Internship report: yeast management in the Maasland Brouwerij Oss

79
Literatuurverslag derdejaarsstage Maasland Brouwerij Oss Gisthuishouding

description

report about yeast management (yeast harvesting, storing, destoring, propagation and pitching together with detection of common infections by lactic acid and other bacteria)In Dutch

Transcript of Internship report: yeast management in the Maasland Brouwerij Oss

Literatuurverslag derdejaarsstageMaasland Brouwerij OssGisthuishouding

LiteratuurverslagGisthuishouding

In opdracht van:Maasland Brouwerij Oss en Bijdehand Bierbrouwerij

Begeleid door:Hogeschool Inholland DelftRotterdamseweg 1412628 AL Delft015 251 9200

Auteur:Stijn Beurskens

Versienummer:1

Datum:9 maart 2014

Status:Werktitel

VoorwoordSeptember 2008 ben ik begonnen als laborant gisthuishouding bij de Maasland Brouwerij Oss (MBO). De stage duurde tot februari 2009. Toentertijd was de MBO Nederlands oudste en grootste microbrouwerij nog actief. De MBO brouwde op ambachtelijke wijze eigen bier met een eigen giststam en brouwde voor klantbrouwers met andere, droog of vloeibaar aangeleverde gisten. De MBO ontbrak het echter aan een goede gisthuishouding om de gisten op veilige wijze te kunnen bewaren, activeren en enten. Hiervoor moest een gist bewaar, activatie, propagatie systeem opgesteld worden, evenals de hierbij behorende kwaliteitsmetingen aan gist, wort, gistend bier alsook een gistwasstap ten behoud van een reincultuur.Tijdens het verloop van de stage werd echter al snel duidelijk dat het MBO laboratorium waar ik tewerkgesteld werd nagenoeg niet bestond: Er waren geen gestandaardiseerde werkvoorschriften, geen gestandaardiseerde meetmomenten tijdens brouw, gistings en gistpropagatieproces en het laboratorium zelf bestond quasi niet: Het was een stoffige, niet vocht of tochtvrije ruimte die als bibliotheek, leslokaal, museum en laboratorium dienstdeed. Tevens waren verschillende materialen onontbeerlijk voor een goede gisthuishouding als een mogelijkheid tot autoclaveren niet aanwezig. Een ander probleem in deze brouwerij draaide rond geld: geld voor nieuwe apparatuur, media en andere spullen nodig om proeven mee te doen was niet altijd voorhanden. In 2010 bleek ook hoe nijpend het geldprobleem was wanneer het faillissement van de brouwerij werd aangevraagd.Veel heb ik geleerd over brouwen, gisthuishouding, communicatie met opdrachtgevers, verhoudingen tussen de personen binnen een organisatie en in laatste, maar misschien wel meest belangrijkste plaats: over mijzelf en mijn uitstelgedrag zonder grenzen. In retrospect heb ik leren inzien hoe belangrijk het is voor je eigen onderzoek, inzichten, tijd en standpunten te waken. Meer dan eens is het voorgekomen dat mijn plannen vertraagd of van de baan geschoven werden door geldtekort, aandachttekort, onterecht problemen afwimpelen door de opdrachtgever en ga zo maar verder. Meer dan eens ben ik begonnen met het schrijven van dit verslag om na een aantal paginas op te geven doordat ik door de bomen het bos niet meer zag. Meer dan eens werd ik dus met mijn neus op de feiten gedrukt dat ik veel beter had moeten communiceren, afbakenen en inperken van verantwoordelijkheden en taken. En meer dan eens bleek dat ik simpelweg meer orde en doorzettingsvermogen tentoon moest stellen. Maar goed; laat dit een wijze les zijn voor een ieder en vooral mijzelf.Door deze strubbelingen tijdens de stage en door andere vertragingen na de stage heeft het schrijven van dit verslag lange tijd op zich laten wachten. Maar nu is het er dan: In ietwat gewijzigde opzet dan aanvankelijk gepland en met een andere brouwerij als afnemer, maar niet te min wel uitgegist. De andere vorm van het verslag uit zich in de aanbevelende aard i.p.v. een hapklaar, ready to implement, stuk lectuur. Dit is doordat tijdens de stage niet voldoende tijd en mogelijkheid was tot het statistisch onderbouwen van de verschillende mogelijke strategin die in dit verslag aan bod komen. Hierdoor kan dit verslag als leidraad tot een verantwoorde gisthuishouding gelezen worden welke gestaafd is door de literatuurstudie die dit verslag is en afwegingen die in samenspraak met brouwers Frans Schamp van MBO en Wesley Aarse van Bijdehand Bierbrouwerij.Graag wil ik via deze weg Frans Schamp bedanken voor de interessante stage die hij mij op het MBO aanbood. Wesley Aarse voor de vriendschap, goede tijd en vele hulp en ontnuchterende inzichten in het brouwproces. En van Hogeschool INHolland wil ik graag Harry Vogel en Ton Lossonczy bedanken voor hun geduld met mijn vorderingen.

Stijn Beurskens

SamenvattingDit stageverslag is het verslag, voortgerold uit de derdejaarsstage van biotechnologiestudent Stijn Beurskens, student aan de Hogeschool INHolland Delft. De stage is gelopen bij de Maasland Brouwerij Oss en geschreven voor de Maasland Brouwerij Oss (MBO) en de Bijdehand Brouwerij (BB). Gevraagd was om het laboratorium en het labwerk rond het brouwproces van de MBO zodanig in te richten dat de standaardbepalingen die al gedaan werden in de MBO gecombineerd met nieuwe besmettings-detectiemethoden gist oogst, bewaar, propagatie en entmethoden allemaal gestroomlijnd konden plaatsvinden door een MBO en HBO stage lopend laborant. Door omstandigheden is dit echter niet gelukt en werd de opdracht omgevormd naar een meer theoretische aard waar dit verslag product van is. De nieuwe opdracht was al deze bovenstaande labwerkzaamheden in een draaiboek en werkvoorschrift te bundelen. Maar dan moest wel eerst een degelijke literatuurstudie naar goede besmettingsdetecties en gistmanagement methoden gedaan worden alvorens met enkele aanbevelingen te komen.Dat maakt dat dit verslag bestaat uit een drieluik van boekwerken: allereerst is er dit literatuurverslag dat via uitgebreide literatuurstudie aanbevelingen doet naar methodieken die ongewenste besmettingen in een brouwerij moeten detecteren en de besmettingshaarden opsporen. Tezamen met een afweging van vele in de literatuur voorkomende gist oogst, bewaar, propagatie en entmethoden. Deze bevindingen in de literatuur zijn uitgewerkt in een draaiboek en werkvoorschriften voor de laborant in de Maasland Brouwerij Oss. Gecombineerd met bepalingen die al min of meer plaatsvonden in de MBO ten tijde van de start van deze stage.Het tweede deel van dit drieluik zijn dus het draaiboek waarin beschreven staat waar, wanneer en waarom bepaalde metingen/monsternamen etc. plaatsvinden tijdens het brouwproces en in het lab.Het derde deel van dit drieluik zijn de werkvoorschriften die als standard operation procedure (SOP) gezien kunnen worden. Hierin wordt stap voor stap uitgelegd hoe welke werkzaamheden plaatsvinden, teneinde alle toekomstige studentstagiairs op MBO en HBO niveau in staat te stellen op zo uniform mogelijke wijze de werkzaamheden te verrichten.

InhoudVoorwoord-1Samenvatting-31Inleiding11.1Mouten, brouwen en gisten31.1.1Brouwproces31.1.2Mouten41.1.3Schroten41.1.4Brouwen51.1.5Vergisten81.1.6Hoofdgisting81.1.7Nagisting op fles91.1.8Probleemstelling, doelstelling en subdoelstellingen.102Literatuuronderzoek gisten en melkzuurbacterin: de inleiding112.1Introductie tot bier; een beknopte geschiedenis11Deel 1: Gisthuishouding123Biergisten; boven en ondergistende stammen124Levenscyclus gisten145Suikermetabolisme in biergist155.1Glycolyse155.2Alcoholfermentatie175.3Stop van fermentatie176Gisten propageren196.1Vers geoogste gist196.2Ingekochte gist196.3Propagatieschema voor van medium opgekweekte reincultuur197Gisten wassen227.1Steriel waterwas227.2Zuurwas227.3Zuur/alkaliwas228Gisten inoculeren/pitchen238.1Steriel gistvat238.2Gezondheid gisten238.3Gisten tellen238.4Viabiliteit gisten259Gisten oogsten en herpitchen269.1Skimmen269.2Bovengisten oogsten als ondergisten2610Gisten bewaren2810.1Geoogste gisten bewaren2810.2Gisten op medium bewaren28Deel 2: Melkzuurdetectie3011Bierbedervende bacterin3012Meest voorkomende besmettingen3212.1Lactobacillus spp.3212.2Pediococcus spp.3312.3Azijnzuurbacterin3312.4Zymomonas spp.3312.5Pectinatus spp.3412.6Megasphaera spp.3413Hoe melkzuurbesmettingen te detecteren3513.1Klassieke methode3513.2Moderne methode3614Welke media te gebruiken in het laboratorium?3714.1Lactobacillus brevis3714.1Lactobacillus lindneri3814.3Lactobacillus casei3814.4Pediococcus damnosus3814.5Pectinatus cerevisiiphylus3814.6Pectinatus fringensis3814.7Megasphaera cerevisiae3814.8Media samengevat3915Hoe besmettingen te voorkomen4016Concluderend: De brouwerij en zijn gistlaboratorium4116.1Besmettingen4116.2Gistpropagatie4116.3Fysisch-chemische bepalingen4217Discussie44Literatuurlijst45Bijlagen: draaiboek en werkvoorschriften en adviespropagatieschemas49

- 1

1InleidingDit literatuurverslag is opgesteld voor de Maasland Brouwerij Oss (MBO) en de Bijdehand Bierbrouwerij (BB) en is de onderbouwing van de hoofdstukken over gisthuishouding in het Draaiboek kwaliteitsmetingen voor de laborant in de Maasland Brouwerij Oss en de Werkvoorschriften voor de laborant in de Maasland Brouwerij Oss. Dit draaiboek en de werkvoorschriften zijn opgesteld om een gestandaardiseerde manier van werken mogelijk te maken op een ambachtelijke brouwerij waar geen geld of middelen zijn voor een state of the art kwaliteitscontrole.Een brouwerij heeft op het gebied van gebruik van gisten de keuze uit grofweg twee mogelijkheden: of het koopt voor elk brouwsel zijn gisten in, kweekt deze gisten op tot een acceptabele giststarter om in het gekookte en weer afgekoelde wort te inoculeren, of het kweekt en onderhoudt de eigen giststam zonder afhankelijk te zijn van een gistleverancier. Beide mogelijkheden kosten geld. Gisten inkopen kan kostelijk zijn doordat de geleverde gist nu eenmaal niet goedkoop aangeboden wordt, maar biedt wel de zekerheid van een nagenoeg besmettingsvrije start van opkweek tot giststarter. Bovendien kan op deze manier veel flexibeler omgesprongen worden in recepturen van de verschillende bieren die gebrouwen worden: Men kan door af te wisselen in giststam ook de smaak van het uiteindelijke bier flink benvloeden. Tegelijkertijd is men niet dezelfde hoeveelheid tijd en materiaal kwijt aan onderhoud van de eigen giststam als bij de tweede mogelijkheid. Eigen gisten bewaren en kweken biedt de brouwer daarentegen een enorme hoeveelheid eigen trots,een mooi visitekaartje en de kans een compleet eigen smaak in het bier te creren. Onafhankelijk van de commercieel aangeboden giststammen die vrijwel iedere kleine brouwer gebruikt, kan de brouwer die kiest voor een eigen giststam en alle rompslomp eromheen zichzelf op deze manier in de markt onderscheiden.Voor de brouwer die zich zoals de MBO zich op deze manier wilt onderscheiden, is dit literatuurverslag geschreven. Dit literatuurverslag legt uit hoe gisten bewaard moeten worden, hoe de gisten na bewaren opgekweekt moeten worden tot een goede giststarter. Vervolgens wordt uitgelegd hoe gisten na de hoofdgisting uit gistingstanks geoogst moeten worden en opnieuw ingezet in het volgende brouwsel, in de gisting op fles, of hoe de gisten terug terug bewaard moeten worden. Naast dit eerste stuk dat gaat over bewaren, propageren en oogsten legt dit verslag ook uit hoe de kwaliteit van de gist gecontroleerd en gewaarborgd worden i.v.m. de meestvoorkomende melkzuurbesmettingen bij brouwerijen. Want alhoewel bier een zeer microbiologisch stabiel product is, bestaan er wel degelijk micro-organismen die in de bier en wort niches kunnen overleven. Maar voordat we zover zijn dat we ons op deze twee epistels over gistgebruik en melkzuurdetectie gooien, wordt eerst uitgelegd wat biergisten zijn en hoe in grote lijnen het biergistmetabolisme eruit ziet.Oftewel voor de achtergronden omtrent het bewaren en de kweek en inoculatie van biergisten alswel de melkzuurdetectie die hierbij hoort, moet men dit literatuurverslag lezen. Wilt men de praktische uitwerking uitgelegd in de handelingen te doen in het laboratorium, moet men de Werkvoorschriften voor de laborant in de Maasland Brouwerij Oss lezen. En wilt men het nut en de plaats van al deze handelingen en meetmomenten in en rond het brouwproces kennen, dan is het Draaiboek kwaliteitsmetingen voor de laborant in de Maasland Brouwerij Oss. de te raadplegen bron.

1.1Mouten, brouwen en gistenTeneinde een duidelijk beeld te kunnen scheppen over de momenten rond het brouwproces waarop een laborant in de brouwerij zijn laborantenwerk verricht, wordt eerst uitgelegd hoe het brouwproces verloopt en welke termen voor elk stadium van het brouwproces gebruikt worden in dit verslag. Bovendien probeert de titel van dit hoofdstukje al duidelijk te maken dat het bier brouwen, mouten en bier vergisten los van elkaar staande processen zijn. Mouten wordt door weinig brouwers zelf gedaan; het omtoveren van gerst naar mout gebeurt extern bij mouterijen die voor vele brouwers mouten. Brouwen vindt plaats in het brouwhuis onder input van veel warmte, vergisting vindt plaats nadat het brouwen is afgelopen en de gehopte, gekookte wort afgekoeld is tot een gewenste vergistingstemperatuur. Het moutproces duurt een zes tot acht dagen, het brouwpooces zelf is al binnen zes uur klaar, de hoofdgisting duurt drie dagen tot zelfs twee weken afhankelijk van gevolgd recept. In het kader van melkzuurbesmettingen en andere onzuiverheden in bier zijn belangrijke aandachtspunten bij het brouwproces en het daaropvolgende gistingsproces de pH veranderingen die plaatsvinden en de hopgift: Deze zorgen samen met de alcohol ervoor dat bier een zeer onvriendelijk milieu is waarin geen enkel pathogeen micro-organisme kan overleven (Dowhanick, 1994; Storgrds, 2000). Dit betekent voor de kleine brouwerijtjes en amateurbrouwers dat bier per definitie niet ziekmakend kan zijn. Mits de grondstoffen maar vrij zijn van mycotoxinen en andere onzuiverheden die als gifstof het brouwproces overleven. Aangezien de meeste ingredinten ingekocht worden via instanties die zelf al zeer streng controleren op de aanwezigheid van ziekteverwekkende bronnen, behoeft de kleine brouwer hier zelf geen rekening mee te houden mits de grondstoffen netjes, droog en donker bewaard worden (Storgrds, 2000).

1.1.1BrouwprocesVoor veel ambachtelijke brouwers zijn de enige vier ingredinten die in bier gaan water, mout, hop en gist (Lewis, z.j.; Bamforth, 2000). Deze vier ingredinten vormen het basisrecept voor bier zoals wij dit in onze contreien kennen. Velerlei additieven kunnen bij bier gedaan worden afhankelijk van smaak, kleur, geureigenschappen, schuimstabiliteit en houdbaarheid, maar uitwijding naar additievenkant valt buiten de scoop van dit onderzoek. Een geschiedkundig overzicht van voedingsadditieven kan gelezen worden (Behre, 1998), overige literatuur kan zijn: (Lewis, z.j.; Lewis en Young, 2001). Het brouwproces wordt hieronder beschreven naar een mix van inzichten uit de volgende bronnen (Lewis, z.j.; Bamforth, 2000; Verhaert, 2006) en de praktijkervaring bij MBO. In dit hoofdstuk fungeert Fig. 1: Schematisch overzicht productieproces bier als kapstok waaraan het verhaal opgehangen wordt.

Figuur 1: Schematisch overzicht productieproces bier (Verhaert, 2006).1.1.2MoutenVoordat bier gebrouwen kan worden, moeten de gersten gemout worden. Mouten is een proces waarbij gerstzaadjes eerst in water geweekt worden zodat de zaden beginnen te ontkiemen. Tijdens deze ontkieming worden de in het zaad aanwezige zetmeel omgezet in suikers. Wanneer na vier tot zes dagen de ontkieming zover gevorderd is dat zo goed als alle zetmelen omgezet zijn in suikers, wordt de kieming gestopt door de zaden te verhitten met hete lucht van 55-220C. Dit heet eesten. Hoe heter geest wordt, hoe agressiever de het roostereffect en dus hoe donkerder de kleur van de gerst en hoe gekarameliseerder de smaak. Als na een tot anderhalve dag eesten de kieming gestopt is en de gerstzaden hun gewenste kleur en geroosterde smaak verkregen hebben, wordt de verhitting stopgezet en heten de gerstezaden vanaf nu gerstemout. Een typisch moutproces duurt dus zes tot acht dagen.1.1.3SchrotenVoordat mout in de beslagketel met brouwwater vermengd worden, moeten de moutzaden eerst opengebroken worden zodat de moutsuikers uit hun zaadjasje bevrijd worden. Dit openbreken van mout wordt gedaan in de schrootmolen waar de mout tussen twee walsen door geplet worden. Na het schroten kan gestart worden met het echte brouwen zelf.1.1.4BrouwenBrouwen is een simpele bezigheid waarbij vrij complexe gebeurtenissen plaatsvinden. Doel van brouwen is het vrijmaken van de voor fermentatie benodigde suikers uit de zetmeelvoorraad in de mout evenals het vrijmaken van alle in mout aanwezige aminozuren voor gistgroei tijdens fermentatie, alsook het vrijmaken van protenen die zorgen voor de afbraak van celwanden en zetmelen en die bovendien zorgen voor de schuimkraag in het bierglas. Deze suikers, aminozuren en enzymen zitten ingesloten in de celwanden en protenstructuren van de moutzaadjes en worden door de inrichting van het brouwproces gestript van celwand en protenen. Brouwen begint met het mengen van geschrote mouten met water; beslaan of ook wel maschen genoemd. Dit beslag wordt constant geroerd zodat zoveel mogelijk voedingsstoffen (vooral de lange, versuikerde zetmeelketens) in het brouwwater opgenomen worden. Het brouwwater wordt ook constant verwarmd naar verschillende temperatuurniveaus die elk enkele minuten tot drie kwartier vastgehouden worden teneinde verschillende enzymen uit mout optimaal hun taak te laten vervullen. In de MBO is een typisch brouwschema opgesteld uit de volgende temperaturen: Beslaan of inmaschen bij 45-50C, versuikeringsrust bij 63C, dextrineringsrust bij 72C en tot slot het afmaschen bij 78C. Na het afmaschen wordt het nu verkregen wort via een filter geklaard en naar de kookketel gebracht waar de geklaarde wort minimaal 40 minuten gekookt wordt en de eerste hopgift plaatsvindt waarna het brouwproces zelf klaar is en de vergisting kan beginnen. Belangrijk om op te letten tijdens het brouwen is dat de pH van het beslag tussen de 5,5 en 5,1 ligt zodat alle enzymen die tijdens het brouwen hun werk moeten doen dit ook kunnen (zie fig. 3: Verband tussen rusttemperaturen, werkzame enzymen en pH tijdens het brouwen). Wanneer de pH vanhet brouwwater zoals in de MBO aan de hoge kant is, is het aan te raden het brouwwater aan te zuren tot de gewenste pH bereikt wordt. Indien hier niet op wordt gelet kan het brouwhuisrendement laag uitvallen doordat niet alle enzymen optimaal hun werk kunnen doen en dus niet de gewenste hoeveelheid zetmeelsuikers afgebroken worden tot vergistbare suikers. Bovendien; hoe lager de pH is wanneer de wort in de fermentor komt; hoe minder micro-organismen kunnen concurreren met de biergisten om voedingsstoffen. Dus hoe minder kans op besmettingen.Het beslaan (geschrote mout en warm water mengen) gebeurt met brouwwater van 45-50C zodat tijdens het verder verwarmen tot 52C de gummyachtige -glucan verbindingen afgebroken worden. Indien -glucanverbindingen nog niet voldoende afgebroken zijn, ontstaat bij het inmaschen een zeer viskeus beslag. Tegenwoordig is via selectie de gerstsamenstelling van zodanige op het brouwproces ingerichte kwaliteit dat deze eiwitrust overbodig is en dus vaak wordt overgeslagen. Sommige brouwerijen, waaronder de MBO, beginnen toch nog te brouwen bij de traditionele inmaschtemperatuur van 45C; uit gewoonte, en voor de zekerheid. Maar slaan de ruststap bij 52C over en stomen direct door naar de 63C rust. Het is tijdens deze inmaschsstap dat alle versuikerde zetmeelketens, enzymen, protenen en aminozuren vrij in het brouwwater terechtkomen.De versuikerde zetmeelketens zijn eigenlijk lange vertakte en onvertakte ketens van glucosemoleculen aan elkaar. Bij de volgende twee temperatuurplateaus oftewel rustmomenten, worden deze lange ketens afgebroken door enzymen vrijgekomen uit mouten bij het inmaschen. Gisten kunnen vooral mono en disachariden fermenteren tot alcohol. Na de 52C gepasseerd te zijn wordt het niet visceuse beslag verder opgewarmd tot een versuikeringsrust bij 63C. Bij deze versuikeringsrust breekt -amylase de tijdens het mouten gevormde versuikerde zetmeelketens af tot maltose (zie fig. 2: De werking van en amylasen. Omdat -amylase een exo-enzym is, kan het enkel maltose afsplitsen van een zetmeelketen vanaf de uiteinden van de zetmeelketens. -amylase kan dus niet knippen ergens halverwege een zetmeelketen. De zetmeelketen bestaat overigens uit allemaal glucosemoleculen. En maltose is een disacharide bestaande uit twee glucosen.

Na de versuikeringsrust volgt de dextrineringsrust bij 72C waarin -amylase de zetmeelketens afbreekt tot sachariden van vaak 6 a 7 glucosen lang. Maar ook kan monosacchariden oftewel glucosen ook wel; dextrinen genoemd. -Amylase is een endo-enzym en splitst de zetmeelketen lukraak in de keten (zie fig. 2: De werking van en amylasen )en niet zoals -amylase enkel aan de uitzijden van de keten.

Figuur 2: De werking van en amylasen (Bommel, 1996). elk rondje stelt een monosacharide oftewel glucose molecuul voor. Een lange keten monosachariden is een zetmeelketen. Duidelijk is te zien dat -amylase vanaf het uiteinde van de keten maltosen afsplitst. En dat -amylase lukraak in de keten knipt en dat minimaal 2 glucosen na een vertakking (Gi in deze afbeelding) beide amylasen actief kunnen zijn hierbij minimaal een sacharide van 6 glucosen overlaat.Eigenlijk zou de volgorde van versuikeringsrust en dextrineringsrust dus precies andersom moeten verlopen. Dit is echter niet haalbaar omdat -amylase denatureert wanneer de temperatuur boven de 63C uitkomt en dus niet meer werkzaam is wanneer de dextrineringsrust bij 72C heeft plaatsgevonden. Dit gegeven en doordat beide amylasen geen polysacharide kunnen afbreken op minder dan twee glucoses van een vertakking van een versuikerde zetmeelketen vandaan (zie fig. 2: De werking van en amylasen), zorgt ervoor dat er na het brouwen ook nog andere suikers dan mono en di sachariden overblijven. Onder andere sachariden die niet door biergisten afgebroken kunnen worden. Deze zorgen voor de zoete body van bieren.

Na de dextrineringsrust komt het afmaschen bij 78C. Bij deze temperatuur vlokken alle eiwitten aanwezig uit op de bodem van de maschketel waardoor het bier al klaarder (helderder) wordt. Tevens wordt nu ook het roermechanism stilgezet zodat alle van het mout aanwezige vliesjes en andere nog vast, grote delen ook naar de bodem zakken. Dit uitvlokken (coaguleren) en bezinken van vaste deeltjes vormt een soort deken op de bodem van de maschketel. Deze bodem is geperforeerd als een zeef. Door dit uitvlokken en bezinken vormt de deken van eiwitten en vaste bestanddelen een fijnmazige filter welke gebruikt wordt om het wort te fileren van de draf (de deken aan vliesjes, vaste deeltjes en eiwitten). Doordat het wort nu gefilterd wordt door deze deken en het als helder wort uit de maschketel komt en in de kookketel stroomt, heet dit proces het klaren en het wort geklaarde wort. en de vaste bestanddelen die achterblijven in de maschketel heet draf en wordt vaak als diervoeder gebruikt.

De geklaarde wort komt nu aan in de kookketel waar de wort een kookproces van minimaal 40 minuten ondergaat. Tijdens dit kookproces wordt ook hop toegevoegd. Hop zorgt voor de bittere aromas en smaken zo typerend voor bijvoorbeeld oertype pilseners en andere bieren. Deze hop en het koken zorgen samen voor een antibacterile werking welke ervoor zorgen dat de wort zo steriel mogelijk is voordat het als gekookte en gehopte wort afgekoeld wordt tot een goede vergistingstemperatuur en naar de gistingstank wordt gepompt alwaar een reincultuur van biergist het nu geklaarde, gekookte en gehopte wort vergist tot jong bier (Bamfort, 2000). Hoppen inhiberen de groei van de meeste Grampositieve bacterin, maar de Gramnegatieven blijven onaangeroerd (Vaughan, OSullivan en Van Sinderen, 2005). Doordat bij good manufacturing practice (GMP) de leveranciers van grondstoffen en de brouwer zelf ervoor hebben gezorgd dat schadelijke bacterin en schimmels niet in de grondstoffen terechtgekomen zijn, is de kans op (myco) toxinen[footnoteRef:1] die het brouwproces overleven zeer klein en voor een kleien brouwer ook niet te controleren. Dus van de grondstoffen zelf kan geen ziekteverweker aanwezig zijn. Besmettingen als lactobacillen, wilde gisten etc. des te meer. Maar door het kookproces en de toegevoegde hop worden nagenoeg alle besmettingen gedood of de kans op groei ontnomen. Hierdoor kan het gekookte en gehopte wort als steriel beschouwd worden en is elke besmetting die in wort of bier terechtkomt een besmetting van de stadia na het wort koken. In het hoofdstuk over melkzuurbesmettingen worden de meestvoorkomende besmettingsmomenten en besmettende bacterin en wilde gisten behandeld waarna detectiemethoden voor de meest voorkomende melkzuurbesmettingen worden voorgesteld. [1: myco = schimmel en toxine = gif, dus met (myco) toxinen worden gifstoffen uit schimmels en uit andere organismen bedoeld]

Figuur 3: Verband tussen rusttemperaturen, werkzame enzymen en pH tijdens het brouwen (C., 2011). Te zien is dat de gewenste pH tijdens het brouwen tussen de 5,5 en 5,1 ligt. Zodat alle enzymen die tijdens het brouwen vrijkomen en actief zijn zich ook kunnen manifesteren. Qua temperaturen is duidelijk te zien dat beslaan of inmaschen bij 45-50C gebeurt (-glucanase), gevolgd door de versuikeringsrust bij 63C (-amylase), dextrineringsrust bij 72C (-amylase) en tot slot het afmaschen bij 78C om alle nog aanwezige zetmelen, eiwtitstructuren en onzuiverheden uitvlokken en op de bodem van de ketel als filterbed fungeren.

1.1.5VergistenIn de MBO en BB alsook vele andere kleine brouwerijtjes vindt gisting plaats in twee stadia: de hoofdgisting in grote gistingstanks. En de tweede gisting oftewel nagisting op fles/vat. Tijdens de hoofdgisting wordt vooral alle tijdens het brouwen gevormde vergistbare suiker omgezet in CO2 en ethanol. Wanneer deze hoofdgisting klaar is na drie dagen tot twee weken en er al sprake is van jong bier, blijft het bier nog een tijdje gekoeld liggen waardoor de gisten bezinken en het bier weer helder wordt. Dit helder worden heet klaren en is ook te zien in afb. 1. Wat afb. 1 niet laat zien is de nagisting op fles of vat omdat afb. 1 een typisch vergendustrialiseerd brouwproces weergeeft waarbij de brouwer de mogelijkheid heeft bier onder druk op fles te zetten. Kleinere brouwerijen hebben hier de uitrusting niet voor en moeten de hoofdgisting dus echt gebruiken voor alcoholvorming en klaring van het bier. En de nagisting op fles wordt gebruikt om de CO2 vorming in de fles op te vangen en zo bier onder druk en dus met mooie koolzuurbelletjes te kunnen serveren.

1.1.6HoofdgistingIn de MBO was de taak van de stagiair vooral gericht op het ontwikkelen van een duurzame gisthuishouding. In het komend diepergravend literatuuronderzoek worden eerst de probleem en doelstellingen geformuleerd. Waarna uitgebreid literatuuronderzoek naar gisten en melkzuren de basis vormen voor het opstellen van bezigheden in het gistlaboratorium teneinde te komen tot een duurzaam, in de MBO toepasbaar gist bewaar, propagatie, ent en oogstsysteem inclusief de nodige melkzuurdetectie. Tot slot worden bovenstaand brouwproces en het komend literatuuronderzoek met elkaar verweven in een draaiboek en werkvoorschriften voor brouwerijlaboranten.

1.1.7Nagisting op flesWanneer in de MBO de hoofdgisting afgelopen is en het bier met wat extra suiker en korrelgist gebotteld is, gaan de flessen de warme ruimte in voor nagisting op fles. De warme ruimte had een temperatuur van 20-25C waardoor de gisten snel de verse suikers fermenteren en hierdoor het alcoholpercentage in de fles nog enkele tiende procenten opgekrikt wordt. Maar de twee belangrijkste redenen van deze warme nagisting is in eerste instantie de drukopbouw doordat CO2 niet meer kan ontsnappen uit de fles. Hierdoor wordt supersaturatie van CO2 in het bier bereikt en dit zorgt voor het oplossen van CO2 in het bier waardoor de mooie koolzuurbubbels ontstaan bij het openen van de fles. De tweede reden is de VDK rust. Bij deze VDK rust worden vicinale diketonen gereduceerd tot minder smaakbedervende stoffen (Boulton en Quain, 2001). Vicinale diketonen zijn een groep van esters en alcoholen die sterke butterscotch, fruit, rubber, schimmel en andere off-flavours aan bier geven (Boulton en Quain, 2001; Hughes en Baxter, 2001) de belangrijkste VDK is 2,3-butanedion ook wel diacetyl genoemd. Vaak wordt diacetyl in verband gebracht met Lactobacillus en Pediococcus besmettingen, maar dit is niet altijd waar. Een onvolledige hoofdgisting (Boulton en Quain, 2001) is zeker bij commercile pilsbrouwers in Nederland ook vaak de reden voor deze off- flavours. De warme VDK-rust wordt in de MBO dus gepaard met de nagisting op fles. De nagisting op fles is klaar na ca. twee weken wanneer de druk in de flessen gestegen is tot drie bar; teken dat de supersaturatie voldoende bereikt is.

1.1.8Probleemstelling, doelstelling en subdoelstellingen.Probleemstelling is zoals in het voorwoord en de inleiding uitgelegd, de MBO beschikt niet over een goede gisthuishouding om de gisten op veilige wijze te kunnen bewaren, activeren, propageren, enten en oogsten.Doelstelling is dus: Een op papier duurzaam gist bewaar, activatie, propagatie ent en oogstsysteem en een melkzuurbesmettingsdetectie op te stellen. In de term duurzaam uit vorige zin zit gesloten dat minimaal een jaar gebrouwen moet kunnen worden met de brouwerij eigen moedergist geleverd door de externe gistdatabank waar de brouwerij zijn gist in back up houdt. En met de woorden op papier worden de volgende zaken uitgesloten: Er hoeft na dit literatuurverslag geen lopend laboratorium achtergelaten te worden. Enkel aanbevelingen voor een mogelijk implementeerbare gisthuishouding verkregen uit literatuuronderzoek worden dus gegeven zonder dat deze uitgebreid statistisch met zelfuitgevoerde proeven onderbouwd moeten zijn. Ook uitgesloten uit dit literatuuronderzoek zijn de stappen te nemen wanneer besmettingen of andere regelmatigheden gesignaleerd worden. Dit soort vervolgonderzoeken kunnen door andere studenten gedaan worden.Subdoelstellingen die uit deze probleem- en doelstelling naar voren komen kunnen als volgt geformuleerd: Onderzoek hoe de MBO zijn geoogste of van de databank verkregen gisten kan bewaren. Onderzoek hoe de MBO zijn gisten uit bewaarstand kan activeren voor propagatie Onderzoek hoe de MBO zijn gisten kan propageren. Onderzoek hoe de MBO zijn gisten kan enten. Onderzoek hoe de MBO zijn gisten kan oogsten. Onderzoek hoe de MBO melkzuurbesmettingen kan detecteren. En bundel al deze aanbevelingen in een draaiboek en werkvoorschriften voor de laborant in de Maasland Brouwerij Oss.Alle doelstellingen geformuleerd in de Onderzoek hoe vorm worden in dit literatuurverslag beantwoord. De laatste doelstelling die behaald moet worden gaat over de bundeling van de aanbevelingen uit dit literatuurverslag in het Draaiboek kwaliteitsmetingen voor de laborant in de Maasland Brouwerij Oss en de Werkvoorschriften voor de laborant in de Maasland Brouwerij Oss. Dit drieluik vormt het eindproduct te overhandigen aan Hogeschool Inholland, de Maasland Brouwerij Oss en de Bijdehand Brouwerij.

2Literatuuronderzoek gisten en melkzuurbacterin: de inleiding

Ever since man became sapient he has devised means of intoxicating himself, principally in order to create, albeit temporarily, a more pleasurable milieu. (Hornsey, 2003).

2.1Introductie tot bier; een beknopte geschiedenisHet citaat van Hornsey waarmee dit hoofdstuk begint, doet vermoeden dat onze mensheid al sinds zijn prille geboorte doorvloeid is van bier, alcoholische dranken en overige geestesverruimende middelen. Vermoedelijk is dit ook zo. Hornsey start zijn verhaal met aanwijzingen en speculaties die magische paddenstoelen de eer geven de eerste geestesverruimende middelen der mensheid te zijn. Maar door hun sterk seizoensafhankelijke beschikbaarheid waren andere, meer jaarrond verkrijgbare bronnen van levensvreugd gewenst. Deze magische paddenstoelen waren vooral in de mode bij nomaden die leefden van wat ze onderweg tegenkwamen. De vondst van rot (lees: gefermenteerd) fruit en de opkomst van de boerenstiel gaven echter mogelijkheid tot het kweken van allerlei interessante, fermentabele grondstoffen die jaarrond verconsumeerd kunnen worden. Via dwalingen naar papaver en andere middelen komen we terecht in het Mesopotamie van 6000 v Chr. waarover een historische consensus heerst; hier werd bier gebrouwen. Een meer selecte groep historici vermoed overigens dat nog eerder dan dit moment ook bier gebrouwen werd in een vergane Aziatische beschaving. Kortom; de geschiedenis van het bierbrouwen is minimaal 8000 jaar oud (Hornsey, 2003). Het is echter pas sinds Pasteur zijn Etudes sur la bierre (Pasteur, 1876) bekend dat microscopische gisten volledig verantwoordelijk zijn voor de alcoholvorming in bier. Voordien was de spontane alcoholvorming een even groot mysterie als de generatia spontanea. Pas sinds 1908 werd de eerste reincultuur door Hanssen in de Carlsbergbrouwerij gesoleerd en gebruikt in het brouwen (Rainbow en Float, 1983; Hough en Briggs, 1975; Priest en Campbell, 1996). Deze allereerste gesoleerde giststam was een pilsgist, dus een gist voor lage gisting, en doordat dit in de Carlsbergbrouwerij geschiedde, kregen ondergistende stammen de naam van deze pilsbrouwerij mee: S. carlsbergensis.Net zolang als men bier brouwt, brouwt men melkzuur. Melkzuurbacterin en andere besmettingen in bier zorgen voor een fris tot zelfs zware zuursmaak in het bier. Bierfermentatie en melkzuurbesmettingen gaan hand in hand in de geschiedenis. Lambiekbieren, geuezes, en verscheidene andere bieren profileren zich met deze besmettingen en bijbehorende smaakevoluties. Bij hen is dit gewenst. Maar de meeste brouwerijen hebben liever niet deze melkzuursmaak in hun bier en zien dit dus ook als ongewenste verontreinigingen. Het is pas sinds bovenstaande ontdekkingen van Pasteur en Hanssen dat gisten en melkzuren ontdekt werden en men begon te leren welke micro-organismen allemaal zorgden voor de zich manifesterende mysterin der generatia spontanea. Het is vanaf dat moment ook dat men leerde het brouwproces te controleren en smaken te verfijnen en opbrengsten te vergroten. Het is die kennis die hier via literatuuronderzoek gebundeld wordt voor de MBO en de BB.

Deel 1: Gisthuishouding3Biergisten; boven en ondergistende stammenGisten zijn onder te verdelen in sporenvormende en niet sporenvormende, eencellige (Rainbow en Float, 1983; Narziss, 1986), gramnegatieve, facultatief anaerobe (Priest en Campbell, 1996; Lewis en Young, 1996) fungi achtigen. Biergisten en wijn en bakkersgisten behoren tot de sporenvormende groep (Rainbow en Float, 1983; Narziss, 1986; Priest en Campbell, 1996; Lewis en Young, 1996) der Sacharomycetaceae (Priest en Campbell, 1996). Vrij vertaald uit het Latijn wilt Sacharomycetaceae zoveel zeggen als suikerschimmel denk maar aan Sacharo ofwel suiker en myces ofwel schimmel. Sacharomyces cerevisiae (suikerschimmels in bier) zijn dan weer onder te verdelen in ondergisten met de naam Sacharomyces carlsbergensis of Sacharomyces uvarum genoemd en bovengisten met de naam Sacharomyces cerevisiae) (Rainbow en Float, 1983; Narziss, 1986; Priest en Campbell, 1996; Lewis en Young, 1996, Baetsl, 2007). S. cerevisiae wordt al sinds mensenheugenis gebruikt voor de bereiding van alcoholische dranken en/of het rijzen van deegwaar hoewel men zich hier niet bewust van was getuige het voorgaand inleidinkje. S. carlsbergensis werd daarentegenover voor het eerst gesoleerd en in reincultuur opgekweekt werd in 1908 door Hansen in de Carlsbergbrouwerij (Rainbow en Float, 1983; Hough en Briggs, 1975; Priest en Campbell, 1996). De onderverdeling in S. cerevisiae en S. carlsbergensis is gebaseerd op drie grote verschillen in fermentatieve eigenschappen (Rainbow en Float (Ed.), 1983; Hough en Briggs, 1975). De eerste eigenschap is de dikkere schuimkop van bovengistende dus S. cerevisiae stammen ten overstaan van lage gisten dus S. carlsbergensis die niet dezelfde activiteit vertonen en bijgevolg een niet zo dikke gistkop vormen. Dit als gevolg van een verschil in de celwandsamenstelling tussen S. cerevisiae en S. carlsbergensis stammen. Bij S. cerevisiae stammen treedt meer Sprossverband op. Dit is het fenomeen dat S. cerevisiae na het budden nog aan elkaar blijft hangen waardoorgroepjes van 8-15 cellen ontstaan (Weustenraed, 1986). Door deze andere celwandsamenstelling en het Sprossverband, blijft de inwendig geproduceerde CO2 hechter gebonden aan de celwand en tussen de verschillende aan elkaar hangende celwanden dan bij S. carlsbergensis stammen waardoor S. cerevisiae bij grote vergistingsactiviteit dus met het uit het bier ontsnappende CO2 aan het oppervlak van het bier komt. Een tweede verschil is te vinden in de vergistingtemperatuur die gebruikelijk is bij het vergisten van bieren van hoge of lage gisting. Een belangrijk derde verschil in metabolische producten is het vermogen van S. carlsbergensis raffinose af te breken tot D-fructose en melibiose om vervolgens de melibiose in D-galactose, D-glucose af te breken. S. cerevisiae kan tussenproduct melibiose niet verder afbreken naar D-galactose en D-glucose en heeft dus als eindproducten melibiose en D-fructose (Zie figuur XX.) (Baetsl, 2007; Dirksen, 2008) En doordat er zo meer onvergistbare suikers overblijven in de gisttank met hoge gisten, kunnen bovengisten een meer zoeter smakend, voller bier maken. Hoewel dit laatste natuurlijk ook sterk afhankelijk is van gebruikte mouten, gebruikt brouwschema en andere parameters. Een niet te onderschatten eigenschap die biergist onderscheidt van andere gisten, is de mate van flocculatie tijdens vergisting. Doordat biergist traditioneel uit gistend bier geoogst wordt en genoculeerd op nieuw wort, is op deze manier (on)bedoeld geselecteerd op biergisten die genoeg flocculeren om een mooie crop (brouwterm voor het gistbezinksel van S. carlsbergensis en S. cerevisiae of de gistkop van S. cerevisiae die geoogst wordt voor renoculatie en of bewaring) te vormen en tegelijkertijd genoeg nog niet uitgeflocculeerde gist in het jong bier houdt voor een secundaire nagisting op fles (Lewis en Young, 1995).In de Maasland Brouwerij Oss worden overigens hoge gisten gebruikt voor het vergisten van gehopt wort tot bier en in de BB worden zowel boven en ondergistende stammen gebruikt afhankelijk van het gewenste resultaat. Maar aangezien moderne bovengisten via verregaande selectie en gekoelde fermentaties ook ondergistende eigenschappen kunnen vertonen qua sedimentatie eigenschappen en er verder qua vergisting enkel onderscheid is qua melibiosevergisting, zullen we in de rest van het verslag de term gist of biergist gebruiken zonder rekening te houden met het verschil tussen de S. crlsbergensis en cerevisiae tenzij anders vermeld.

4Levenscyclus gistenVier fases zijn te onderscheiden in de levenscyclus van biergisten tijdens de fermentatie van wort tot bier. Een lag fase, groeifase, fermentatiefase en een sedimentatiefase. Dit hoofdstukje over de levenscyclus van gisten komt tenzij anders vermeld uit het artikel over trehalose en glycogeen in biergisten van Bolat (2008) wegens het kort, bondig, up to date en duidelijk leesbaar karakter van de tekst.In de eerste fase moet de gistcel nog wennen aan zijn nieuwe, wortsuikerrijke omgeving. In deze wenfase, lag fase genoemd, zorgt het aerobe milieu van wort voor de trigger om glycogeen te dissimileren (afbreken) tot glucose. Deze glucose wordt straks in de groeifase gebruikt wordt voor reproductie van de gistcel. De wortsuikers uit het wort kunnen nog niet gedissimileerd worden door gebrek aan membraanfunctionalteit op dit moment. Wanneer te weinig glycogeen aanwezig is in de gistcellen, zal de start van groei en fermentatiefase langzamer verlopen waardoor de kans op overwoekering door besmettingen groter wordt. Bovendien worden bij een te lage glycogeenspiegel veel vicinale diketonen (VDK) gevormd. Dit zijn sterke off flavours in bier (Bamfort, 2008). Tijdens deze fase ziet de brouwer nog niets gebeuren in de gistingstank.In de groeifase oftewel respiratiefase worden de glucosevoorraden, net opgebouwd uit de afbraak van glycogeen in de lag fase, gebruikt om te reproduceren. Op dit moment komt de eerste schuimlaag op het wort te staan door het ontsnappend CO2. Gemiddeld reproduceert een S. cerevisiae zich vier tot zes maal tijdens zijn levenscyclus in een gistingstank en een S. carlsbergensis drie tot vier maal (Wuestenraed, ..)De fermentatiefase start wanneer alle zuurstof uit het wort is opgebruikt tijdens de groeifase. Tijdens de fermentatiefase bevindt de gist zich zo verdeeld en ongeflocculeerd mogelijk in suspensie zodat een zo groot mogelijk gistoppervlak in contact staat met het wort. In deze fase is stevig geborrel en een stevige schuimkraag op het wort te zien wegens de hoge suiker naar CO2 en ethanol omzettingen die plaatsvinden. Deze schuimkraag begint uit te dunnen en in te zakken wanneer de gisten beginnen te flocculeren en de sedimentatiefase ingaat.Tijdens de fermentatiefase veroorzaakt de gist een zeer onvriendelijk milieu voor zichzelf: zuurstof is opgebruikt waardoor van aerobe groei naar anaerobe fermentatie overgegaan moet worden. Wortsuikers raken op, CO2 en ethanolgehalten schieten de lucht in, aminozuren en andere bouwstenen in het wort raken op. Kortom; de gist is zichzelf aan het vergiftigen. Om zich tegen deze moeilijke omstandigheden te beschermen bouwt de gistcel weer zijn eigen glycogeen op en bereidt het zich voor op een soort winterslaap; de stationaire fase. Een vijfde fase waarin vrijwel geen celactiviteit is in de hoop op betere tijden. Tegelijkertijd bouwt de gistcel ook zijn trehalosegehalte op. Lange tijd is gedacht dat trehalose net als glycogeen als energieopslag werd gebruikt. Dit is echter weerlegt doordat aangetoond is dat bij de splitsing van trehalose geen ATP vrijkomt terwijl de synthese ervan wel een ATP kost (Mnch, Krger en Stahl, 1995). Wel heeft trehalose een beschermende werking op vele gebieden. Het beschermt de cel tegen hittestress, uitdrogingsstress en toxische stoffen, osmotische stress en tegen oxidatieve stress. En zorgt voor een juiste vouwing en reparatie van protenen (Gibson et al., 2007).

5Suikermetabolisme in biergistGist is de grootste vriend van de brouwer, toch hebben gist en brouwer verschillende doelen voor ogen. De brouwer gebruikt gisten voor hun ethanol en koolzuurgasproductie uit wortsuikers. Gisten zelf gebruiken de wortsuikers liefst voor groei. Groei door de wortsuikers te gebruiken als energiebron voor biosynthese, stikstof voor protenesynthese en zuurstof voor assimilatieprocessen. Ethanol en CO2 zijn toxische afvalstoffen voor de gistcel (Baetsl, 2007). Daarom zal voor de propagatie van gist een zeer goede O2 toevoer en CO2 afvoer moeten plaatsvinden. Zeker met de trehalose en glycogeen opbouw van vorig hoofdstukje in het achterhoofd. Eerder zijn de termen vergistbare en onvergistbare suikers genoemd. Een voor S. cerevisiae groep onvergistbare suikers zijn de pentoses. De meest in wort aanwezige vergistbare suikers zijn maltose (59%), maltotriose (21%), glucose (14%), sucrose (6%) en fructose (1%) (Hough, Briggs en Stevens, 1975). Al deze suikers worden enzymatisch afgebroken tot vooral glucose en een beetje fructose. Dit zijn de C6H12O6 suikers. Deze suikers worden vervolgens weer verder afgebroken via allerlei metabole routes tot CO2 en ethanol. Vele metabole routes zijn er, bij elke gisstam heeft net weer iets andere verhoudingen in de mix van metaboler routes. Dat is goed te constateren wanneer proefsgewijs een en dezelfde wortbatch opgedeeld wordt naar verschillende gisttanks en elke gisttank zijn eigen giststam gepitched/genoculeerd krijgt. In elk gistvat komt een organoleptische ander bier waarbij niet alleen het alcoholgehalte kan verschillen per giststam maar ook zullen andere chemische omzettingen plaatsgevonden hebben in de gistcel wat tot gevolg heeft dat er dus ook andere smaken gevormd zijn. Voorbeelden van belangrijke metabole routes in biergisten zijn de Embden Myerhof Parnas (EMP) ook wel glycolytische route genoemd, de hexose-monofosfaat (HMP) route, Krebs cyclus, de waterstof acceptoren en respiratoire keten, de Pasteur en Crabtree effects, productie van diketonen en fusel alcoholen, ester en lipidenvorming (Weustenraed, 1986; Hough, Briggs en Stevens, 1975) en ga zo maar door. Voor een overzicht van deze en andere metabole routes in biergisten kan het boek Malting and Brewing science (Hough, Briggs en Stevens, 1975) worden geraadpleegd; diepgaande analyse hiervan valt buiten de scoop van dit verslag. Oppervlakkig wordt in onderstaande kopjes wel de belangrijkste metabole route voor alcoholvorming behandeld: de glycolyse van glucose, gevolgd door de alcoholische fermentatie.5.1GlycolyseVoor vele micro-organismen, planten en dieren is glycolyse een belangrijke metabole route waarbij energie uit glucose opgevangen wordt in 2 ATP door glucose te splitsen tot 2 pyrodruivenzuur. Nadat energie gewonnen is via glycolyse, kunnen vele organismen verschillende dingen doen met het ontstane pyruvaat. Zo kunnen alle aerobe organismen net als mensen het pyrodruivenzuur gebruiken om via de citroenzuurcyclus (in literatuur ook wel TCA cycle of Krebs cyclus genoemd) in mitochondria energie te winnen en in ATP vast te leggen. Gisten en melkzuurbacterin kunnen dit ook. Maar gisten kunnen naast deze aerobe omzettingen ook anaerobe fermentaties volbrengen mist in anaeroob milieu natuurlijk- . Gisten en melkzuurbacterin gebruiken net als mensen de glycolyse om suiker om te zetten in pyrodruivenzuur, energie en protonen, maar gisten en melkzuurbacterin kunnen daarna in een anaeroob milieu via alcoholfermentatie het pyrodruivenzuur omzetten in ethanol en via melkzuurfermentatie in lactaat. Hierbij spreekt voor zich dat door selectie bij biergisten de nadruk ligt op ethanolvorming en dat melkzuurbacterin vaak de nadruk leggen op melkzuurproductie. Fig. 4: Glycolyse oftewel; Embden Meyerhof Parnas route laat de volledige glycolyse inclusief de werkzame enzymen zien. Let vooral op de protonen die opgenomen worden, de 2 ATP die uiteindelijk ontstaat en het eindproduct pyrodruivenzuur (in het Engels pyruvate genoemd). Na deze tien omzettingen kunnen biergisten in anaeroob milieu dus melkzuur vormen, of ethanol. Onder het volgende kopje wordt de ethanol vorming gellustreerd.

Figuur 4: Glycolyse oftewel; Embden Meyerhof Parnas route (Beukema, z.j.). De blauwe namen zijn de namen van de stoffen die ontstaan, de grijze namen zijn de namen van de enzymen die de omzettingen katalyseren en in het paars staan de proton of energie arme en in het rood de proton of energierijke H+ en energiedragers.

5.2AlcoholfermentatieOnder vorig kopje is de vorming van pyrodruivenzuur behandeld. Fig. 5: Glycolyse en aerobe assimilatie of anaerobe fermentatie in biergist laat zien dat in biergist na de glycolyse of de respiratoire- (ademhalings-) keten gevormd wordt wanneer de biergist zich in een aeroob milieu bevindt. Dit is dus bijvoorbeeld de bedoeling tijdens de propagatie van gisten: dat o.a. veel biomassa, glycogeen en trehalose opgebouwd worden. Wanneer de brouwer dit aerobe milieu echter wegneemt in de gistingstank, is het de bedoeling dat de biergisten CO2 en alcohol aanmaken in de vorm van ethanol. Fig. 6: Omzetting van pyrodruivenzuur naar ethanol laat de twee stappen zien waarmee pyrodruivenzuur gefermenteerd wordt tot ethanol. Figuur 5: Glycolyse en aerobe assimilatie of anaerobe fermentatie in biergist. (Alba-Lois, en Segal-Kischinevzky, 2010). Na glycolyse volgt f de aerobe respiratoire keten in mitochondrin met de citroenzuurcyclus, f de anaerobe fermentatie tot CO2 en ethanol.

Figuur 6: Omzetting van pyrodruivenzuur naar ethanol (Beukema, z.j.). CO2 wordt afgesplitst van pyrodruivenzuur waarbij acetaldehyde gevormd welde verder wordt gereduceerd tot ethanol.

5.3Stop van fermentatieDrie redenen voor de stop van een goede gisting zijn aan te wijzen (Rainbow en Float, 1983): suiker en of stikstof tekorten in wort waardoor de gist verhongert. Alcoholverstikking doordat het alcoholgehalte te hoog wordt voor de gist om goed in te gedijen, let wel op; CO2 kan niet gebeuren doordat de gisttank waarin de hoofdgisting plaatsvindt niet hermetisch is afgesloten, maar via een waterslot het overtollige CO2 uit de tank laat ontsnappen. En het voortijdig settelen of flocculeren van gisten door onjuiste gistkeus bij het worttype of door mutaties in flocculatie eigenschappen van de giststam die de overhand krijgen (Powel en Diacetis, 2007).

6Gisten propagerenWanneer in een brouwerij gesproken wordt van propagatie dan heeft men het over het voortplanten van gisten teneinde een te inoculeren giststarter te bekomen. Een giststarter klaar voor inoculatie van S. cerevisiae bevat genoeg gistcellen om het te inoculeren wort te voorzien van 6-15 x 106 gistcellen/ ml wort afhankelijk van de gravitatie van de in te zetten wort (De Rouck, z.j.;Broderick, 1977; Dowhanick, 1994; Boulton en Quain, 2001; Lewis en Young, 2001; Baetsl,2007), en de gezondheid van de gisten etc. (Broderick, 1977; Boulton en Quain, 2001; Lewis en Young, 2001). Bij het inzetten van S. carlsbergensis, wordt zelfs gesproken van 15-30 x 106 viabele gistcellen/ml wort. Grofweg drie bronnen voor inoculatiegist bestaan er:1. Vers geoogste gist uit een gistvat waarin bier vergist wordt2. Ingekochte natte gist van een andere brouwerij of ingekochte droge gist of natte gist van bijvoorbeeld Brewferm of Wyeast3. Van slant of andere mediumvorm opgekweekte reincultuur uit eigen laboratorium6.1Vers geoogste gistVers geoogste gist hoeft niet gepropageerd te worden wanneer het geoogste volume verse gist genoeg gezonde gistcellen bevat om als giststarter genoculeerd wordt in nieuw wort. Belangrijkste aandachtspunten bij het herpitchen van geoogste gisten is dat de gist gekoeld wordt tot 4C, z.s.m., d.w.z. binnen enkele uren na oogsten, liefst binnen 24 tot maximaal binnen 48 uur na oogsten nieuwe wort te metaboliseren krijgt (De Rouck, z.j.; Broderick, 1977; Dowhanick, 1994; Boulton en Quain, 2001; Lewis en Young, 2001; Baetsl, 2007). En dat de gisten gewassen worden (De Rouck, z.j.; Broderick, 1977; Dowhanick, 1994) vlak voor inoculatie plaatsvindt. Uitgebreider zal hierop worden ingegaan in de hoofdstukjes Gisten oogsten en herpitchen en gisten wassen.6.2Ingekochte gistIngekochte gist van een andere brouwerij of andere bron zoals bijvoorbeeld de commercile Wyeast Laboratories en Brewferm gistleveranciers hoeft niet altijd de juiste hoeveelheid gistcellen te bevatten om een succesvolle vergisting te kunnen afdwingen. Alhoewel wyeast literverpakkingen aan gistsuspensie aanbieden met 12 x 108 viabele gistcellen/ml (Anoniem, z.j. 1). Dit is volgens de literatuur voldoende giststarter voor directe vergisting van 1 hL wort. Voor een brouwsel in de MBO waar een 3hL en 20 hL brouwinstallatie staan, kunnen dus 3 van deze zakken al voldoende zijn om de 3 hL installatie te pitchen onder belkuchting en gistvoeding waarna wanneer in de 3 hL het gistgetal weer aangegroeid is tot ca. 10-15 x 106 viabele gistcellen kan de 3hL batch gebruikt worden om een 20 hL batch te vergisten. Nadeel van dit systeem is de hoge prijs van een zon zak. Via Brouwland kost een gistsuspensie al 210,- (Anoniem, z.j. 2). Uiteindelijk kost de gist in een 20hL brouwsel al 630,- die weer terugverdiend moeten worden in de verkoop van het bier. Daarom worden vaak kleinere giststarters gekocht die eerst gepropageerd worden alvorens in het te vergisten brouwsel genoculeerd worden. Een passend propagatiesysteem voor gekochte gisten is op te stellen met het propagatieschema uit het volgend kopje: Propagatieschema voor van medium opgekweekte reincultuur.6.3Propagatieschema voor van medium opgekweekte reincultuurVele verschillende propagatieschemas voor biergisten zijn voorgesteld in de literatuur. Alle schemas zijn erop gericht gisten op een zo comfortabel mogelijke manier te laten vermeerderen met als doel een giststarter te bekomen die genoeg gezonde gistcellen/ml oplevert. Gezonde gistcellen zijn cellen met liefst zo min mogelijk budding scars, een grote vacuole (Broderick, 1977), maar vooral zoveel mogelijk glycogeen en trehalose (De Rouck, z.j.; Baetsl, 2007; Cheong, Wackerbauer en Kang, 2007; Bolat 2008). Glycogeen is de energiedrager van de gistcel en wordt opgebouwd bij aerobe assimilatie en wordt afgebroken gedurende de lag fase waarin gisten zich bevinden wanneer ze in een nieuw mileu terechtkomen zoals bij fermentaties het geval is: Het aerobe milieu van tijdens propagatie wordt vervangen voor een anaeroob milieu in de gisttank. Op dit moment breekt de gistcel eerst zijn glycogeenreserven af om zich te kunnen vermenigvuldigen alvorens te starten met de assimilatie van wortsuikers (Bolat, 2008). Om deze reden is de glycogeenspiegel de belangrijkste beperkende factor van de gistcel (De Rouck, z.j.; Broderick, 1977; Dymond, 1994; Boulton en Quain, 2001; Lewis en Young, 2001; Baetsl, 2007; Bolat, 2008). Hierdoor is bij propagatie de beluchting belangrijk; om de aerobe assimilatie van glycogeen en trehalose te bewerktstelligen. Verschillende propagatieschemas worden voorgesteld in de literatuur. Uiteindelijk draait het allemaal om het opkweken van een reincultuur uit een opslag medium/slant naar een voldoende grote giststarter om een brouwsel te kunnen vergisten. Literatuurstudie wijst uit dat S. carlsbergensis te inoculeren uitgegaan moet worden van een gistgetal in het genoculeerde wort voor vergisting tot pils van 15-30 x 106 gistcellen/ml wort en voor S. cerevisiae ligt deze gistgetal op 6-15 x 106 gistcellen/ml wort (Weustenraed, 1986; Dowhanick, 1994; Rouck, De, 1994; en vele andere bronnen). Het pitchgetal dat gebruikt wordt is natuurlijk altijd onderhevig aan de wensen van de brouwer en het stamwortgehalte van de wort etc.. Maar in dit verslag wordt gekozen voor 15 x 106 gistcellen /ml wort. Dit is; het wort dat vergist wordt tot bier moet dit gistgetal bevatten. Wanneer bij elke stap tijdens propagatie gewerkt wordt met een factor 10 betekent dit dus dat de laatste propagatiestap voor de inoculatie dus 15 x 107 gistcellen per ml te inoculeren wort moet tellen. En we starten van een cultuurslant met slechts enkelecellen. In bijlage 3: adviespropagatieschemas zijn enkele propagatieschemas uit literatuur uitgetekend. Een eigen mix van deze schemas wordt hier voorgesteld. Hierbij is getracht de handelingen zo simpel mogelijk te houden en de benodigdheden hiervoor af te stemmen op de in de MBO aanwezige apparatuur. Ook is rekening gehouden met de volgende kanttekeningen van de Master Brewers Association America (MBAA) (Dowhanick, 1994) tenzij anders vermeld: Hoe groter de propagatiestappen, hoe minder arbeidsintensief het propageren is, maar ook hoe meer stress veroorzaakt wordt aan de gisten door de sterke verschillen in concentraties, pH en omsotische druk etc.. Stappen waarbij de gisten in 5 tot 100 keer grotere volumes worden gemengd zijn in literatuur vermeldt (Priest en Campbell, 2003). Liefst wordt gewerkt met zoveel mogelijk jonge gistcellen; te verkrijgen door te starten met een laag gistgetal zodat zoveel mogelijk nieuwe gisten aangemaakt moeten worden. Hierbij geldt: een tot vijf budding scars per gistcel zijn jonge gisten, 20-30 budding scars zijn oude gisten; budding scars te tellen met lichtmicroscoop. Gezonde gisten waren hierboven al uitgelegd (een grote vacuole en geen korreligheid of autolyse, vast te stellen via lichtmicroscoop). Viabiliteit kan vastgesteld worden via het omslachtige methyleenblauw of rhodamineB -kleuring of via een recenter meer in zwang komende methyleen-violet kleuring (Verhaert, 2006). Gepropageerde gist moet belucht worden alvoren gepitched te worden, vers geoogste gist uit een andere bervergisting moet belucht worden, enkele uren laten rusten en daarna pas gepitched worden. Verlies vooral niet uit het oog dat een besmetting foute boel is, maar niet onoverkomelijk. Als de besmetiing niet afwijkt van wat vroeger wel gewerkt heeft voor fermentatie kan het propagaat gewoon worden ingezet; de ervaring leert wat wenselijk is en wat niet. Immers licht de smaakdrempel voor organoleptische melkzuurbesmetting op gemiddeld 400 ppm melkzuur en andere biervervuilende bacterin in bier (Menz et al., 2010).

De tijden hier aangegeven zijn richtlijn; bij gebruik van gezonde gisten, het normale wort uit de eigen brouwerij en de voorgeschreven temperaturen en zuurstoftoevoer zou met dit stappenplan het gistgetal van ca 15 x 107 gistcellen/ml te inoculeren wort behaald moeten worden.

7Gisten wassenGeoogste gisten die via microscopische bepalingen gezond genoeg bevonden zijn voor herpitchen/herinoculeren in het nieuwe brouwsel, worden door vele brouwerijen zonder uitzondering gewassen (Rouck, De, z.j.; Dowhanick, 1977; Dymond, 1994). Soms worden van medium gepropageerde gisten ook gewassen i.v.m. het zuiveren van een lichte besmetting. Drie soorten gistwas worden onderscheiden: een wasstap met steriel water, een wasstap met zuur en een wasstap met een zuur/alkalimengsel. Belangrijkst bij deze wasstappen id dat de temperatuur altijd onder de 5C moet zijn en blijven (Rouck, De, z.j.; Dowhanick, 1977).7.1Steriel waterwasDe voor gisten meest vriendelijke was is de was met steriel, gedemineraliseerd water. Hierbij worden gistslurrie en steriel water gekoeld tot