Klinische moleculaire genetica - internisten · 2018. 11. 30. · Genoomdiagnostiek anno nu Dr. Rob...

Genoomdiagnostiek anno nu

Dr. Rob van der Luijt

Laboratoriumspecialist Klinische Genetica

Afdeling Klinische Genetica/LDGA LUMC

[email protected]

NIV - COIG – cursus Genoom & Genetica Bunnik, 30 november 2018

Klinische moleculaire genetica

Klinische moleculaire genetica Genoomdiagnostiek anno nu

Hoofdonderwerpen

• Inleiding genoomdiagnostiek

• Onderzoekstechnieken genoomdiagnostiek

• Interpretatie van varianten in het genoom

• Trends in de genoomdiagnostiek

Inleiding Genoomdiagnostiek Het hoe en waarom van de genoomdiagnostiek • Opsporen van afwijkingen in het erfelijk materiaal

(het genoom)

• Interpreteren van afwijkingen in het erfelijk materiaal (het genoom)

• Verband leggen tussen genotype en fenotype

• Erfelijkheidsvragen beantwoorden

-2

Geboorteplanning - Dragerschapscreening

-0.5

Zwangerschap - NIPT (trisomie 13/18/21, geslacht, dragerschap)

Geboorte - i.p.v. hielprik: dragerschap erfelijke aandoeningen

0 0-10

Onbegrepen aangeboren afwijkingen - De novo screening - Whole genome scan

10-20

Ziekte preventie - BRCA, CFTR

Kanker - Gepersonaliseerde behandeling

>50

Farmacogenetica -medicatie keuze

60

Veroudering - Gezond ouder worden

>100

Overlijden - Moleculaire autopsie bij onbegrepen doodsoorzaak

8.000 ziekten met genetische oorzaak 1 op 30 kinderen 1 op 6 ziekenhuisopnamen van kinderen 1 op 5 oorzaak kindersterfte

Toepassingen genoominformatie Van (pre-)conceptie tot na de dood

Variatie in het genoom Klinisch relevant ?

Het genoom van een individu bevat miljoenen variaties Grootste deel : geen consequenties Natuurlijke of normale variatie (genetisch polymorfisme) Ieder individu heeft ca. 3 miljoen SNP’s Sommige variaties in het genoom veroorzaken (verhoogd risico op) bepaalde erfelijke ziekten: pathogene varianten (mutaties)

Onderzoekstechnieken genoomdiagnostiek Van chromosoomonderzoek naar WGS

Detecteren van het complete spectrum van variatie

in het genoom

• Chromosomale afwijkingen (numeriek / structureel)

• Grote deleties, inserties, Copy Number Variations (CNV)

• Repeatexpansies

• Puntmutaties, Single Nucleotide Variations (SNV)


Cytogenetica • Aantal chromosomen • Structuur chromosomen

Moleculaire Cytogenetica • Deleties & Duplicaties Moleculaire Genetica • Intragene mutaties (puntmutaties)

Groot

Klein

Chromosoomonderzoek m.b.v. de microscoop

(cytogenetisch onderzoek, karyotypering, FISH)

Moleculaire cytogenetica

(array-CGH, SNP-array)

DNA sequencing

(Sanger, NGS, WES, WGS)

N.B. Voor de detectie van kleinere deleties en duplicaties

(bijv. 1 exon) is meestal aparte test nodig (bijv. MLPA)

Inleiding Genoomdiagnostiek Het hoe en waarom van de genoomdiagnostiek


DNA-sequentie = volgorde van de basen, nucleotiden Aflezen DNA sequentie-analyse (‘DNA sequencing’)

Vergelijken met normale referentie-sequentie Opsporen van verschillen Nagaan of deze verschillen klinisch relevant zijn

Proces Genoomdiagnostiek Overzicht

Proces Genoomdiagnostiek Doorlooptijden Nieuwe patiënt (familie) Bevestiging/uitsluiting klinische diagnose 4-8 weken Lid van bekende familie, mutatie bekend max. 4 weken Dragerschapbepaling Presymptomatisch onderzoek Spoeddiagnostiek (o.a. prenatale diagnostiek) max. 2 weken Complexe genetische diagnostiek (grote genpanels, exoom sequencing) 1-26 weken

Onderzoekstechnieken genoomdiagnostiek

Voorbereidende opdracht 1.

Waarom is het uitvoeren van Sanger sequencing als enige test bij veel erfelijke aandoeningen onvoldoende om een genetische diagnose te kunnen stellen ?

Sanger sequencing is

a. niet in staat om de meeste SNP's aan te tonen.

b. niet in staat om de meeste VUS-sen aan te tonen.

c. niet in staat om de meeste structurele veranderingen aan te tonen.

d. niet in staat om de meeste puntmutaties aan te tonen.




Sanger sequencing is niet in staat om de meeste …. aan te tonen.

SNP's VUS-sen Structurele Punt- variaties mutaties




Eervolle vermelding 1

“Sanger sequencing = DNA met primer in 4 aparte epjes voor normale PCR reactie. Per epje 1 nucleotide toevoegen die de reactie stopt (ddNTP). Daarna gelelectroforese, scheiden op 1 base, en sequentie aflezen. Derhalve krijg je een sequentie waarbij je 1 base-verschil (*) kunt detecteren (=SNP's, VUS, puntmutaties). Structurele veranderingen kun je niet detecteren”.




Eervolle vermelding 2

"Antwoord C lijkt mij het meest passend, echter het juiste antwoord lijkt mij eerder dat Sanger sequencing veel te tijdrovend is voor de meeste aanvragen van genetische diagnostiek. Er moet immers naar veel te veel genen (en dus nucleotiden) worden gekeken".

Principe Next Generation Sequencing (NGS) Massively parallel sequencing

DNA molecuul

glasplaatje

G A A T G C C C T A T G C T A C

DNA-moleculen worden aan een oppervlak gebonden en enkelstrengs gemaakt Elke base heeft een eigen kleur, hiermee wordt de basenvolgorde (sequentie) bepaald Als er een base wordt ingebouwd in de groeiende DNA-keten, ontstaat er een lichtsignaal Een hoge-resolutie camera ‘scant’ de slide en registreert de signalen (=basen) Dit gebeurt op vele miljoenen posities op de slide tegelijk De sequentie van een single molecuul noemen we een read

Principe Next Generation Sequencing (NGS) Massively parallel sequencing

Overzicht NGS

Sample prep

Multiplexen

Sequencen

Data Analyse

Data interpretatie

Proband

Father

Mother

NGS patroon & Sanger patroon

NGS

Sanger

Genoomdiagnostiek en Next Generation Sequencing

Whole Exome Sequencing (WES)

• Exoom

– de coderende gebieden

(alle exonen) van het genoom

– ca. 1 % van het genoom

– ca. 20.000 genen

– Ongeveer 50 miljoen basen

(50 Mb)

• De basevolgorde van dit exoom wordt

met massively parallel sequencing bepaald (NGS)

PACBIO RS II

Ion Torrent PGM

Solid 5500 xl

GS FLX 454

HiSeq / MiSeq

Oxford Nanopore MINION

Next Generation Sequencing (NGS) platforms

NovaSeq 6000


Whole Genome Sequencing

Interpretatie Mutatie-nomenclatuur

HGVS mutatie nomenclatuur http://varnomen.hgvs.org/

• g.1162G>A genomische referentie sequentie

• c.6232_6236del cDNA referentie sequentie

• p.(Gly542*) eiwit (protein) referentie

sequentie

Interpretatie Klassificatie van varianten in het genoom

Het IARC 5-klassensysteem voor genetische varianten

Klasse 5. Pathogeen (P)

Klasse 4. Waarschijnlijk pathogeen (LP)

Klasse 3. Onbekende klinische relevantie (VOUS of VUS*)

Klasse 2. Waarschijnlijk klinisch niet-relevant (LB)

Klasse 1. Klinisch niet-relevant, benigne (B)

* Variant Of Unknown Clinical Significance

• 50.000 varianten per patiënt

• Meesten zijn “normaal” of niet relevant

• Diverse filterstappen nodig om tot

de causale variant te komen

Voorbeeld 1: Klinische interpretatie van een exoom

• Waarop is de filtering gebaseerd ?

1. Bekende variant J/N ?

• Lokale databases (MVL’s) en externe databases

(MVL=Managed Variant List, gecureerde lijst)

• Zo ja, in welke klasse (1B, 2LB, 3VUS, 4LP, 5P) ?

• Frequentie in normale controlepopulaties

(let op: ethische achtergrond: AMR, ASJ, EAS, NFE, etc.)

Klinische interpretatie van een exoom

• Waarop is de filtering gebaseerd ?

2. Onbekende variant

• Wat is het te verwachten effect op het gen / transcript / eiwit ?

• Leidt de verandering tot een prematuur stopcodon ?

• Is er een effect op RNA splicing ?

• Is de aminozuurverandering (missense mutatie) ingrijpend ?

• Betreft het een geconserveerd aminozuur ?

• Ligt de variant in een functioneel domein ?

• Verschillende predictieprogramma’s




Bij het ophelderen van de klinische betekenis van tot dusver onbekende genetische varianten wordt veelal gebruik gemaakt van in silico predictie programma's.

Noem twee belangrijke redenen waarom uiterste voorzichtigheid geboden is bij het includeren van dergelijke resultaten in klinische uitslagbrieven.





“de aanvrager is zich vaak niet bewust van de valkuilen en onzekerheden en de kans bestaat dat deze uitslagen onterecht als de absolute waarheid worden beschouwd”





“er zijn geen statistieken van de sensitiviteit en specificiteit en dus van de positief en negatief voorspellende waarde van dergelijke analyses”

“deze testen zijn niet gevalideerd”

“in silico is geen causaal verband tussen variant en ziekte”



Misschien niet precies wat we hier bedoelden, maar zeker ook belangrijke aspecten van klinisch-genetisch onderzoek:

• mogelijk problemen met verzekeringsaanvragen voor patiënt (ook genoemd: hypotheek, leningen)

• de patiënt heeft recht op het "niet-weten" van een uitslag

• risico op "genetisch determinisme"

• speculatieve resultaten zouden ten koste kunnen gaan van de werkelijke klinische boodschap

• uitslagen zonder medische consequenties kunnen wel veel impact hebben op het leven van patiënten

Grade /Histology

unknown

BRCA1 / BRCA2

variant

Personal and

family history

of cancer of the

carrier

Severity of the

protein

modification

Biochemical

functional assays

Loss of

heterozygosity

ER/PR/Her-2-Neu

status

Integrated

algorythms

Co-segregation

with the disease

in-silico

assessment

Co-occurrence with

a deleterious in

trans mutation

Voorbeeld 2:

Interpretatie van varianten in de ‘borstkankergenen’

BRCA1 en BRCA2

een geïntegreerde multidisciplinaire benadering

Trends in de genoomdiagnostiek (1/3) Toepassingsgebied en onderzoeksmethoden

• Steeds verdere uitbreiding van de mogelijkheden van genetisch onderzoek

– één specifiek gen

– een ‘genpanel’ (EPI, CAR, MET, NEF, NEU, ONC, VBE, IDP)

– een volledig exoom (WES)

• In nabije toekomst wellicht analyse van het volledige genoom: Whole Genome Sequencing (WGS)


• Van zeldzame monogene aandoeningen naar complexe, veelvoorkomende ziekten met een erfelijke component

• Van “last resort” naar “genome first” of “genetics first”

• Van (gen- of ziekte-) specifieke test naar “one-test-fits-all”

• multidisciplinair overleg belangrijker dan ooit tevoren

• “mainstreaming” medische genetica

Nanopore sequencing


DNA sequencing. Iets voor u ?

Klinische moleculaire genetica - internisten · 2018. 11. 30. · Genoomdiagnostiek anno nu Dr. Rob...

Documents

Transcript of Klinische moleculaire genetica - internisten · 2018. 11. 30. · Genoomdiagnostiek anno nu Dr. Rob...