligase herstelt alles.

Wat is het essentieel verschil tussen een somatische en een kiemlijnmutatie?Een kiemlijnmutatie is een mutatie in de geslachtscellen (gameten) en zorgt voor een erfelijk overdraagbare verandering voor nakomelingen. Een somatische celmutatie resulteert in een verandering van de getroffen cel en zijn eventuele nakomelingen, deze is dus lokaal en individueel.

Noem ten minste vier soorten van DNA-schade ter hoogte van specifieke basen in DNA.Hydrolyse van purinebasen, oxydatie van guanine, TT-dimeren-vorming na absorptie van een UV-foton door een thyminebase en hydrolytische deaminatie (omzetting van cytosine tot uracil).

Hoe ontstaan TT-dimeren en door welk mechanisme kunnen ze worden hersteld?TT-dimeren ontstaan door absorptie van een UV-foton door een thyminebase die de energie van het foton gebruikt voor brugvorming met een naburig thymine. Het gevolg is een covalente structuur die de DNA-helix verstoort en de replicatie en transcriptie verhindert. Herstel kan door de fotoreactivatie waarbij een speciaal enzym (fotolyase) het TT-dimeer herkent, erop bindt en wacht op een nieuw foton om de energie hiervan te gebruiken om het TT-dimeer te verbreken. Een andere optie van herstel is een vorm van excisieherstel waarbij het DNA aan weerszijden van de TT-dimeer door een endonuclease wordt doorgeknipt en het gat door DNA-polymerase en DNA-ligase wordt gedicht.

Waarom wordt de hydrolytische deaminatie van cytosine premutageen genoemd?De verandering is premutageen omdat uracil tijdens de transcriptie en replicatie adenine kiest als complementaire base, terwijl cytosine een paar vormt met guanine.

Wat zijn CpG eilanden en wat is hun betekenis bij de studie van het menselijk genoom?CpG eilanden zijn CG dinucleotiden in het menselijk DNA. Een deel van de cytosines hiervan wordt heel makelijk enzymatisch gemethyleerd tot 5-methylcytosine. Het 5-methylcytosine wordt op zijn beurt iets gemakkelijker gehydrolytisch gedeamineerd dan cytosine, hierdoor ontstaat thymine die van nature aanwezig is in DNA. Deze fout wordt dus moeilijk opgespoord tijdens DNA-herstel. CG dinucleotiden zijn daarom ongeveer een 40x waarschijnlijker doelwit voor puntmutaties dan willekeurige cytosines. Daarom komen CpG eilanden weinig voor in het menselijk DNA. 5-methylcytosine wordt in kankeronderzoek als endogeen mutageen en carcinogeen bestempeld.CG-eilanden zijn repetitief voorkomende CG-sequenties die vaak in een promoter of enhancer regio van een transcriptie-eenheid liggen.

Wat zijn AP-endonucleasen?AP-endonucleasen zijn nucleasen die AP-sites herkennen en deze openknippen bij base-excisie herstel. De beschadigde base wordt eerst herkend en afgeknipt, hierna ontstaat de base vrije plaats (AP-site) die dan door AP-endonuclease wordt herkend en opengeknipt. Fosfodiesterase knipt de backbone een 2e maal door, DNA-polymerase vult het gat op en DNA-ligase herstelt de breuk.

Wat is de moleculaire basis van de huidaandoening xeroderma pigmentosum?Een mutatie in de XP-genen zorgen voor Xeroderma Pigmentosum. De XP-genen staan in voor herstel van DNA-schade na UV-straling. Patienten vertonen een extreme gevoeligheid voor zonlicht en krijgen al zeer vroeg huidkanker.

Via welke mechanismen van genherschikkingen kan er variatie in een genoom ontstaan?Genherschikkingen komen tot stand via homologe recombinatie en transpositie. Homologe recombinatie is een proces waarin een DNA-segment wordt uitgewisseld met een homoloog gebied van een ander DNA-molecuul. Bij de mens vindt dit plaats tijdens de meiose; crossing over. Ook na de S-fase van een somatische celcylcus kunnen de homologe chromatiden van een gerepliceerd chromosoom delen uitwisselen door homologe recombinatie; sister chromatid exchange. Het gebied waar keten-uitwisseling plaatsvindt noemt met heteroduplex.

Transpositie is een drastischere vorm van genherschikking en houdt een insertie of deletie van een DNA-fragment in. Dit wordt meestal door externe factoren zoals DNA-parasieten (bacteriofagen en plasmiden) veroorzaakt.

Wat is het gevolg van homologe recombinatie tijdens de mitose resp. de meiose?Crossing-over tijdens de meiose zorgt voor een verandering in de erfelijke eigenschappen, het maternaal en paternaal DNA wordt gemengd. Bij sister-chromatid exchange treedt er geen verandering op van de erfelijke informatie.

Welke mobiele extrachromosomale elementen ken je?Bacteriofagen zijn virussen die parasiteren op het metabolisme van bacterien. Soms richt het virus de gastcel niet direct ten gronde maar nestelt het viraal genoom zich als een profaag in het chromosoom van de gastcel.Retrovirussen zijn gespecialiseerd in het parasiteren van eukaryote cellen. Deze DNA-parasieten dragen hun genoom in de gastcellen als een infectieus RNA-deeltje dat in de besmette cel wordt omgezet tot cDNA.Plasmiden zijn kleine cirkelvormige DNA-moleculen die zich autonoom van de gastcel waarin ze leven repliceren.Transposons zijn DNA-elementen die de eigenschap bezitten om hun positie in het genoom te veranderen, ze worden ook wel jumping genes genoemd.

Wat is het verschil tussen een retrovirus en een viraal retro(trans)poson?Retrovirussn verblijven gedurende een deel van hun leven buiten de cel en dringen een niet besmette gastheer binnen via een infectieus mechanisme terwijl retroposons als mobiel DNA de cel nooit verlaten. Verder bezit alleen het retrovirus het vermogen tot de productie van een reeks structuureiwitten die het (+) RNA gaan omgeven als mantel, zodat een nieuw infectieus virus onstaat dat de gastcel kan verlaten.

Welke enzymatische activiteit(en) is/zijn geassocieerd met reverse transcriptase?Het enzyme bezit 3 activiteiten, 1) een polymerase dat (+) RNA als matrijs leest en (-) DNA polymeriseert; 2) een RNAase dat de (+) RNA-streng vernietigt en 3) een polymerase dat de (-) DNA-streng leest en de complementaire (+) DNA-streng polymeriseert.

Beschrijf hoe retroviraal cDNA als provirus kan integreren in gastheer-DNA.Het retrovirus komt meestal dankzij een specifieke moleculaire interactie tussen een oppervlakte-eiwit van het virus en een specifieke receptor binnen in de gastcel. Het eiwit-RNA complex dringt de cel binnen en het RNA zal in de kern na ontmanteling worden omgezet tot cDNA. Dit integreert zich lukraak in het genoom van de gastcel. Hiervoor gebruikt het virus een integrase, dit is een recombinase dat enerzijds de flanken van het virus ‘klaarmaakt’ voor insertie en anderzijds de eigenlijke recombinatie tussen viraal DNA en gast-DNA mogelijk maakt. Na integratie van het cDNA spreekt men van een provirus.

Beschrijf de expressie van retrovirale genen en de processing van de hierdoor gecodeerde virale eiwitten.Het (+) RNA-genoom van een typisch retrovirus is 8 kB lang en bevat minstens 3 genen die telkens transcriptiegebieden zijn voor verschillende kleine eiwitten. Van 5’ naar 3’ treft men de genen gag, pol en env die geflankeerd worden door de LTR’s. Een sterke promotor met enhancer-activiteit in de linker LTR is zeer belangrijk; deze transcriptie leidt tot een lang mRNA die het volledige gag-pol-env sequentie bestrijkt. Translatie van dit mRNA geeft vooral het gag-voorloper eiwit dat door een protease wordt gekliefd in de kleinere manteleiwitten van het RNA-virus. In 5% van de gevallen wordt het stopcodon na het gag-gen niet gerespecteerd waardoor het pol-voorloper eiwit ontstaat. Dit wordt door een protease geknipt tot de enzymen reverse transcriptase en integrase. Splicing van het mRNA geeft dan nog het mRNA voor het env-voorloper eiwit dat wordt gekliefd in eiwitten die zich bevinden in/op het buitenste lipidenmembraan van het virus.

Definieer de begrippen F-factor en Hfr-cel in de context van bacteriële conjugatie.De F-factor codeert genetisch voor het mannelijk fenotype (F+) dat een sexpilus kan uitstulpen. Door deze cytoplasmatische brug migreert een streng van de F-factor naar de F(-) cel en krijgt deze na replicatie tot complementaire F-strengen ook een F(+) fenotype. Een Hfr-cel ontstaat doordat een F-factor zich door recombinatie integreert in het bacterieel chromosoom, de frequentie van conjugaties is dan groot. De cel zal dan tijdens conjugatie een keten van het hele chromosoom overdragen ipv alleen de F-factor. Dit chromosoom kan dan homoloog recombineren met dat van de F(-) cel.

Hoe kunnen recombinante plasmiden ontstaan die naast F-genen ook nog andere (bv. Ab-resistentiegenen) dragen?Bij een onnauwkeurig proces kunnen volledige genen uit een gastcel mee worden genomen bij Hrf cellen. Hierdoor ontstaan grotere recombinante plasmiden die naast F- genen ook andere genen dragen. Plasmiden of lysogene bacterien kunnen zo bepaalde genen binnendragen in voor de mens belangrijke bacterien. Deze genen kunnen dan de pathogenen eigenschappen van deze bacterien drastisch veranderen.

Welke types transposons ken je?De kleinste transposons zijn insertie sequenties (IS); deze bevatten voldoende informatie voor transpositie. Aan beide uiteinden liggen directe of omgekeerde terminale-repeats, waar aan de buitenkant nog een doelwit-sequentie ligt. Tussen de flanken van de insertiesequentie bevindt zich een gen voor het enzym transposase.Complexe transposons bevatten nog extra genen die aan beide zijden van het extra gen begrensd worden door een transposeerbare IS-module.

Verklaar op welke wijze transposons de expressie van genen al dan niet tijdelijk kunnen wijzigen. Geef enkele voorbeelden in dit verband dit relevant zijn voor de menselijke pathologie.D.m.v. insertie inactivatie wordt de expressie van een gen verstoord. De transposon-sequentie integreert zich dan in de buurt of in een gen. Dit is te zien bij patienten vij neurofibromatose en hemofilie werden insertie inactivaties ontdekt, met Alu-element en LINE-1 element.Het enhancer effect houdt in dat grotere transposons soms een enhancer bevatten die de expressie van een naburig gen kan verhogen. Recombinatie van 2 naburige homologe transposons kan de situatie van het tussenliggende gebied veranderen.

Hoofdstuk 11 – Transcriptie en RNA-processing

Definieer het begrip primair transcript.Dit is het net afgeschreven RNA tijdens de transcriptie. De verzamelnaam voor alle chemische bewerkingen van het primair transcript noemt men RNA-processing.

Wat wordt bedoeld met co-lineariteit tussen DNA, boodschapper-RNA en aminozuurvolgorde van een polypeptideketen?Dit betekent dat DNA, mRNA en de aminozuurvolgorde allemaal op een manier kopies van elkaar zijn. Ze zijn allemaal op het DNA gebaseerd en hebben dezelfde basisvolgorde van nucleotiden, in mRNA worden thymines veranderd in uracil maar dit verandert niks aan de volgorde.

Wat is het onderscheid tussen de coderende en de matrijsketen bij transcriptie van een DNA-fragment? RNA-polymerase leest de matrijsketen af en creeert een complementaire RNA-keten die uracil bevat in plaats van thymine. De RNA-keten groeit van 5’ naar 3’ en de matrijsketen wordt dus afgelezen van 3’ naar 5’. Het verschil tussen de coderende en de matrijsketen is dat de matrijs van 3’ naar 5’ loopt en de coderende van 5’ naar 3’ zoals de RNA-keten.

Bespreek kort de essentiële verschillen tussen DNA- en RNA-replicatie (substraten, enzymen, noodzaak aan primer, richting van synthese, proefleesactiviteit).De substraten in de RNA-replicatie verschillen in zover van elkaar dat het bij DNA om het hele genoom gaat terwijl bij RNA-replicatie het maar om een stukje (voor een eiwit coderend gen) gaat. Bij RNA-polymerase wordt RNA-polymerase gebruikt en aangezien de synthese van 5’ naar 3’ loopt zijn er geen primers of ligase nodig. Er is ook geen proeflees activiteit dus fouten komen vaker voor. Uracil ipv thymine.

Welke types eukaryoot RNA polymerase ken je? Wat is hun respectievelijke functie?RNA-polymerase I wordt gebruikt voor transcriptie van rRNA-genen, RNA-polymerase II voor eiwitcoderende genen, RNA-polymerase III voor de tRNA-genen. De verschillen tussen de types RNA werden ontdekt naar aanleiding van de grote verschillen in hun onderlinge gevoeligheid voor het toxine α-amanitine. I niet gevoelig, II zeer gevoelig, III gevoelig.

Wat zijn de belangrijkste proximale promotersequenties bij pro- en eukaryoten?Bij prokaryoten zijn dit de Pribnow box (-10 regio) met consensussequentie TATAAT en de -35 regio met consensussequentie TTGACA.Bij eukaryoten strekken proximale promotersequenties voor RNA-polymerase II zich uit over een gebied van minstens 300 bp stroomopwaarts. Een belangrijke regio is de TATA-box (centrum thv -20 tot -50 bp) die lijkt op de Pribnow-consensus. Verder zijn er nog de CAAT-module (genoemd naar de consensus CAAT) en de GC-box met consensus GGGCGG. Op dergelijke promotersequenties binden transcriptiefactoren, bij TATA-box is dit bijvoorbeeld het TATA-box bindende eiwit (TPB). Het binden wordt geholpen door TPB-geassocieerde eiwitten (TAF), TBP trekt ook nog andere initiatiefactoren aan. Hierdoor ontstaat een initiatie-complex voor RNA-polymerase zodat transcriptie kan starten.

Wat zijn enhancers en silencers?Dit zijn distale elementen die tot op 10 kb afstand van een promoter kunnen liggen. Ze kunnen de transcriptie-activiteit verhogen en worden dan een enhancer genoemd. De enhancers hebben als bijzondere eigenschap dat hun juiste positie en orientatie ten opzichte van het gen weinig belangrijk is. Als de distale elementen de transcriptie-activiteit van op afstand onderdrukken worden ze silencers genoemd.

Wat wordt bedoeld met de begrippen cis- en trans-element in de context van transcriptie en genexpressie?

Bespreek de opbouw van het RNA-polymerase II initiatiecomplex.Op de TATA-box bindt het TATA-box bindende eiwit (TPB) als een zadel. Het binden wordt geholpen door TPB-geassocieerde eiwitten (TAF), TBP trekt ook nog andere initiatiefactoren aan. Hierdoor ontstaat een initiatie-complex voor RNA-polymerase zodat transcriptie kan starten.

Bespreek mechanismen van transcriptie-terminatie bij prokaryoten.De beeindiging van de transcriptie wordt net zoals de initiatie geregeld door een aantal specifieke signalen aan de flank van het transcriptiegebied en eventueel hulpeiwitten die deze signalen herkennen. Bij prokaryoten verloopt het via 2 mechanismen. De rho-onafhankelijke terminatie komt tot stand door een bepaalde stopsequentie aan het eind van de transcriptieregio. De rho-afhankelijke terminatie doet een beroep op een eiwitfactor (Rho) die het nieuw gevormde RNA van de matrijs aftrekt ten koste van ATP-hydrolyse.

Bespreek de belangrijkste stappen bij processing van ribosomale en transport-RNA precursoren.Bij prokaryoten en eukaryoten moet het primair transcript eerst een aantal chemische modificaties ondergaan, alvorens er functionele RNA-moleculen ontstaan. Deze processing omvat: -Het klieven van een groter voorloper molecuul in een aantal kleine stukken, dit gebeurt onder invloed van specifieke RNasen.-Verwijdering van korte intronsequenties en 5’ - of 3’- terminale sequenties uit tRNA-voorlopers.-Toevoegen van de sequentie CCA aan het 3’-uiteinde van de tRNA’s-Chemische modificaties van basen of ribose.

Leg uit hoe de 5’-cap en de poly-A staart aan eukaryote mRNA’s wordt aangehecht. Wat is de functie van beide modificaties?Het toevoegen van een 5’-cap en het vormen van een 3’-poly-A staart zijn modificaties van het heterogeen nucleair RNA (hnRNA). De 5’-capping begint reeds vroeg tijdens de transcriptie. Op het onvoltooide primair transcript zullen enzymen een 7-methyl-GMP via een 5’-5’ fosfo-anhydridebinding vasthechten aan de 1e nucleotide van het transcript dat vastzit aan het 2e. Hierdoor draagt het mRNA geen vrije 5’-OH groep meer. De functie van deze kap zou in verband staan met stabiliteit en met de start van de translatie.De toevoeging van de poly-A staart vindt plaats na de transcriptie en is gekoppeld aan het klieven van het primair transcript ter hoogte van een polyadenylatiesignaal (AAUAA) aan het 3’-uiteinde van transcript. De staart groeit door toedoen van het enzym poly-A polymerase totdat ongeveer 250 nucleotiden zijn toegevoegd. De functie van deze staart heeft net als de 5’-cap iets te maken met de efficientie van translatie en beschermt het voltooide mRNA tegen afbraak aan de 3’-zijde door exonucleasen.

Welke sequentie-specifieke voorwaarden zijn noodzakelijk voor een correcte splicing van introns uit primaire transcripten?Specifieke signalen bakenen introns af waardoor de splicing correct kan verlopen. Het consensussignaal voor de 5’-grens tussen exons/introns is AG/GUAAGU, terwijl aan de 3’-zijde meestal CAG/G voorkomt. Behalve een vertakkings-site met een belangrike adeninebase, die 1 van de uiteinden van het intron accepteert tijdens de splicing, is de intronsequentie tussen de geconserveerde uiteinden vrij onbelangrijk.

Bespreek de opbouw van een spliceosoom.Het spliceosoom is een eiwit-RNA complex dat bestaat uit 6 verschillende snRNP’s (small nuclear ribonucleoproteins -”snurps”) Elk van deze snRNP’s is opgebouwd uit een klein RNA (snRNA) en 1 of enkele eiwitten.

Hoe kan via transesterificaties een intron uitgeknipt worden uit eukaryotische mRNA-voorlopers?Het reactiemechanisme van de RNA-splicing bestaat uit 2 opeenvolgende transesterificaties, waarbij telkens een fosfaatester wordt verbroken die wordt vervangen door een nieuwe esterverbinding. Het intron wordt als een soort lasso verwijderd omdat het 5’-uiteinde (fosfaat) bindt op de 2’-OH acceptorgroep van de vertakkingssite. In de 1e reactie wordt de 5’ exon-intron verbinding aangevallen door de 2’ OH-groep van de vertakkingssite. Hierbij brengt het U1-proteine samen met het U1-snRNA de 5’ grens van het intron recht boven het U2-proteine dat de vertakkingssite bindt. Tijdens de 2e reactie valt de vrije 3’ OH -groep van exon 1 de 3’ exon-intron verbinding aan. Hiervoor zijn andere U-eiwitten van het spliceosoom nodig. het resultaat is een lassovormig vrij intron en een verbinding tussen exon 1 en 2. Het U1-snRNA bezit een interne sequentie die complementair is aan de 5’ intronsequentie.

Definieer kort het begrip complexe mRNA transcriptie-eenheid.Complexe mRNA transcriptie-eenheden produceren verschillende mRNA’s door ofwel gebruik te maken van alternatieve wegen van splicing of alternatieve polyadenylsignalen.

Illustreer met een schets wat verstaan wordt onder alternatieve splicing en alternatieve polyadenylatie.Bij alternatieve splicing kunnen de 5’ en/of 3’-introngrenzen afgedekt worden door specifieke RNA-bindende eiwitten, zodat deze grenzen niet zichtbaar zijn voor het spliceosoom. De alternatieve polyadenylatie berust op het feit dat in 1 gen vercshillende AATAA-sequenties liggen aan de 3’-zijde van het gen. In het primair transcript kunnen sommige van deze signalen worden afgedekt door RNA-binden eiwitten wodat deze grenen ook niet zichtbaar zijn voor het klievingsapparaat.

Geef een concreet voorbeeld van cel-specifieke RNA-processing bij de mens.

Wat is RNA-editing? Geef hiervan een relevant voorbeeld voor de menselijke fysiologie.Dit is het specifiek wijzigen van 1 of enkele basen van het coderend gedeelte van een mRNA. Hierdoor worden 1 of enkele aminozuren in het coderend eiwit gewijzigd. Een voorbeeld vindt men bij transcript dat codeert voor eiwit apoliproteine-B dat een rol speelt in het vervoer van lipiden zoals cholesterol in het menselijke bloed. Het gen dat codeert voor dit eiwit wordt tot eenzelfde mRNA afgeschreven in parenchymcellen van de lever en de mucosacellen van de dunne darm. Door verandering van 1 base in het lever mRNA zal het gecodeerde levereiwit ruim 50% worden ingekort want de verandering creeert een stopcodon voor de eiwitsynthese.

Bespreek het principe van de DNA-footprinting techniek.Via footprinting zoekt men waar de belangrijke sequenties van de promoter liggen. De interactie tussen kerneiwitten van weefsel Y met een stukje radioactief P-gemerkt DNA stroom-opwaarts van gen X, wordt blootgesteld aan het enzym DNase, zodat gemiddeld 1 breuk per DNA-keten ontstaat. Door de verzameling van DNA-fragmenten te scheiden nar lengte ontstaat een ladder. Wanneer men dit experiment herhaalt nadat het DNA werd geincubeerd met de kerneiwitten van weefsel Y, ontbreekt een deel van de DNA-fragmenten op die plaatsen waar het eiwit gebonden is aan de promotersequentie. Hoe kan deletie-mutagenese aangewend worden om functioneel relevante regio’s in een promoter te analyseren?Men kan plaatsgericht stukjes uit de promoter verwijderen; door de expressie van het testgen te volgen kan met het functionele belang van de aangebrachte mutatie inschatten.

Wat is de electrophoretic mobility shift assay (EMSA)?Dit is het bestuderen van de eiwitten die aan bepaalde promotersequenties kunnen binden. De eiwit-DNA interactie leidt tot een tragere migratie van het radioactief gemerkte promoterfragment door een polyacrylamidegel. Deze vertraging noemt men een mobiliteitsshift. Incubeert men met een specifiek antiserum dan zal het immunoglobuline-eiwit-DNA complex nog trager migreren: supershift.

Geef een voorbeeld van menselijke pathologie waarbij mutatie in een intron toch kan leiden tot een afwijkend eiwitproduct.In een variant van β-thalassemie situeert zich een mutatie in intron 1. Normaal zijn dergelijke mutaties onopgemerkt maar in dit geval ontstaat een nieuwe 3’-splicesite in het intron, waardoor het splicen van de β-globuline mRNA voorloper niet meer normaal verloopt. De vertaling van dit foutief gespliced β-globuline-mRNA resulteert in een abnormaal kort eiwit. Want het 6e codon van het abnormale exon is een stopcodon. Dit getrunceerd β-globuline is niet geschikt om zuurstof te transporteren.

Hoofdstuk 12 – Translatie en eiwitprocessing

Wat versta je onder ‘degeneratie van de genetische code’?

Leg uit waarom de genetische code geëvolueerd is naar een drieletter-(triplet) code, en geen twee- of vierlettercode.De code moet voor 20 verschillende aminozuren coderen en aangezien je steeds 4 mogelijkheden als base bevat krijg je bij de triplet code 4 x 4 x 4 =64 verschillende codons. Bij een 2-letter code had je 4 x 4 =16 verschillende codons gehad wat niet genoeg was geweest en bij een 4 letter code had je veel teveel verschillende codons gehad (4 x 4 x 4 x 4 =256)

Er bestaat een vrij goede correlatie tussen het aantal synonieme codons voor een bepaald aminozuur en de relatieve aanwezigheid van dit aminozuur in proteïnen. Welke hypothese werd hiervoor ontwikkeld? Waarom geldt deze hypothese niet voor arginine?De hypothese luidt als volgt: het aantal type codons per aminozuur stemt overeen met de relatieve beschikbaarheid van aminozuren voor translatie. Er is dus een lineaire correlatie tussen het aantal synonieme codons voor een bepaald aminozuur en de relatieve aanwezigheid van dit aminozuur in eiwitten. Arginine is een uitzondering met 6 synonieme codons maar met maar1-2% als molpercentage maar een verklaring hiervoor is dat in 4 op 6 codons het om CG gaat. Deze worden makkelijk gemethyleerd en muteren dan in TG.

Verklaar de begrippen missense, nonsens en frameshift mutaties.Missense mutaties zijn puntmutaties van een eiwitcoderend codon waardoor een ander type aminozuur wordt gevormd. Nonsens mutaties ontstaan doordat een coderend codon veranderd in een stopcodon. Een frameshift is het gevolg van een deletie of insertie en hierdoor worden alle volgende aminozuren foutief gewijzigd. Ze ontstaan vaak door acridine en worden geneutraliseerd door suppressor mutaties die het leesraam herstellen.

Beschrijf hoe de Ames-test kan gebruikt worden als in vitro test voor mutageniciteit.Men plaats een mutante bacterie die niet kan groeien zonder histidine in een kweekmedium. Zeldzame mutaties leveren een revertant op die wel kan groeien zonder histidine. Onder aanwezigheid van een mutagene stof in het medium neemt het aantal mutaties toe, hetgeen te meten is als een toename van het aantal revertante kolonies.

Wat is het verband tussen aflatoxine en hepatocellulair carcinoom?Aflatoxine is een carcinogene stof die van de schimmel Asperillus flavus komt. Deze stof veroorzaakt specifiek G→T transversies in het DNA van vooral leverweefsel. Als dit plaatsvindt in het codon van het p53 eiwit, een tumor-suppressor eiwit, dan wordt dit geinactiveerd en ontsnappen de levercellen aan een rem op celdelingen. Dit kan dan tot een hepatocellulair carcinoom leiden.

Wat is een polysoom?Dit zijn verschillende ribosomen die achter elkaar over de matrijs heen schuiven, hetgeen de snelheid van de translatie verhoogt.

Tijdens welke stappen van de eiwitsynthese wordt er energie onder vorm van ATP of GTP verbruikt?Het energetisch opladen van aminozuren (activatie) kost 2 ATP en deze wordt opgebruikt onder de vorm van GTP tijdens de elongatie.

Welke elementen zijn belangrijk voor de juiste substraatkeuze door aminoacyl-tRNA-synthetasen?De keuze van het aminozuur wordt door het enzym gemaakt op basis van grootte en op hydrofobiciteit. De nauwkeurige keuze van de tRNA’s blijkt te berusten op een vrij groot bindingsoppervlak van het enzym ten opzichte van het tRNA.

Welke reacties worden gekatalyseerd door aminoacyl-tRNA-synthetasen?De aminozuuractivering, het enzym kiest een aminozuur als substraat en bindt dit via de caboxylgroep op het 3’-uiteinde van het bijbehorende tRNA, waardoor aminoacyl-tRNA ontstaat.

Geef een voorbeeld van proefleesactiviteit door aminoacyl-tRNA-synthetasen.Net als bij replicatie controleren aminoacyl-tRNA synthetasen hun belangrijke werk en worden sommige foutieve aminozuur-tRNA verbindingen toegelaten in de hydrolytische site. Door proeflezen worden deze fouten ongedaan gemaakt.

Wat zegt de ‘wobble’ hypothese met betrekking tot de codon-anticodon interactie?Wobble houdt in dat tussen de 3e codonbase en de 1 anti-codonbase een grotere vrijheid geniet wat betreft de Watson-Crick regels voor de interactie.

Welke kenmerken hebben alle tRNA’s gemeenschappelijk?Het zijn enkelvoudige kleine RNA-ketens van ongeveer 75 nucleotiden. Een gedeelte van de keten is enkelstrengig terwijl andere delen met elkaar reageren tot dubbelstrengen. De enkelstrengige regio’s zijn altijd op dezelfde plaatsen aanwezig, zoals de 3’-terminus (met de posttranscriptioneel toegevoegde CCA-sequentie) en een drietal lussen waaronder de anti-codonlus. Ook dubbelstrengige regio’s zijn constant, ze vormen korte zones van dubbele helix en geven de typische tertiaire structuur. Deze ruimtelijke structuur lijkt op een L waarbij de 3’-terminus en de anticodonlus zich aan beide uiteinden vinden. Het geactiveerde aminozuur zit vast aan de 3’-terminale adenine dat na transcriptie wordt toegevoegd aan RNA; het bevindt zich tijdens de eiwitsynthese op vrij grote astand van de anticodonlus die het codon in mRNA leest.

Waaruit bestaan prokaryote en eukaryote ribosomen?Elk ribosoom bestaat uit een grote en een kleine subeenheid die buiten de momenten dat de ribosomen deelnemen aan translatie los in het cytoplasma voorkomen. Biij prokaryoten is de grote van het gehele ribosoom 70S. De grote subeenheid bestaat uit 30S-rRNA en 16S-rRNA dat een rol speelt in de initiatie van de translatie, de correcte plaatsing van het leesraam en de wobble. De kleine subeenheid bestaat uit 23S-rRNA dat een rol speelt bij het tot stand komen van de peptide binding.Bij eukaryote ribosomen (80S groot) gaat het respectievelijk om 40S-rRNA, 18S-rRNA en 28S-rRNA.

Wat is de functie van de A-site en de P-site in ribosomen tijdens translatie?De A-site (acyl) is de bindingsplaats voor nieuw aangevoerde amino-acyl-tRNA’s. De P-site (peptidyl) draagt tijdens de translatie vooral de tRNA die verbonden is aan de groeiende polypeptideketen.

Beschrijf initiatie, elongatie, en terminatie van de translatie bij eukaryoten.De initiatie start met de binding van het ribosoom op het 5’-uiteinde van het mRNA. Dit gebeurt zeer precies zodat het startcodon van het mRNA juist tegenover de P-site komt te liggen, hetgeen de instelling van het leesraam bepaalt. Tegenover het startcodon AUG bevindt zich in de P-site een speciaal initiator-tRNA dat geactiveerd methionine draagt. De initiatie wordt geholpen door initiatiefactoren, eiwitten die ten koste van GTP-hydrolyse het ribosoom en initiator-tRNA correct t.o.v. het mRNA. Het eiwit eIF4 (eukaryote initiatiefactor) zoekt de 1e AUG-sequentie t.o.v. de 5’-Cap van het mRNA en plaatst deze sequentie atiparallel t.o.v. het anticodon van het initiator-tRNA. De verschuiving van de kleine ribosoomsubeenheid van de Cap positie naar de eerste AUG van het mRNA gaat gepaard met hydrolyse van ATP (1 per per base). De elongatie begint wanneer een 2e tRNA indt in de lege A-site, hierbij past de anticodonlus precies op het 2e codon van het mRNA. Elongatiefactoren helpen bij het uitkiezen van de juiste aminoacyl-tRNA met correcte anti-codon. De 1e peptidebinding wordt gemaakt door methionine van peptidyl-tRNA met de geactiveerde carboxylgroep over te plaatsen naar de vrije aminogroep van aminoacyl-tRNA, dat nu peptidyl-tRNA wordt. Tijdens translocatie laat het vrije tRNA los van de P-site, verhuist peptidyl-tRNA van A-site naar P-site en verschuift het ribosoom 3 plaatsen in de 3’-richting.Terminatie treedt op wanneer 1 van de 3 stopcodons (UGA, UAA of UAG) tegenover de A-site komen te liggen. Er bestaan voor deze codons geen tRNA’s met anticodons maar in plaats daarvam binden er specifieke terminatie-eiwitten, release factors, in de A-site. Deze factoren zorgen voor ontkoppeling van de voltooide peptideketen.

Beschrijf het proces van foutcorrectie (kwaliteitscontrole) tijdens de elongatiefase van de eiwitsynthese bij bacteriën.Als blijkt dat het tRNA in de A-site foutief is en dus de codon/anticodon binding te zwak is, dan is er voor korte duur de gelegenheid om dit tRNA te verwijderen, voordat de pepidebinding wordt gemaakt. De plaatsing van een tRNA is pas irreversibel als 1 van de elongatiefactoren, bij prokaryoten EF-Tu, GTP heeft gehydrolyseerd tot GTP en Pi. Deze hydrolyse vergt enige tijd (milliseconden) en in deze tijd kunnen de fouten herstelt worden.

Bespreek de co-translationele translocatie en eiwitadressering van eiwitten naar het endoplasmatisch reticulum.Ribosomen die tegen de cytosolzijde van het E.R. liggen maken eiwitten aan die tijdens de translatie door deze membraan bewegen. Deze eiwitten komen dan in het lumen van het E.R. waar ze verder worden bewerkt. Dit proces is afhankelijk van een signalpeptide dat wordt herkent door SRP (signal recognition particle). SRP bindt op de hydrofobe signaalsequentie zodat deze uit het ribosoom steekt. Het SRP/signaalpeptide-complex bindt vervolgens op een SRP-receptor van het E.R. en wordt dan als draad door een porie van het membraan binnengebracht. In het lumen wordt de signaalsequentie afgesplitst door een signaalpeptidase. Tijdens het proces wordt de translatie stopgezet.

Bespreek mitochondriale en lysosomale eiwitadressering.Mitochondriale matrix eiwitten moeten 2 lipidenmembranen passeren voordat ze in het mitochodrium zijn, vandaar mitochondriale eiwitadressering. De translocatie door de mitochondriale membranen vindt alleen plaats nadat de eiwitsynthese voltooid is. De polypeptideketen wordt in een ontrolde, lineaire toestand gehouden want een globulair eiwit kan niet door het importkanaal van het mitochondrium. Dit preserveren gebeurt door moleculaire chaperons (hsp-familie). Een complex tussen het importeiwit en hsp70 migreert naar de oppervlakte van het mitochondrium, waar gespecialiseerde kanalen het eiwit binnenlaten. De energie nodig voor de import wordt geleverd door een protonengradient die het positief geladen signaalpeptide in de matrix trekt, Een mitochondriaal hsp60-complex rolt het matrixeiwit op tot de juiste structuur.(Lysosomale eiwitadressering zie verder)

Wat is de cellulaire lokalisatie en functie van het proteïne disulfide isomerase?Het disulfide isomerase bevindt zich in het ER en helpt bij het vormen van zwavelbruggen bij nieuw gevormde eiwitten. Het blijft in het ER aanwezig door zijn KDEL-sequentie die bindt op de KDEL-receptor van het ER.

Bespreek O- en N-gebonden glycosylatie.Dit is het binden van een suikergroep op een hydroxylgroep van serine of threonine (O-gebonden) of op de amidogroep van asparagine (N-gebonden). Beide processen starten in het ER lumen en worden afgemaakt in het Golgi-apparaat.

Wat zijn complexe en ‘high-mannose’ oligosachariden?High-mannose suikers worden gevormd door N-glycosylatie op de drager dolicholfosfaat. Tijdens deze synthese worden geactiveerde suikers gebruikt; 2 N-acetyl glucosamine, 9 mannose en 3 glucose. De lange isopreenstaart van dolicholfosfaat zorgt voor een goede verankering van dit lipide in de membraan. Een complexe oligosacharide bouwt voort op high-mannose maar dit wordt uitgebreid met de bouwstenen siaalzuur, glucose, galactose en N-acetyl glucosamine.

Bespreek de rol van siaalzuurresten in glycoproteïnen.De snelheid van verwijdering van siaalzuur bepaalt de levensduur van de glycoproteinen in het bloed. Het siaalzuur zit op de eiwitten en wordt verwijderd door sialidasen die in de wanden van bloedvaten zitten. Zo ontstaan asialoglycoproteinen die galactose als uiteinden hebben en als versleten worden beschouwd door een receptor in de lever.

Wat zijn SNARE eiwitten?SNARE-eiwitten (acronym van soluble NSF attachment receptor of SNAP’s) zijn fusie-eiwitten die de specifieke versmelting verzorgen van de lipidemembraan van het transportvesikel met het doelwit membraan waar eiwitacceptoren verankerd zitten.

Bepreek het verband tussen ABO-bloedgroeppolymorfismen en glycosylatie.De ABO-bloedgroepen worden gevormd door een polymorfisme voor een bepaald glycosyltransferase-gen. Verschillende transferasen verkiezen verschillende soorten suikers en zo ontstaan verschillende oligosachariden (A-antigeen en B-antigeen). Het O-allel bezit een leesraamverschuiving en kan geen functioneel glycosyltransferase-gen maken. Het gevolg is een ologosacharide terminaal galactose of N-acetylgalactosamine.

Bespreek lysosomale eiwitadressering en het verband met lysosomale stapelingsziekten.Het signaal voor de lysosomale adressering is mannose-6-fosfaat op het N-geboden oligosacharide van het glycoproteine. Alleen lysosomale enzymen worden in het cis-Golgi herkend door een fosfotransferase dat mannose doet fosforyleren. De mannose-6-fosfaat receptor herkent de suiker in de membraan van de Golgi cisternea en neemt hem mee in een speciaal vesikel naar het lysosoom. Als het enzym voor mannosefosforylering ontbreekt worden de lysosomale hydrolasen niet herkend en worden ze uit de cel gebracht ipv naar het lysosoom. De lysosomen kunnen niet goed functioneren zonder enzymen die helpen afbreken en er stapelt zich afval op in het lysosoom. Deze lysosomale stapelingsziektes worden ook wel I-ziektes (inclusie) genoemd.

Hoe verloopt de proteolytische processing van insuline-precursoren in de pancreatische β-cellen?Hormonen moeten vaak met hun ruimtelijke structuur binden op een receptor. De cel maakt deze peptidehormonen eerst al precursor aan die de juiste ruimtelijke structuur nog niet heeft bereikt. De processing van van pro-hormoon tot hormoon bindt plaats door pro-hormoon convertasen die peptidebindingen die moeten worden gesplitst herkennen. Deze bindingen liggen naast een dibasisch aminozuur-paar in het pro-peptide.Pro-insuline wordt in de pancreatische β-cellen via 2 pro-hormoon convertasen (PC2 en PC1/3) en carboxypeptidase H in C-peptide en insuline gesplitst. De A- en B-ketens van insuline blijven nog via 2 disulfidebruggen aan elkaar vastzitten.

Welk verband bestaat er tussen de levensduur van een proteïne en de aard van het aminoterminaal uiteinde? Geef enkele voorbeelden van eiwitten met een lange en met een korte levensduur.Stabiele eiwitten met lange levensduur hebben meestal een klein en niet geladen aminoterminaal einde. Eiwitten met een extreem korte levensduur hebben Arg of Lys als uiteinde. Aminoterminaal Tyr, Phe, Leu en Ile maken het eiwit ook instabiel. De producten van de proto-oncogenen JUN en FOS zijn zeer labiele eiwitten.

Wat is de rol van ubiquitinylering bij eiwitdegradatie? Het ubiquitinyleringssysteem herkend de aminoterminale signalen voor de levensduur van cytoplasmatische eiwitten. Dit systeem hecht aan de ε-aminogroep van een lysinezijketen in het labiele eiwit aan de carboxyterminus van ubiquitine, een polypeptide dat zeer sterk geconserveerd is. Het ubiquitine-eiwit complex wordt vervolgens afgebroken door een proteasoom.

Geef voorbeelden van aminoglycoside-antibiotica en bespreek het mechanisme waardoor ze de prokaryote translatie kunnen beïnvloeden.Streptomycine is een voorbeeld van aminoglycoside-antibiotica, het bezit een complexe suikerstructuur. Dit verstoort de initiatiefase van de translatie door te binden op 1 specifieke plaats van het 15S-tRNA en op 1 eiwit (S12) van de kleine subeenheid. Door deze binding herkent het initiator tRNA dat is opgeladen met N-formylmethionine de kleine subeenheid niet meer. Streptomycine beinvloedt ook de precisie van de interacties tussen codon en anticodon voor de ribosomen die toch door de initiatiefase zijn heengekomen. Hierdoor vertoont het aangemaakte eiwit veel fouten.

Bespreek het werkingsmechanisme van tetracyclines, chlooramfenicol en erythromycine.Tetracyclines binden op de lege A-site van het bacteriele ribosoom. Ze verhinderen de toevoer van aminoacyl-tRNA’s en blokkeren de zo de elongatiefase van de bacteriele translatie. Chlooramfenicol bindt krachtig aan het deel van het 23S-tRNA dat verantwoordelijk is voor de interactie met het 3’-uiteinde van het aminoacyl-tRNA (CCA) en remt op deze manier de peptidyl transferase activiteit. Erythromycine bindt op de 50S ribosomale subeenheid en remt de translocatiestap van de elongatiefase door te verhinderen dat het peptidyl-tRNA verhuist van de A-site naar de P-site.

Verklaar hoe het difterie-toxine de translatie in eukaryote cellen kan inhiberen.Een fragment van het toxine dringt via een membraanreceptor de cel binnen. In het cytoplasma zal dit fragment ADP-ribose groepen covalent binden op elongatiefactor-2 die normaal verantwoordelijk is voor de eukaryotische translocatiestap. Zodoende valt de eiwitsynthese stil.

Via welke mechanismen kan interferon-γ virale infecties afremmen?Interferons zijn kleine eiwitten met antivirale en imuunstimulerende werking. De viraal besmette cel secreteert interferons die dan binden op interferonreceptoren van nog niet besmette cellen. Deze activatie leidt tot intracellulaire signaaltransductie die ondermeer loopt volgens de JAK-STAT route. De door interferon gestimuleerde cellen gaan zich verdedigen tegen een eventueel daarop volgende virale infectie door enzymen te produceren die het virale mRNA afbreekt of die de translatie van virale eiwitten stopzetten.

Hoe kunnen mutaties in het α1-antitrypsine (elastase-inhibitor) gen leiden tot emfyseem?Abnormaal in het ER-lumen opgevouwen eiwitten worden niet doorgelaten tot het Golgi-apparaat, maar blijven dus in de cel (retentie). Bij patienten met mutaties in het elastase-inhibitor, is de α1-antitrypsineconcentratie verlaagd of zelfs afwezig. Het vrijgekomen elastase uit de witte bloedcellen kan ongehinderd het elastine van de longblaasjes verteren waardoor op den duur longemfyseem ontstaat.

Hoofdstuk 13 – Regeling van de genexpressie

Wat wordt bedoeld met monocistronisch en polycistronisch mRNA?Een polycistronisch mRNA codeert voor meerdere eiwitten, een monocistronisch mRNA codeert voor maar 1 eiwit. Polycistronisch mRNA bevat dus stop- en start-signalen voor de synthese van verschillende eiwitten.

Wat is het verschil tussen een cis en een trans element in de context van genexpressie?Het repressoreiwit diffundeert van de plaats van productie naar zijn doelwit (operator) en wordt transacting factor genoemd. De operator die dus als bindingsplaats voor de repressor dient, ligt direct naast de structurele genen en heet het cisacting element.

Beschrijf de opbouw van het E. coli lactose-operon.Dit bestaat uit de 3 naburige structurele genen (Z, Y en A) voor permease, galactosidase en transacetylase en de promotor. Permease zorgt voor de opname van lactose in de cel. Een operon is het geheel van de structurele genen (RNA-coderend) en de flankerende regulerende sequenties die de transcriptie ervan controleren.

Beschrijf inductie resp. repressie van het lactose (lac) operon.Wanneer er geen lactose in het extra-cellulair milieu aanwezig is, wordt de expressie van deze genen onderdrukt door het lac-repressor-eiwit, dat gecodeerd wordt door het I-gen. Transcriptie van het lac-operon wordt verhinderd doordat de lac-repressor bindt op de operator die overlapt met de lac-promoter. Deze binding veroorzaakt een fysische hindernis voor het RNA-polymerase om met de transcriptie van het lac-operon te beginnen. De bindingsactiviteit van de lac-repressor wordt in sterke mate bepaald door allosterische interactie met allolactose, een lactosederivaat. Bij blootstelling aan lactose zal allolactose gevormd worden en binden aan de lac-repressor. Hierdoor verandert de vorm van het repressoreiwit en krijgt het een lage affiniteit ten opzicht evan de operator. Op deze wijze valt de repressie weg en kan de transcriptie van de structurele genen beginnen. De stimulatie van transcriptie door lactose heet inductie.

Hoe verloopt de regulatie van het tryptofaan operon?In het operon liggen de structurele genen die coderen voor enzymen van de tryptofaanbiosynthese. Transcriptie van het tryptofaanoperon wordt geblokkeerd door een specifiek repressoreiwit, dat bindt op een speciale operator. De tryptofaanrepressor op zichzelf is inactief (aporepressor); hij kan pas binden op de operator nadat een ruimtelijke verandering is opgetreden, die tot stand komt door de associatie met een klein molecuul, de co-repressor. De co-repressor voor de tryptofaan-aporepressoris het aminozuur tryptofaan. De operatorsite van het tryptofaanoperon is ongeveer 20bp lang en symmetrisch; ook hier bindt het repressoreiwit als een dimeer, waarbij bepaalde

Beschrijf de rol van het catabolite-gene activator protein (CAP) bij de glucosehuishouding van E. coli.Wanneer glucose en lactose beide aanwezig zijn, is er onderdanks de inductie door lactose een vrij geringe expressie van het lac-operon. De reden hiervoor is dat de lac-promoter vrij ‘zwak’ is, zodat RNA-polymerase hulp van andere eiwitten nodig heeft om efficient te binden en de transcriptie te starten. Deze hulp wordt geleverd door het CAP (catabolite gene activator protein), een eiwitdimeer dat allosterisch moet worden geactiveerd door cyclisch AMP, alvorens het kan binden op de lac-promoter. In aanwezigheid van glucise is het cAMP voldoende laag om CAP inactief te houden, zodat de transcriptie van het lac-operon niet of nauwelijks plaats vindt. Bij gebrek aan glucose wordt er cAMP geproduceerd dat het CAP activeert.

Definieer het begrip ‘attenuatie’ in de context van biosynthetische operons, en illustreer dit voor het tryptofaan operon.Attenuatie is een fijnregeling, die optreedt wanneer de tryptofaanconcentratie in de cel onder een bepaalde drempel valt (geen co-repressie). De attenuatie is afhankelijk van een terminatiesignaal in het eerste gedeelte van het polycistronisch mRNA (het leider RNA). Door tussenkomst van ribosomen vouwt deze leider zich zodanig op dat een rho-onafhankelijke terminator gevormd wordt en mRNA van de matrijs afvalt. Bij zeer lage tryptofaanconcentratie is er geen repressie, wordt attenuatie genegeerd en gaat transcriptoe verder. Het werkingsmechanisme is gebaseerd op het feit dat translatie en transcriptie bij prokaryoten tegelijkertijd gebeuren. Ribosomen schuiven over het mRNA en vertalen het in een polypeptideketen. Juist voor de attenuator bevinden zich in de leidersequentie 2 tryptofaancodons. Als er een hoge tryptofaanconcentratie zich in de cel bevindt, dan volgt het ribosoom de transcriptie op de voet; hierdoor vormt regio 2 geen ‘stamlus’ structuur met regio 3. Zo kan regio 3 een rho-onafhankelijke terminator vormen met regio 4 en het mRNA van de matrijs wordt afgeduwd. Bij schaarste aan tryptofaan duurt de translatie van deze 2 codons langer en hierdoor loopt de transcriptie goed vooruit op de translatie. Regio 2 vormt met regio 3 een stam voordat het ribosoom regio 2 kan vertalen,

Wat is het verschil tussen de lytische en lysogene cyclus van bacteriofaag λ?De lytische weg bestaat uit replicatie van het viraal DNA, gevolgd door intense transcriptie en translatie van de structurele λ-genen, zodat op korte tijd vele dochtervirussen ontstaan die letterlijk uit de gastcel barsten. Tijdens de lysogene weg integreert het DNA zichzelf in het chromosoom van de gastcel. Het virus is zo een slapende profaag geworden die vele generaties lang in het chromosoom van de gastcel kan blijven zitten. Stress in de bacteriele cel kan de slapende profaag doen ontwaken en de lytische weg activeren.

Geef voorbeelden van het helix-bocht-helix motief bij prokaryote transcriptiefactoren. Welke structurele kenmerken hebben deze gemeenschappelijk?Het helix-bocht-helix motief wordt zo genoemd vanwege zijn karakteristieke aanwezigheid van een DNA-herkennende α-helix, die via een β-bocht verbonden is met een 2e structurele α-helix. Voorbeelden van eiwitten met deze structuur zijn het Cro-eiwit en de regeleiwitten λ-repressor en CAP. Ze hebben dit speciale motief om goed op DNA te kunnen binden. Elk eiwit bestaat uit een dimeer en bindt op DNA via 2 parallel lopende α-helixen die precies 1 winding van dubbelstrengig DNA van elkaar verwijderd zijn. Het eiwit past dus met de 2 helixen in 2 groeven van het DNA.

Wat zijn ‘housekeeping genes’?Dit zijn de standaardgenen die nodig zijn voor de basisuitrusting en -werking van elke cel.

Hoe kunnen verschillen in condensatiegraad van chromatine in verband worden gebracht met wijzigingen in genexpressie?In principe komen alleen genen die in het euchromatine liggen in aanmerking voor transcriptie. Transcriptioneel DNA is sterker ontrolt dan transcriptioneel inactief DNA. Er bestaan lokale verschillen in de graad van condensatie. Een argument hiervoor is de gevoeligheid van DNA voor de hydrolytische eigenschappen van DNase, dat de dubbele helix doorknipt. Het euchromatine is in de transcriptioneel actieve gebieden minder opgerold en toegankelijker voor het DNase. Een korte regio 5’ ten opzichte van het actieve gen (hypersensitive sites) is heel gevoelig voor DNase. Hier maakt het DNA een abrupte bocht door binding van transcriptiefactoren aan enhancer- of promoter elementen.

Welke epigenetische mechanismen kunnen leiden tot verschillen in genexpressie?Imprinting, het aanbrengen van vaderlijk of moederlijk methylatiepatroon op chromosomen. Dit mechanisme van imprinting heeft te maken met het binden van transcriptiefactoren, de basensequenties van een transcriptioneel actieve promoter is bezet met talrijke eiwitten die de toegang van het methylase tot CG-sequenties verhinderen. Hoe de methylatie tot gen-inactivatie leidt is onduidelijk.

Bespreek de structuur en functie van zinkvingereiwitten.Transcriptiefactoren binden via bepaalde eiwitdomeinen aan het DNA. Zinkvingereiwitten zijn 1 van de meest gebruikte eiwitdomeinen in eukaryoten. Het domein bestaat uit een Zn2+-ion dat covalent wordt gebonden aan 4 tot 6 aminozuurketens en zo de kern vormt van een compact opgevouwen structuur. De C2H4-zinkvingen-eiwitten binden het zinkion via 2 histidineresidu’s en 2 cysteinezwavelatomen. Eiwitten bezitten meerdere zinkvingerdomeinen die samen als hand rond de DNA-helix grijpen.

Bespreek de domeinstructuur van de steroïdhormoonreceptor–superfamilie en de functie van elk domein. Hoe kan ligandbinding aan deze receptoren leiden tot transcriptie van doelwitgenen?Iedere receptor bezit 2 naburige vingers; de 8 cysteinezijketens van het eiwit zijn reeds in primaire structuur herkenbaar met een bepaalde consensus. Het DNA-bindend domein van de glucocorticoidreceptor bevat 2 C4 zinkvingers. De eerste vinger draagt residu’s die zowel op fosfaten als specifieke basen van het glucocorticoid-responsief element binden, terwijl de 2e vinger sterke ionbindingen maakt met de fosfaten van de DNA-ruggengraat en een aantal residu’s bevat die verantwoordelijk zijn voor de dimerisatie van de receptor.

Steroidhormoon receptoren zijn eiwitten die uit 3 domeinen zijn opgebouwd. Naast het DNA-bindend domein dat centraal ligt in de receptorstructuur bevat elke receptor een C-terminaal ligandbindend domein dat het steroidhormoon specifiek bindt. De hormonen verhuizen naar de kern wanneer het ligand is gebonden op het ligandbindende domein van de receptor. Pas nadat het ligand-receptor complex in de kern is terechtgekomen kan het als transcriptiefactor een werking uitoefenen. Essentie van regeling: Oftewel wordt de lege receptor geen toegang verleend om naar de plaats van transcriptie te gaan of hij bezit een rustend transactivatiedomein. De bezetting van de receptor laat de translocatie toe van naar de kern of stelt het transactivatiedomein actief op.

Bespreek de structuur en functie van homeodomein eiwitten.Wat is het verschil tussen een homeodomein en een homeobox?De homeobox is het coderend DNA voor een een homeodomein. Het homeodomein bestaat uit 60 aminozuren. Ruimtelijk bestaat het uit 3 of α-helixen, waarvan er 1 bindt op een specifieke DNA-sequentie in de promoter of enhancer van genen die betrokken zijn bij de embryogenese.

Bespreek de algemene structuur van transcriptiefactoren van het leucinerits type.Er is een hierarchische associatie van multipele transcriptiefactoren met als eindresultaat een complex dat het basis transcriptie apparaat activeert. Een tweede niveau van complexiteit heeft te maken met het feit dat veel transcriptiefactoren homo- en heterodimeren kunnen vormen. Zo kunnen verschillende factoren verschillende dimeren vormen die elk een specifieke DNA-sequentie kunnen herkennen.

Welke elementen spelen een rol bij de trans-activatie van RNA polymerase?De werking van hulpeiwitten TFIID-TFIIH is zeer belangrijk, ze zorgen dat het RNA-polymerase II de juiste plaats van het gen herkent en kan beginnen met de transcriptie. Verder begint de echte initiatie met de binding van het TATA-box-bindende eiwit (TBP) op de TATA-box. De TAF’s spelen hier een belangrijke rol. Het TFIIH werkt enerzijds als een DNA-helicase en trekt de matrijsstreng en de coderende streng uit elkaar. TFIIH werkt ook als een proteine kinase die C-terminale domeinen creeert dmv fosforylering. Hierdoor kan RNA-polymerase II loskomen uit het initiatiecomplex en beginnen met transcriptie.

Wat is het verband tussen signaaltransductie via cytokinereceptoren en transcriptie van door cytokines gecontroleerde genexpressie?Cytokines zijn lokaal werkende hormonen van het immuunstelsel. Gevolg van de binding van een cytokine aan zijn receptor is een verandering in transcriptionele controle van de expressie van welbepaalde genen.

Bespreek de rol van CREB bij de regeling van transcriptiefactoren via cAMP-afhankelijk proteïnekinase.CREB (cAMP-responsief element-bindend proteine) bindt na fosforylatie door proteine kinase A op CRE’s (cAMP-responsief element) van genen die gecontroleerd worden door de intracellulaire cAMP concentratie. In de lever zal dit leiden tot activatie van de neoglucogenese en rem van de glycolyse.

Geef enkele voorbeelden van genexpressie-regulatie op post-transcriptioneel niveau.Deze regulatie gebeurt dmv de stabiliteit van mRNA’s. Sommige mRNA’s worden herkend door DNasen zoals c-JUN en c-FOS. De stabiliteit van andere mRNA’s hangt af van externe factoren. Bijvoorbeeld caseine, het meest vertegenwoordigd eiwit van moedermelk. Het is instabiel in de cellen van de borstklier als er geen prolactine wordt geproduceerd. De 3’-UTR van de transferrinereceptor-mRNA bevat sensoren (iron responsive elements IRE) die reageren op het ijzergehalte van de cel. Bij een laag gehalte worden deze sensoren afgeschermd door een IRE-binding protein zodat het mRNA stabiel is. Bij teveel liggen de IRE’s naakt en wordt het mRNA snel afgebroken.

Geef enkele voorbeelden van genexpressie-regulatie op translatieniveau.Een ander voorbeeld is bij ferritine, het belangrijkste ijzerbindende eiwit. De mRNA bevat in de 5’-untranslated region 2 IRE’s die bij een hoge cellulaire ijzerconcentratie naakt blijven liggen zodat het mRNA efficient wordt vertaald. Bij een laag cellulair ijzergehalte worden deze IRE’s echter bezet met IRE-bindende eiwitten zodat de translatie niet kan beginnen.De extracellulaire glucoseconcentratie is een zeer belangrijke fysiologische stimulus voor de translatie van het pre-pro-insuline. Glucose wordt door β-cellen gemetaboliseerd, waarna een metaboliet interageert met het pre-pro-insuline mRNA.

Wat versta je onder het begrip histoncode? Histonen bevatten gedeelten die gemodificeerd kunnen worden (methylering, acetylering), waardoor de associatie tussen de DNA en de eiwitten wordt versterkt of verzwakt). Het patroon van deze modificaties wordt de histoncode genoemd.

Welke type modificaties kunnen voorkomen op histoneiwitten?Di- of trimethylering, acetylering en methylering.

Waarop berust de antivirale werking van interferons?Interferons zijn kleine eiwitten met antivirale en imuunstimulerende werking. De viraal besmette cel secreteert interferons die dan binden op interferonreceptoren van nog niet besmette cellen. Deze activatie leidt tot intracellulaire signaaltransductie die ondermeer loopt volgens de JAK-STAT route. De door interferon gestimuleerde cellen gaan zich verdedigen tegen een eventueel daarop volgende virale infectie door enzymen te produceren die het virale mRNA afbreekt of die de translatie van virale eiwitten stopzetten.

Verklaar kort hoe de vroegste ontwikkelingsstadia van Drosophila gestuurd worden door gradiënten van transcriptiefactor-eiwitten.Door extreem veel delingen maar geen groei onstaat er een syncytium met een 2000-tal cellen. Sommige van de transcriptiefactoren kwamen in een concentratiegradient voor en zo krijgt iedere cel andere een andere responsiviteit van genen. Als de concentratie van de factor onder een bepaald niveau is komt het gen niet tot uitdrukking. Zo differentieren de cellen zich van elkaar.

Geef enkele argumenten waarom homeodomeineiwitten bij Drosophila, muis en mens paralogen zijn van elkaar.Omdat homeobox eiwitten een fundamentele rol spelen in de ontwikkelings fysiologie. Hun functie is evolutionair goed geconserveerd gebleven.

Hoofdstuk 14 - Recombinant-DNA technologie : Zelfstudie

Hybridisatie:

- Wat is het principe van hybridisatie en welke parameters beïnvloeden het proces van reassociatie tussen twee enkelstrengen?

2 complementaire strengen kunnen een paar vormen volgens Watson-Crick regels en gestabiliseerd worden door H-bruggen.

- Wat is in situ hybridisatie? En wat is FISHMet een radioactief gemerkte cDNA-probe kan men nagaan waar een bepaald nucleinezuur is gelokaliseerd. FISH is

fluorescentie in situ hybridisatie en is de niet-radioactieve variant van deze techniek.- Principe van Northern blotGaat na hoeveek van een zeker mRNA aanwezig is door RNA op een agarosegel te plaatsen en elektroforese uit te

voeren. Hierna wordt het geblot op een naar een nylon membraan en verankerd door UV-straling, Dan wordt het blootgesteld aan een radioactieve cDNA probe die na autoradiografie aan de hand van de densiteit en positie van de band aangeeft hoeveel mRNA en hoe lang het mRNA is.

Restrictie-enzymen:

- Naamgeving van restrictie-enzymenEnzym wordt genoemd naar bon (bacterie, stam, historisch nummer) EcoRI, HindIII..- Wat zijn de meest voorkomende lengtes van de palindroom herkenningssequenties?4-8 bp- Verschil tussen ‘blunt end’ en ‘sticky end’ restrictie-enzymen kennenRechte breuk is een blunt end en een scheve breuk is een sticky end- Biologisch belang van restrictie-enzymen bij bacteriënZe knippen vreemd DNA en beschermen de bacterie tegen parasitait DNA- Principe van Southern blotDNA wordt geknipt door restrictie-enzymen, fragmenten worden naar hun lengte gescheiden in agarosegel. DNA

wordt geblot, gedenatureerd tot enkelstrengen en een radioactieve probe zoekt naar bepaalde sequenties. Deze worden via autoradiografie gevisualiseerd.

DNA-sequentiebepaling:

- Principe van de enzymatische sequentiemethode van Sanger en de rol van ddNTP’s hierbijDit is gecontroleerde onderbreking van in vitro DNA replicatie. Deze methode maakt gebruik van het feit dat het

reactiemechanisme van DNA-replicatie de vrije 3’OH groep van de DNA keten nodig heeft voor het inbouwen van een nieuw nucleotide. Sanger gebruikte ddNTP’s die verschilde van de dNTP’s door het ontbreken van een vrije 3’OH-groep. Wanneer zo’n ddNTP aan de DNA-keten wordt gehecht stopt de replicatie.

- Kunnen verklaren hoe een volautomatische sequenator met fluorescerende primers werkt

Labeling van nieuw aangemaakte streng loopt via fluorescente primers of fluorescerende ddNTP’s. De scheiding van de nieuw aangemaakte strengen gebeurt in een capillair of in een gel. Een laser exciteert de ingebouwde fluorescentielabel en een fotodetector vangt de emissie van de label op.

Klonen van genen:

- Principe van klonen: begrip vector en gastheercelVector is een plasmide of virus dat een DNA-fragment bevat dat wordt ingebouwd in de gastheercel en daar wordt

gerepliceerd.- Kunnen uitleggen wat het verschil is tussen een genomische bibliotheek en een complementair-DNA (cDNA)

bibliotheekDe genomische bib is een afspiegeling van het totaal genoom. De cDNA bib is een afspiegeling van de genen die in

expressie zijn van een bepaald weefsel of cel.- De rol van DNA-ligase, terminaal transferase en oligo-dT kunnen toelichtenDNA-ligase verbindt een dierlijk DNA-fragment covalent aan een door een restrictie-enzym opengeknipt bacterieel

plasmide. Oligo-dT kolom zuivert het totale RNA tot mRNA (het bindt de poly-A staarten van het mRNA). Het mRNA wordt dan omgezet tot cDNA via reverse transcriptase waarbij oligo-dT kan dienen als primer. Het terminal transferase bouwt een korte 3’-arm aan die dan kan worden aangebouwd aan een complementaire primer.

- Principe van kloneren en screenen van een genomische of cDNA bibliotheek aangemaakt in bacteriofaag lambda

- Wat is een expressiebibliotheek?Dit is als er geen DNA-probe bestaat maar wel een antilichaam voor het eiwit wiens mRNA we zoeken. In een

expressiebib zit het cDNA ingebouwd in een expressie-vector waarin mRNA zal worden geproduceerd. Dit wordt in de gastheercel vertaald tot eiwit dat dan via antilichaam wordt opgespoord.

Polymerase kettingreactie (PCR):

- Verschillende stadia van een PCR Dissociatie, primer associatie (annealing) en primer elongatie.- Wat is de theoretische opbrengst van een PCR na n cycli, en waarom is deze in de praktijk veel lager?na n cycli zijn er theoretisch 2^n kopieen, dit is lager omdat er geen 100& efficientie voor elke reactie bestaat.- Belangrijkste toepassingsgebieden van PCR kunnen opnoemendiagnose van erfelijke ziekten, detecte van latente virusbesmetting in bloed, in vitro klonen van cDNA-fragment,

gerechtelijke geneeskunde.- Principe van reverse-transcription (RT)-PCR kunnen uitleggenPCR-amplificatiestap wordt gecombineerd met de isolatie van mRNA en de omzetting van mRNA in cDNA gaat via

reverse transcriptase. Zo kan men de expressie van mRNA in een cel onderzoeken.

Expressie van recombinante eiwitten:

- Belang van expressie in eukaryote kunnen toelichten + enkele voorbeelden van voor de mens belangrijke toepassingen hiervan kunnen noemen

Dit is het produceren van een recombinant eiwit. De transcriptie zal plaatsvinden als er een actieve promoter in de invloedsfeer staat en deze al dan niet door een enhancer wordt versterkt. Het wordt vooral in de farmaceutische branche gebruikt om insuline, groeihormoon, factor VIII, erythropoetine en tissue plasminogen activator te produceren.

Antisense RNA en DNA: niet kennenFocus 14.1 t.e.m. 14.4: niet kennen

Hoofdstuk 16 – Inleiding tot het metabolisme

Wat zijn de essentiële verschillen tussen anabole en katabole paden in het metabolisme?Katabole wegen omvatten de metabolische reacties die de cel voorzien van voldoende chemische energie (ATP) om te kunnen overleven en zich te kunnen voortplanten. Deze voorwaarden omvatten alle energie die noodzakelijk is voor groei, arbeid, beweging, transport elektrische geleiding en intercellulaire communicatie. Katabolisme = afbraak waarbij energie vrijkomt.Anabole wegen omvatten de biochemische reacties die leiden tot de biosynthese van nieuwe moleculen, dit meestal vanuit kleinere bouwstenen. Anabolisme is opbouw waarbij energie nodig is.

Waarom gebruiken de meeste anabole en katabole processen niet precies dezelfde wegen in twee richtingen voor de opbouw respectievelijk afbraak van een biomolecule? Geef een concreet voorbeeld.Dit is omdat er een onafhankelijke regeling van de ene en de andere weg moet kunnen plaatsvinden. Door verschillende enzymen te gebruiken verschillen terugreacties ookal hebben ze dezelfde substraten, tussenproducten en eindproducten. Een voorbeeld is de glycogeenafbraak/opbouw waarbij er 1 snelheidsbeperkend enzym is voor afbraak (fosforylase) en een ander voor de glycogeen opbouw (glycogeen synthetase)

Wat wordt bedoeld met fase 1 reacties van katabole wegen? Waar gaan deze reacties door bij de mens?Dit is het verteren van macromoleculen tot kleine brokstukken via hydrolyse. Bij de mens gebeurt dit in het lumen van de tractus digestivus.

Wat is feedback inhibitie? Geef hiervan een concreet voorbeeld.Dit is het voorkomen van allosterische inhibitoren als eindproducten van een keten. Als deze eindproducten aanwezig zijn wordt de keten stil gelegd via allosterische inhibitie. Dit gebeurt bij katabole enzymen die geremd worden door ATP en gestimuleerd door ADP of AMP.http://highered.mcgraw-hill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535::/sites/dl/free/0072437316/120070/bio10.swf::Feedback%20Inhibition%20of%20Biochemical%20Pathways

Wat is de ATP-ADP cyclus?ATP = ADP + P + Energie. Door middel van ATPasen kan energie die in ATP opgeslagen is onder de vorm van 2 energierijke fosfaten losgesplitst worden. Tijdens de synthese van ATP kan op ADP een energierijke fosfaatgroep worden overgedragen. Dit gebeurt via oxidatieve fosforylatie. ATP wordt verbruikt in endergonische processen zoals biosynthese, mechanische arbeid en actief transport.

Geef enkele voorbeelden van verbindingen met een hogere fosforyl-transfer potentiaal dan ATP.Fosfoenolpyruvaat, 1,3-Bifosfoglyceraat en creatine-fosfaat.

Geef voorbeelden van nucleotiden als hoog-energetische dragers van verbindingen in het intermediair metabolisme.NAD+, NADP+ en FAD zijn elektronendragers en functioneren als goede reductoren.

Geef voorbeelden van biosynthetische processen waar NADPH als reducerend vermogen wordt aangewend.De vetzuursynthese, de synthese van cholesterol en de productie van GSH. NADPH beschermt tegen oxidatieve schade die zuurstof en andere oxidanten aan cellen kunnen berokkenen.

Welke bouwstenen zijn gemeenschappelijk aanwezig in FAD, NAD+ en CoA?Adenine en in FAD en NAD+ ook een dinucleotide.

Wat is de rol van NADP+ in het metabolisme?Het is de elektronendrager en en co-enzym van een beperkt aantal dehydrogenasen (2 in de pentosefosfaat route en het malic enzyme)

Illustreer het belang van vitaminen van de B-groep in het metabolisme.Dit zijn voorlopers van belangrijke dragers. Vitamine B2 (riboflavine) is de voorloper van FAD, nicotinezuur is de voorloper van NAD en NADP en panththeenzuur is de voorloper van co-enzym A.

Volgens welke algemene principes kan de hoeveelheid enzym ter hoogte van een fluxbepalende stap geregeld worden?Enzymen die dergelijke stappen controleren zijn vaak de sleutelenzymen in het metabolisme en staan over het algemeen onder sterke regulatie. De hoeveelheid enzym kan worden geregeld op het niveau van genexpressie.

Volgens welke algemene principes kan de enzymactiviteit ter hoogte van een fluxbepalende stap geregeld worden?Dit kan via allosterie of covalente modificatie zoals fosforylatie.

Kan de Krebscyclus beschouwd worden als een zuiver anabool of zuiver katabool proces? Licht je antwoord kort toe.Geen van beide, alleen de laatste stap in de Krebscyclus is zuiver katabool (oxidatieve fosforylatie). De andere stappen kunnen ook voor anabole doeleinden worden gebruikt.

Wat wordt verstaan onder de ‘energy charge’ van een cel?Energy charge is te vergelijken met het opladen of ontladen van een batterij. Bij ontlading wordt het katabolisme geactiveerd en het anabolisme geremd, terwijl bij een opgeladen cel het katabolisme remt en de biosynthese wordt toegelaten. De energy charge is afhankelijk van van de concentratie van adeninenucleotiden.

Leg het verschil uit tussen een multifunctioneel enzym en een metabolon, en geef van elk minstens één voorbeeld. Multifunctionele enzymen zijn polypeptideketens die, nadat de polypeptideketen is opgevouwen tot de juiste driedimensionale structuur, meerdere actieve sites bezitten. Elke site in een dergelijk enzym katalyseert 1 stap in een anabole route; de opeenvolgende sites katalyseren stappen in de route.Bij een metabolon is de organisatie analoog, alleen katalyseert elk enzym slechts 1 stap in de weg.

Geef voorbeelden van metabole processen die zich afspelen in resp. de mitochondriën, het glad endoplasmatisch reticulum, en de celkern.Mitochondrien- aerobe verbranding van suikers, vetten en aminozuren, ATP-productieGlycogeengranulen: glycogeenmetabolismeRibosomen: eiwitsyntheseKern: DNA en RNA syntheseCytosol: glycolyse en grootste deel van neoglucogenese

Met welke technieken kan het metabolisme bestudeerd worden op het niveau van het volledige organisme?In vivi metabolse studies mbv positron-emissie tomografie (PET) scanning of functionele magnetische resonantie (fMRT)