LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo – Tiến Sỹ Quản Lê Hà - Người đã trực tiếp hướng dẫn và dìu dắt em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, các cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em tiến hành thí nghiệm và hoàn thành đề tài.

Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng thí nghiệm Hoá sinh đã hỗ trợ em thực hiện một số thí nghiệm trong thời gian triển khai đề tài.

Em xin chân thành cảm ơn sự động viên, chia sẻ, giúp đỡ của gia đình, bạn bè trong suốt thời gian vừa qua.

Hà Nội, ngày 29 tháng 05 năm 2008

Sinh viên

Trịnh thị Thuỳ

DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Hình dạng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae

Hình 1.2. Cấu tạo tế bào nấm men Saccharomyces

Hình 1.3. Sản phẩm Marmit

Hình 1.4. Sản phẩm Vegemite

Hình 1.5. Chế phẩm β – glucan

Hình 1.6. Vị trí xúc tác của neutrase gồm 3 gốc Asp 102, His57 và Ser195

Hình 2.1. Đường chuẩn glutamic

Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ flavourzyme đến khả năng thuỷ phân protein nấm men

Hình 3.2. Ảnh hưỏng của nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm Flavourzyme

Hình 3.3. Ảnh hưởng của xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo đến khả năng thuỷ phân protein nấm men

Hình 3.4. Ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năng thuỷ phân protein nấm men

Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm neutrase 0.8L

Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ neutrase đến khả năng thuỷ phân protein nấm men

Hình 3.7. So sánh khả năng thuỷ phân của flavourzyme, neutrase, phương pháp tự phân

Hình 3.8. Sắc ký đồ

Bảng 1.1. Ảnh hưởng của NaCl đến sự phân bố độ ẩm của nấm

bảng 1.2. Thành phần của nấm men trích ly sản xuất bằng phương pháp thuỷ phân

Bảng 3.1. Kết quả đo độ ẩm

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ flavourzyme đến khả năng thuỷ phân protein nấm men

Bảng 3.3. Ảnh hưỏng của nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm Flavourzyme

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo đến khả năng thuỷ phân protein nấm men

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năng thuỷ phân protein nấm men

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm neutrase 0.8L

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ neutrase đến khả năng thuỷ phân protein nấm men

Bảng 3.8. So sánh khả năng thuỷ phân của flavourzyme, neutrase, phương pháp tự phân nấm men

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

EDTA : Ethylen Diamin Tetra Acetic Acid

HdP :Hoạt độ protease

KTĐ :Khô tuyệt đối

TCA :Trichloroaceticacid

TGTP : Thời gian thuỷ phân

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU...................................................................................................1CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN............................................................2

1.1. Nấm men Saccharomyces và ứng dụng..............................................21.1.1. Giới thiệu về Saccharomyces.......................................................2

1.1.1.1. Hình dạng và kích thước tế bào nấm men.............................21.1.1.2. Cấu tạo tế bào nấm men........................................................31.1.1.3. Thành phần hoá học của tế bào nấm men.............................5

1.1.2. Các ứng dụng của nấm men trong ngành công nghiệp thực phẩm...............................................................................................................8

1.1.2.1. Ứng dụng trong sản xuất các đồ uống lên men.....................81.1.2.2. Ứng dụng để tạo sản phẩm thuỷ phân nấm men.................81.1.2.3. Ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm bánh mì..................91.1.2.4. Thu nhận enzym....................................................................91.1.2.5. Thu nhận protein...................................................................91.1.2.6. Sử dụng sinh khối nấm men làm thức ăn chăn nuôi.............91.1.2.7. Ứng dụng nấm men tạo các sản phẩm chữa bệnh...............10

1.1.3. Ứng dụng của dịch thuỷ phân nấm men....................................101.1.3.1. Sử dụng làm chất điều vị.....................................................101.1.3.2. Sản xuất một số sản phẩm truyền thống.............................111.1.3.3. Sử dụng làm môi trường vi sinh vật....................................121.1.3.4. Bổ sung vào quá trình nấu bia.............................................131.1.3.5. Sử dụng tạo ra một số sản phẩm chữa bệnh........................131.1.3.6. Sử dụng làm thức ăn chăn nuôi..........................................14

1.2. Tổng quan về protease......................................................................151.2.1. Khái quát về protease.................................................................15

1.2.1.1. Phân loại protease..............................................................151.2.1.2. Nguồn gốc protease............................................................161.2.1.3. Các yếu tố chính ảnh hưởng đến hoạt động của enzym......20

1.2.2. Ứng dụng của protease trong thuỷ phân protein........................211.2.2.1. Ứng dụng trong điều chế các dịch đạm thuỷ phân..............221.2.2.2. Ứng dụng trong sản xuất nước mắm...................................221.2.2.3. Ứng dụng trong quá trình sản xuất bia...............................221.2.2.4. Ứng dụng trong chế biến thịt cá.........................................231.2.2.5. Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác.....................23

1.2.3. Một số chế phẩm enzym protease từ vi sinh vật........................23

1.2.3.1. Chế phẩm neutrase 0.8L......................................................231.2.3.2. Chế phẩm enzym Flavourzyme...........................................26

1.3. Các phương pháp thủy phân nấm men.............................................271.3.1. Phương pháp hoá học.................................................................27

1.3.1.1. Thuỷ phân bằng axit............................................................271.3.1.2. Thuỷ phân bằng kiềm..........................................................28

1.3.2. Phương pháp enzym..................................................................281.3.2.1. Phương pháp tự phân nấm men...........................................281.3.2.2. Phương pháp thuỷ phân có bổ sung enzym protease..........28

1.3.3. Phương pháp thuỷ phân enzym kết hợp với axit:......................29CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................................................................................30

2.1. Nguyên vật liệu.................................................................................302.1.1. Nấm men....................................................................................302.1.2. Các chế phẩm enzym.................................................................302.1.3. Các loại hoá chất sử dụng trong đề tài.......................................302.1.4. Thiết bị sử dụng.........................................................................31

2.2. Các phương pháp nghiên cứu...........................................................312.2.1. Phương pháp xác định hoạt độ enzym protease.........................312.2.2. Phương pháp rửa nấm men........................................................332.2.3. Phương pháp xác định độ ẩm.....................................................332.2.4. Nghiên cứu thuỷ phân nấm men................................................33

2.2.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzym protease.........332.2.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ thuỷ phân..................342.2.4.3. Nghiên cứu xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo.....342.2.4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năng thuỷ phân protein nấm men của enzym...........................35

2.2.5. Phương pháp ninhydrin xác định hàm lượng axit amin.............352.2.6. Phương pháp sắc ký bản mỏng..................................................37

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...........................383.1. Xác định độ ẩm của nấm men lọc chân không.................................383.2. Xác định hoạt độ enzym protease.....................................................38

3.2.1. Xác định hoạt độ enzym protease trong chế phẩm Flavourzyme 500MG.................................................................................................383.2.2. Xác định hoạt độ enzym protease trong chế phẩm neutrase 0.8L.............................................................................................................38

3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thuỷ phân protein nấm men

bằng chế phẩm flavourzyme 500MG......................................................393.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ flavourzyme.......................................393.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thuỷ phân........................40

3.4. Nghiên cứu xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo..................423.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năng thuỷ phân protein nấm men.....................................................................443.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm neutrase 0.8L..................................................................45

3.6.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ thuỷ phân............................................453.6.2. Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzym neutrase và thời gian thuỷ phân..............................................................................................47

3.7. So sánh hiệu quả thuỷ phân bằng chế phẩm enzym neutrase, flavourzyme và phương pháp tự phân.....................................................48

KẾT LUẬN............................................................................................52KIẾN NGHỊ..........................................................................................53TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................54

MỞ ĐẦUNgành công nghệ sản xuất bia ở Việt Nam ngày càng phát triển. Sản

lượng bia ở Việt Nam đã tăng từ 1,29 tỷ lít vào năm 2003; 1,37 tỷ lít năm 2004; 1,5 tỷ lít năm 2005 và đạt 1,7 tỷ lít vào năm 2006. Nấm men bia là một tác nhân quan trọng không thể thiếu tham gia trực tiếp vào quá trình lên men bia. Sau khi lên men, một lượng lớn nấm men thải ra. Trung bình cứ sản xuất ra được 100 lít bia sẽ thải ra môi trường 2 lít men có thuỷ phần 88%. Men bia có hàm lượng protein cao trung bình khoảng 50% (tính theo chất khô), trong thành phần protein có đầy đủ các acid amin, đặc biệt là các acid amin không thay thế. Ngoài ra, nó còn chứa các chất khoáng, giàu vitamin nhóm B, nhóm D và các chất kích thích sinh trưởng. Trong 1 g chất khô của nấm men chứa 300 μg vitamin B1, 40 μg vitamin B2, 50μg vitamin B6, 600μg vitamin PP, 80μg axit pantoteic, 25μg axit folic, 1μg biotin và 500μg inozit. Trên thế giới, nấm men bia được quan tâm nghiên cứu tận dụng với nhiều mục đích khác nhau như làm thực phẩm, làm nguồn thuốc bổ giàu axit amin và vitamin. Tuy nhiên ở Việt Nam hiện nay các nhà máy sản xuất bia vẫn chưa ứng dụng men bia thải ra ngoài một cách hiệu quả, men thải ra từ các nhà máy bia được sử dụng chủ yếu làm thức ăn chăn nuôi, khả năng khai thác các thành phần có giá trị sinh học trong men bia để tạo ra các sản phẩm ứng dụng cho con người còn rất hạn chế. Hơn nữa, nếu không được sử dụng triệt để thì nguồn bã nấm men này còn là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường. Xuất phát từ những điều đó cùng với sự gợi ý của giáo viên hướng dẫn, để góp phần tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cho người bằng nguồn tận thu nấm men bia, em tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu ứng dụng enzym protease để tạo sản phẩm thuỷ phân nấm men”.

Nội dung chính bao gồm:

- Nghiên cứu tìm điều kiện thích hợp để thuỷ phân nấm men bia bằng các chế phẩm enzim Neutrase và Flavourzyme (điều kiện nhiệt độ, nồng độ enzim, thời gian) và so sánh với quá trình tự phân nấm men.

- Nghiên cứu xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năng thuỷ phân protein nấm men của enzym.

- Định tính một số thành phần axit amin quan trọng trong sản phẩm thuỷ phân.

1

-

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Nấm men Saccharomyces và ứng dụng

1.1.1. Giới thiệu về Saccharomyces

Saccharomyces thuộc họ Saccharomycetaceae, lớp Ascomycetes, ngành nấm. Là vi sinh vật có cấu tạo đơn bào, không di động, có khả năng sinh sản nhanh, sinh sản chủ yếu bằng phương pháp nảy chồi. Sinh khối của chúng rất giàu protein, vitamin và lipit. Tế bào nấm men thuộc loại Eucaryot (nhân thật), có khả năng hô hấp yếm khí tuỳ tiện.

Chúng phân bố rất rộng rãi trong thiên nhiên nhất là trong đất, có thể nói đất là môi trường tự nhiên để giữ giống nấm men và đặc biệt là trên bề mặt của rất nhiều loại lá cây, các loại quả hay các loại cây lương thực thực phẩm khác.

Nấm men có khả năng lên men các loại đường để tạo thành rượu trong điều kiện yếm khí, còn trong điều kiện hiếu khí thì chúng tạo thành sinh khối tế bào. Vì thế, nấm men được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm để sản xuất rượu, bia, nước giải khát lên men, sản xuất men bánh mì, sản xuất protein sinh khối, tạo hương nước chấm, sản xuất chất béo... [18], [23], [25], [26], [34].

1.1.1.1. Hình dạng và kích thước tế bào nấm men

Nấm men thuộc các loài khác nhau thường có hình dạng khác nhau. Ngay trong cùng một loài, hình dạng tế bào cũng thay đổi tuỳ thuộc vào điều kiện sống và tuổi đời. Trong môi trường đặc biệt thì nấm men có hình dạng rất ổn định. Đa số nấm men có hình ovan, hình bầu dục, hình tròn. Nấm men có hình tròn, hình trứng như Saccharomyces cerevisiae, hình elip như Saccharomyces ellipsoideus, hình quả chanh như Saccharomyces apiculatus, đôi khi có hình chai như Saccharomyces ludwigii.

So với các vi sinh vật khác (đối với vi khuẩn chẳng hạn), nấm men có kích thước tương đối lớn. Một số nấm men được sử dụng trong công nghệ thực phẩm thường có kích thước khoảng 3 ÷ 5 × 5 ÷ 10µm [34]. Kích thước này cũng thay đổi nhiều tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường sống...

2

Tế bào nấm men trong tự nhiên có thể đứng riêng lẻ hoặc sau khi nảy chồi vẫn dính vào nhau tạo thành chuỗi.

Hình 1.1. Hình dạng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae

Hiện nay trên Thế Giới và ở Việt Nam đang sử dụng hai loại nấm men bia, đó là nấm men nổi (Saccharomyces cerevisiae) và nấm men chìm (Saccharomyces carlbergensis), là tế bào hình cầu hay hình trứng, có kích thước 2.5-10 µm chiều rộng và 4.5-21 µm chiều dài.

1.1.1.2. Cấu tạo tế bào nấm men

Nấm men là sinh vật đơn bào, hiển vi, tế bào cơ bản giống như ở động vật, thực vật. So sánh cấu tạo tế bào nấm men với vi khuẩn ta thấy có sự tiến hoá nhảy vọt từ nhân sơ đến nhân chuẩn. Cùng với sự tiến hoá về nhân và cơ chế phân chia nhân (nhân có màng, có các thể nhiễm sắc, phân bào có tơ...), ở cơ thể nhân chuẩn xuất hiện nhiều thể không thấy ở thể nhân sơ như: Ti thể, lục lạp... [26].

3

Hình 1.2. Cấu tạo tế bào nấm men Saccharomyces

Tế bào nấm men có thành phần và cấu tạo phức tạp. Trong tế bào có các cấu tử tiểu thể và có thể chia thành: Các cơ quan nội bào hay cơ quan tử của tế bào và các chất chứa trong tế bào hay các thể vùi của tế bào (inclusion).

Thành tế bào

Thành tế bào dày khoảng 25 nm và chiếm khoảng 25-30 % khối lượng khô tế bào, là lớp vỏ bao quanh tế bào nấm men, tạo hình dáng tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp: Lớp trong cùng cấu tạo từ β-glucan không tan trong kiềm, lớp giữa cấu tạo từ β-glucan hoà tan, lớp ngoài cùng là mannan photphoryl. Giữa hai lớp màng phía ngoài có chứa các enzym invertaza, photphataza axit, β-glucosidaza, proteaza...Thành tế bào chứa khoảng 15 kitin cần thiết cho sẹo nảy chồi.

Glucan (chủ yếu) và mannan chiếm tới 90% chất khô của vỏ tế bào. Glucan là một polyme phức tạp, có cấu tạo phân nhánh từ các tiểu phần là D-glucoza, phân nhánh có liên kết β-1,6 và β-1,3. Glucan là thành phần chính cấu tạo nên vỏ tế bào, nếu thành phần này bị phá hỏng thì tế bào bị

4

phá vỡ hoàn toàn. Mannan là polyme phân nhánh của đường D-mannanoza, mỗi phân tử thường chứa từ 200-400 gốc mannanoza, có phân tử lượng là 5.9×104, không phải là thành phần quyết định của vỏ tế bào. Nếu bỏ phần mannan hình dáng tế bào không bị biến đổi.

Thành tế bào nấm men chứa 6-7 % protein, phần protein của nó thường liên kết vững chắc với phần hidratcacbon và tạo thành các phức chất giàu lưu huỳnh. Ngoài protein, thành tế bào nấm men còn chứa lipit, đường khử, nitơ, các axitamin, và các chất khoáng...Thành phần hoá học của thành tế bào nấm men có thể thay đổi phụ thuộc vào chủng, điều kiện môi trường sống và tuổi đời [26], [34].

Màng nguyên sinh chất: Màng nguyên sinh chất là một lớp màng rất mỏng, dày không quá 0.1nm, dính chặt với tế bào chất, nằm sát vách tế bào. Màng nguyên sinh chất có cấu tạo 3 lớp: Lớp giữa là lipid và photpholipid, hai lớp còn lại là protein. Hai lớp này đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển các chất hoà tan và hoạt động của các enzym.

Nguyên sinh chất: Nguyên sinh chất của tế bào nấm men là một hệ thống keo cấu tạo bởi protit, lipit, lipoit, polysacarit, muối khoáng, nước. Nguyên sinh chất nằm ngay bên dưới thành tế bào, dày khoảng 80A0, có độ nhớt cao (gấp 800 lần độ nhớt của nước) và chứa tất cả các cấu trúc cơ bản của tế bào.

Nhân tế bào: Khác với vi khuẩn, tế bào nấm men có nhân thật. Mỗi tế bào nấm men có một nhân hình tròn hoặc hình bầu dục, được bao bọc bởi một màng nhân. Trong nhân là nhân con. Hình dáng và kích thước của nhân có thể thay đổi phụ thuộc vào tuổi và trạng thái sinh lý tế bào. Trong các tế bào nấm men đang hoạt động mạnh, nhân có kích thước khá lớn. Cũng như các sinh vật khác, nhân tế bào nấm men có cấu tạo bởi protein, AND, ARN và nhiều enzym. Nhân quyết định tính di truyền và tham gia điều khiển mọi hoạt động sống của tế bào. Trong nhân có chứa nhiễm sắc thể, có quá trình giảm phân khi sinh sản và đôi khi cũng có thể phân cắt theo kiểu trực phân.

Không bào: Không bào có tính thẩm thấu cao, là nơi tích luỹ các sản phẩm trao đổi chất. Glycogen có thể chiếm tới 12 % chất khô của tế bào. Trehaloza là một hydratcacbon dự trữ, có thể chiếm tới 16 % lượng chất khô trong tế bào. Chính không bào là nơi chứa axit amin tự do. Ngoài ra không bào còn chứa purin, ortophotphat polyme hoá và các enzym thuỷ phân.

5

Ty thể: Ty thể nấm men chứa AND, ARN, ARN polymeraza, các enzym hô hấp, chúng suy biến thành các tiền ty thể (promitochondries) trong quá trình lên men khi môi trường chứa hơn 5 % glucoza. Màng ty thể có chứa lipid, photpholipid, ergosterol.

1.1.1.3. Thành phần hoá học của tế bào nấm men

Thành phần hoá học của tế bào nấm men tuỳ thuộc điều kiện môi trường nuôi, thành phần chất dinh dưỡng, tình trạng sinh lý của tế bào.

Trong tế bào có chứa hầu hết các chất cần thiết như protein, glucid, lipid, các enzym, các axit nucleic, chất khoáng [26].

Cũng như các cơ thể sống khác, thành phần cơ bản và chủ yếu của tế bào nấm men là nước (khoảng 70-75 % khối lượng chung). Thành phần sinh khối khô của nấm men như sau (%):

Chất vô cơ 5-10

Cacbon 25 – 50

Nitơ 4.8 – 12

Protein (N × 6.25) 30 -75

Lipid 2 – 5

Thành phần hoá học của tế bào nấm men nếu tính theo các nguyên tố cấu thành sẽ là (% theo trị số trung bình): C – 47, H – 65, O – 31, N – 5 ÷ 10, P – 1.6 ÷ 3.5. Hàm lượng các nguyên tố không phải đa lượng: Ca – 0.3 ÷ 0.8, K – 9.5 ÷ 2.5, Mg - 0.1 ÷ 0.4, Na - 0.06 ÷ 0.2, S – 0.2. Các nguyên tố vi lượng (mg/kg): Fe 90 ÷ 350, Cu – 20 ÷ 135, Zn – 100 ÷ 160, Mo – 15 ÷ 65 [26].

a. Nước trong tế bào nấm men

Nấm men ép có chứa 70 – 75 % là nước, và 25 – 30 % còn lại là chất khô.

Nước bao gồm phần nước ngoài tế bào (ngoại bào) là phần nước nằm trong khoảng trống giữa tế bào, và nước trong tế bào (nội bào) là phần nước nằm trong tế bào chất của tế bào. Lượng nước khác nhau còn tuỳ chủng nấm men, kỹ thuật nuôi và phương pháp thu tế bào. Ví dụ: khi nuôi trong môi trường có NaCl, lượng nước trong tế bào giảm, điều này thể hiện ở bảng 1.1

6

Bảng 1.1. Ảnh hưởng của NaCl đến sự phân bố độ ẩm của nấm men

Phương pháp nuôi

Phân bố trong nấm men, %

Phân bố độ ẩm trong men ép

lượng chất khô

độ ẩm ngoại bào nội bào

Không thêm NaCl 27 73 22 51

Thêm NaCl vào môi trường nuôi

31 69 22 47

Thay đổi độ ẩm của nấm men sẽ kéo theo thay đổi tỉ lệ nước nội bào và nước ngoại bào. Khi loại bỏ 85 % lượng nước từ nấm men ở nhiệt độ dưới 500C hầu như không ảnh hưởng đến hoạt động của chúng [25].

b. Chất khô trong tế bào nấm men

Chất khô của tế bào nấm men gồm có (tính theo % khối lượng nấm men ép): 23 – 28 là chất hữu cơ và 5 – 7 là tro. Chất hữu cơ ở đây gồm có: Protein 13-14%, glycogen 6 – 8 %, xenluloza 1.8 – 2 %, Chất béo 0.5 – 2 %.

Protein

Trong các chất hữu cơ của tế bào nấm men thì protein là thành phần có giá trị nhất. Thành phần protein nấm men phụ thuộc vào loài giống, thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy [26], [38].

Nấm men có hàm lượng protein nguyên liệu trung bình khoảng 50 % (tính theo chất khô), trong đó có khoảng 45 % protein hoàn chỉnh. Các dẫn xuất của axit nucleic như bazơ purin và pyrimidin, các axit amin tự do đều được coi là protein nguyên liệu. Trong thành phần protein có đầy đủ các axit amin và đặc biệt là axit amin không thay thế. Hàm lượng các axit amin trong tế bào nấm men ở giai đoạn cuối lên men như sau (mg/g men khô): Lizin – 7.5; arginin – 1.3; histidin – 11.0; axit asparaginic – 2.9; serin – 2.7; glyxin – 1.5; axit glutamic – 3.9; alanin – 8.7; prolin – 2.0; tirozin – 2.8; metionin – 2.9; lơxin – 5.4; sistein - vết... [26].

Vitamin

7

Nấm men có thể tổng hợp được tất cả các vitamin trong chừng mực nào đó (nhiều hoặc ít), ngoại trừ biotin (vitamin H). Thực tế cho thấy, tế bào nấm men rất giàu vitamin, nhất là vitamin nhóm B và tiền vitamin D2

là ergosterol.

Hàm lượng vitamin trong tế bào nấm men như sau (μg/g chất khô): Inozit 6000 – 15000; biotin (vitamin H) 0.6 ÷ 0.7; riboflavin (vitamin B2) 30 ÷ 60; axit pantotenic (vitamin B3) 2.0 ÷ 19.0; thiamin (vitamin B1) 24 ÷ 50; pyridoxine (vitamin B6) 14 ÷ 39; nicotinamit (vitamin B5) 370 ÷ 750.

Chất béo: Chất béo trong tế bào nấm men có các axit oleic, linoelic, palmitic. Trong chất béo có tới 30 – 40 % phosphatit.

Tro: Trong tro nấm men thấy có các oxyt sau đây (%): P2O5 25 ÷ 60; CaO – 1 ÷ 8; MgO – 4 ÷ 6; Na2O – 0.5 ÷ 2; SO3 - 0.5 ÷ 6; SiO2 – 1 ÷ 2; Fe2O3 – 0.05 ÷ 0.7.

Các nguyên tố vi lượng: Chúng tham gia vào thành phần của nhiều enzym, vitamin và nhiều hợp chất khác nữa trong quá trình sinh tổng hợp các sản phẩm của tế bào. Các nguyên tố vi lượng (mg/kg): Fe 90 ÷ 350, Cu – 20 ÷ 135, Zn – 100 ÷ 160, Mo – 15 ÷ 65.

Glycogen: Là những chất dự trữ nguồn cacbon (hydratcacbon của nấm men). Khi trong môi trường thiếu nguồn cacbon dinh dưỡng, glycogen sẽ được huy động tham gia vào quá trình tiêu hoá của nấm men và giải phóng ra nước, khí cacbonic.

Trehaloza: Hợp chất thường kết hợp với hàng loạt hạt glycogen làm nguồn dự trữ cacbon rất cơ động. Ở cùng một giá trị pH, hàm lượng Trehaloza tăng thì nitơ giảm.

Như vậy, protein là thành phần chủ yếu trong chất khô tế bào nấm men. Nếu ta tận dụng thuỷ phân nguồn thứ phẩm này thải ra từ các nhà máy bia sẽ thu được dịch thuỷ phân protein nấm men có giá trị dinh dưỡng rất cao, với các thành phần axit amin không thay thế như lizin, metionin...bổ sung vào thực phẩm thiếu hụt các axit amin này (như các protein có nguồn gốc thực vật...) và tạo ra nhiều sản phẩm có giá trị khác.

1.1.2. Các ứng dụng của nấm men trong ngành công nghiệp thực phẩm

1.1.2.1. Ứng dụng trong sản xuất các đồ uống lên men

Lên men là một trong những kỹ thuật lâu đời nhất trong chế biến thực phẩm và mang tầm quan trọng kinh tế to lớn. Các sản phẩm lên men phổ

8

biến là rượu, bia, nước giải khát...Các sản phẩm này ngày càng nhiều và dường như chưa bao giờ đáp ứng đủ nhu cầu của con người.

Nấm men đóng vai trò là tác nhân lên men, nó hấp thụ các hydratcacbon thấp phân tử và các chất dinh dưỡng khác trong môi trường vào tế bào, rồi thực hiện quá trình trao đổi chất trong điều kiện kỵ khí qua một chuỗi các biến đổi phức tạp tạo thành sản phẩm mà chủ yếu là rượu etylic, CO2 và một số sản phẩm phụ khác.

Nấm men thường được sử dụng trong quá trình lên men rượu là Saccharomyces.

1.1.2.2. Ứng dụng để tạo sản phẩm thuỷ phân nấm men

Men được hoà với nước theo tỉ lệ thích hợp, có thể bổ sung enzym thuỷ phân hoặc không, giữ ở 50 – 550C, đây là nhiệt độ thích hợp cho enzym protease có sẵn trong tế bào nấm men và enzym protease bổ sung vào hoạt động thuỷ phân protein thành các đạm thấp phân tử, đồng thời giải phóng ra nhiều thành phần có giá trị khác. Dịch thuỷ phân chứa rất nhiều axit amin đặc biệt là các axit amin không thay thế, peptid, vitamin nhóm B, các hydratcacbon...

bảng 1.2. Thành phần của nấm men trích ly sản xuất bằng phương pháp thuỷ phân [27]

Các axit amin (% so với khối lượng ban đầu) Các vitamin (mg/kg, ppm)Alanin 3.4 Isoleucin 2.0 prolin 1.9

Arginin 2.1 Leucin 2.9 Serin 1.6 Thiamin 20-30

Asparagin

3.8 Lizin 3.2 Treonin 1.9 Riboflavin 50-70

Cistin 0.3 Methionin 0.5 Tirozin 0.8 Piridoxin 25-35

Glycin 1.6 Ornithin 0.3 Histidin 0.9 Niacinamd 600

Axit glutamic

7.2 Phenylalanin

1.6 Axit butyric

0.1 Axit pantotenic

200

9

Nhiều thực phẩm có nguồn gốc thực vật chứa hàm lượng protein cao nhưng lại không thể dùng làm nguồn protein thức ăn cho con người và gia súc do thiếu một số axit amin không thay thế. Ví dụ: protein lúa mì nghèo lizin, protein lúa nước nghèo lizin và threonin, protein ngô nghèo lizin và tryptophan, protein đậu nghèo metionin. Do đó, trên toàn thế giới việc thiếu hụt các axit amin không thay thế như: lizin, threonin và metionin... còn trầm trọng hơn là đói protein nói chung. Vì vậy, việc tận dụng nguồn protein nấm men để tạo ra dịch thuỷ phân có giá trị dinh dưỡng và giá trị sinh học cao mà lại an toàn cho người và gia súc là rất cần thiết.

1.1.2.3. Ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm bánh mì

Sinh khối nấm men làm nở bột mì là sinh khối men Saccharomyces cerevisiae còn sống, còn hoạt tính lên men rượu, khi trộn với bột mì sẽ lên men rượu, giải phóng ra CO2 làm phồng gluten (protein trong bột mì), bột nhào nở làm cho bánh mì xốp.

1.1.2.4. Thu nhận enzym

Thu nhận enzym superoxit dismutaza: Sử dụng công nghệ nghiền tế bào Saccharomyces cerevisiae kết hợp với xử lý kiềm [6].

Thu nhận chế phẩm invertase: Tự phân nấm men bia ở 500C, pH 5.5, thời gian 50 giờ. Khi đó hoạt tính invertase thu được là 120.9 U/g chất khô nấm men [23].

1.1.2.5. Thu nhận protein

Protein nấm men có ưu điểm là nguồn protein sạch, chứa đầy đủ các axit amin không thay thế, giá thành rẻ, hàm lượng cholesterol thấp [28] …Từ việc thu hồi nấm men dư thừa tại các nhà máy bia, sử dụng công nghệ enzym và công nghệ chế biến tiên tiến, đã sản xuất bột nấm men giàu protein 46.27 %- 56.67 %, có đầy đủ các axit amin thay thế và không thay thế với tỷ lệ lớn, các vitamin và các nguyên tố vi lượng như Mg, Ca, Fe, Na...có khả năng thay thế nguồn protein động vật. Được sử dụng làm bột dinh dưỡng trẻ em, phối trộn với bột canh tạo ra 1 loại bột nêm có độ ngọt đạm cho gia vị.

1.1.2.6. Sử dụng sinh khối nấm men làm thức ăn chăn nuôi

Trong hoàn cảnh nhiều nước trên thế giới (chủ yếu ở châu Phi và châu Á) còn bị đói protein trầm trọng, các nước châu Âu hằng năm vẫn phải nhập đậu tương cho chăn nuôi, thì protein vi sinh vật là một nguồn hấp dẫn.

10

Sinh khối nấm men làm nguồn protein – vitamin bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, đây là các tế bào của các giống Saccharomyces, Candida… đã sấy khô, đã chết, không còn hoạt tính lên men rượu. Protein vi sinh vật đặc biệt giàu lizin, đây là một lợi thế khi bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Men bia khô có thành phần protein 44.5 %, chất béo 1.2 %, xơ 1.3 %, nước 10.9 %.

Cho thức ăn tinh ngô, cám, khoai vào thùng, chum, pha nước vừa đủ sền sệt. Trộn 2 – 4 % bánh men đã bóp vụn, bổ sung thêm ure 200 g và lân 150g/100kg bột, khuấy đều, đậy lại, ủ ấm và cứ 6-8 giờ đảo 1 lần. Sau vài ngày, men sẽ mọc trắng, có mùi thơm. Thức ăn được ủ men bia làm tăng protein lên 9-14 %. Thức ăn ủ men trộn vào khẩu phần của lợn con 40 %, lợn choai 50-60 %, lợn nái chửa hai tháng cuối và lợn nái mới đẻ không trộn thức ăn ủ men này vì có thể thiếu khoáng, nhất là canxi cho cấu tạo phát triển xương của thai và lợn con. [18]

1.1.2.7. Ứng dụng nấm men tạo các sản phẩm chữa bệnh

Men bia sống thường được sử dụng làm thuốc trong các trường hợp cơ thể mệt mỏi, kiệt sức, thiếu máu, kém ăn, chậm tăng trưởng, stress, rối loạn thần kinh. Khi kết hợp với selen, nó tạo thành phân tử selen hữu cơ có tác dụng ra tăng hiệu năng chống các gốc tự do, làm chậm quá trình lão hoá và là yếu tố quan trọng trong nhóm các chất chống oxy hoá cần thiết cho sức khoẻ.

Men bia sống có tác dụng chống nhiễm trùng bằng cách tăng cường hệ thống miễn dịch. Các loại thuốc uống chứa men bia thường kết hợp men bia 400 g với men bia selen – 75 mg, silice 25 mg, giúp tăng cường sức khoẻ, chống nhiễm trùng (trong các trường hợp bị cảm, ho, nóng sốt). Men bia còn được sử dụng làm thực phẩm bổ sung cho phụ nữ mang thai và cho con bú.

Men bia sống dùng làm thuốc thường có 20 tỷ tế bào sống Saccharomyces cerevisiae/1g, chứa trong 2 viên nang với hàm lượng 16 axit amin, 17 vitamin, 14 muối khoáng. Nó được xem là loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao và là vectơ dẫn đường cho sự hấp thu các loại vitamin khác vào cơ thể [14].

Chế phẩm YeaSacc 1026 bao gồm các tế bào nấm men của dòng men Saccharomyces cerevisiae 1026, là một dạng men sống dùng để trộn vào

11

thức ăn. Có tác dụng kích thích tăng trưởng và hoạt động của các loại vi khuẩn có lợi cho đường ruột [1].

1.1.3. Ứng dụng của dịch thuỷ phân nấm men

1.1.3.1. Sử dụng làm chất điều vị

Sử dụng một lượng nhỏ dịch thuỷ phân nấm men vào một số thực phẩm như súp, nước xốt, trứng, snack, bánh quy…sẽ góp phần tích cực vào việc tăng giá trị cảm quan và giá trị dinh dưỡng cho sản phẩm. Đây là kết quả của các axit amin và các peptide phân tử lượng thấp trong dịch thuỷ phân nấm men.

1.1.3.2. Sản xuất một số sản phẩm truyền thống

Dịch thuỷ phân nấm men giàu axit amin đặc biệt là các axit amin không thay thế, vitamin nhóm B, khoáng… được sử dụng để tạo rất nhiều sản phẩm thơm ngon, bổ dưỡng như vegemite, marmite, oxo, cenovis, recipe…

1) MARMITE: Sản phẩm này có xuất xứ từ nước Anh, thành phần chính của Marmite là YE. Sản phẩm dính, có dạng sệt, màu nâu, vị mạnh, cực kỳ mặn, có vị thịt. Mùi vị của nó được so sánh với nước tương (xì dầu). Ngoài ra, marmite còn có một sản phẩm tương tự ở New Zealand, Úc.

Marmite là món ăn truyền thống ở Anh, được ăn với bánh mỳ, bánh bích quy. Các nhà hàng Trung Quốc, Singapore sử dụng marmite trong các món xào thịt lợn để làm tăng vị ngọt cho thức ăn. Nó cũng được cho vào cháo yến để bổ sung hương thơm cho cháo.

Hình 1.3. Sản phẩm Marmit

Thông tin dinh dưỡng của Marmite loại 100g được sản xuất ở Anh:

12

- Năng lượng: 219 kcal - Protein: 38.4 g

- Cacbonhydrat: 19.2 g - Đường: 0.5 g

- Chất béo: 0.1 g - Natri: 4.3g

- Thiamin: 5.8 mg - Riboflavin: 7 mg

- Niacin: 160 mg - Axit folic: 2500µg

- Vitamin B12: 15 μg

2) VEGEMITE: Là sản phẩm được làm từ YE, trông rất mịn, dính. Sử dụng để phết lên bánh sandwich, bánh mì nướng, bánh bích quy…Sản phẩm có vị mặn, hơi đắng, có vị mạch nha, gần giống vị canh thang thịt bò. Vegemite được coi là món ăn truyền thống ở Úc, New Zealand. Vegemite rất giàu vitamin nhóm B.

Hình 1.4. Sản phẩm Vegemite

Thông tin dinh dưỡng của vegemite loại 5g:

- Năng lượng 9.76 kcal - Protein: 1.3g

- Cacbonhydrat tổng số 1g - Chất béo < 1g

- Niacin: 2500 μg - Thiamine: 550 µg

- Riboflavin: 430 μg - Folate: 100 μg

- Natri: 169 mg

Tuy nhiên, việc sử dụng đạm vi sinh cho con người bị hạn chế bởi hàm lượng axit nucleic của nó. Tổ chức WHO khuyến cáo mức độ tối đa của axit nucleic là 2 % trong thực phẩm. Trong khi đạm nấm men chứa khoảng 6-13 %.

13

1.1.3.3. Sử dụng làm môi trường vi sinh vật

Chiết lấy phần trong từ dịch thuỷ phân nấm men, bỏ cặn, trung hoà và đun sôi. Từ dịch men thuỷ phân ta có thể pha thành môi trường thạch - nước men - đường (nước men được thêm 0.5 % muối ăn, 1- 2 % glucoza và 2 % thạch). pH 6,8. Thanh trùng ở 0.5at trong 30 phút. Có thể thay glucoza bằng 5 % sacaroza, pH = 6.0 – 6.5 [26].

Dịch men thuỷ phân có thể cô đặc thành cao men, đem dùng dần để pha môi trường với tư cách là nguồn nitơ hữu cơ (peptone, peptid, axit amin, nucleotide...) và nguồn vitamin đặc biệt là vitamin nhóm B.

Thành phần môi trường để nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae sinh tổng hợp protease là môi trường lỏng có các thành phần như sau: dextrin 2.5 g, bột đậu nành 5 g, saccharose 3 g, Na2CO3 0.9 g, NaHCO3 0.3 g, Na3PO4 0.3 g, chất chiết nấm men 0.1 g, đong vừa đủ 100ml nước. Môi trường này thích hợp cho nấm mốc phát triển và sinh tổng hợp protease [13].

1.1.3.4. Bổ sung vào quá trình nấu bia

Chất chiết nấm men được xem là nguồn nitơ tốt nhất bổ sung vào dịch nha trong sản xuất bia với kỹ thuật lên men nồng độ cao đối với dịch nha 220 pt, hàm lượng chất chiết nấm men cần bổ sung là 40 mg/lit. Làm giảm thời gian lên men, nồng độ cồn trong bia non tăng lên [22].

1.1.3.5. Sử dụng tạo ra một số sản phẩm chữa bệnh

Thuốc ống uống BIOFIL: Đây là sản phẩm của công ty cổ phần Dược - Vật tư Y tế Thanh Hoá, đi từ nguyên liệu sinh khối nấm men bia. Qua quá trình lắng lọc tinh chế, thuỷ phân axit kiềm với men đặc hiệu, áp dụng công nghệ mới tạo sản phẩm ống uống BIOFIL 10 ml đóng hộp 10 ống và hộp 20 ống. Là thuốc bổ dưỡng giàu axit amin và vitamin nhóm B. Với giá bán bằng 30 % thuốc nước ngoài cùng loại. Với mức sản xuất năm 2004, làm lợi cho xã hội và người tiêu dùng 19.500 triệu đồng [29].

Ngoài các thành phần có giá trị trong dịch chiết nấm men như đã nêu ở trên thì phần bã rắn không bị thuỷ phân bao gồm chủ yếu là thành tế bào cũng có rất nhiều ứng dụng.

- β–glucan là hỗn hợp sinh học tự nhiên bao gồm β 1-3, 1- 6 glucan và manna oligosaccharide được chiết suất từ thành tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae. β–glucan giúp kích thích hệ thống miễn dịch tự

14

nhiên, tăng cường hoạt động của các đại thực bào và kích thích tiết nhiều cytokines (chất hoạt hoá tế bào) nhằm tiêu diệt các mầm bệnh xâm nhấp từ bên ngoài. Vì vậy, β-glucan đã được ứng dụng để bào chế các loại thuốc chữa vết thương, thuốc chống u bướu.

β–glucan giúp giảm hệ số chuyển đổi thức ăn, kích thích tiêu hoá, phòng các bệnh đường ruột, nhiễm trùng do vi khuẩn, virut, làm giảm cholesterol trong máu. β–glucan là giải pháp thay thế kháng sinh trong phòng trị bệnh vật nuôi an toàn và hiệu quả. β–glucan chịu được nhiệt độ 1200C nên có thể dùng làm thức ăn ép viên [29]. Hiện nay, trên thị trường có một số sản phẩm: BETA CLUCAN 25, BETA GLUCAN 40

Hình 1.5. Chế phẩm β - glucan

BETA GLUCAN 25: Trong 1kg sản phẩm chứa 25 % β–glucan 1 – 3, 1 – 6

BETA GLUCAN 40: Trong 1kg sản phẩm chứa 40 % β–glucan 1 – 3, 1 – 6

- Mannan–oligo-saccharide (MOS) (đại diện là chế phẩm Bio–Mos) cũng được chiết từ thành tế bào nấm men có tác dụng chống bệnh ỉa chảy ở lợn cai sữa. MOS có khả năng thu hút và loại thải ra ngoài phần lớn các vi khuẩn đường ruột có hại như E.coli, Salmonella, các độc tố nấm như Aflatoxin. Vì vậy, sử dụng Bio-Mos sẽ ngăn chặn sự định vị của mầm bệnh, tăng cường hệ thống phòng thủ của cơ thể, giúp vật nuôi tăng trọng nhanh [1].

15

Thực phẩm bổ sung B complex (100 viên) 205.700 vnd. Mỗi viên cung cấp đầy đủ 7 loại vitamin B từ tự nhiên (B1, B2, B3, B5, B6, axit folic và B12) cần thiết cho cả phụ nữ và nam giới. Tất cả được chiết xuất từ nấm men.

1.1.3.6. Sử dụng làm thức ăn chăn nuôi

Tuy thành phần của các axit amin trong protein nấm men không cân đối và có giá trị sinh học như axit amin từ protein động vật, nhưng giá trị dinh dưỡng của nó cũng gần giống protein động vật. Sử dụng dịch thuỷ phân nấm men sẽ góp phần bổ sung các axit amin không thay thế bị thiếu hụt trong thức ăn hàng ngày như lizin, metionin…Ngoài ra, các vitamin nhóm B, các hydratcacbon, các chất kích thích sinh trưởng...làm vật nuôi lớn rất nhanh. Hiện nay, trên thị trường có các sản phẩm của Altech sử dụng trong nuôi thuỷ sản...

1.2. Tổng quan về protease

1.2.1. Khái quát về protease

Enzym protease là nhóm men thuỷ phân liên kết peptit (-CO-NH-) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự.

Trong các enzym công nghiệp, enzym thuỷ phân chiếm 75 % và protease chiếm khoảng 60 % tổng lượng enzym được tiêu thụ trên thế giới.

1.2.1.1. Phân loại protease

Người ta phân loại nhóm enzym này theo nhiều cách khác nhau [8].

- Dựa vào vị trí của liên kết peptit ở nội mạch hay ở đầu mạch thì enzym protease được chia thành 2 nhóm: endopeptidase và exopeptidase.

- Dựa vào quá trình thuỷ phân có thể chia thành proteinase và peptidase. Sơ đồ ước lệ của quá trình thuỷ phân protein có thể biểu diễn như sau:

Proteinase peptidase

protein → albumoza → pepton → polypeptit → peptit → axit amin

Proteinase: Là enzym thuỷ phân liên kết peptit ở giữa chuỗi mạch polypeptit. Vì vậy, nó cắt phân tử protit thành những đoạn protein có phân tử lượng nhỏ hơn (pepton, polypeptit). Enzym này xúc tác cho quá trình

16

thuỷ phân liên kết peptit bên trong phân tử protit. Hoạt độ tối ưu đạt được khi pH = 4.6 – 4.9, nhiệt độ tối ưu là 50 – 600C, nhóm enzym này chỉ bị vô hoạt khi nhiệt độ lớn hơn 700C. Ở 500C, dưới tác dụng của enzym này sản phẩm tạo thành chủ yếu là các pha thấp phân tử (peptit, polypeptit), còn ở 600C thì sản phẩm chủ yếu thuộc nhóm phân tử lượng trung bình.

Peptidase: Là nhóm enzym không ít hơn 2 cấu tử. Thuỷ phân liên kết peptit ở 2 đầu của phân tử protit. Đầu tiên tạo thành các dipeptit rồi thành axit amin tự do. Trong quá trình thủy phân mối liên kết peptit ở đầu amin hoặc đầu cacboxyl sẽ dần dần bị thuỷ phân. Các enzym này có tính đặc hiệu rất cao. Ví dụ: Dipeptidase thì thuỷ phân dipeptit, còn polypeptidase thì thuỷ phân polypeptit có từ 3 axit amin trở lên. Aminopeptidase chỉ thể hiện hoạt lực xúc tác khi cơ chất có nhóm – NH2 tự do, còn cacboxylpeptidase chỉ hoạt động thuỷ phân khi cơ chất có nhóm –COOH tự do. Tất cả các peptidase kém bền nhiệt hơn proteinase nhưng lại hoạt động tốt trong môi trường kiềm. Hoạt động tốt nhất ở pH = 7 – 8 và nhiệt độ khoảng 40 – 420C. Trong dung dịch nước, enzym này hoạt động yếu dần khi tăng nhiệt độ lên 500C và biến tính phi thuận nghịch nhanh chóng ở nhiệt độ 600C.

- Dựa vào tính chất của môi trường hoạt động có thể chia thành: protease kiềm tính (pH = 8 - 11), protease trung tính (pH = 6.0 – 7.5) và protease axit tính (pH < 6.0). Tuy nhiên cách phân loại này chỉ có ý nghĩa thực dụng, không thực sự chính xác vì pH tối thích của mỗi enzym còn phụ thuộc vào bản chất của cơ chất và nhiều yếu tố khác nữa.

- Dựa vào nhóm chức năng ở trung tâm hoạt động có 4 loại: serine protease, cysteine protease, aspartic protease và metallo protease. Đây là cách phân loại phổ biến hiện nay.

+ Serine protease: Là những proteinase có nhóm –OH của gốc serin trong trung tâm hoạt động có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzym. Enzym thuộc nhóm này thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. Lớp enzym này được chia thành 2 nhóm nhỏ hơn đó là chymotrypsin và substilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzym của động vật có vú như: chymotrypsin, trypsin, elastase hay kallikrein. Nhóm enzym substilisin gồm các enzym của vi khuẩn như substilisin.

+ Cysteine protease: Là những proteinase có nhóm – SH trong trung tâm hoạt động. Các enzym thuộc nhóm này thường hoạt động mạnh ở pH

17

trung tính, có tính đặc hiệu rộng và chỉ hoạt động được khi nhóm –SH không bị bao vây như papain, bromelain...

+ Aspartic protease: Là những enzym có chứa nhóm cacboxyl trong trung tâm hoạt động, thường hoạt động mạnh ở pH trung tính như pepsin, renin, cathepsin...

+ Metallo protease: Là nhóm enzym được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động mạnh nhất ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA.

1.2.1.2. Nguồn gốc protease

Enzym protease khá phổ biến ở cả động vật, thực vật và vi sinh vật.

Protease động vật

Các enzym có trong các cơ quan và mô cơ của động vật như: pepsin, trypsin, chymotrypsin, renin... được phát hiện sớm nhất [2], [8].

- Trypsin: Là enzym tiêu hoá đường ruột, phù hợp để thuỷ phân protein thực phẩm. Nó là một serine proteinase và thuỷ phân mối liên kết peptit giữa lysine và arginine.

- Chymotrypsin: Được tìm thấy ở dịch tuỵ. Nó đặc hiệu với mối liên kết peptit có các nhóm cacboxyl của các axit amin thơm như phenylalanine, tryrosine hoặc tryptophan.

- Pepsin: Là một proteinase axit, hoạt động thích hợp ở pH = 1.3 – 2.2. Thu được từ dịch dạ dày heo. Enzym này thuỷ phân mối liên kết peptit giữa hai axit amin ưa béo. Được sử dụng trong quá trình làm lạnh bia và mục đích tiêu hoá.

- Renin: Là protease giống pepsin được sinh ra ở dạng tiền enzym không hoạt động trong ngăn thứ tư của dạ dày bê, và được chuyển thành dạng renin hoạt động do sự hoạt động của pepsin hoặc do quá trình tự xúc tác của chúng. Renin làm biến đổi casein thành paracasein đây là chất kết tủa để hình thành vụn sữa đông trong điều kiện có canxi trong môi trường.

Do đa số nguồn protease động vật phải thu nhận từ nội tạng, không mang lại hiệu quả kinh tế cao nên các nghiên cứu về chúng rất hạn chế so với protease từ thực vật và vi sinh vật.

Protease thực vật

18

Protease thực vật được phát hiện muộn hơn protease động vật (bắt đầu từ cuối thế kỉ 18). Việc sử dụng thực vật làm nguồn protease bị chi phối bởi nhiều yếu tố như thổ nhưỡng, khí hậu. Các protease có trong đu đủ (papain), trong dứa (bromelin), trong các cây sung, si thuộc họ ficus (fixin) là những protease thực vật được biết đến nhiều nhất [2], [8].

- Papain: Là enzym được tách từ nhựa đu đủ, rất bền với nhiệt. Nó chịu được nhiệt độ 700C ở pH 7.0 tới 30 phút, dưới dạng bột nó chịu được 1000C trong 3 giờ. Nhiệt độ tối thích 60 – 700C và pH tối thích thường giữa 5.0 và 7.0.

- Bromelin: Thu được từ thân cây và dịch chiết của cây dứa. Enzym này có tính chất như một cystein proteinase. Enzym này có nhiệt độ tối thích là 50 – 600C, pH tối thích là 5 – 8. Nhiệt độ bất hoạt của enzym này là 700C, thấp hơn so với papain. Bromelin được sử dụng nhiều trong y dược và công nghiệp, được dùng thay cho papain.

- Focin: Thu được từ mủ một loại sung có màu vàng kem đến màu hồng và pH axit (pH = 3- 4).

- Keratinase: Một vài nhóm thực vật sản xuất các protease thuỷ phân được lông và tóc. Sự phân giải lông và tóc có tầm quan trọng trong sản xuất axit amin thiết yếu Lysine và để tránh sự tắc nghẽn của hệ thống nước thải. Nhiều công bố ở trong nước và trên thế giới đã phát hiện được nguồn protease trong hạt, thịt quả, thân của các loại cây khác nhau.

Các enzym protease có mặt ở nhiều loài thực vật và phân bố trong các mô khác nhau. Nhưng cho đến nay, ở Việt Nam các tác giả chỉ tập trung nghiên cứu ở dứa và đu đủ. Vì vậy việc mở rộng phạm vi nghiên cứu trên các loài thực vật khác nhau là rất cần thiết.

Protease vi sinh vật

Protease vi sinh vật được phát hiện từ năm 1918, nhưng được chú ý nghiên cứu nhiều hơn từ năm 1950. Protease vi sinh vật chiếm khoảng 40 % tổng lượng enzym bán trên thế giới [2], [8], [33].

Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endoprotease hoặc exoprotease. Còn vi sinh vật có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của vi sinh vật có tính đặc hiệu khác thường, chúng có thể phân huỷ tới 80 % liên kết peptit có trong phân tử protein. Nó không những phá huỷ hoàn toàn và nhanh chóng các liên kết peptit mà còn

19

có khả năng phá huỷ chậm một số liên kết không đặc trưng khác. Như vậy trong từng trường hợp cụ thể, cần nghiên cứu chọn lọc loài vi sinh vật thích hợp và những điều kiện tối ưu cho hoạt độ của nó.

Các protease vi sinh vật có thể được thu nhận từ vi khuẩn và nấm.

- Vi khuẩn: Hầu hết các protease thương mại, chủ yếu là kiềm tính và trung tính được sản xuất từ vi sinh vật thuộc chi Bacillus như Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, B.licheniformis, B.cereus. Các protease trung tính vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5 - 8) và có khả năng chịu nhiệt độ thấp. Các proteinase kiềm tính của vi khuẩn có khả năng hoạt động ở pH kiềm tính và có tính đặc hiệu rộng, nhiệt độ thích hợp của chúng khoảng 600C.

- Nấm: Nấm tạo ra nhiều loại enzym hơn so với vi khuẩn. Chẳng hạn như Aspergillus oryzae sinh ra các protease trung tính, kiềm tính và axit tính. Các proteinase của nấm hoạt động trong vùng pH khá rộng (pH 4 - 11) và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất cao. Tuy nhiên, chúng có tốc độ phản ứng thấp hơn và mức độ chịu nhiệt kém hơn so với các enzym của vi khuẩn.

Như vậy, các chế phẩm protease được sản xuất từ vi sinh vật rất đa dạng, phong phú về chủng loại và tính chất. Các proteinase của vi khuẩn có tốc độ phản ứng nhanh và độ bền nhiệt lớn.

Protease vi sinh vật được chia làm 3 nhóm: Protease kiềm tính, protease trung tính, protease axit tính.

Protease kiềm tính: Có nhiều loài vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp protease kiềm tính. Quan trọng nhất là các loài thuộc chi Bacillus như Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus firmus...Các loài nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp protease kiềm tính được sử dụng rộng rãi nhất là A . niger, A . oryzae, A . flavus, A . sojae...Protease kiềm tính bền ở nhiệt độ cao và bền trong môi trường kiềm pH = 9 – 11. Protease kiềm tính của B. subtilis thuỷ phân hàng loạt các liên kết peptit. Protein được thuỷ phân ở mức độ nhiều hơn so với protease trung tính.

Protease trung tính: Vi sinh vật sinh tổng hợp nhóm protease này là các loài vi khuẩn B.subtilis, B.cereus, B. megaterium, Pseudomonas aeruginosa, Streptomyces griseus, và nấm mốc A. oryzae, A . Sojae... Protease trung tính thường không ổn định và các ion Ca2+, Na+, Cl- có tác

20

dụng làm tăng tính ổn định của các enzym này. Khoảng pH tối thích thường hẹp, ở điều kiện nhiệt độ 370C hoạt độ protease là 100 % thì ở nhiệt độ 500C, sau 30 phút, hoạt độ enzym giảm xuống còn 80 %. Cũng sau khoảng thời gian đó, ở 600C hoạt độ chỉ còn 20 % và ở 700C thì chỉ sau 10 phút enzym bị vô hoạt hoàn toàn.

Protease trung tính của B . subtilis thuỷ phân mối liên kết peptit vốn được tạo thành từ nhóm cacboxyl của alanin, serin, histidin và nhóm amin của valin, loxin hay phenylalanine.

Protease axit tính:

- Các vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp protease nhóm này là loài Alcaligenes, Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Pseudomonas, Serratia, Streptococcus, Streptomyces. Trong các loài thuộc chi Bacillus phổ biến là B.subtilis, B. polymyxa, B.mensentericus.

- Các loài nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzym làm đông sữa: Aspergillus, Candida, Corilus, Endothia, Enthomophthora, Mucor, Penicillium, Rhizopus, Sclerotium, Torulopsis. Trong số đó chỉ có ba loại được sử dụng rộng rãi để sản xuất enzym là Mucor pusillus varlindt (nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt) và Endothia parasita, Mucor miehei (phương pháp bề sâu).

Protease axit có pH tối thích 4.0 – 5.5

Như vậy, các chế phẩm enzym được sản xuất từ các nguồn khác nhau thì khác nhau về điều kiện hoạt động như pH, nhiệt độ, cơ chất đặc hiệu, đặc hiệu liên kết phân cắt. Vì vậy việc lựa chọn chế phẩm áp dụng trong sản xuất phải được cân nhắc để đạt được mục đích công nghệ đặt ra.

1.2.1.3. Các yếu tố chính ảnh hưởng đến hoạt động của enzym

Ảnh hưởng của nồng độ enzym

Nói chung trong điều kiện thừa cơ chất vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzym [2]

v = k. [E]

Trong đó v: vận tốc phản ứng

[E]: Nồng độ enzym

21

Cũng có trường hợp khi nồng độ enzym quá lớn vận tốc phản ứng tăng chậm

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Ở nồng độ cơ chất thấp, vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ cơ chất.

khi nồng độ cơ chất đã đủ lớn đến một mức nào đó, nếu tiếp tục tăng thì vận tốc phản ứng sẽ không tăng theo.

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Ở các nhiệt độ khác nhau, hoạt độ của enzym cũng khác nhau. Nhiệt độ ứng với hoạt độ enzym cao nhất được gọi là nhiệt độ tối ưu của enzym. Mỗi enzym có giá trị nhiệt độ tối ưu khác nhau. Tuy nhiên nhiệt độ tối ưu của mỗi enzym không cố định mà có thể thay đổi tuỳ cơ chất, pH môi trường, thời gian phản ứng...

Nhiệt độ mà enzym bị mất hoàn toàn hoạt tính gọi là nhiệt độ tới hạn, thường nhiệt độ tới hạn khoảng 700C. Ở nhiệt độ tới hạn enzym bị biến tính, ít có khả năng phục hồi được hoạt độ. Ngược lại, ở nhiệt độ dưới 00C hoạt độ enzym tuy bị giảm nhưng lại có thể tăng lên khi đưa về nhiệt độ bình thường.

22

Ảnh hưởng của pH môi trường

pH môi trường có ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzym vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hoá cơ chất, enzym và ảnh hưởng đến độ bền protein enzym. Đa số enzym bền trong giới hạn pH giữa 5.0 và 9.0

pH tối ưu cho hoạt động của nhiều enzym vào khoảng 7.0. Tuy nhiên cũng có một số enzym có pH tối ưu rất thấp (pepsin, proteinaza axit của vi sinh vật...) hoặc khá cao (substilizin có pH tối ưu > 10). pH tối ưu của một enzym cũng không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như cơ chất, tính chất dung dịch đệm, nhiệt độ...

Ảnh hưởng của chất kìm hãm và chất hoạt hoá

Tính hoạt động của một số enzym protease còn phụ thuộc vào sự có mặt của các ion kim loại và một số hợp chất khác. Một số trong những chất đó có tác dụng làm tăng tính hoạt động của enzym, còn một số khác lại có tác dụng kìm hãm hoạt động của các enzym [8].

Protease của Aspergillus awamori 78 – 2 bị kìm hãm bởi các ion Co2+, Fe2+, Cu2+, Hg2+, Ca2+, Mg2+,Mn2+, Zn2+, Ni2+ và EDTA (etylen diamin tetraaxetic).

Protease I, II,III của Aspergillus oryzae không bị kìm hãm bởi các ion Ba2+, Ca2+, Mn2+, Mg2+, Zn2+, nhưng bị kìm hãm bởi các ion kim loại khác như Cu2+, Co2+,Cd2+,Fe3+. Protease của Bacillus subtilis bị mất hoạt tính bởi hợp chất tạo phức và khi nồng độ ure cao, ngoài ra nó bị kìm hãm bởi EDTA. Conovalov và Dorokhow nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần nước quả đến hoạt độ của enzym protease nhận thấy ion Na+ và Ca2+ là chất hoạt hoá enzym protease. Đường có tác dụng kích thích enzym protease, ngược lại axit có tác dụng ức chế enzym protease. Chất chát có nồng độ 0.02 % có tác dụng kìm hãm sự hoạt động của enzym protease.

1.2.2. Ứng dụng của protease trong thuỷ phân protein

Với nguồn gốc thu nhận phong phú đa dạng, protease được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp: Công nghiệp thực phẩm, Công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược... Trong đó ứng dụng rộng rãi nhất của protease là trong ngành công nghiệp thực phẩm.

23

1.2.2.1. Ứng dụng trong điều chế các dịch đạm thuỷ phân

Hiện nay, sử dụng protease để thu dịch thuỷ phân protein được ứng dụng rất rộng rãi như sản xuất nước giải khát, thức ăn kiêng, xì dầu, điều chế các dịch đạm thuỷ phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm, bổ sung vào thức ăn gia súc...hoặc các sản phẩm thuỷ phân protein thực phẩm chứa các peptit chống tăng huyết áp, làm giảm đau, kích thích miễn dịch, peptit tăng khả năng hấp thụ canxi...Khó khăn gặp phải trong thuỷ phân protein là tạo ra các peptit đắng. Thuỷ phân thái quá protein thường dẫn đến hình thành các sản phẩm thuỷ phân có vị đắng cao. Các serine proteinase của Bacillus subtilis đặc hiệu ở vị trí amino axit thơm hoặc amino axit kỵ nước. Vì vậy, chúng có khả năng làm giảm vị đắng của dịch thuỷ phân.

Nấm men cũng là một nguồn protein đang được nghiên cứu nhiều để tạo sản phẩm thuỷ phân. Do lượng men thải ra từ công nghiệp bia rượu ngày càng tăng mà con người vẫn chưa tận dụng hết được.

Các protease sử dụng trong chế biến dịch đạm thuỷ phân như Neutrase, Flavourzyme, Viscozyme, Protamex, Alcalas.

1.2.2.2. Ứng dụng trong sản xuất nước mắm

Để sản xuất nước mắm ngắn ngày từ cá, người ta phải tiến hành ủ lên men ít nhất từ 6 tháng đến một năm. Nhưng với công nghệ enzym, người ta có thể nghiền sơ bộ cá nguyên liệu đồng thời phối trộn với các chế phẩm protease. Như vậy, thời gian thuỷ phân giảm xuống chỉ còn 30 ngày.

Sử dụng enzym protease (Neutrase) với tỷ lệ 0.025% với cá tươi, 0.035% với cá ướp 10-15% muối và 0.075% với cá mặn 25-30% muối. Đưa enzym vào chế biến chượp cá mặn hầu như không làm tăng giá thành sản phẩm vì hiệu suất sử dụng đạm cao. Đạm thuỷ phân bình quân tăng 10.7%, đạm sử dụng trong sản xuất bình quân tăng 13.8%. Hiệu suất sử dụng đạm tăng 2.6%. Tiêu hao nguyên liệu giảm 12.1%. [21]

1.2.2.3. Ứng dụng trong quá trình sản xuất bia

Việc ứng dụng các chế phẩm proteolitic trong sản xuất bia giúp cho người sản xuất có thể sử dụng hoàn toàn protein đại mạch do các enzym này chuyển protein thành trạng thái hoà tan, ổn định vào dịch đường, cho phép nâng cao giá trị sinh học của bia.

24

Enzym protease sản xuất từ chủng Aspergillus oryzae 938/2 theo phương pháp bề mặt có hoạt lực 145 U/ml có tác dụng tốt đến quá trình lên men của nấm men ở tỷ lệ sử dụng nguyên liệu thay thế 50 %, hàm lượng tổng nitơ hoà tan tăng 16-28 %, nitơ amin tự do tăng 18-26 %. Làm giảm giá thành 100.900 đồng cho 1000 lít bia, mà chất lượng bia vẫn đạt chỉ tiêu hoá lý và cảm quan tương đương mẫu dùng 30 % nguyên liệu thay thế. Việc ứng dụng các chế phẩm enzym protease vào quá trình sản xuất bia có những ưu điểm sau: Tăng tỉ lệ nguyên liệu thay thế (từ 30 % lên 50 %), giảm thời gian lên men chính (1 ngày), giống nấm men kết lắng tốt cho hiệu suất thu hồi tăng 2.5 %, bia thành phẩm đạt các chỉ tiêu hoá lý quy định, nâng cao hiệu quả kinh tế [12].

1.2.2.4. Ứng dụng trong chế biến thịt cá

Trong công nghiệp thịt cá, protease giúp làm mềm thịt nhờ thuỷ phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt mềm và có vị tốt hơn. Protease dùng trong công nghiệp chế biến thịt thường là protease thực vật như: papain, bromelin, fixin... và enzym vi sinh vật từ nấm mốc, xạ khuẩn.

1.2.2.5. Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác

Trong sản xuất bột giặt, enzym chiếm 0.2-2 % khối lượng và chiếm 5-10 % giá thành nguyên liệu. Công dụng của protease là phân huỷ vết bẩn dạng protein trên vải như máu, lòng đỏ trứng, sữa, nước rau, đậu, nước xốt thức ăn... [36]

1.2.3. Một số chế phẩm enzym protease từ vi sinh vật

1.2.3.1. Chế phẩm neutrase 0.8L

Neutrase 0.8L là chế phẩm protease thương mại của hãng Novo Nordisk Đan mạch, được sản xuất nhờ quá trình lên men chìm chủng Bacillus amyloliquefaciens [17].

Neutrase thuộc loại metallo proteinase xúc tác thuỷ phân các liên kết peptit ở bên trong phân tử protein, polypeptit...

Neutrase là một protease trung tính, trong khi hầu hết các chế phẩm thương mại khác đều chứa cả phần proteinase kiềm tính. Dải pH hoạt động 5,5 – 7,5; dải nhiệt độ hoạt động 45 - 550C. Chế phẩm này không chứa amylase, chứa một lượng β-glucanase không xác định. Cần ion kẽm cho hoạt động của nó, ion Ca2+ có tác dụng làm bền enzym, enzym bị ức chế

25

bởi EDTA. Neutrase bị vô hoạt ở 850C trong 2 phút. Sự ổn định của neutrase ở nhiệt độ nhất định phụ thuộc vào loại và nồng độ cơ chất.

Neutrase 0.8L có màu nâu sáng, trạng thái lỏng. Nhiệt độ bảo quản 0–100C, bảo quản trong bao bì khô, kín, tránh ánh sáng mặt trời, vi sinh vật tổng số ≤ 50000 TB/g, coliform ≤30 TB/g. Neutrase 0.8L có hoạt độ là 0.8AU/g (Anson Units per gram). Các thành phần của enzym neutrase dễ dàng hoà tan trong nước.

Vị trí hoạt động của neutrase khi tham gia xúc tác thuỷ phân cơ chất có chứa nhóm hydroxyl Serine195, imidazol của histidin57, và nhóm cacboxyl của Aspartic102.

Hình 1.6. Vị trí xúc tác của neutrase

Cơ chế xúc tác của enzym neutrase

Trung tâm hoạt động của enzym gồm 3 gốc Asp102, His57, Ser195.

Khi cho enzym và cơ chất tiếp xúc với nhau thì tâm ái nhân của enzym sẽ tương tác trực tiếp với nguyên tử tích điện dương của liên kết bị thuỷ phân.

Cụ thể là dưới sự giúp đỡ của gốc Asp102, His57 sẽ cho ra một proton, nguyên tử oxy của nhóm – OH của gốc Ser 195 của enzym nhận thêm một electron.

26

Gốc này sẽ tương tác trực tiếp với nguyên tử C của nhóm CO của liên kết peptit cần phân cắt và tạo phức chất trung gian giữa cơ chất và trung tâm hoạt động của enzym.

Tiếp đến, phức chất này sẽ bị phá huỷ do sự sắp xếp lại các liên kết, khi này một phần của cơ chất được tách ra ngoài, 1 phần còn lại của cơ chất vẫn liên kết với gốc Ser của trung tâm hoạt động của enzym và tạo ra chất mới Acyl-enzym, chất này được hình thành giữa nhóm CO với nguyên tử oxy của nhóm –OH của gốc Ser 195 của enzym.

Dưới sự trợ giúp của Asp102, His57 sẽ cho phân tử nước 1 proton, nguyên tử oxy của nước sẽ tấn công vào Acyl-enzym, để hình thành một phức chất trung gian mới.

27

Phức chất này giải phóng sản phẩm thứ 2, lúc này liên kết giữa C của CO của phần còn lại của cơ chất với nguyên tử oxy của nhóm –OH của gốc Ser195 bị phá vỡ. Enzym giải phóng ra và bắt đầu hành trình mới.

1.2.3.2. Chế phẩm enzym Flavourzyme

Flavourzyme là chế phẩm protease thương mại của hãng Novo Nordisk Đan mạch được sản xuất từ chủng Aspergillus oryzae [17].

Flavourzyme là một hỗn hợp peptidase, vừa có hoạt tính endoprotease, vừa có hoạt tính exoprotease. Có thể thuỷ phân trên 70 % mối liên kết peptit, sản phẩm thuỷ phân của flavourzyme thơm ngon, không có vị đắng khi thuỷ phân ở mức độ vừa phải. Sản phẩm không có các chất độc hại, hàm lượng muối thấp.

Nhiệt độ tối ưu cho hỗn hợp enzym cũng như cho exopeptidase là 500C. Thuỷ phân trong điều kiện axit nhẹ hoặc trong điều kiện trung tính, dải pH hoạt động 5.0 – 7.0; pH tối ưu cho exopeptidase 7.0. Flavourzyme bị vô hoạt ở nhiệt độ 850C trong 5 phút hoặc ở 1200C trong 5 giây.

Flavourzyme 500 MG có màu nâu, có 2 loại:

28

Loại A: Tạo thành hạt trong NaCl

Loại B: Tạo thành hạt trong yến mạch

Các thành phần của Flavourzyme 500MG dễ dàng hoà tan trong nước.

Flavourzyme 500 MG có hoạt độ 500 LAPU/g. 1 LAPU (đơn vị Leucine Aminopeptidase) là lượng enzym thuỷ phân được 1μmol L-leucine-p-nitroanilide trong 1 phút theo phương pháp phân tích của Novo Nordisk AF 298/1 [17].

Chế phẩm dạng bột, màu nâu. Sản phẩm được bảo quản trong điều kiện khô, lạnh, bảo quản ở 50C sản phẩm có thể duy trì được hoạt độ trong ít nhất 3 tháng.

1.3. Các phương pháp thủy phân nấm men

Bản chất của quá trình thuỷ phân protein là sự thuỷ phân liên kết peptit. Do liên kết peptit là liên kết mạnh, thuỷ phân xảy ra trong điều kiện có xúc tác. Tác nhân xúc tác có thể là tác nhân hoá học hoặc tác nhân sinh học.

Các sản phẩm thuỷ phân chưa hoàn toàn thường hay bị đắng. Sản phẩm bị đắng khi mức độ thuỷ phân đạt từ 4 – 40%. Vị đắng liên quan tới các peptit chứa các axit amin kỵ nước. Vị đắng chỉ ảnh hưởng đến tính chất cảm quan, không ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng.

1.3.1. Phương pháp hoá học

1.3.1.1. Thuỷ phân bằng axit

Nguyên tắc: Dùng HCl nồng độ 6 – 10 N, nhiệt độ 100 – 1800C, thời gian thuỷ phân 24 – 72 giờ. Nếu gia tăng áp suất sẽ giảm được thời gian. Sau thuỷ phân, axit trong dịch thuỷ phân được trung hoà bằng NaOH hoặc Na2CO3 [15].

Ưu điểm: Rẻ tiền, nhanh và hiệu suất thuỷ phân cao từ 85 – 90 %, sản phẩm giàu axit amin và dễ bảo quản.

Nhược điểm:

- Do nhiệt độ cao và nồng độ axit đặc, một số axit amin bị phá huỷ trong quá trình thuỷ phân. Tryptophan bị phá huỷ hoàn toàn, các axit amin

29

chứa lưu huỳnh bị mất 10 – 30 %. Các axit amin chứa nhóm – OH bị phân huỷ một phần như Thr, Ser, Met, Cys.

- Chí phí năng lượng và thiết bị cao do phải chịu nhiệt và chống axit ăn mòn, việc sử dụng HCl đặc độc hại và ô nhiễm môi trường.

- Khi nồng độ HCl cao và nhiệt độ cao thường xảy ra phản ứng giữa Cl2 hoặc HCl có trong chất béo tế bào nấm men sinh độc tố monochloropropanol và dichloropropanol là tác nhân gây ung thư.

- Hàm lượng muối cao do quá trình trung hoà bằng NaOH.

Người ta cũng có thể thuỷ phân nấm men bằng axit H2SO4, thuỷ phân bằng axit này thì dịch sau thuỷ phân được trung hoà bằng vôi, kết tủa CaSO4 tạo thành được lọc ra. Dịch lọc sẽ có hàm lượng muối thấp hơn so với thuỷ phân bằng HCl. Tuy nhiên vị của dịch thuỷ phân bằng H2SO4 thường kém hơn dịch thuỷ phân bằng HCl.

1.3.1.2. Thuỷ phân bằng kiềm

Nguyên tắc: Dùng kiềm 4–8 N, nhiệt độ 100 – 1100C, thời gian 24 – 36 giờ [15].

Ưu điểm: Thuỷ phân bằng phương pháp này bảo toàn được tryptophan.

Nhược điểm: Xảy ra hiện tượng racemic hoá nên sản phẩm thuỷ phân là hỗn hợp racemic D, L – amino axit, làm giảm giá trị dinh dưỡng. Ngoài ra, còn xảy ra quá trình oxy hoá một số axit amin khác. Kiềm xúc tác cho phản ứng tạo lysinoalanine làm giảm lysine trong dịch thuỷ phân. Vì vậy, trong sản xuất thực phẩm ít khi dùng phương pháp thuỷ phân bằng kiềm [15].

1.3.2. Phương pháp enzym

1.3.2.1. Phương pháp tự phân nấm men

Nguyên tắc là nấm men được hoà với nước theo tỉ lệ thích hợp, giữ ở nhiệt độ thích hợp cho hệ enzym protease có sẵn trong tế bào nấm men hoạt động phân huỷ các thành phần của tế bào. Dịch thuỷ phân rất giàu axit amin, peptid, vitamin nhóm B và các hydratcacbon.

1.3.2.2. Phương pháp thuỷ phân có bổ sung enzym protease

Nguyên tắc là sử dụng chế phẩm enzym protease thuỷ phân protein của nấm men trong điều kiện thích hợp cho enzym hoạt động để tạo thành các dạng đạm khác nhau.

30

Phương pháp này về bản chất giống phương pháp tự phân, chỉ khác là phương pháp tự phân sử dụng enzym protease có sẵn trong tế bào nấm men, còn phương pháp bổ sung thêm enzym protease thì protein nấm men được kết hợp thuỷ phân từ protease có sẵn trong tế bào nấm men và chế phẩm enzym bổ sung vào với mục đích tăng hiệu suất thuỷ phân.

Phương pháp enzym có ưu điểm là điều kiện thuỷ phân ôn hoà, hoàn toàn không sử dụng hoá chất, không làm biến đổi thành phần axit amin ban đầu nên an toàn cho người sử dụng và giữ được giá trị dinh dưỡng.

Hiệu suất thuỷ phân tối đa của phương pháp chỉ đạt 70 %. Sự thuỷ phân hạn chế do tác dụng của enzym nhất là các endoprotease từ vi khuẩn làm giải phóng ra các peptit kị nước có đính các gốc leucin và phenylalanin nên sản phẩm thuỷ phân từ protease thường có vị đắng. Tuy nhiên việc loại bỏ vị đắng hoàn toàn có thể giải quyết được khi sử dụng phản ứng plastin [30] hoặc serine proteinase của Bacillus subtilis vì protease này đặc hiệu ở vị trí axit amin thơm hoặc axit amin kỵ nước. Vì vậy chúng có khả năng làm giảm vị đắng của dịch thuỷ phân.

Trong thời điểm hiện nay khi mà báo chí trong và ngoài nước đề cập rất nhiều đến một số chất độc trong thực phẩm trong đó có monochloropropanol và dichloropropanol, monochloropropanediol... là những chất gây ung thư, rất độc hại cho con người hình thành từ quá trình thuỷ phân protein bằng phương pháp axit đặc thì việc sản xuất ra sản phẩm thuỷ phân protein an toàn và giàu giá trị dinh dưỡng bằng phương pháp enzym, và dễ tiêu hoá không chứa D-aminoacid như thuỷ phân protein bằng kiềm là rất cần thiết.

1.3.3. Phương pháp thuỷ phân enzym kết hợp với axit:

Có thể thực hiện thuỷ phân bằng axit trước rồi sau đó mới thuỷ phân bằng enzym hoặc thuỷ phân trước bằng enzym rồi mới thuỷ phân bằng axit. Việc kết hợp sử dụng enzym protease và axit xúc tác quá trình thuỷ phân có ưu điểm là giảm thiểu hoá chất độc hại, giảm thiểu ô nhiễm môi trường, rút ngắn thời gian sảnxuất, nhưng vẫn có khả năng sinh ra độc tố.

31

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật liệu

2.1.1. Nấm men

Nấm men bia sử dụng thuộc chủng men nổi Saccharomyces cerevisiae, là thứ phẩm của nhà máy bia henninger, có màu trắng sữa, mịn, được bảo quản ở 40C dùng dần.

2.1.2. Các chế phẩm enzym

Chế phẩm enzym netrase 0.8L

Neutrase 0.8L là chế phẩm protease thương mại của hãng Novo Nordisk Đan Mạch, được sản xuất từ chủng Bacillus amyloliquefaciens, có dạng lỏng, màu nâu. Dải nhiệt độ hoạt động 45-550C, dải pH hoạt động 5,5-7,5. Chế phẩm được bảo quản trong tủ lạnh ở 40C.

Chế phẩm enzym flavourzyme 500MG

Flavourzyme là chế phẩm protease thương mại của hãng Novo Nordisk Đan Mạch, được sản xuất từ chủng Aspergillus oryzae. Flavourzyme vừa có hoạt tính endoprotease, vừa có hoạt tính exoprotease. Nhiệt độ tối ưu 50 – 550C, dải pH hoạt động 5,0 – 7,0. Chế phẩm dạng bột, màu nâu, được bảo quản trong tủ lạnh ở 40C.

Chế phẩm cereflo 1500L

Cereflo là chế phẩm endo-Glucanase thương mại của hãng Novo Nordisk Đan Mạch, được sản xuất từ Bacillus amyloliquefaciens bằng lên men chìm, enzym này phân giải β-glucan (các cầu nối 1,3(4) β-glucozit) của thành tế bào nấm men. Cereflo có dạng lỏng, màu nâu, tỷ trọng 1.25g/ml, hoạt độ 1500 BGU/g. Ngoài hoạt tính β-glucanase, cereflo còn có hoạt tính α-amylase.

Các thành phần enzym hoạt tính của cereflo đều dễ dàng hoà tan trong nước. Ổn định trong NaCl, sacarose/glucose. Lượng vi sinh vật tổng số trong chế phẩm <50000 TB/g, coliform < 30 TB/g. Chế phẩm được bảo quản trong tủ lạnh ở 40C.

2.1.3. Các loại hoá chất sử dụng trong đề tài

32

- Dung dịch ninhydrin 2% - Rượu n-butilic

- Dung dịch pyridine 20% - Axit axetic

- TCA 1.5M - Axeton

- Cazein - Bản mỏng silicagen

- Đệm phot phat pH = 7 - Nước cất

- Một số axit amin chuẩn (leucin, lysin, axit glutamic, methionin)

2.1.4. Thiết bị sử dụng

- Bình ổn nhiệt - Lò vi sóng

- Cân phân tích - Nồi thanh trùng

- Tủ sấy - Micropipet

- Máy đo OD - Tủ ấm

- Máy khuấy từ - Máy đo pH

- Máy ly tâm lạnh - Buồng sắc ký

- Máy ly tâm thường tốc độ 6000 vòng/phút

2.2. Các phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp xác định hoạt độ enzym protease

Cơ sở của phương pháp: Phương pháp dựa trên cơ sở thuỷ phân cazein bằng enzym nghiên cứu, tiếp đó làm vô hoạt enzym và kết tủa protein chưa bị thuỷ phân bằng TCA. Định lượng sản phẩm tạo thành bằng cách đo độ hấp thụ của axit amin có trong dung dịch thuỷ phân tại bước sóng 275 nm. Dựa vào đồ thị chuẩn tyrozin để tính lượng sản phẩm tương ứng do enzym xúc tác tạo ra.

Một đơn vị hoạt độ protease là lượng enzym làm giải phóng ra 1mg tyrozin trong thời gian 5 phút ở 500C.

Tiến hành

- Chuẩn bị dung dịch cazein 2%, pH = 7: Cân chính xác 1g cazein cho vào cốc thuỷ tinh sạch. Thêm 40 ml dung dịch đệm photphat pH = 7, rồi để cốc trong tủ lạnh 40C ngâm qua đêm để cazein trương nở. Đậy kín bằng giấy bạc để tránh nhiễm khuẩn. Lấy cốc ra, bổ sung vào đó 5 ml dung dịch NaOH 0.1N rồi bổ sung thêm dung dịch đệm để đạt pH = 7. Cốc phải được

33

đặt trên máy khuấy từ để cazein được hoà tan hoàn toàn. Định mức đến 50 ml bằng dung dịch đệm. Như vậy ta sẽ thu được dung dịch cazein 2% pH = 7.

- Chuẩn bị dung dịch enzym:

+ Đối với chế phẩm enzym flavourzyme 500MG: Cân 0.1g enzym, cho vào cốc thuỷ tinh sạch rồi bổ sung 49.9 ml dung dịch đệm photphat pH = 7, cho lên máy khuấy từ khuấy đều. Được dung dịch enzym flavourzyme 0.2% (w/v).

+ Đối với chế phẩm enzym neutrase 0.8L: Tiến hành pha loãng 500 lần bằng dung dịch đệm photphat pH = 7.

- Thực hiện phản ứng enzym: Lấy vào ống falcon 50 ml những thành phần sau: 3.5 ml dung dịch đệm photphat (pH = 7) + 0.5 ml dung dịch cazein 2% (pH = 7) + 0.5 ml dung dịch enzym vừa chuẩn bị ở trên. Tiến hành ủ trong bình ổn nhiệt ở 500C trong 5 phút, sau đó bổ sung 0.5 ml TCA 1.5 M. Giữ trong 30 phút ở 40C để đình chỉ hoạt động của enzym. Sau đó mang đi ly tâm lạnh ở 40C trong 15 phút với vận tốc 10000 vòng phút. Ta sẽ thu được dịch trong đem so màu ở bước sóng bằng 275 nm sử dụng cuvet thạch anh.

Với mẫu kiểm chứng ta cũng làm tương tự như trên nhưng không để phản ứng 5 phút trong bình ổn nhiệt mà bổ sung TCA vào ngay.

Từ giá trị OD thu được ta tiến hành tính hoạt độ enzym.

- Thiết lập công thức tính hoạt độ protease:

Dựa vào phương trình đường chuẩn tyrozin y = 0.1242x – 0.0001

R2 = 0.9

x là giá trị OD đo được tại bước sóng λ = 275 nm

y là nồng độ tyrozin tính theo mg/ml

+ Đối với chế phẩm enzym Flavourzyme:

Hoạt độ Flavourzyme HdPF = = 5000×y (U/g)

5: Số ml dịch phản ứng trong ống nghiệm (3.5 ml dung dịch đệm + 0.5 ml dung dịch cazein 2% + 0.5 ml dung dịch enzym + 0.5 ml dung dịch TCA).

34

50: Số ml dịch enzym sau khi pha loãng

0.5: Số ml dịch enzym tham gia phản ứng

0.1: Số g enzym đem đi pha

+ Đối với chế phẩm enzym neutrase

Hoạt độ enzym neutrase HdPN = = 5000×y (U/ml)

5: Số ml dịch phản ứng trong ống nghiệm (3.5 ml dung dịch đệm + 0.5 ml dung dịch cazein 2% + 0.5 ml dung dịch enzym + 0.5 ml dung dịch TCA).

500: Số lần pha loãng của dung dịch enzym

0.5: Số ml dịch enzym tham gia phản ứng

2.2.2. Phương pháp rửa nấm men

- Tiến hành: Để chuẩn bị nấm men cho các thí nghiệm, đã tiến hành rửa bằng nước cất ở 40C 3 - 4 lần, ly tâm 6000 vòng/phút. Sau đó đem lọc bằng hệ thống lọc hút chân không. Men thu được sẽ dùng cho tất cả các thí nghiệm tiếp theo.

2.2.3. Phương pháp xác định độ ẩm

- Nguyên tắc: Để xác định độ ẩm nấm men lọc chân không ta tiến hành theo phương pháp sấy đến khối lượng không đổi [7].

- Tiến hành: Cân m0 g nấm men lọc chân không, sấy ở 1050C tới khi khối lượng men không đổi ta được m1 g.

- Độ ẩm của nấm men lọc chân không được tính như sau:

W = %

2.2.4. Nghiên cứu thuỷ phân nấm men

2.2.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzym protease

Đối với chế phẩm enzym flavourzyme 500MG

Chuẩn bị 6 bình tam giác sạch khô. Cho vào mỗi bình 10 g nấm men + 20 ml nước cất có nhiệt độ 550C. Sau đó bổ sung enzym, bình 1 là bình tự phân (không bổ sung enzym), bình 2 bố sung 0.1 % enzym (0.01 g enzym), bình 3 bổ sung 0.4 % enzym (0.04 g enzym), bình 4 bổ sung 0.7 % enzym

35

(0.07 g enzym), bình 5 bổ sung 1 % enzym (0.1g enzym), bình 6 bổ sung 2 % enzym (0.2 g enzym). Các bình được ủ ở 550C trong bình ổn nhiệt. Cứ 8 giờ lại lẫy mẫu 1 lần, xác định hàm lượng axit amin tạo thành (quy ra g/100g men KTĐ) theo phương pháp ninhydrin.

Đối với chế phẩm enzym neutrase 0.8L

Chuẩn bị 4 bình tam giác sạch khô. Cho vào mỗi bình 10 g nấm men + 20 ml nước cất có nhiệt độ 500C. Sau đó bổ sung enzym, bình 1 là bình tự phân (không bổ sung enzym), bình 2 bố sung 0.1 % enzym (0.01 ml enzym), bình 3 bổ sung 0.2% enzym (0.02 ml enzym), bình 4 bổ sung 0.3 % enzym (0.03 ml enzym). Các bình được ủ ở 500C trong bình ổn nhiệt. Cứ 4 giờ lại lấy mẫu 1 lần, xác định hàm lượng axit amin tạo thành (quy ra g/100g men KTĐ) theo phương pháp ninhydrin.

2.2.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ thuỷ phân

Đối với chế phẩm enzym Flavourzyme 500MG

Chuẩn bị 4 bình tam giác sạch khô. Mỗi bình lấy 10 g nấm men + 20 ml nước cất + 0.1 g enzym. Bình 1 ủ ở 450C, bình 2 ủ ở 500C, bình 3 ủ ở 550C, bình 4 ủ ở 600C. Cứ 4 giờ lại lấy mẫu 1 lần, xác định hàm lượng axit amin tạo thành (quy ra g/100 g men KTĐ) theo phương pháp ninhydrin.

Đối với chế phẩm enzym neutrase 0.8L

Chuẩn bị 3 bình tam giác sạch khô. Mỗi bình lấy 10 g nấm men + 20 ml nước cất + 0.03 ml enzym. Bình 1 ủ ở 450C, bình 2 ủ ở 500C, bình 3 ủ ở 550C. Cứ 4 giờ lại lấy mẫu 1 lần, xác định hàm lượng axit amin tạo thành (quy ra g/100g men KTĐ) theo phương pháp ninhydrin.

2.2.4.3. Nghiên cứu xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo

Chuẩn bị 5 bình tam giác sạch khô. Mỗi bình lấy 10 g nấm men + 20 ml nước cất. Đánh số thứ tự các bình theo thứ tự 1, 2, 3, 4, 5. Các bình 3, bình 4, bình 5 được chỉnh về pH 7.5, sau đó bổ sung enzym:

- Bình 3: Bổ sung 0.1 % chế phẩm cereflo (bổ sung 0.01 ml chế phẩm cereflo)

- Bình 4: Bổ sung 0.2 % chế phẩm cereflo (bổ sung 0.02 ml chế phẩm cereflo)

- Bình 5: Bổ sung 0.4 % chế phẩm cereflo (bổ sung 0.04 ml chế phẩm cereflo)

36

3 bình (bình 3, bình 4, bình 5) được ủ trong bình ổn nhiệt ở 300C trong 30 phút [2]. Sau đó chỉnh về pH ban đầu (lúc chưa điều chỉnh pH).

Tiếp theo, tiến hành bổ sung chế phẩm enzym neutrase 0.8L vào các bình như sau:

- Bình 1: không bổ sung neutrase.

- Bình 2, bình 3, bình 4, bình 5 bổ sung 0.1 % neutrase 0.8L (bổ sung 0.01 ml chế phẩm neutrase 0.8L).

Các bình được ủ ở nhiệt độ 500C. Cứ 8 giờ lại lấy mẫu 1 lần, xác định hàm lượng axit amin tạo thành (quy ra g/100g men KTĐ) theo phương pháp ninhydrin.

2.2.4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năng thuỷ phân protein nấm men của enzym

Chuẩn bị 3 bình tam giác sạch khô. Mỗi bình lấy 10 g nấm men + 20 ml nước cất.

- Bình 1: Ủ trong bình ổn nhiệt ở 800C trong 15 phút. Sau đó, lấy ra làm nguội đến 500C. Bổ sung 0.1 % chế phẩm neutrase 0.8L (bổ sung 0.01 ml chế phẩm).

- Bình 2: Không bổ sung enzym

- Bình 3: Bổ sung 0.1 % chế phẩm neutrase 0.8L (bổ sung 0.01 ml chế phẩm)

Các bình được ủ ở 500C trong bình ổn nhiệt. Cứ 8 giờ lại lấy mẫu 1 lần, xác định hàm lượng axit amin tạo thành (quy ra g/100 g men KTĐ) theo phương pháp ninhydrin.

2.2.5. Phương pháp ninhydrin xác định hàm lượng axit amin

- Nguyên tắc: Khi đun nóng ở nhiệt độ cao, axit amin phản ứng với thuốc thử ninhydrin tạo thành 1 phức có màu tím xanh. Dựa vào cường độ màu của phức này khi đo OD ở bước sóng 570nm có thể định lượng được axit amin thông qua xây dựng 1 đường chuẩn [7].

- Tiến hành:

+ Chuẩn bị dịch trong: Dung dịch cần lấy mẫu trước khi lấy mẫu phải lắc đều, sau đó lấy ra 2 g, thêm vào 20 ml nước cất. Đem ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút. Phần dịch trong để lấy mẫu phản ứng.

37

+ Thực hiện phản ứng ninhydrin: Lấy 1 ml dịch trong thu được ở trên + 1 ml dung dịch ninhydrin 2 % + 1 ml dung dịch pyridine 20 %, lắc đều. Tiến hành ủ trong bình ổn nhiệt ở 750C trong 10 phút. Sau đó, lấy ra làm lạnh trong 20 phút để ổn định màu và dừng phản ứng. Pyridine có vai trò là chất ổn định màu.

Song song với mẫu thí nghiệm ta cũng làm 1 mẫu kiểm chứng tương tự như trên, chỉ khác là thay 1 ml dung dịch cần phân tích bằng 1 ml nước cất.

+ Tiến hành pha loãng: Các mẫu phản ứng sau khi làm lạnh đem đổ vào bình định mức 100 ml, dùng nước cất định mức đến vạch, lắc đều.

+ Tiến hành đo quang: Đo quang ở bước sóng 570 nm. Từ giá trị OD thu được ta tính lượng axit amin tạo ra từ 100 g men KTĐ.

+ Thiết lập công thức tính hàm lượng axit amin:

38

y = 5.97x + 0.3178R2 = 0.9959

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

axit amin, g/100ml

OD

, 570

nm

Hình 2.1. Đường chuẩn glutamic

Dựa vào phương trình đường chuẩn glutamic: y = 5.97x + 0.3178

R2 = 0.9959

y là giá trị OD đo được tại bước sóng λ = 570 nm.

x là nồng độ axit glutamic tính theo g/100ml

39

→ Hàm lượng axit amin (tính theo axit glutamic) quy ra g/100g men KTĐ là:

C = = (g/100g men KTĐ)

22: Thể tích dịch thuỷ phân lấy ra đã pha loãng (2 g dịch thuỷ phân + 20 ml nước cất)

2: Số g dịch thuỷ phân lấy mẫu

100: Số ml dịch trong chứa x g axit amin

30: Khối lượng dịch thuỷ phân chuẩn bị lúc đầu (10 g men lọc chân không + 20 g nước cất bổ sung)

10: Số g men lọc chân không đem đi phản ứng thuỷ phân

w: Độ ẩm của men lọc chân không

2.2.6. Phương pháp sắc ký bản mỏng

Nguyên tắc: Khi dung môi pha động di chuyển qua pha tĩnh (bản mỏng) có chấm 1 giọt dung dịch chứa hỗn hợp các chất cần phần tích. Do tác dụng của lực mao quản, dung môi thấm theo lớp mỏng, các cấu tử trong hỗn hợp dịch chuyển trên bản mỏng theo hướng pha động với những tốc độ khác nhau, do có hệ số phân bố khác nhau. Kết quả ta thu được sắc ký đồ trên lớp mỏng với mỗi cấu tử trong hỗn hợp được phân chia thành 1 vùng riêng. So sánh với chất chuẩn ta định tính được các cấu tử trong hỗn hợp.

Tiến hành: Hệ dung môi sử dụng là rượu n-butilic:axit axetic:nước theo tỉ lệ 3:1:1. Dung dịch axit amin (mẫu phân tích và axit amin chuẩn) được pha loãng sao cho trong 5µl dung dịch chứa 50µg axit amin. Thời gian chạy sắc ký 3 giờ. Sử dụng thuốc hiện màu ninhydrin 0.1% pha trong cồn 990.

40

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Xác định độ ẩm của nấm men lọc chân không

Để xác định độ ẩm của nấm men lọc chân không, ta tiến hành theo phương pháp sấy đến khối lượng không đổi [7].

Khối lượng nấm men lọc chân không đem đi sấy là m0 (g). Lượng nấm men này được sấy ở 1050C đến khối lượng không đổi là m1(g).

Bảng 3.1. Kết quả đo độ ẩm

m0 (g) m1 (g) W (%)

19.13 3.988 79.15

19.5 3.958 79.70

20.0 4.130 79.35

Độ ẩm của nấm men lọc chân không là W = =

79.4%

Vậy độ ẩm của nấm men lọc chân không là 79.4%

3.2. Xác định hoạt độ enzym protease

3.2.1. Xác định hoạt độ enzym protease trong chế phẩm Flavourzyme 500MG

Để xác định hoạt độ enzym protease trong chế phẩm Flavourzyme 500MG, ta tiến hành pha dung dịch enzym Flavourzyme 0.2% (w/v). Thực hiện phản ứng enzym và đo quang ở bước sóng 275nm (xem mục 2.2.1). Giá trị OD đo được là 0.267 A.

Hoạt độ enzym protease trong chế phẩm Flavourzyme 500MG là 165.31U/g (công thức tính mục 2.2.1).

41

3.2.2. Xác định hoạt độ enzym protease trong chế phẩm neutrase 0.8L

Để xác định hoạt độ enzym protease trong chế phẩm neutrase 0.8L, tiến hành pha loãng chế phẩm enzym 500 lần. Sau đó, thực hiện phản ứng enzym và đo quang ở bước sóng 275nm (xem mục 2.2.1). Giá trị OD đo được là 0.744 A.

Hoạt độ protease trong chế phẩm enzym neutrase 0.8L là 461.52 U/ml (công thức tính mục 2.2.1).

3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm flavourzyme 500MG

3.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ flavourzyme

Tỉ lệ chế phẩm enzym bổ sung vào có ảnh hưởng lớn đến khả năng thuỷ phân protein nấm men. Để xác định tỉ lệ enzym cơ chất thích hợp, ta tiến hành làm 6 mẫu thí nghiệm với tỉ lệ enzym bổ sung khác nhau:

Mẫu 1: Không bổ sung enzym

Mẫu 2: Bổ sung 0.1% enzym (0.01g enzym/10 g nấm men)

Mẫu 3: Bổ sung 0.4% enzym (0.04 g enzym/10 g nấm men)

Mẫu 4: Bổ sung 0.7% enzym (0.07g enzym/10 g nấm men)

Mẫu 5: Bổ sung 1% enzym (0.1 g enzym/10 g nấm men)

Mẫu 6: Bổ sung 2% enzym (0.2 g enzym/10 g nấm men)

Sản phẩm cuối cùng thu được trong phản ứng thuỷ phân protein là các axit amin. Vì vậy trong quá trình nghiên cứu, khả năng thuỷ phân protein nấm men của enzym được xác định qua lượng axit amin tạo thành.

Quá trình thuỷ phân xảy ra trong điều kiện nhiệt độ 550C. Sau 8 giờ lại tiến hành lấy mẫu 1 lần. Hàm lượng axit amin được xác định theo phương pháp ninhydrin (xem mục 2.2.5) và được chuyển ra g/100g men KTĐ. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2 (xem phụ lục) và trên hình 3.1.

Kết quả thu được cho thấy:

Khả năng thuỷ phân protein nấm men tăng lên khi tăng nồng độ enzym bổ sung. Axit amin thu được nhiều nhất ở mẫu bổ sung 2% chế phẩm enzym. Sau 16 giờ thuỷ phân, lượng axit amin thu được ở mẫu không bổ sung enzym là 33.4g, mẫu bổ sung 0.1% enzym là 38.25g, mẫu bổ sung 0.4% enzym là 47.43g, mẫu bổ sung 0.7% enzym là 49.05g, mẫu bổ sung

42

1% enzym là 59.47g, mẫu bổ sung 2% enzym là 62g. Điều này cũng đúng với quy luật ảnh hưởng của các yếu tố đến vận tốc enzym. Khi vận tốc phản ứng lớn hơn nhiều lần so với vận tốc enzym thì tốc độ của phản ứng thuỷ phân phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzym. Có nghĩa là nồng độ enzym càng tăng thì hiệu suất thuỷ phân càng cao.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44

hàm

lượn

g ax

it am

in, g

/100

g m

en K

TĐ

Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ flavourzyme đến khả năng thuỷ phân protein nấm men

Nồng độ enzym 0.1% cho lượng axit amin tạo thành thấp nhất, tức hiệu suất thuỷ phân bé nhất (38.25g) nhưng vẫn tăng 14.5% so với mẫu đối chứng không bổ sung enzym (33.4 g) sau 16 giờ thuỷ phân.

43

Nồng độ enzym cao nhất 2% cho lượng axit amin nhiều nhất (62 g) sau 16 giờ thuỷ phân. Nhưng mức tăng là không đáng kể so với mẫu bổ sung 1% enzym (59.47g), tức chỉ tăng 4.25% (so với mẫu bổ sung 1% enzym), trong khi lượng enzym phải dùng cao hơn gấp đôi. Sử dụng enzym ở nồng độ này là không có lợi về mặt kinh tế. vì vậy, ta chọn tỉ lệ chế phẩm flavourzyme bổ sung là 1% cho các thí nghiệm tiếp theo.

Ở mẫu bổ sung 1% enzym hiệu suất thuỷ phân tăng 78% so với mẫu không bổ sung enzym sau 16 giờ thuỷ phân.

3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thuỷ phân

Trong quá trình thuỷ phân nhiệt độ đóng vai trò rất quan trọng đối với hoạt động của enzym. Mỗi enzym có nguồn gốc khác nhau thường hoạt động mạnh nhất ở 1 khoảng nhiệt độ nhất định. Khi tạo môi trường phản ứng có nhiệt độ tối ưu cho enzym thuỷ phân sẽ thu được hàm lượng axit amin tối đa và rút ngắn được thời gian thuỷ phân cần thiết để đạt được hàm lượng axit amin này.

Để theo dõi ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm flavourzyme, em tiến hành thuỷ phân 4 mẫu với cùng tỉ lệ enzym là 1% (0.1g enzym/10g nấm men) ở các mức nhiệt độ 450C, 500C, 550C, 600C.

Sau 4 giờ lại tiến hành lấy mẫu 1 lần, xác định hàm lượng axit amin tạo thành (quy ra g/100 men KTĐ) theo phương pháp ninhydrin (xem mục 2.2.5). Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 (xem phụ lục) và trên hình 3.2

44

0

10

20

30

40

50

60

70

0 4 8 12 16 20 24 28 32

Hàm

lượn

g ax

it am

in, g

/100

g m

en K

TĐ

Hình 3.2. Ảnh hưỏng của nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm Flavourzyme

Kết quả thu được cho thấy nhiệt độ ảnh hưởng rõ rệt đến vận tốc, thời gian thuỷ phân.

Hiệu suất thuỷ phân cao nhất ở 550C sau 16 giờ thuỷ phân (đạt 59.47g), lượng axit amin thu được tăng 89 % so với mẫu thuỷ phân ở 450C (đạt 31.46g), tăng 34 % so với mẫu thuỷ phân ở 500C (đạt 44.22g), tăng 151 % so với mẫu thuỷ phân ở 600C (đạt 23.69 g).

45

Nhiệt độ thuỷ phân tốt nhất là 550C, giảm lần lượt theo thứ tự 500C, 450C, 600C. Điều này có thể giải thích như sau: Nhiệt độ cao hơn 550C (600C), hiệu suất thuỷ phân giảm do enzim mất hoạt tính vì bị biến tính. Nhiệt độ cao làm duỗi chuỗi protein enzim, cấu trúc bậc 2, bậc 3 của enzim bị phá vỡ, không còn cấu trúc không gian cần thiết cho enzym hoạt động bình thường. Ở nhiệt độ thấp hơn 550C (450C, 500C), enzim không được cung cấp đủ năng lượng hoạt hoá cần thiết nên hoạt động kém hiệu quả. Do vậy, nhiệt độ thích hợp cho enzym flavourzyme hoạt động là 550C. Vì ở 600C enzim bắt đầu bị biến tính nên trong sản xuất cần phải điều chỉnh nhiệt độ thuỷ phân trong khoảng 500C – 550C.

Tốc độ thuỷ phân diễn ra nhanh nhất trong 16 giờ đầu tiên. Sau đó, axit amin vẫn tiếp tục tăng ở các mẫu thuỷ phân tại nhiệt độ 450C, 500C, 600C. Riêng mẫu đặt ở 550C axit amin hầu như không tăng nữa. Như vậy, ở nhiệt độ thuỷ phân thích hợp 550C thời gian thuỷ phân được rút ngắn.

Với nhiệt độ được chọn 550C, sau 16 giờ thuỷ phân axit amin đạt được là 59.47 g, trong khi axit amin chỉ đạt 63.88 g sau 32 giờ thuỷ phân (tăng 7.4% so với thời gian thuỷ phân 16 giờ). Nếu tiếp tục tăng thêm thời gian thuỷ phân thì sản phẩm thuỷ phân rất dễ bị nhiễm và không đạt hiệu quả kinh tế. Vì vậy, ta chọn nhiệt độ thuỷ phân 550C, thời gian thuỷ phân thích hợp là 16 giờ.

3.4. Nghiên cứu xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo

Glucan là thành phần chính cấu tạo nên vỏ tế bào, nếu thành phần này bị phá hỏng thì tế bào bị phá vỡ hoàn toàn. Thành tế bào bị phá vỡ sẽ giải phóng protein bên trong tế bào, tạo điều kiện cho enzym protease bên ngoài tiếp xúc và phân cắt protein nấm men, góp phần làm tăng hiệu suất thuỷ phân protein. Với mục đích đó, ở thí nghiệm này em tiến hành bổ sung chế phẩm cereflo 1500L (xem 2.1.2).

Để theo dõi ảnh hưởng của xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo đến khả năng thuỷ phân protein nấm men, em tiến hành phản ứng thuỷ phân 5 mẫu (Các bước tiến hành xem mục 2.2.4.3).

- Mẫu 1: Không bổ sung enzym

- Mẫu 2: Bổ sung 0.1% neutrase 0.8L

- Mẫu 3: Bổ sung 0.1% cereflo và 0.1% neutrase 0.8L

- Mẫu 4: Bổ sung 0.2% cereflo và 0.1% neutrase 0.8L

46

- Mẫu 5: Bổ sung 0.4% cereflo và 0.1% neutrase 0.8L

Các mẫu được ủ trong cùng điều kiện nhiệt độ 500C. Sau 8 giờ lại lấy mẫu 1 lần, xác định hàm lượng axit amin tạo thành (tính theo g/100g men KTĐ) theo phương pháp ninhydrin (xem 2.2.5). Kết quả được trình bày ở bảng 3.4 (xem phụ lục) và hình 3.3.

0

10

20

30

40

50

60

0 8 16 24 32 40

Hàm

lượ

ng a

xit a

min

, g/1

00g

men

KTĐ

Tự phân 0.1% neutrase 0.1% cereflo + 0.1% neutrase

0.2% cereflo + 0.1% neutrase 0.4% cereflo + 0.1% neutrase

Hình 3.3. Ảnh hưởng của xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo đến khả năng thuỷ phân protein nấm men

47

Kết quả thu được cho thấy, hàm lượng axit amin tạo thành ở các mẫu có bổ sung enzym cereflo gần như nhau và nhiều hơn không đáng kể so với mẫu đối chứng chỉ bổ sung 0.1% enzym neutrase. Cụ thể là, ở mẫu có bổ sung enzym cereflo với liều lượng cao nhất là 0.4% thì lượng axit amin tạo thành (đạt 48.22 g) cũng chỉ tăng 5.7% so với mẫu đối chứng bổ sung 0.1% neutrase (đạt 45.6 g) sau 16 giờ thuỷ phân. Vì vậy, sử dụng enzym cereflo trong trường hợp này không đem lại hiệu quả. Điều này có thể giải thích rằng ta chưa tạo được điều kiện thích hợp cho β- glucanase hoạt động thuỷ phân thành tế bào nấm men.

Trong tương lai cần nghiên cứu điều kiện tối ưu (nhiệt độ, pH, thời gian...) cho enzym β-glucanase (cereflo) công phá thành tế bào nấm men.

3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năng thuỷ phân protein nấm men

Để theo dõi ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năng thuỷ phân protein nấm men, em tiến hành thuỷ phân 3 mẫu:

- Mẫu 1: Ủ trong bình ổn nhiệt ở 800C trong 15 phút. Sau đó làm nguội đến 500C, bổ sung 0.1% chế phẩm enzym neutrase 0.8L (0.01ml enzym/10g nấm men).

- Mẫu 2: Tự phân (không bổ sung enzym)

- Mẫu 3: Bổ sung 0.1% chế phẩm enzym neutrase 0.8L (0.01ml enzym/10g nấm men).

Các bình được ủ ở nhiệt độ 500C. Cứ 8 giờ lại lấy mẫu 1 lần, xác định hàm lượng axit amin tạo thành (tính theo g/100g men KTĐ) theo phương pháp ninhydrin (xem 2.2.5).

Kết quả phân tích được trình bày trên hình 3.4 và bảng 3.5 (xem phụ lục).

48

0

10

20

30

40

50

60

0 8 16 24 32 40

Hàm

lượ

ng a

xit a

min

, g/1

00g

men

KTĐ

xử lý nhiệt, 0.1% neutrase Tự phân 0.1% neutrase

Hình 3.4. Ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năng thuỷ phân protein nấm men

Kết quả thu được cho thấy:Mẫu 3 cho hiệu quả thuỷ phân cao nhất. Cụ thể là, sau 16 giờ thuỷ

phân lượng axit amin thu được ở mẫu 3 (đạt 45.6 g) gấp 1.29 lần mẫu 2 (đạt 35.37 g), gấp 15.3 lần mẫu 1 (đạt 2.98 g). Điều này có thể giải thích như sau: Xử lý nhiệt tế bào mẫu 1 ở 800C trong 15 phút làm vô hoạt hoàn

49

toàn hệ enzym có sẵn trong tế bào nấm men, trong đó có enzym protease. Axit amin tạo thành ở mẫu 1 chỉ do hoạt động thuỷ phân của enzym trong chế phẩm neutrase bổ sung vào. Ở mẫu 2, axit amin thu được là kết quả của quá trình tự phân huỷ tế bào nhờ hệ enzym có sẵn trong tế bào nấm men. Trong khi đó, axit amin tạo thành ở mẫu 3 nhiều hơn cả là do hoạt động thuỷ phân của hệ enzym có sẵn trong tế bào nấm men có sự hỗ trợ của enzym neutrase bổ sung vào.

Axit amin tạo thành ở mẫu 1 thấp hơn hẳn mẫu 2 chứng tỏ hệ enzym có sẵn trong tế bào nấm men có vai trò rất lớn trong việc phá vỡ tế bào tạo sản phẩm thuỷ phân protein nấm men. Hay nói cách khác, khả năng công phá thành tế bào nấm men và tạo sản phẩm thuỷ phân của riêng enzym neutrase yếu hơn nhiều so với hệ enzym có sẵn trong tế bào nấm men.

Lượng axit amin tạo thành ở mẫu 3 cao hơn hẳn tổng lượng axit amin tạo thành ở mẫu 1 và mẫu 2. Điều này có thể giải thích rằng các enzym không hoạt động độc lập mà có sự phối hợp hoạt động giữa enzym có sẵn trong tế bào nấm men và enzym bổ sung vào. Chọn phương pháp bổ sung thêm enzym protease để tăng hiệu quả thuỷ phân protein nấm men là rất cần thiết.3.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm neutrase 0.8L3.6.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ thuỷ phân

Cũng như đối với tất cả các enzym khác, nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng rất mạnh đến độ hoạt động của enzym. Mỗi loại enzym có một vùng nhiệt độ hoạt động riêng.

Để theo dõi ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm neutrase 0.8L, em tiến hành thuỷ phân 3 mẫu với cùng tỉ lệ enzym là 0.3% (nấm men (g)/nước cất (ml)/enzym (ml) = 10/20/0.03), nhưng nhiệt độ thuỷ phân khác nhau:

Mẫu 1 ủ ở 450CMẫu 2 ủ ở 500C

Mẫu 3 ủ ở 550C

Sau 4 giờ lại tiến hành lấy mẫu 1 lần, xác định hàm lượng axit amin tạo thành (quy ra g/100g men KTĐ) theo phương pháp ninhydrin (mục 2.2.5). Kết quả được trình bày ở bảng 3.6 (xem phụ lục) và trên hình 3.5

50

0

10

20

30

40

50

60

0 4 8 12 16 20 24 28 32

Hàm

lượn

g ax

it am

in, g

/100

g m

en K

TĐ

Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm neutrase 0.8L

So sánh 3 mức nhiệt độ thuỷ phân 450C, 500C, 550C ta thấy hàm lượng axit amin tạo thành nhiều nhất nhiệt độ 500C. Sau 16 giờ thuỷ phân, lượng axit amin tạo thành là 48.69 g ở 450C; 51.44 g ở 500C; 45.51 g ở 550C. Ta chọn nhiệt độ thuỷ phân là 500C cho các thí nghiệm tiếp theo.

Hiệu quả thuỷ phân ở nhiệt độ 550C bắt đầu giảm so với mẫu thuỷ phân ở nhiệt độ 500C. Chứng tỏ ở 550C enzym bắt đầu bị biến tính. Vì vậy,

51

trong sản xuất công nghiệp cần phải điều chỉnh nhiệt độ thuỷ phân từ 45-500C.

52

3.6.2. Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzym neutrase và thời gian thuỷ phân

Để xác định tỉ lệ chế phẩm enzym neutrase 0.8L thích hợp cần bổ sung. Ta tiến hành 4 mẫu thí nghiệm với cùng nhiệt độ thuỷ phân 500C nhưng tỉ lệ enzym bổ sung khác nhau:

- Mẫu 1: Không bổ sung enzym

- Mẫu 2: Bổ sung 0.1% enzym (0.01ml enzym/10g nấm men)

- Mẫu 3: Bổ sung 0.2% enzym (0.02ml enzym/10g nấm men)

- Mẫu 4: Bổ sung 0.3% enzym (0.03ml enzym/10g nấm men)

Sau 4 giờ lại lấy mẫu 1 lần, xác định hàm lượng axit amin tạo thành (quy ra g/100g men KTĐ) theo phương pháp ninhydrin (mục 2.2.5). Kết quả được trình bày trên hình 3.6 và bảng 3.7 (xem phụ lục).

53

0

10

20

30

40

50

60

0 4 8 12 16 20 24 28 32

Lượn

g ax

it am

in, g

/100

g m

en k

hô

Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ neutrase đến khả năng thuỷ phân protein nấm men

Kết quả thu được cho thấy: Việc bổ sung chế phẩm enzym neutrase 0.8L vào làm hiệu quả thuỷ phân tăng hơn hẳn so với mẫu không bổ sung enzym. Cụ thể là, sau 16 giờ thuỷ phân hàm lượng axit amin tạo thành ở các mẫu được so sánh với mẫu đối chứng không bổ sung enzym như sau: Tăng 29 % (đạt 45.6g) ở mẫu bổ sung 0.1% enzym, tăng 45.5% (đạt 51.44

54

g) ở mẫu bổ sung 0.2% enzym, tăng 45.5 % (đạt 51.44 g) ở mẫu bổ sung 0.3% enzym.

Nồng độ enzym 0.3% cho lượng axit amin tạo thành cao hơn nồng độ enzym 0.2% một chút trong 12 giờ đầu tiên. Nhưng sau 12 giờ thuỷ phân, 2 đường biểu diễn nhập làm một, tức hiệu quả thuỷ phân của chúng bằng nhau.

Lượng axit amin tạo thành ở tất cả các mẫu tăng mạnh trong thời gian thuỷ phân từ 0-16 giờ, sau 16 giờ thuỷ phân lượng axit amin tạo thành tăng chậm hơn rất nhiều (axit amin tạo thành ở mẫu bổ sung 0.2 % enzym tăng 32 % khi tăng thời gian thuỷ phân từ 8 giờ lên 12 giờ, tăng 16.8 % khi tăng thời gian thuỷ phân thuỷ phân từ 12 giờ lên 16 giờ, tăng 3.65 % khi tăng thời gian thuỷ phân từ 16 giờ lên 20 giờ). Vì vậy, ta chọn thời gian thuỷ phân là 16 giờ là thơi gian thích hợp để tiến hành phản ứng thuỷ phân.

3.7. So sánh hiệu quả thuỷ phân bằng chế phẩm enzym neutrase, flavourzyme và phương pháp tự phân

Các enzym protease có nguồn gốc khác nhau thì khả năng phân cắt của chúng lên mạch protein khác nhau. Kết quả là hàm lượng axit amin tạo thành trong dịch thuỷ phân và cơ cấu tỉ lệ giữa các thành phân của sản phẩm cũng khác nhau.

Để so sánh hiệu quả thuỷ phân bằng chế phẩm enzym neutrase, flavourzyme và phương pháp tự phân, ta chọn điều kiện thuỷ phân cho mỗi mẫu là điều kiện thích hợp nhất cho hoạt động của nó, tức là:

Đối với chế phẩm enzym flavourzyme: Thuỷ phân trong điều kiện tối ưu là nồng độ enzym 1%, nhiệt độ thuỷ phân 550C.

Đối với chế phẩm enzym neutrase: Thuỷ phân trong điều kiện tối ưu là nồng độ enzym 0.2%, nhiệt độ thuỷ phân 500C.

Đối với mẫu tự phân: Chọn nhiệt độ tự phân là 500C (cho hàm lượng axit amin tạo thành cao hơn ở 550C).

Kết quả được trình bày trên hình 3.7

55

0

10

20

30

40

50

60

70

4 8 12 16 20 24 Thời gian, giờ

Hàm

lượn

g ax

it am

in, g

/100

g m

en K

TĐ

tự phân neutrase flavourzyme

Hình 3.7. So sánh khả năng thuỷ phân của flavourzyme, neutrase, phương pháp tự phân

Từ đồ thị cho thấy:

Hàm lượng axit amin tạo thành ở mẫu thuỷ phân bằng flavourzyme luôn cao hơn mẫu thuỷ phân bằng neutrase và mẫu tự phân.

Hiệu suất thuỷ phân đạt cao nhất ở các mẫu sau 16 giờ thuỷ phân ở cả mẫu thủy phân bằng flavourzyme và mẫu thuỷ phân bằng neutrase.

Sau 16 giờ thuỷ phân, hàm lượng axit amin tạo thành ở mẫu thuỷ phân bằng enzym flavourzyme và neutrase cao hơn mẫu tự phân tương ứng là 78% và 45.5%. Vậy thủy phân bằng flavourzyme (1% enzym, 550C) cho hiệu quả thuỷ phân cao hơn sử dụng enzym neutrase và phương pháp tự phân.

3.8. Định tính thành phần axit amin trong dịch thuỷ phân nấm men

56

Để khảo sát thành phần axit amin trong dịch thuỷ phân nấm men, em tiến hành theo phương pháp sắc ký bản mỏng trên hệ dung môi n-butanol - axit axetic - nước (3:1:1) (xem mục 2.2.6).

Bao gồm 6 mẫu phân tích. Trong đó có 4 mẫu là axit amin chuẩn.

Mẫu 1: Dịch axit amin là sản phẩm thuỷ phân 16 giờ sử dụng 0.2% chế phẩm neutrase 0.8L (kí hiệu N)

Mẫu 2: Dịch axit amin là sản phẩm thuỷ phân 16 giờ sử dụng 1% chế phẩm flavourzyme 500MG (kí hiệu F)

Mẫu 3: Dung dịch axit glutamic chuẩn ( kí hiệu Glu)

Mẫu 4: Dung dịch Leucin chuẩn (kí hiệu Leu)

Mẫu 5: Dung dịch Lysin chuẩn (kí hiệu Lys)

Mẫu 6: Dung dịch Methionin chuẩn (kí hiệu Met).

Thời gian chạy sắc ký 3 giờ. Kết quả được thể hiện trên sắc ký đồ hình 3.8

457

Hình 3.8. Sắc ký đồ

Kết quả thu được trên sắc ký đồ cho thấy:

Thành phần axit amin trong dịch thuỷ phân sử dụng chế phẩm neutrase và dịch thuỷ phân sử dụng chế phẩm flavourzyme không khác nhau nhiều. Hai dung dịch này đều tạo ra 4 vệt tương ứng với quãng đường chạy, kích thước, độ rõ của các vệt tương tự như nhau trên sắc ký đồ. Dung dịch thuỷ phân thu được khi sử dụng flavourzyme và neutrase có 4 axit amin chiếm thành phần nhiều nhất.

So với các vệt axit amin chuẩn, thấy rằng dung dịch mẫu N và F đều chứa Lysin. Theo tài liệu tham khảo, lysin thành phần axit amin chiếm tương đối nhiều trong dịch thuỷ phân nấm men (3.2% theo [27]).

Trên sắc ký đồ cũng cho thấy sự có mặt của Leucin trong dịch thủy phân mẫu N và F. Leucin là thành phần axit amin có trong sản phẩm thuỷ phân nấm men , chiếm 2.9% [27].

Giá trị R của các axit amin chuẩn trên sắc ký đồ như sau: Axit glutamic RGlu = 0.3, Leucin RLeu = 0.68, Lysin RLys = 0.14, methionin RMet = 0.61. Độ lớn của các giá trị này không đúng với [37], nhưng thứ tự về độ lớn thì đúng với [37]. tức là theo [37] thì RLys < RGlu < RMet < RLeu .Vì vậy, ta có thể dựa vào giá trị R thu được của các giếng trên sắc ký đồ của dung dịch thuỷ phân để dự đoán thành phần xuất hiện trên sắc ký đồ.

- Vệt số 2 và số 3 có quãng đường chạy không trùng với axit amin chuẩn nào. Các axit amin ở các vị trí này có giá trị R nằm trong khoảng R của lysin và leucin. Vệt 2 có quãng đường chạy xa hơn axit glutamic nên ta có thể dự đoán rằng vệt 2 rất có thể là valin (2.3% dịch thuỷ phân [27]), alanin (chiếm 3.4% dịch thuỷ phân [27]). Vệt số 3 có quãng đường chạy ngắn hơn methionin nên ta có thể dự đoán rằng vệt số 3 rất có thể là valin (chiếm 2.3% dịch thuỷ phân [27]).

Tóm lại đã khảo sát sơ bộ bằng sắc ký lớp mỏng để khẳng định trong sản phẩm thủy phân nấm men có chứa các axit amin không thay thế quan trọng đối với người và động vật, đặc biệt là Lysin, Leucin.

58

KẾT LUẬN

Từ kết quả nghiên cứu, em đã rút ra được kết luận như sau:

1. Đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzym, nhiệt độ và thời gian đến khả năng thuỷ phân nấm men bằng chế phẩm Flavourzyme 500MG

- Nồng độ enzym thích hợp 1%

- Nhiệt độ thuỷ phân tối ưu 550C

- Thời gian thuỷ phân thích hợp 16 giờ

- Hiệu quả thuỷ phân tăng 78% so với quá trình tự phân (3.3.1)

2. Đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzym, nhiệt độ và thời gian đến khả năng thuỷ phân nấm men bằng chế phẩm neutrase 0.8L

- Nồng độ enzym thích hợp 0.2%

- Nhiệt độ thuỷ phân tối ưu 500C

- Thời gian thuỷ phân thích hợp 16 giờ

- Hiệu suất thuỷ phân tăng 45.5% so với quá trình tự phân (3.6.2)

3. Quá trình xử lý nhiệt tế bào đem lại hiệu quả thuỷ phân thấp hơn nhiều so với quá trình tự phân.

4. Sự kết hợp sử dụng enzym β-glucanase (cereflo) và enzym protease (neutrase) cho hiệu quả thuỷ phân không cao.

5. Đã định tính thành phần dịch thuỷ phân nấm men

- Thành phần dịch thuỷ phân bằng 2 chế phẩm flavourzyme và neutrase có chứa các axit amin tương tự như nhau.

59

- Thành phần dịch thuỷ phân bằng 2 chế phẩm flavourzyme và neutrase đều có chứa lysin và leucin.

KIẾN NGHỊ

Qua quá trình nghiên cứu, em xin đề xuất 1 số ý kiến như sau:

- Tiến hành thử nghiệm sản xuất sản phẩm thuỷ phân nấm men bia với quy mô rộng bằng chế phẩm flavourzyme.

- Khai thác thêm về ảnh hưởng của các yếu tố khác (pH, chất kìm hãm, chất hoạt hoá...) đến quá trình thuỷ phân nấm men bia bằng enzym protease.

- Tiếp tục khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân nấm men bia bằng các enzym khác nhau.

- Tiếp tục nghiên cứu điều kiện tối ưu để công phá thành tế bào nấm men bằng các phương pháp khác nhau.

- Nghiên cứu các phương pháp là giảm hàm lượng acid nucleic trong dịch phân .

- Tiếp tục nghiên cứu thành phần dịch thuỷ phân nấm men.

60

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 2000. Sử dụng chế phẩm sinh học trong chăn nuôi. Hà Nội.

2. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến, 1998. Công nghệ enzym. NXB Nông Nghiệp, TP Hồ Chí Minh.

3. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng, 1998. Hoá sinh học. NXB Giáo dục.

4. Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tường, 1997. Thực hành hoá sinh học. NXB Giáo dục.

5. Densikow, M.T., 1963. Tận dụng phế liệu của công nghệ thực phẩm (Nguyễn Văn Đạt – Bùi Huy Thanh dịch). NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội.

6. Tống Thị Anh Đào, Lê Văn Nhương, Nguyễn Đức Lượng, 1999. Thu nhận enzym superoxit dismutaza theo công nghệ nghiền tế bào Saccharomyces cerevisiae. Tạp chí Khoa học Công nghệ, 37(5): tr 20 -25.

7. Nguyễn Văn Đạt, Ngô Văn Tàm, 1974. Phân tích lương thực thực phẩm. Bộ Lương thực – Thực phẩm.

8. Quản Lê Hà, 1999. Nghiên cứu 1 số đặc tính và ứng dụng hệ enzym thuỷ phân tinh bột và protein trong sản xuất các đồ uống. Luận án tiến sĩ ngành Công nghệ sản phẩm lên men và nước uống không có rượu. Trường ĐHBK Hà Nội.

9. Nguyễn Ngọc Hải, 1994. Nấm men và công nghệ sinh học. Viện Di truyền Nông Nghiệp.

10. Vương Thị Việt Hoa, Nguyễn Hải Sự, Đặng Ngọc Thuỳ Dương, 2005. Tận dụng men dư thừa từ nhà máy bia để sản xuất yeasts extract bột

61

dùng trong môi trường nuôi cấy vi sinh. Tạp chí khoa học kỹ thuật Nông Lâm nghiệp, TP Hồ Chí Minh, (2).

11. Hoàng Đình Hòa, 2002. Công nghệ sản xuất malt và bia. NXB Khoa Học và Kĩ Thuật.

12. Trương Thị Hoà, 1994. Nghiên cứu ứng dụng protease trong sản xuất bia.

13. Nguyễn Văn Hồng, 2004. Báo cáo tuyển tập hội nghị khoa học. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm enzym protease dùng để thay thế một số chất xúc tác hoá học trong công nghiệp. TP Hồ Chí Minh.

14.http:// www.forum.hanoifishing.com/showthread.php?t=242415.http://www.google.com.vn/search?q=thu%E1%BB%B7+ph%C3%A2n+protein&hl=vi&start=40&sa=N16. http:// www.nanogenpharma.com

17. http:// www.novozymes.com

18. Khoa học - Công nghệ - Môi trường Tuyên Quang. Chế biến thức ăn gia súc gia cầm. Nhà xuất bản văn hoá dân tộc, tr 18-20.

19. Ngô Tuấn Kỳ, 1988. Enzym và đời sống. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

20. Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thuỷ, Nguyễn Thanh Hằng, Lê Thị Lan Chi, 2005. Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr 19.

21. Ngô Thị Mại, Nguyễn Thị Dự, Thái Thị Hảo, Trần Việt Lan, 1998. Ứng dụng enzym protease để rút ngắn thời gian sản xuất nước mắm. Viện Công nghiệp Thực phẩm.

22. Lê Văn Việt Mẫn, Phạm Quốc Chương, 2007. Nghiên cứu cải thiện quá trình lên men nồng độ cao trong sản xuất bia. Đại học Quốc Gia, TP Hồ Chí Minh, 10 (6): tr 66-70.

23. Lê Văn Việt Mẫn, Trần Thâm Minh Hoàng, Nguyễn Ngọc Tuyết Sương, 2006. Nghiên cứu quá trình tự phân bã nấm men bia để thu nhận chế phẩm invertase. Tạp chí phát triển Khoa học và Công nghệ, 9 (12).

62

24. Lê Văn Việt Mẫn, Phạm Quốc Chương, 2007. Nghiên cứu cải thiện quá trình lên men nồng độ cao trong sản xuất bia. Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh.

25. Lao Thị Nga, 1987. Kỹ thuật sản xuất nấm men bánh mì và một số loài nấm ăn. NXB TP Hồ Chí Minh.

26. Lương Đức Phẩm, 2005. Nấm men công nghiệp. NXB Khoa học và Kỹ thuật.

27. Lê Xuân Phương, 2001. Vi sinh vật công nghiệp. NXB Xây dựng, Hà Nội.

28. Nguyễn Phương, 2007. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sấy phun để thiết kế chế tạo thiết bị sản xuất bột đậu nành uống liền và bột nấm men giàu protein và khoáng chất. Trung tâm Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm Hà Nội.

29. Lường Văn Sơn, Trinh Xuân Bài, Hà Thị Hạnh, Lê Đức Lễ, 1999. Nghiên cứu sử dụng sinh khối nấm men bia của nhà máy bia Thanh Hoá sản xuất thuốc ống uống Biofil ở quy mô công nghiệp. Công ty cổ phần Dược - Vật tư Y tế Thanh Hoá.

30. Lâm Xuân Thanh. Nghiên cứu các phương pháp biến hình protein đậu tương và ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm. Luận văn phó tiến sĩ khoa học kỹ thuật, ĐHBK Hà Nội.

31. Quản Văn Thịnh, 1978. Sinh tổng hợp enzym protease từ chủng nấm mốc Asp. Oryzae VN1 và ứng dụng trong sản xuất nước chấm. Luận án phó tiến sĩ Khoa học kỹ thuật, Trường ĐHBK Hà Nội.

32. Nguyễn Bích Thuỷ, năm. Nghiên cứu sử dụng một số enzym thuỷ phân trong sản xuất bia. Luận văn thạc sĩ ngành công nghệ thực phẩm, ĐHBK Hà Nội.

33. Nguyễn Thế Trang, Nguyễn Thanh Trà, Lương Đức Phẩm, năm. Nghiên cứu thu nhận chế phẩm proteaza từ Aspergillus oryzae TP-98 bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt. Tạp chí Khoa học Công nghệ.

34. Đặng Trung Trụ. Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ lên men đến sự thoái hoá của nấm men trong sản xuất bia. Luận văn thạc sĩ Công nghệ thực phẩm, ĐHBK Hà Nội.

35. Trường đại học Y Hà Nội, 2001. hoá sinh. NXB Y học.

63

36. Hoàng Vân, 2004. Một số nét về enzym sử dụng trong các chất tẩy rửa. Tạp chí Công nghệ Hoá Chất, 3.

37. Đào Hữu Vinh. Nguyễn Xuân Dũng. Trần Thị Mỹ Linh, Phạm Việt Hùng, 1985. Các phương pháp sắc ký. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà nội.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

38. Anna Halász, Radomir Lásztity, 1991. Use of yeast biomass in food production. CRC press, Boca Raton Ann Arbor Boston.

39. Behalova B. and Berank, 1986. Autolysis of disintegrated cells of the yeasts Saccharomycess cerevisiae. Acta biotechnology Vol 6; pp 147 – 152.

40. Carl C.Lindegren, 1949. The yeast cell. Educat.publ.

41. Champagne C.P., Gaudreau H., Conway J., 2003. Effect of the production or use of mixtures of bakers’ or brewers’ yeast extract on their ability to promote growth of lactobacilli and pediococci. Electronic journal of biotechnology, vol 6.

42. Conway J, Gaudreau.H, Champagne C.P., 2001. The effect of the addition of proteases and glucanases during yeast autolysis on the production and properties of yeast extraxt. Canadian J. of Microbiology. Vol.47, Number 1, pp 18-24.

43. F.G. Walter, 1953. The manufacture of compressed yeast. Chapman and Hall.

44. Hanlon GW, Hodges NA, Russel AD, 1982. The influence of glucose, ammonium and magnesium by A.oryzae- J.Gen microbial 128, pp 845-851.

45. H.d.A.H. Cook, 1958. The chemistry and biology of yeasts. Acad.

46. Henry J. Peppler, 1973. Yeast technology. Avi Publ. Co.,

47. J. Ladder, Rij N.j. W. Kreger – Van, 1967. The yeast. North – Holland

48. K. Arima, H.d. w. Roman, 1957. Yeasts . W.Junk Publ.

49. Owen P. Ward, 1983. Properties of microbial protease – Microbial enzymes and biotechnology, pp 263-281.

64

50. Schanus, Edward G, Mcpherson, Marinelle, 1994. Yeast extract from Candida utilis, production and use as emulsifier of same.

51. Tatjana Vukasinovic Milic, Marica Rakin and Slavica Siler-Marinkovic, 2006. Utilization of baker’s yeast (Saccharomyces cerevisiae) for the production of yeast extract: effect of different enzymatic treatments on solid, protein and carbohydrate recovery. J. Serb. Soc. 72(5).

PHỤ LỤCBảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ flavourzyme đến khả năng thuỷ

phân protein nấm men

TGTP, giờ

Hàm lượng axit amin (g/100 g men KTĐ)

Không bổ sung enzym

0.1% enzym

0.4% enzym

0.7% enzym

1% enzym

2% enzym

8 27.86 31.75 35.58 37.04 39.61 42.36

16 33.40 38.25 47.43 49.05 59.47 62.0

24 33.83 38.83 48.74 54.34 63.20 64.66

32 39.08 50.73 52.18 56.28 63.88 64.66

40 42.31 54.60 54.60 59.06 64.60 66.0

Bảng 3.3. Ảnh hưỏng của nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm Flavourzyme

TGTP, giờ

Hàm lượng axit amin (g/100 g men KTĐ)

450C 500C 550C 600C

4 2.67 12.26 22.34 3.25

8 11.18 31.36 39.61 10.39

12 16.17 43.40 51.21 14.71

16 31.46 44.22 59.47 23.69

20 43.69 48.54 62.96 28.98

65

24 46.84 52.52 63.20 38.30

28 49.63 55.58 63.88 39.06

32 52.54 57.62 63.88 42.07

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo đến khả năng thuỷ phân protein nấm men

TGTP, giờ

Hàm lượng axit amin (g/100 g men KTĐ)

Không bổ sung

enzym

0.1% neutrase

0.1% cereflo

0.1% neutrase

0.2% cereflo

0.1% neutrase

0.4% cereflo

0.1% neutrase

8 28.40 32.08 33.32 35.66 35.77

16 35.37 45.60 46.28 48.98 48.22

24 40.26 49.35 50.26 52.38 52.11

32 42.38 53.08 53.22 54.29 54.32

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năng thuỷ phân protein nấm men

TGTP, giờ Hàm lượng axit amin (g/100 g men KTĐ)

Xử lý 800C (15 phút),

0.1% enzym neutrase

Tự phân 0.1% neutrase

8 1.45 28.40 32.08

16 2.98 35.37 45.60

24 3.06 40.26 49.35

32 3.84 42.38 53.08

66

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm neutrase 0.8L

TGTP, giờ Hàm lượng axit amin (g/100 g men KTĐ)

450C 500C 550C

4 13.27 23.88 16.52

8 29.46 36.09 21.71

12 39.03 46.14 35.94

16 48.69 51.44 41.51

20 51.44 53.52 42.79

24 52.66 55.29 43.28

28 52.89 55.29 44.79

32 55.06 55.48 45.81

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ neutrase đến khả năng thuỷ phân protein nấm men

TGTP, giờ

Hàm lượng axit amin (g/100 g men KTĐ)

Không bổ sung enzym

0.1% neutrase 0.2% neutrase

0.3% neutrase

4 12.35 16.58 19.64 23.88

8 28.40 32.08 33.38 36.09

12 33.08 38.53 44.03 46.14

16 35.37 45.60 51.44 51.44

20 38.83 46.97 53.32 53.52

24 40.26 49.35 54.48 55.29

67

28 41.25 51.04 54.72 55.29

32 42.38 53.08 54.72 55.48

68