INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

58
INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN PROGNOSE VAN SEPSIS- GEÏNDUCEERDE NIERSCHADE: SPECIESVERGELIJKENDE STUDIE Aantal woorden: 16.306 Anna Lisa Bütefisch Studentennummer: 01308442 Promotor: Prof. dr. Evelyne Meyer Promotor: Prof. dr. Gunther Van Loon Onderdeel van de Masterproef voorgelegd voor het behalen van de graad master in de diergeneeskunde Academiejaar: 2018 2019

Transcript of INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

Page 1: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN PROGNOSE VAN SEPSIS-GEÏNDUCEERDE NIERSCHADE: SPECIESVERGELIJKENDE STUDIE Aantal woorden: 16.306

Anna Lisa Bütefisch Studentennummer: 01308442 Promotor: Prof. dr. Evelyne Meyer Promotor: Prof. dr. Gunther Van Loon Onderdeel van de Masterproef voorgelegd voor het behalen van de graad master in de diergeneeskunde Academiejaar: 2018 – 2019

Page 2: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

Voorwoord In eerste instantie wil ik mijn promotor, Prof. dr. Evelyne Meyer, hartelijk bedanken voor de goede ondersteuning en het nalezen van mijn thesis. Ook Kristel Demeyere zou ik willen bedanken voor haar hulp met de uitvoering van de ELISAs en de goede begleiding tijdens de verwerking van de onderzoeksdata. Hierbij heeft Thomas Demaeyer ook voor een groot stuk aan mee gewerkt, bedankt daarvoor. Ook prof. dr. Gunther Van Loon, Alexander Dufourni en Laura Dhont wil ik bedanken voor hun hulp.

Page 3: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

VERTROUWELIJK – BELANGRIJK

Deze masterproef bevat vertrouwelijke informatie en/of vertrouwelijke onderzoeksresultaten die toebehoren aan de Universiteit Gent of aan derden. Deze masterproef of enig onderdeel ervan mag op geen enkele wijze publiek gemaakt worden zonder de uitdrukkelijke schriftelijke voorafgaande toestemming vanwege de Universiteit Gent. Zo mag de masterproef onder geen voorwaarde door derden worden ingekeken of aan derden worden meegedeeld. Het nemen van kopieën of het op eender welke wijze dupliceren van de masterproef is verboden. Het niet respecteren van de vertrouwelijke aard van de masterproef kan onherstelbare schade veroorzaken aan de Universiteit Gent.

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden.

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef

Page 4: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

2

INHOUDSOPGAVE

1 SAMENVATTING 3

2 LITERATUURSTUDIE 3

2.1 Sepsis 3

2.2 Sepsis-geïnduceerde nierschade 7

2.3 Biomerkers voor sepsis-geïnduceerde nierschade 13 2.3.1 Conventionele biomerkers 13 2.3.2 Innovatieve biomerkers 15

2.4 Probleemstelling en doelstelling 22

3 ONDERZOEK 23

3.1 Materiaal en Methoden 23 3.1.1 Onderzoek van de porciene stalen 23 3.1.2 Onderzoek van de equiene stalen 27

4 RESULTATEN 32

4.1 Resultaten van de porciene analyses 32 4.1.1 Resultaten voor NGAL 32 4.1.2 Resultaten voor CHI3L1 34

4.2 Resultaten van de equiene analyses 36 4.2.1 Resultaten voor NGAL 36 4.2.2 Resultaten voor CHI3L1 39

5 DISCUSSIE 41

6 CONCLUSIE 44

7 REFERENTIELIJST 45

8 BIJLAGEN 50

Page 5: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

3

1 Samenvatting

Neonatale sepsis is zowel bij de mens als bij het paard een hoofdoorzaak voor morbiditeit en mortaliteit op intensieve zorgen (Sanchez, 2005; Bhandari et al, 2008). Bij biggens staat sepsis op de derde plaats van de meest voorkomende doodsoorzaken (Vandekerckhove, 2016). Een van de meest belangrijke complicaties tijdens sepsis is de ontwikkeling van acute nierschade (ANS)(Geor, 2003; Aamer et al, 2016).

Omdat na een episode van ANS slechts beperkte reparatie van het nierweefsel plaatsvindt is een snelle detectie cruciaal om ernstige nierschade te kunnen voorkomen. De populairste klinische niermerker tot op vandaag is serum creatinine (sCr). Voor de vroegtijdige detectie van nierschade heeft sCr echter weinig nut, aangezien meer dan 75% van de nefronen aangetast moeten zijn vóór de concentraties in het bloed beginnen stijgen (Arosalo et al, 2007; Dahlem et al, 2017). Dit leidt tot een te late diagnose van ANS waardoor het tijdsvenster van succesvol ingrijpen vaak al gepasseerd is bij het stellen van de diagnose. Nieuwe, gevoeligere niermerkers zouden een snellere diagnose mogelijk maken en daardoor een doelgerichte en succesvollere behandeling in de hand werken (Singer et al, 2016).

In vergelijking met de humane geneeskunde bevindt het onderzoek naar nieuwe niermerkers in de diergeneeskunde zich nog in een relatief preliminair stadium, zeker bij het juveniele dier. Het doel van deze masterproef is de evaluatie van neutrofiel gelatinase-geassocieerd lipocaline (NGAL), chitinase-3-like 1 proteïne 1(CHI3L1) en enkele andere innovatieve niermerkers voor de diergeneeskunde. Het onderzoeksgedeelte van deze masterproef omvat de analyses van porciene en equiene bloed-en urinestalen afkomstig van jonge (proef)dieren met (geïnduceerde) sepsis. Hierop werden de concentraties van NGAL en CHI3L1 op zowel urine alsook serum of plasma van biggen en veulens bepaald.

2 Literatuurstudie 2.1 Sepsis Sepsis is bij de mens een levensbedreigend syndroom met een 25-30% kans op sterfte ondanks intensieve therapie (Alberti et al, 2002; Roy, 2004; Dellinger et al, 2012). Bij ernstige sepsis en het intreden van septische shock kan dit zelfs oplopen tot 70% (Doi et al, 2009). Sepsis en septische shock zijn dan ook de meest belangrijke doodsoorzaak van adulte intensieve zorgpatiënten (Parker en Watkins, 2001; Castellheim et al, 2008). In de VS alleen worden jaarlijks 750. 000 gevallen van sepsis gemeld (Singer et al, 2016) met een stijgende trend over de laatste jaren (Dellinger et al, 2012; Singer et al, 2016). Ook in de diergeneeskunde is sepsis een veelvoorkomene uitdaging voor de clinici. Binnen de diersoorten zijn er verschillen in gevoeligheid voor endotoxines. Honden, katten en knaagdieren zijn veel minder gevoelig voor de effecten van endotoxines dan primaten, varkens, konijnen en en schapen (Zanotti-Cavazzoni en Goldfarb, 2009, Li et al, 2019).

Page 6: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

4

Sepsis word gedefinieerd als een uit de hand gelopen ontstekingsreactie die ontstaat nadat een infectieus agens in de circulatie terecht is gekomen (Zarjou en Agarwal, 2011; Aamer et al, 2016). Het is dan ook kenmerkend voor sepsis dat de orgaanschade optreedt op een plaats die verschilt van de initiële infectiehaard (Zarjou en Agarwal, 2011). In de regel ligt een bacteriële infectie aan de basis van de pathogenese, infecties door virussen, parasieten, schimmels of hun producten zijn echter ook mogelijk (Dellinger et al, 2013). Bij de mens zijn E. coli, Staphylococcus aureus en Pseudomonas spp. de voornaamste verwekkers van sepsis (Castellheim et al, 2008). Bij honden is Escherichia coli de meest voorkomende kiem geassocieerd met sepsis (Martin et al., 2003). Bij paarden kunnen zowel gram-positieve als ook gram-negatieve kiemen aan de basis liggen. Gram-negatieve kiemen zouden vaker sepsis veroorzaken bij het veulen (Roy, 2004; Wong et al, 2017). Bij een studie met 112 septicaemische veulens werd E. coli naast Enterococcus spp en Pantoea agglomerans het meest geïsoleerd (Wong et al, 2017). Andere veel voorkomende kiemen waren Enterococcus spp, Actinobacilus spp, Enterobacter spp, Klebsiella pneumonia en D-hemolytische streptococcen. Sepsis en leeftijd In de humane geneeskunde zijn vooral geriatrische patiënten gepredisponeerd om sepsis te ontwikkelen (Zanotti-Cavazzoni en Goldfarb, 2009; Singer et al, 2016). Dit heeft ook te maken met het feit dat bepaalde comorbiditeiten zoals kanker of diabetes mellitus het risico op sepsis verhogen (Zarjou en Agarwal, 2011). Dit is ook zo bij de hond (Grauer, 2007). Comorbiditeiten bij volwassen paarden zijn voornamelijk acute gastrointestinale problemen waardoor veralgemeende endotoxemie ontstaat. Ook bacteriële pneumoniën, myositis door Clostridium, retentio secundinarum of metritis kunnen hier een rol spelen. Over comorbiditeiten voor sepsis bij het volwassen varken is er geen literatuur beschikbaar. Een andere belangrijke risicogroep zijn pediatrische patiënten. In de VS ontwikkelen per jaar meer dan 42.000 kinderen ernstige sepsis waardoor het één van de belangrijkste doodsorzaken bij kinderen en neonati is (Watson en Carcillo, 2005; Wheeler et al, 2008). Ook in de pediatrische diergeneeskunde is sepsis een veel voorkomend probleem. Sepsis is bij kittens en welpen een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit tijdens de eerste levensweken (Hoskins, 1993; Traas, 2008). Naar analogie met de humane geneeskunde is sepsis bij veulens van minder dan één week oud de hoofdoorzaak voor hun ziekte en sterfte (Furr, 2003; Sanchez, 2005). Vergeleken met andere species zouden paarden zelfs nog gevoeliger zijn voor de ontwikkeling van sepsis (Roy, 2004). Bij het pasgeboren veulen is het perinatale asfyxie syndroom (PAS) een belangrijke risicofactor voor het ontwikkelen van sepsis. An de basis van de pathogenese van PAS ligt hypoxisch-ischemische hersenschade tijdens de geboorte of onmiddellijk ervoor (Vaala, 1999). Deze veulens kunnen door veralgemeende ontstekingsreacties bijzonder snel achteruit gaan.

Page 7: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

5

Een uiteenlopend klinisch beeld is typisch voor septicaemische dieren aangezien de symptomen zich afleiden van de verschillende orgaanmanifestaties. Sepsis wordt dan ook beschouwd als syndroom en niet als specifieke ziekte. Zo is bijvoorbeeld hypotensie een teken voor depressie van het cardiovasculair stelsel tijdens septicaemie. Van septische shock spreekt men indien de bloeddruk zich ook na vloeistoftherapie niet normaliseert (Roy, 2004). Diagnostiek Sepsis werd klassiek gedefinieerd als een positieve bloedcultuur en een score van t2 volgens de “systemic inflammatory response syndrome” of SIRS criteria. Een score van t2 komt overeen met de aanwezigheid van 2 of meer van de volgende symptomen: hyper-of hyopthermie, tachycardie of -pnee, afwijkingen van de leukocytentelling (leukocytose of -penie) of een linksverschuiving (>10% onrijpe granulocyten) (Wong en Wilkins, 2015). In de humane geneeskunde bestaan er zowel SIRS criteria voor adulte als pediatrische patiënten. Bij de pediatrische patiënt moet bijkomend de lichaamstemperatuur of een afwijking in de lymfocytentelling aanwezig zijn om aan de SIRS criteria te voldoen, omdat er in de pediatrie veel meer ziekten geassocieerd worden met tachycardie en tachypnee. Ook voor het veulen bestaat er een aparte SIRS score (Wong et al, 2017). Het SIRS concept werd in de humane geneeskunde ontwikkeld om zo snel mogelijk patiënten met een sepsis-risico te kunnen identificiëren. Hier was het belangrijk om geen van deze patiënten te missen, zodat de inclusie-criteria redelijk breed zijn opgesteld. Het gevolg hiervan is een zeer lage specificiteit. Er moet dus rekening worden gehouden met het feit dat SIRS ook door trauma, brandwonden, ischemie, pancreatitis, bloedverlies en anafylaxis kan veroorzaakt worden (Wong et al, 2017). Een iets meer gedifferentieerd beeld kunnen sepsis scores geven omdat ze een grotere range van symptomen includeren. Het meest gebruikte classificatiesysteem is hierbij de “Sequential sepsis-related Organ Failure Assessment”- of SOFA score (Tabel 1). Voor de SOFA score worden er verschillende orgaansystemen geevalueerd: het respiratoir stelsel (partiele zuurstofdruk), de lever (bilirubine), de nieren (sCr), het cardiovasculair stelsel (bloeddruk) en het neuronaal stelsel (Glasgow Coma Score ter beoordeling van de hersenfunctie). Klinisch wijst een acute verhoging van de SOFA score met 2 of meer punten in combinatie met een diagnose van infectie op sepsis (Singer et al, 2016). Meer dan 2 punten in dit scoring-systeem komen overeen met een mortaliteitskans van meer dan 10%. Patiënten met septische shock hebben zelfs een kans op sterfte van meer dan 40%.

Page 8: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

6

Dergelijke scoring systemen worden ook in de diergeneeskunde gebruikt. De equiene sepsis score werd in de jaren ‘80 overgenomen uit de humane geneeskunde en was vooral bedoeld om, in afwachting van een bloedcultuur uitslag, bij veulens te kunnen besluiten of sepsis de reden voor de vertoonde symptomen zou kunnen zijn. In de jaren nadien werden verschillende punten in het scoring systeem aangepast, zodat hieruit de “gemodificeerde sepsis score” ontstond. Deze gemodificeerde score elimineerde sommige parameters zoals metabole acidose of de paritiële zuurstofdruk omwille van een betere haalbaarheid voor de clinici (Weber et al, 2014; Wong et al, 2017). In 2017 werd een nieuwe sepsis score voorgesteld: de geüpdate sepsis score. De geüpdate sepsis score includeert bijkomende criteria die in recente studies met sepsis werden geassocieerd, zoals de SIRS criteria voor equiene neonati, bloed lactaat waarden en sCr. De geüpdate sepsis score is qua sensibiliteit en specificiteit vergelijkbaar met de gemodificeerde sepsis score, maar biedt geen diagnostisch voordeel hier tegenover (Wong et al, 2017). Ook bij de hond en het varken is het gebruik van een sepsis score een handig tool voor de diagnostische en prognostische doeleinden (Ripanti et al, 2012; Soerensen et al, 2012). Een bloedcultuur blijft bij mens en dier de gouden standaard voor de diagnose van sepsis (Alizadeh et al, 2016; Wong et al, 2017). Zowel vals positieve (contaminatie tijdens staalname, bij sommige veulens kan transiënte bacteremie aanwezig zijn zonder infectie (Wong et al, 2017)) als ook vals negatieve resultaten kunnen voorkomen (Wong et al, 2017; Alizadeh et al, 2016). Redenen hiervoor zijn de matige gevoeligheid (Bactec: 35-90% (Alizadeh et al, 2016) van bloedculturen, eventueel voorafgegaande behandeling met antibiotica, een laag aantal circulerende bacteriën of een te klein verzameld volume voor bloedcultuur (Wong et al, 2017). Wilson en Madigan toonden reeds in 1989 aan dat enkel 40% van de achteraf op autopsie bevestigde septicaemische E.coli infecties bij veulens gediagnosticeerd konden worden met behulp van een bloedcultuur.

Tabel 1 De SOFA score voor de humane geneeskunde. Uit: Singer et al, 2016.

Page 9: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

7

Een bijkomende beperking van bloedculturen is, dat resultaten in het beste geval beschikbaar zijn na 48 uur. Deze periode is te lang om behandeling af te wachten (Sanchez, 2005; Wong et al, 2017). Ondanks deze nadelen zijn bloedculturen een heel belangrijk hulpmiddel omdat niet enkel een diagnose kan bevestigd worden, maar ook identificatie van de kiem mogelijk is waardoor via een antibiogram een selectieve antibiotische behandeling mogelijk wordt (Wong et al, 2017). 2.2 Sepsis-geïnduceerde nierschade

Ondanks het feit dat de nieren bij alle species slechts een klein deel van het lichaamsgewicht uitmaken, ontvangen ze ca. 25% van het hartminuutvolume (Despopoulos en Silbernagl, 2008). De zeer goede doorbloeding van de nier verhoogt de kans op blootstelling aan allerlei noxen, zoals toxines. Deze doorbloeding, en de gevoeligheid voor hypoxie door de grote zuurstofbehoefte (Eckardt et al, 2005) zorgen ervoor dat de nier een kwetsbaar doelwit vormt tijdens sepsis.

Sepsis is dan ook de meest belangrijke oorzaak voor acute nierschade (ANS) in ziekenhuizen (Zarjou en Agarwal, 2011, Bellomo et al, 2012). Bij meer dan 50% van de gehospitaliseerde ANS patiënten is sepsis aanwezig (Zajou en Agarwal, 2011). ANS werd vroeger ook acuut nierfalen genoemd omdat het ervoor zorgt, dat de nier haar excretorische functie niet meer kan vervullen. ANS verloopt in de regel volledig asymptomatisch tot een irreversiebel eindstadium wordt bereikt. Enkel de opstapeling van afvalstoffen in het bloed (ureum, creatinine) kan de clinicus een duidelijke indicatie geven. Immers, oligurie kan, maar is niet altijd aanwezig (Geor, 2007; Bellomo et al, 2012). Oligurische ANS is bij paarden geassocieerd met een slechte prognose zeker indien vochttherapie geen verbetering brengt. In dat geval moet de hoeveelheid infuus nauwkeurig opgevolgd worden anders kan dit leiden tot subcutaan oedeem of longoedeem (Geor, 2007).

ANS kan prerenale, renale of postrenale oorzaken hebben. De meest voorkomende triggers voor ANS zijn prerenale oorzaken, die voor verminderde doorbloeding van het nierparenchym zorgen. Dit is zo bij de mens en het paard (Geor, 2007; Bellomo et al, 2012). Bij renale ANS zijn pathologische veranderingen ter hoogte van het nierparenchym de reden voor nierschade. Een voorbeeld hiervoor is acute tubulaire schade, zoals die kan ontstaan tijdens sepsis. Ook glomerulonefritis, vasculitis of interstitiële nefritis zijn renale oorzaken voor ANS, net zoals geneesmiddelen met nefrotoxische effecten (radiocontrastmiddelen, aminoglycosiden, NSAIDs,etc.). Ongeveer 20% van de ANS gevallen zouden met het gebruik van dergelijk frequent gebruiktennefrotoxische medicatie geassocieerd zijn (Bellomo et al, 2012). Alhoewel hierrond geen cijfers bekend zijn bij paarden, weet men wel dat NSAID- en antibiotica-geïnduceerde nierschade ook bij deze diersoort een veel voorkomend probleem is (Geor, 2007). Post-renale nierschade komt zelden voor, de oorzaak hiervan is een gestoorde afvoer van de urine (bv. door prostaattumoren) met terugvloei naar het nierbekken. Het meest frequent treedt post-renale nierschade bij het paard op in verband met blaasrupturen bij neonati (Geor, 2007).

Page 10: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

8

Bij neonatale veulens ontstaat ANS in de regel als complicatie van sepsis, PAS of door aminoglycoside-therapie. Het gebruik van gentamycine in het bijzonder blijkt nierschade in de hand te werken. Kritisch zieke paarden met tekenen van deydratatie, hypovolemie, endotoxemie, sepsis of hypoxemie zijn nog gevoeliger voor de nefrotoxische nierschade door aminoglycosiden (Geor, 2007).

Verhoogde nierwaarden in het bloed kunnen ook op chronische nierproblemen duiden. Zoals bij de mens moet ook bij hond en kat dit onderscheid gemaakt worden, omdat chronische nierziekte (CNZ) bij deze diersoorten een veelvoorkomend probleem vormt. Bij de geriatrische kat loopt de prevalentie zelfs op tot 30% (Ghys et al, 2014). Met behulp van echografie en de klinische presentatie (sepsis aanwezig, ernstige diarree, hemorrhagische shock duiden eerder op ANS) kan onderscheiden worden of het om een chronisch of acuut probleem gaat. Zoals bij de mens moet hier echter ook rekening worden gehouden met het feit dat de aanwezigheid van een acuut non-renaal probleem niet uitsluit dat ervoor al een chronisch proces aan de gang was (“acute-on-chronic”; Bellomo et al, 2012). Immers blijkt, dat 30% van de mensen die op intensieve zorgen worden opgenomen reeds een chronisch nierprobleem hebben. Men mag in deze context ook niet vergeten dat CNZ een belangrijke risicofactor is voor de ontwikkeling van ANS (Coca et al, 2008).

De pathogenese van ANS in het algemeen, en van sepsis-geïnduceerde nierschade in het bijzonder is nog niet helemaal duidelijk (Castellheim et al, 2008; Lerolle, 2010; Bellomo et al, 2012;). Zeker bij paarden is er relatief weinig geweten over de pathogenese zelf, er wordt vooral geëxtrapoleerd vanuit andere diersoorten (Geor, 2007).

De rol van cytokines in het ontstaan van sepis-geïnduceerde nierschade

Het startpunt bij sepsis is altijd de intrede van een infectieus agens in het lichaam, waarna het agens zelf en/of zijn producten terechtkomen in het bloed. Hierdoor wordt de cellulaire en humorale afweer geactiveerd, wat tot de secretie leidt van cytokines met als meest belangrijke tumor necrosis factor alpha (TNF-D), interleukine 1 (IL-1), IL-6 en IL-18 ( Roy, 2004; Zarjou en Agarwal, 2011). Tijdens sepsis is deze stap ontregeld waardoor er overmatig veel cytokines worden geproduceerd. Deze “cytokinestorm” ligt aan de basis voor de verstoorde orgaanwerking tijdens sepsis (Zarjou en Agarwal, 2011). De concentraties van TNF-D, IL-1ß, IL-6, IL-8, IL-10 en IL-12 verhogen bij biggen met septicaemie (Castellheim et al, 2008).

TNF-D, IL-1 en IL-6

TNF-D concentraties lijken bij alle species als eerste te stijgen, en een verhoogde concentratie correleert met een verhoogde mortaliteit (Roy, 2004). Door toediening van enkel IL-1 en TNF-D kan klinische sepsis in proefdieren geïnduceerd worden (Roy, 2004). TNF-D wordt geproduceerd door T-cellen, macrofagen en endotheelcellen. Het stimuleert de vrijstelling van IL-1 en IL-6 en de activatie van neutrofielen. Verder zorgt het voor hypotensie en activatie van de stollingscascade.

Page 11: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

9

Deze activatie van de stollingscascade stimuleert op zijn beurt inflammatie, waardoor deze activaties van de stollingscascade en van de aangeboren immuniteit ongunstige effecten op het lichaam hebben (Roy, 2004).

Door de effecten van IL-1 en TNF-D worden neutrofielen geactiveerd, waardoor adhesie transmigratie naar de ontstekingsplaats worden bevorderd (Roy, 2004). Samen met TNF-D stimuleert IL-1 de productie van verschillende mediatoren zoals platelet-activating factor (PAF), prostaglandine E2 (PGE2) en leukotrieen. IL-1 zorgt eveneens voor een verhoogde productie van IL-6 door de endotheelcellen met als gevolgd modificatie van de endotheelcelfuncties, vrijstelling van verschillende chemokines en prostaglandines, complementfactoren en PAF. De expressie van de tissue factor (TF, weefselfactor) op macrofagen en endotheelcellen veroorzaakt de vorming van thrombine. Ongustig in deze context is dat de natuurlijke inhibitiesystemen zoals het anti-thrombine, de TF pathway inhibitor, het proteïne C systeem en het fibrinolytische systeem tijdens sepsis niet naar behoren werken (Roy, 2004). Het samenspel van de boven beschreven mechanismen zorgt voor het verdwijnen de anti-coagulatieve eigenschappen van het endotheeloppervlak en een sneller optredende coagulatie tijdens sepsis (Roy, 2004. Dit uit zich in veranderingen van de hemostatische parameters, zoals bijvoorbeeld verhoogde PF, de partiële thromboplastine tijd (PTT), fibrinogene degradatieproducten (FDPs) en thrombopenie. Veranderingen van de hemostatische parameteres, thrombosen en gedissemineerde intravasculaire stolling (DIS) kunnen dan ook opgemerkt worden bij veulens en adulte paarden met sepsis (Roy, 2004). Via negatieve feedback inhibeert IL-6 echter ook de productie van IL-1 en TNF-D . Hierdoor schrijft men IL-6 zowel pro-als ook anti-inflammatoire eigenschappen toe. IL-6 blijkt bij paarden een goede merker voor mortaliteit te zijn, omdat het de mate van de initiële TNF en IL-1 vrijstelling weergeeft. Het heeft echter geen sepsis-inducerende werking bij proeven (Roy, 2004).

Bij sepsis-geïnduceerde nierschade zou meer IL-18 vrijgesteld worden dan bij nierschade die door een andere etiologie ontstaat (Zarjou en Agarwal, 2011).

De wisselwerking van pro-en anti-inflammatoire pathways tijdens sepsis

Tijdens sepsis worden dus niet enkel pro-, maar ook anti-inflammatoire pathways geactiveerd (Zarjou en Agarwal, 2011). Een initiële pro-inflammatoire respons wordt typisch gevolgd door een anti-inflammatoire fase die gekenmerkt is door een verandering in cytokine-productie en antigen-presentatie door de monocyten. Dit wordt wordt ook de “compensatory anti-inflammatory response syndrome” (CARS) genoemd (Roy, 2004). Lymfocytopenie en een hogere incidentie van apoptosis maken hier eveneens deel van uit. Deze twee fasen volgen typisch op elkaar, maar in sommige gevallen treedt ook overlap op; dit wordt dan als “mixed anti-inflammatory response syndrome” (MARS) beschreven (Roy, 2004).

Page 12: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

10

De anti-inflammatoire moleculen zijn voornamelijk IL-4, IL-10, IL-11, IL-13, oplosbare TNF receptoren en de IL-1 receptor antagonist. IL-10 bezit eveneens anti-inflammatoire eigenschappen en remt, zoals IL-6 , de productie van TNF-D. Deze anti-inflammatoire cytokines zijn echter niet in staat om de ontstekingsreactie af te remmen, erger nog, ze liggen waarschijnlijk mee aan de basis voor het ontstaan van een immuundeficiëntie die sepsis patiënten kwetsbaar maakt voor bijkomende infectie (Cavaillon et al., 2003; Roy, 2004; Scumpia en Moldawer, 2005)

Veranderingen in het doorbloedingspatroon

Bij het ontrafelen van de pathogenese van sepsis-geïnduceerde nierschade spelen vooral veranderingen in het doorbloedingspatroon een belangrijke rol (Gomez et al, 2014). Arteriële vasodilatatie gecombineerd met een daling van de perifere vasculaire weerstand zorgt voor een daling van de gemiddelde arteriële bloeddruk. Hierdoor verdeelt het bloed zich naar de periferie, waardoor minder volume in de centrale circulatie zit. Vroeger dacht men dat nierfalen tijdens sepsis voornamelijk veroorzaakt wordt door een hierop volgende hypoperfusie van het nierparenchym. Recente studies tonen echter aan, dat tijdens sepsis een normo- of zelfs hyperperfusie aanwezig is (Zarjou en Agarwal, 2011; Bellomo et al, 2012; Gomez et al, 2014). Zo zou zelfs een 80% occlusie van de renale arterie voor twee uur lang geen oorzaak van irreversiebele nierschade zijn (Bellomo et al, 2012). Ondertussen wordt in de literatuur zelfs gesuggereerd dat hyperemie aan de basis van sepsis-geïnduceerde nierschade zou kunnen liggen (Bellomo et al, 2012; Zarjou en Agarwal, 2011).

Normaal gezien kan de nier de renale bloedvloei en de GFR zelfs tijdens perioden van systemische hypo- of hypertensie in homeostase houden. De capillaire hydrostatische druk wordt hierbij door verschillende intrinsieke myogene mechanismen en de invloed van NO en prostaglandine I2 op de diameter van de vaten geregeld. Een verhoogde tubulaire flow resulteert bijvoorbeeld in vasoconstrictie van de afferente arteriolen en een daling van de GFR (Geor, 2007). Deze autoregulatiemechanismen werken niet meer tijdens sepsis. Verantwoordelijk hiervoor is een excessieve vrijstelling van NO. Na contact met lipopolysaccharide (LPS), IL-1 of TNF-D produceren leukocyten en endotheelcellen meer stikstofoxide (nitric oxide, NO). NO veroorzaakt normaal gezien een louter lokale vasodilatatie. Door overmatige vrijstelling van NO tijdens sepsis ontstaat er echter een veralgemeend beeld van vasodilatatie (Roy, 2004; Geor, 2007). Een bijkomend probleem is de slechte werking van inhibitiemechanismen voor NO tijdens veralgemeende endotheelactivatie in het kader van sepsis. Er onstaat hypotensie, en door het negatief inotroop effect van NO ter hoogte van het myocard kan er zelfs hartfalen optreden (Parratt, 1998). In de nier zetten de efferente arteriolen door de effecten van NO meer uit dan de afferente arteriolen. De hierdoor verminderde vulling van de arteries zorgt voor prikkeling van de basoreceptoren en activatie van het renine-angiotensine-aldosterone systeem (RAAS). Vasopressine zorgt dan voor vasoconstrictie van de renale bloedvaten en toenemende waterretentie (Bellomo et al, 2012).

Page 13: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

11

De verhoogde renale bloedvloei wordt als gevolg voornamelijk afgevoerd via de efferente bloedvaten en niet (via de glomerulus) naar de tubuli. Hierdoor ontstaat een verlaagde glomerulaire capillaire druk waardoor de filtratiecapaciteit van de nier afneemt, de GFR daalt (Zarjou en Agarwal, 2011). Verder ontstaat vasculaire congestie ter hoogte van de medulla en hierdoor endotheelschade met onsteking als gevolg (Geor, 2007). Hypoperfusie van de glomerulus is dus mogelijks niet de oorzaak maar eerder het gevolg van de pathologische veranderingen in de nier tijdens sepsis (Bellomo et al, 2012).

De rol van matrixmetalloproteasen en toll-like receptoren tijdens sepsis

MMP’s zijn endopeptidases die inflammatie weefseldegradatie bevorderen, maar ook een rol spelen tijdens wondheling. Vooral MMP-9 wordt een belangrijke rol toegeschreven tijdens het ontstaan van sepsis. Zo zijn MMP-9 knockout muizen resistent tegenover het ontstaan van septische shock en kunnen verhoogde MMP-9 concentraties worden gevonden in het bloed van biggen met sepsis vergeleken met gezonde biggen (Castellheim et al, 2008).

De ongebreidelde ontstekingsreactie tijdens sepsis is vooral te wijten aan een ontspoorde respons van de aangeboren afweer. Hierbij spelen pattern recognition receptoren (PRR), zoals de toll-like receptoren (TLR) een sleutelrol. PRR kunnen pathogen-associated molecular patterns (PAMPS) herkennen. Verschillende TLR’s kunnen verschillende types van pathogenen herkennen, zo is TLR2 bij voorbeeld belangrijk voor de herkenning van gram-positieve peptidoglycanen en lipoproteïnen. TLR4 herkent vooral gram-negatieve endotoxines, waaronder LPS (Roy, 2004). Het belang van de TLRs werd vooral duidelijk toen men een bepaalde lijn van muizen ontdekte die enerzijds uitermate resistent tegenover de effecten van zuivere LPS injecties bleek, maar die anderzijds heel gevoelig waren voor infectie met sommige gram-negatieve bacteriën. Deze muizen hadden een mutatie waardoor TLR4 defect was. Hieruit kan men concluderen dat TLR4 in grote mate verantwoordelijk is voor de immuunrespons op LPS-injectie (Roy, 2004). Vooral TLR-2 en TLR-4 worden dan ook sterker geëxpresseerd in individuen met sepsis (Zarjou en Agarwal, 2011). Men gaat ervan uit dat deze inzichten speciesoverschrijdend zijn (Roy, 2004).

Na interactie tussen PAMP en TLR worden een aantal processen in gang gezet waardoor uiteindelijk de nuclear factor “kappa-light-chain-enhancer of activated B-cells” (NF-NB) en mitogeen geactiveerd proteïne (MAP) kinases geactiveerd worden. Deze pathways leiden uiteindelijk tot de expressie van pro-inflammatoire cytokines, chemokines en het major histocompatibility complex (MHC) (Roy, 2004).

Therapie

Endotheeldysfunctie, zoals vaak gezien bij sepsis, leidt tot intravasculaire hypovolemie. Vochttherapie is dan ook de meest toegepaste behandeling bij ANS (Ostermann et al, 2015) en zou ernstige nierschade tegengaan, indien vroegtijdig opgestart (Geor, 2007). Het volume infuus moet echter wel goed opgevolgd worden want overmatig infunderen kan leiden tot vocht“overload” of overvulling.

Page 14: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

12

Het gevolg hiervan is uitrekking van het atrium en de endothelia. Hierdoor kan schade aan de glycocalix ontstaan, met een gestoorde permeabiliteit van de capillairen en extravasatie als gevolg. Dit gaat op zijn beurt weer intravasculaire hypovolemie veroorzaken (Ostermann et al, 2015). Behalve nauw opgevolgde vochttherapie is het ook belangrijk om een eventuele dysbalans in de zuur-base-huishouding te behandelen. Supplementatie met antioxidantia kan helpen om de schade veroorzaakt door “reactive oxygen species” (ROS) te verminderen. Renale vervangingstherapie, zoals dit bij de mens wordt toegepast, wordt zelden tot nooit toegepast bij paarden (Geor, 2007). Tot op vandaag bestaat er geen werkzame farmacologische therapie voor de behandeling van ANS (Bellomo et al, 2012). Het is daarom belangrijk om de achterliggende oorzaak te behandelen. Behandeling met nefrotoxische medicatie, zoals aminoglycosiden, moet overwogen worden. Monitoring van de aminoglycoside-concentraties in het bloed van paarden kan handig zijn, omdat te hoge concentraties een verhoogd risico op nierschade hebben (>2 µg/mL voor gentamycine of > 5 µg/mL voor amikacine) (Geor,2007). Het gebruik van diuretica wordt niet aangeraden, studies hieromtrent konden geen positieve effecten bewijzen en de toediening van furosemide werd bij sommige species in verband gebracht met een verhoogde gevoeligheid voor de nefrotoxiciteit van aminoglycosiden. Dopamine wordt soms bij paarden met ANS gebruikt om de renale bloedvloei te verhogen. Verschillende studies bij mensen hebben echter aangetoond dat hierdoor onvoorspelbare effecten kunnen optreden zoals systemische vasoconstrictie. Ook bij paarden wordt daarom van het gebruik afgeraden (Geor, 2007).

Prognose

Prognostisch gezien is sepsis-geassocieerde nierschade ongunstiger dan nierschade die door andere etiologiën ontstaat. Dit is te wijten aan de ongebreidelde inflammatie tijdens sepsis (Neveu et al, 1996; Maddens et al, 2012). Het aantal bacteriën per gram orgaanweefsel is hoger bij muizen met sepsis-geïnduceerde nierschade dan bij muizen met sepsis en zonder nierschade. Ook de concentraties van TNF, IL-6, KC, MCP-1 en IL-10 waren significant verhoogd bij de groep geïnfecteerde muizen. Behalve voor IL-10 waren alle anderen concentraties ook hoger bij muizen met sepsis-geïnduceerde nierschade dan bij de septische muizen die geen nierschade ontwikkelden. (Maddens et al, 2012). Verder blijkt dat patiënten met sepsis-geïnduceerde nierschade een slechtere prognose hebben dan patiënten die enkel sepsis hebben (Ronco et al, 2008). Betrokkenheid van de nieren bij sepsis voorspelt een hogere mortaliteit dan voor patiënten met sepsis waarbij de nieren niet betrokken zijn (Zarjou en Agarwal, 2011).

Page 15: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

13

Histologische bevindingen

Sepsis veroorzaakt voornamelijk tubulaire nierschade. Zowel bij de mens als ook in (experimentele) sepsis studies met varkens, paarden, schapen, muizen en ratten werden slechts subtiele (onderbroken brush-border, vacuolisatie tubuluscellen) of geen afwijkingen gevonden op histologisch onderzoek (Geor, 2007; Langenberg et al, 2007; Chvojka et al, 2008; Maddens et al, 2012; Peng et al, 2012; Langenberg, 2013; Zarbock et al, 2014). Langenberg (2007, 2013) suggereert zelfs dat sepsis-geïnduceerde nierschade niet noodzakelijk histologische letsels veroorzaakt. Acute tubulaire necrose kan aanwezig zijn is echter geen consistente bevinding bij zowel dieren als ook mensen met sepsis (Langenberg et al, 2007). In een studie met mensen werden enkel bij sepsispatiënten grote getallen monocyten en polymorfonucleaire neutrofiele cellen ter hoogte van de capillairen gevonden (Lerolle et al, 2010). 2.3 Biomerkers voor sepsis-geïnduceerde nierschade 2.3.1 Conventionele biomerkers 2.3.1.1 Inleiding

Traditioneel gebeurt de evaluatie van de nierfunctie door middel van meting van de glomerulaire filtratie snelheid (GFR). De gouden standaard hiervoor is het bepalen van de inulineklaring. Inuline is een volledig filtreerbare en inerte stof die noch geresorbeerd noch gesecreteerd wordt. Er is eveneens geen synthese of afbraak ervan door de tubuli (Ferguson en Waikar, 2012). Door constante toediening van inuline en regelmatige staalnames van urine en bloed kan de GFR zeer precies berekend worden. Echter, in de klinische praktijk is deze tijd- en arbeidsintensieve methode geen optie. Er wordt daarom meestal gebruik gemaakt van de geschatte (“estimated”) GFR of (eGFR). Deze wordt gemeten aan de hand van moleculen die bij een verstoring van de nierfunctie in het bloed accumuleren (Ferguson en Waikar, 2012). Voorbeelden van zulke moleculen zijn creatinine en ureum.

De ontwikkeling van nierschade verloopt in de regel asymptomatisch tot het punt waar ernstige schade aan het parenchym is ontstaan. Oligurie kan helpen om een nierprobleem op te merken, maar de meting van het geplaste volume urine is noch specifiek noch gevoelig (Bellomo et al, 2012). Opvolging van de urineproductie is echter zelfs bij gehospitaliseerde dieren praktisch niet haalbaar. Een bijkomend probleem is de beïnvloeding van de urineproductie door intensieve vochttherapie en verschillende geneesmiddelen (e.g. diuretica). Zoals eerder aangehaald is oligurie niet altijd aanwezig tijdens ANS (Geor, 2007; Bellomo et al, 2012). Meting van het urinair soortelijk gewicht (USG) geeft een indruk van het concentrerend vermogen van de nier. Te lage USG waarden wijzen op een intrinsiek nierprobleem. Een verhoogd aantal (witte en/of rode) bloedcellen of de aanwezigheid van cilinders in de urine (“urinary casts”) kunnen een aanwijzing geven voor nierschade. Proteinurie, glucosurie en enzymurie worden geassocieerd met tubulaire of glomerulaire schade.

Page 16: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

14

2.3.1.2 Blood Urea Nitrogen (BUN)

Ureum is een afvalproduct van het stikstofmetabolisme dat zich bij nierfalen in het bloed opstapelt (“blood urea nitrogen”, BUN). Dit weerd reeds in het begin van de 20

ste eeuw opgemerkt. De correlatie tussen de BUN en de eGFR is echter slechts matig. De BUN kan immers ook stijgen in afwezigheid van een verandering van GFR, omdat deze ook beinvloed wordt door andere processen in het lichaam (Ferguson en Waikar, 2012).

Een voorbeeld hiervan is de hoeveelheid eiwitten in het dieet, zo kan proteïnearme voeding voor een verlaging van de BUN zorgen. Leverproblemen kunnen de BUN eveneens doen dalen. Weefselafbraak (bij voorbeeld trauma, bloedingen) of therapie met glucocorticoïden verhogen de ureum concentratie in het bloed (Urbschat et al, 2011). Ondanks deze tekortkomingen wordt BUN nog regelmatig gebruikt, zowel in de humane (Urbschat et al, 2011; Ferguson en Waikar, 2012) als ook in de diergeneeskunde bij kleine huisdieren, paarden, varkens en herkauwers. (Russel en Roussel, 2007; Wilson, 2007; Hanto et al, 2010; Ghys et al, 2014).

2.3.1.3 Serum Creatinine (sCr)

Een ander afvalproduct voor de bepaling van de eGFR is sCr. Zoals reeds vermeld is sCr geen directe merker voor renaal insult, maar enkel een reflectie van de filtratiecapaciteit van de nier (de Geus, 2013). SCr is een spiermetaboliet, individuën met een grotere of kleinere spiermassa produceren daardoor meer, respectievelijk minder sCr (Coca et al, 2008; de Geus, 2013). Tijdens hospitalisatie van kritisch zieke patiënten treedt frequent verlies van spiermassa op, wat voor een onderschatting van de sCr zorgt. Normale sCr concentraties zijn bij deze patiënten dus geen garantie voor een intacte nierfunctie (Coca et al, 2008; de Geus, 2013; Mohamed et al, 2017). Variabele tubulaire secretie van sCr kan eveneens voor een vertekend beeld zorgen. Hierdoor gebeurt vooral tijdens gedaalde glomerulaire filtratie een overschatting van de nierfunctie (de Geus, 2013). Er is eveneens beïnvloeding door leeftijd, geslacht, hydratatiestatus, voeding, lichaamsgewicht en verschillende geneesmiddelen mogelijk (Coca et al, 2008; de Geus, 2013). Voorbeelden voor geneesmiddelen met invloed op sCr zijn cimetidine of trimethoprim (Ferguson en Waikar, 2012; Aamer et al, 2016). SCr concentraties kunnen bij honden post-prandiaal verhoogd zijn (Ghys et al, 2014).

Een bijkomend probleem bij het klinisch gebruik van sCr is, dat de basale, fysiologische waarden individueel verschillen, zodat het vaak moeilijk is om een cut-off waarde te determineren. In klinische studies wordt deze basale waarde vaak geschat aan de hand van leeftijd, geslacht en lichaamsgewicht (de Geus, 2013). Relevant is ook dat de concentratie van sCr tijdens sepsis verlaagt, waardoor nierschade gemaskeerd kan worden (Zajou en Agarwal, 2011). Voor neonati kan sCr enkel beperkt gebruikt worden als niermerker aangezien sCr tijdens de eerste dagen na de partus sterk verhoogd kan zijn zonder associatie met nierfalen. Dit kan in het bijzonder optreden bij premature neonati of als de moeder ziek was tijdens de zwangerschap.

Page 17: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

15

Bij het veulen wordt hypercreatininemie in de eerste dagen na geboorte in verband gebracht met placentale dysfunctie. Seriële sCr bepalingen kunnen hier helpen om een juiste diagnose te stellen, ze zouden immers stijgen of stagneren bij veulens met nierproblemen waarentegen er bij veulens met neonatale hypercreatininemie een daling plaatsvindt (Chaney et al, 2010).

Zoals eerder vermeld is het belangrijkste nadeel van sCr als renale merker zijn zeer lage gevoeligheid. Pas als ca. 75% van de nefronen aangetast zijn, stijgt de sCr concentratie (Arosalo et al, 2007; Ghys et al, 2014). Hoge sCr zijn niet specifiek voor de diagnose van ANS, ze kunnen evengoed een teken zijn van chronisch nierfalen (de Geus, 2013; Ghys et al, 2014).

2.3.2 Innovatieve biomerkers 2.3.2.1 Inleiding Het klinisch belang van ANS heeft de interesse voor nieuwe biomerkers doen toenemen. Ondanks veel onderzoek is er echter weinig consensus over de bruikbaarheid van de meeste biomerkers. De onderzoeksresultaten zijn vaak uiteenlopend voor dezelfde merker, waardoor het moeilijk is om tot een eenduidige conclusie te komen (Coca et al, 2008). In het kader van deze masterproef met beperkt onderzoek zullen daarom enkel tubulaire merkers worden besproken die reeds bij minstens 2 species zijn beschreven (Tabel 2). Tabel 2 Biomerkers voor tubulaire nierschade

Andere interessante merkers, die echter buiten de scope van deze masterproef vallen zijn: TIMP-2 (Tissue inhibitor of metalloproteinases 2; De Loor, 2016), atriale natriuretrische peptides (ANPs; Vesely, 2003; Morgenthaler et al, 2004), Insulin-like growth factor-binding protein 7 (IGFBP7; De Loor, 2016) en Tamm-Horsfall proteïne (De Loor, 2016). Symmetric Dimethylarginine (SDMA) wordt bij hond en kat gebruikt voor de diagnose van CNZ en is in stijgende mate een populaire niermerker bij deze kleine huisdieren.

Type merker Naam Tubulaire proteïnen N-acetyl-ß-D-glucosaminidase (NAG) D/S glutathione S-transferase (GST) J-glutamyl transpeptidase (GGT) Kidney injury molecule-1 (KIM-1)

Laag-moleculaire proteïnen Retinol-binding proteine (RBP) Cystatin C (CysC)

Inflammatie-geassocieerde proteïnen Interleukine 18 (IL-18) Neutrofiel gelatinase-geassocieerd lipocaline (NGAL) Chitinase 3-like proteïne 1 (CHI3L1) Matrix-metalloprotease 9 (MMP-9)

Structurele niermerkers Sodium-hydrogen exchanger isoform 3 (NHE-3)

Page 18: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

16

SDMA kan echter noch kwalitatief noch kwantitatief differentiëren tussen ANS en CNZ en zal daarom in het kader van deze literatuurstudie niet worden besproken. D1- en E2 microglobulines worden in de literatuur eveneens als merkers voor ANS beschreven (Lisowska-Myjak, 2010; Ferguson en Waikar, 2012; De Loor et al, 2013). Deze laag moleculaire proteïnen verhogen echter enkel in de aanwezigheid van glomerulaire schade wat ze minder interessant maakt voor de diagnose van sepsis-geïnduceerde (tubulaire) nierschade (Dieterle et al, 2010). Verder zijn verhogingen van E2-microglobuline niet specifiek voor ANS, concentraties stijgen ook bij andere inflammatoire processen in het lichaam (Ferguson en Waikar, 2012) 2.3.2.2 Tubulaire proteïnes 2.3.2.2.1 Tubulaire enzymes Enzymurie treedt al op na lichte beschadiging van de tubuli. De gevoeligheid voor vroege nierschade is hierbij superieur vergeleken met proteïnurie. Een algemeen nadeel voor de analyse van alle tubulaire enzymes is hun snelle inactivatie in de urine (Lisowska-Myjak, 2010). Verder zijn verhogingen van E2-microglobuline niet specifiek voor ANS, concentraties stijgen ook bij andere inflammatoire processen in het lichaam (Ferguson en Waikar, 2012) N-acetyl-ß-D-glucosaminidase (NAG) NAG is een glucosidase in de lysosomen van proximale tubulaire epitheelcellen. NAG reflecteert een verhoogde lysosomale activiteit ter hoogde van de tubuluscellen waardoor in de meeste gevallen tubulaire schade ontstaat. Het blijkt goede eigenschappen te hebben als merker voor beginnende (Liangos, 2007; Coca et al, 2008; Ferguson en Waikar, 2012) en reeds aanwezige ANS bij mensen (Liangos, 2007; Coca et al, 2008; Lisowska-Myjak, 2010; De Loor et al, 2013), honden (De Loor et al, 2013) en varkens (Lipcsey et al, 2009; Murphy et al, 2009). Bij honden bestaat er veel variatie betreffende de basale concentraties van NAG afhankelijk van leeftijd en lichaamsgewicht, daarom kunnen enkel seriële metingen van NAG een idee van de nierfunctie geven (De Loor et al, 2013). Concentraties van NAG kunnen ook een prognostische inschatting geven (Coca et al, 2008; De Loor et al, 2013). NAG kan ook verhoogd zijn bij CNZ (Trof et al, 2005, Liangos et al, 2007). D/S glutathione S-transferase (GST) GST kan vroege nierschade detecteren (Coca et al, 2008). GST concentraties verhogen ook bij CNZ (Trof et al, 2005). Bij de diagnose van ANS bij kritisch zieke humane patiënten bewees GST een goede gevoeligheid en specificiteit te hebben (Lisowska-Myjak, 2010). GST steeg bij ratten met nierschade door een nefrotoxisch geneesmiddel (cisplatin) (Chen et al, 2013). GST bezit een slechte stabiliteit in urine wat het minder interessant maakt voor routinematige onderzoeken (Coca et al, 2008).

Page 19: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

17

J-glutamyl transpeptidase (GGT) Dit enzyme bevindt zich aan de brush border van de proximale tubulusepitheelcellen. Bij tubuaire schade komt het in grote hoeveelheden in de urine terecht. Bij de mens werd GGT getest als vroege merker voor ANS met goede resultaten (Coca et al, 2008). Bij paarden met ANS kunnen eveneens verhoogde GGT concentraties worden waargenomen. In analogie met resultaten uit humane studies is GGT bij paarden enkel van belang voor de vroege detectie aangezien de concentraties na een eerste fase snel terug binnen een normale range vallen (Arosalo et al, 2007). GGT verhoogt bij paarden met gentamicine-geïnduceerde nierschade (Savage, 2008). GGT concentraties verhogen ook bij CNZ (Trof et al, 2005). GGT bezit een slechte stabiliteit in urine. Hierdoor mag maximaal 4u tussen staalname en analyse liggen. Verder moet het staal voor de analyse met behulp van een chromatografische kolom gefiltreerd worden om matrixeffecten te voorkomen. Deze beperkingen maken GGT minder interessant als klinisch bruikbare merker. 2.3.2.2.2 Andere tubulaire proteïnes Kidney injury molecule-1 (KIM-1) KIM-1 is een glycoproteïne dat enkel voorkomt in de apicale membraan van beschadigde proximale tubulus epitheelcellen. In nierweefsel en urine van gezonde mensen en muizen is het niet detecteerbaar (<0,1 ng/ml; Lisowska-Myjak, 2010; de Geus, 2013). KIM-1 is een specifieke en kwantitatieve merker voor proximale tubulaire schade zowel van toxische als ischemische oorsprong bij mensen (Liangos et al, 2007; Coca et al, 2008; Lisowka-Myjak, 2010; de Geus, 2013) en muizen (Lisowka-Myjak, 2010; de Geus, 2013). Vroege nieschade kan echter minder goed door KIM-1 gedetecteerd worden (Coca et al, 2008), behalve na hartchirurgie (De Loor et al, 2013). KIM-1 verhoogd ook bij de aanwezigheid van renale carcinomas of bij polycystische nierziekte (Liangos et al, 2007) maar stijgt niet bij CNZ (Lisowska-Myjak, 2010). KIM-1 werd nog niet getest bij honden (De Loor et al, 2013) en paarden (Savage, 2008). 2.3.2.3 Laag-moleculaire proteïnen De meeste cellen produceren laag moleculaire proteinen (MG<40 kDa), die initieel gefiltreerd worden en dan volledige reabsorptie ondergaan. Dysfunctie van de proximale tubulus leidt tot uitscheiding van deze eiwitten in de urine (proteïnurie; Lisowska-Myjak, 2010). Retinol-binding proteine (RBP) RBP staat in voor het vitamine A transport. RBP is uitermate gevoelig voor de detectie van nierschade aangezien minimale dalingen in de tubulaire functie reeds leiden tot excretie van RBP in de urine. Een voordeel tegenover E2-microglobuline is zijn stabiliteit in urine met een pH<6 (Lisowska-Myjak, 2010). RBP is veelbelovend voor de detectie van ANS bij de mens (Ferguson en Waikar, 2012) en de hond (De Loor et al, 2013).

Page 20: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

18

Cystatin C (CysC) CysC is een cysteine protease inhibitor die door alle gekernde cellen aan een relatief constante snelheid gesecreteerd wordt (Lisowska-Myjak, 2010; de Geus, 2013). CysC geeft, zoals sCr een schatting van de GFR (de Geus, 2013; Arosalo et al, 2007). De concentraties van CysC zijn bij de mens onafhankelijk van leeftijd, geslacht, lichaamsmassa en hydratatiestatus (Lisowska-Myjak, 2010). Bij honden blijkt daarentegen wel een invloed van de leeftijd op de basale concentraties van CysC te bestaan. De studie die dit vaststelde deed echter enkel klinisch onderzoek om een hond als gezond te definieren, verder onderzoek met een betere controle (meting van de GFR om subklinische nierschade uit te sluiten) zou moeten gebeuren om dit te bevestigen (Ghys et al, 2014). Ontstekingsprocessen en veranderingen in schildklierfunctie kunnen bij de mens een invloed uitoefenen op de CysC concentratie in het bloed (de Geus, 2013; Ghys et al, 2014), net zoals de toediening van corticosteroïden (de Geus, 2013). CysC werd beschreven als merker voor CNZ, waarbij het een betere inschatting van de nierfunctie geeft dan sCr (de Geus, 2013). Bij hond en kat is CysC een goede merker voor CNZ, er moet echter nog meer onderzoek gebeuren om te zien of er werkelijk een voordeel tegeonver sCr(Ghys et al, 2014). CysC kan ANS bij de mens aantonen en geeft een prognostische inschatting van het verder verloop ervan (Coca et al, 2008). Echter, aangezien CysC de GFR reflecteert en deze tijdens vroege ANS nog niet verlaagd moet zijn wordt CysC aanzien als een minder bruikbare merker bij sepsis-geïnduceerde nierschade (Lisowska-Myjak, 2010). CysC werd nooit gevalideerd voor sepsis-geïnduceerde nierschade en viel noch in de urine noch in het serum op met verhoogde concentraties tijdens een experimentele proteoom studie bij septische muizen (Maddens et al, 2012). CysC wordt gebruikt worden voor de detectie van sepsis-geïnduceerde nierschade bij varkens (Lipcsey et al, 2009). Er bestaan geen studies omtrent CysC als niermerker bij het paard. Arosalo et al (2007) deed een poging om CysC met behulp van een humane immunoassay te evalueren, er was echter geen kruisreactie. Een praktisch voordeel van CysC is de goede stabiliteit in urine bij routine bewaring (Lisowska-Myjak, 2010).

Page 21: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

19

2.3.2.4 Inflammatie-geassocieerde proteïnen Cytokines zijn belangrijke mediatoren tijdens inflammatie. Verhoogde cytokine concentraties in het bloed wijzen op systemische ontstekingsprocessen en bieden daarom maar weinig potentieel voor de diagnose van ANS. Cytokine concentraties in de urine blijken wel nuttig in deze context en kunnen een mortaliteit voorspellen bij de mens (Lisowska-Myjak, 2010). Interleukine 18 (IL-18) IL-18 is een proinflammatoire cytokine dat tijdens orgaanschade wordt vrijgesteld. IL-18 dient dan (naast IL-6, IL-8, IL-10 en TNF-D) ook als prognostische merker voor multipel orgaanfalen. In de nier volgt vrijstelling van IL-18 voornamelijk na tubulair insult (Lisowska-Myjak, 2010). Hogere concentraties van IL-18 in de urine blijken dan ook een goede diagnostische merker voor ANS bij muizen (Faubel et al, 2007) en bij de mens te zijn (Coca et al, 2008; Lisowska-Myjak, 2010; de Geus, 2013; De Loor et al, 2013). IL-18 is volgens Coca et al (2008) minder goed geschikt voor de vroege detectie van nierschade. Andere auteurs beweren hierentegen dat IL-18 wel vroege nierschade kunnen detecteren (Zarjou en Agarwal, 2011; Ferguson en Waikar, 2012). De Loor et al (2013) stellen dat IL-18 geschikt is voor de prognose van vroege nierschade na grote chirurgische ingrepen. CNZ, urinaire infecties en prerenale azotemie veroorzaken geen stijging in IL-18 in de urine. De gevoeligheid van IL-18 is echter laag, met als gevolg dat niet alle zieke individuen verhoogde IL-18 concentraties vertonen (Coca et al, 2008). Er bestaat nog geen literatuur omtrent IL-18 bij paarden of varkens. Neutrofiel gelatinase-geassocieerd lipocaline (NGAL) NGAL (synoniemen: lipocalin 2, siderocalin, neutrophil lipocalin) is een klein ijzertransporterende proteïne dat geproduceerd wordt door epitheelcellen van maag, colon, lever, longen en nier. Zoals de naam suggereert, bevindt het zich in neutrofiele granulocyten, meer bepaald in de in cytoplasmatische granules. NGAL kan bij gezonde individuen waargenomen worden in de distale tubulus en in de collectiebuizen van het nefron (de Geus, 2013). Tijdens ANS kan NGAL toxische effecten van te veel ijzer tegengaan door dit op te slaan en beschikbaar te maken voor de intracellulaire regeneratiemechanismen van lichaamseigen cellen. Experimenten waarbij men NGAL toediende tijdens of kort na ischemische nierschade toonden aan dat er hierdoor apoptose van tubulaire epitheelcellen plaatsvond. NGAL zou echter ook een beschermend en proliferatiebevordernd effect hebben op deze epitheelcellen (Lisowska-Myjak, 2010; de Geus, 2013). De NGAL concentraties in het plasma/serum zijn afkomstig van epithelia (long, darmen, nieren) en van de neutrofielen zelf. NGAL wordt gefiltreerd door de glomerulus en onder fysiologische omstandigheden volledig gereabsorbeerd in de proximale tubulus (de Geus, 2013). Tijdens nierschade is een deel van de urinaire concentraties hiervan afkomstig (De Loor et al, 2016).

Page 22: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

20

Bijkomend wordt NGAL tijdens ANS gesecreteerd door de distale tubulus (de Geus, 2013; De Loor et al, 2016), waar het een rol zou spelen bij de afweer van bacteriën (De Loor et al, 2016). De NGAL concentraties in het bloed worden bijgevolg veel meer door systemische, non-renale inflammatie beïnvloedt dan de concentraties in de urine. Hierdoor wordt NGAL in de urine veelal beschouwd als doeltreffendere niermerker (de Geus, 2013). NGAL in urine en bloed kan zowel verhoogd bij sepsis zonder of met ANS maar ook bij ANS in het algemeen (Maddens et al ,2012; de Geus, 2013). Differentiatie tussen sepsis-geïnduceerde nierschade en sepsis zonder ANS is kwantitatief mogelijk bij mensen, muizen en varkens (Maddens et al , 2012; de Geus, 2013; Wang et al, 2014). NGAL werd in 2 proof-of-concept studies geevalueerd bij honden en bleek nierschade vroeger aan te tonen dan sCr (De Loor et al, 2013). Er bestaat nog geen literatuur over NGAL bij paarden met ANS of sepsis. De concentratie van NGAL in het bloed en in de urine correleert bij mensen en muizen met de ernst van nierschade (Lisowska-Myjak, 2010; Zarjou en Agarwal, 2011; Maddens et al ,2012; de Geus, 2013). Ondanks uitgebreid onderzoek en talrijke studies is er nog geen duidelijk besluit of NGAL in urine en/of serum en/of plasma een handig tool voor de diagnose van ANS kunnen zijn. De resultaten blijken in grote mate afhankelijk van het type studiepopulatie. Zo volgt bij voorbeeld uit een metastudie dat verhoogde NGAL concentraties in de urine ANS kan voorspellen bij kinderen na hartchirurgie en bij volwassenen na niertransplantatie. Minder goede prestaties werden bij kritisch zieke kinderen en bij volwassenen na hartchirurgie gezien (Coca et al, 2008). Meerdere bronnen rapporteren een goede gevoeligheid, maar slechte specificiteit van verhoogde NGAL concentraties in urine (Coca et al, 2008; Wheeler et al, 2008 Lisowska-Myjak, 2010). Ook verhoogde NGAL concentraties in het serum van kritisch zieke kinderen vertonenen een lage specificiteit voor de diagnose van ANS (Coca et al, 2008). Bij dezelfde studie kon wel een correlatie met de ernst van de ziekte werden vastgesteld. Patiënten met sepsis vertoonden hogere concentraties dan kinderen die slechts SIRS vertoonden. NGAL kan ook verhoogd zijn in patiënten met vooraf bestaande nierschade (CNZ) en systemische of renale infecties (Lisowska-Myjak, 2010; Maddens et al, 2012; de Geus, 2013). Fel verhoogde NGAL concentraties duiden wel eerder op ANS dan op CNZ (Maddens et al, 2012). Chitinase 3-like proteïne 1 (CHI3L1) In de secretorische granules van neutrofielen bevindt zich naast NGAL ook CHI3L1. De hoeveelheid CHI3L1 (synoniemen: Cartilage glycoprotein-39, YKL-40) per granule is echter om een veelvoud minder dan de hoeveelheid NGAL. Dit wilt zeggen dat CHI3L1 tijdens een urinaire infectie minder hoge urine concentraties bereikt in vergelijking met NGAL. CHI3L1 is een lid van de mammalian chitinase, meer bepaald van de Chitinase-like proteïnen (CLPs). CLPs zijn betrokken bij T-helper 2 gemedieerde inflammatieprocessen. CHI3L1 wordt na een episode van renale stress of schade in het nierweefsel vrijgesteld door macrofagen.

Page 23: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

21

CHI3L1 bindt aan de IL-18 D2 receptor waardoor apoptose en pyroptose van het renaal epitheel worden tegengegaan. Verder wordt hierdoor de IL-1 secretie door macrofagen geinhibeerd. De anti-inflammatoire effecten van CHI3L1 helpen zo bij de bescherming en de reparatie van beschadigd nierweefsel. Mogelijks promoot CHI3L1 door deze effecten echter ook de overgang naar een chronische ontsteking(De Loor et al, 2016). CHI3L1 verhoogt zowel in het serum als in de urine tijdens ANS. De concentratie van CHI3L1 in serum wordt in een studie van De Loor et al (2016) echter als slechte prognostische merker voor ANS beschreven. Daarentegen verhoogde de urinaire concentratie van CHI3L1 24u voor een episode van ANS en lag gemiddeld 2 keer hoger dan bij patiënten die geen nierfalen zouden ontwikkelen. Urinaire CHI3L1 blijkt in deze studie een even goede merker voor de vroege herkenning van ANS (graad > 2) als de concentratie van NGAL in de urine. Een deel van de urinaire concentraties van CHI3L1 is afkomstig van plasma filtratie, zoals dit bij NGAL het geval is. De Loor et al (2016) suggereren dat CHI3L1 net zoals NGAL door binding op de megaline receptor tubulaire reabsorptie ondergaat. Dit zou betekenen dat NGAL en CHI3L1 een invloed op elkaars concentratie in de urine uitoefenen, omdat ze allebei op die zelfde receptor binden (De Loor et al, 2016). In de proteoom studie van Maddens et al (2012) bleek CHI3L1 sepsis-geïnduceerde nierschade bij muizen goed te kunnen discrimineren van sepsis zonder ANS. Het werd dan ook enkel in de urine van de muizen die septisch waren en nierschade vertoonden gevonden en niet in de uirine van muizen met sepsis die nog geen nierschade hadden ontwikkeld (Maddens et al, 2012). Chitinase-3-like proteïne 3 (CHI3L3) en acidic mammalian chitinase (CHIA) konden bij deze studie eveneens worden gevonden in de urine van muizen met sepsis-geïnduceerde nierschade, maar hun discriminerend vermogen was minder goed dan dat van CHI3L1 (De Loor et al, 2016). Ook bij de mens kan er een goede prognostische inschatting gemaakt worden met behulp van CHI3L1. Maddens et al (2016) vonden hogere concentraties van CHIL1 bij sepsis patiënten met ANS vergeleken met sepsis patiënten zonder ANS. Bij een studie met over 180 kritisch zieke adulte patiënten werd gevonden dat de urinaire CHI3L1 concentratie ANS (t2 volgens de “Kidney Disease: Improving Global Outcomes“ (KDIGO) criteria) 12-24 uur op voorhand kon voorspellen. De concentratie van CHI3L1 correleerde hierbij met de ernst van ANS (De Loor et al, 2016). Voor varkens en paarden is er nog geen literatuur beschikbaar. Matrix-metalloprotease 9 (MMP-9) De accumulatie van MMP-9 in de urine wordt in verband gebracht met ANS omdat MMP-9 een te hoge moleculaire massa heeft om door de intacte nierfilter te geraken (68-82 kDa). Bij endotoxemische paarden met koliek en vermoeden op nierschade waren dan ook verhoogde concentraties van MMP-9 in de urine aanwezig (Savage, 2008). In een studie met ratten waarbij ischemische nierschade werd geïnduceerd kon een verhoogde expressie van MMP-9 in het nierweefsel werden opgemerkt (Basile et al, 2003). Bij de mens kan MMP-9 in de urine nierschade aantonen, bij de studie van Han et al (2008) kon echter niet gediscrimineerd worden tussen ANS en urinaire infecties.

Page 24: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

22

2.3.2.5 Structurele niermerkers Sodium-hydrogen exchanger isoform 3 (NHE-3) NHE is verantwoordelijk voor ca 60-70% van de totale natrium- en bicarbonaatresorptie ter hoogte van de nier. Tijdens ANS wordt er een plotse vermindering in natrium opname gezien. Dit wordt veroorzaakt door schade aan NHE waardoor deze in de urine terechtkomt. Eerste studies bij muizen met ANS (ref) konden dit reeds aantonen. Verder onderzoek moet uitwijzen of NHE-3 ook bij andere species een potentieel als niermerker heeft (Coca et al, 2008). 2.4 Probleemstelling en doelstelling

Omdat het nierweefsel gekenmerkt wordt door een beperkte reparatiecapaciteit na insult, is het voorkomen van verdere nierschade de meest belangrijke interventie bij de behandeling van nierpatienten (Arosalo et al, 2007). Een vroege detectie van ANS zorgt voor een doeltreffendere behandeling en meer kans op gedeeltelijk herstel van de nierfunctie met een betere prognose als gevolg (Arosalo et al, 2007). Ondanks deze bevindingen worden in de diergeneeskundige kliniek tot op de dag van vandaag voornamelijk sCr en BUN als merkers voor (sepsis-geinduceerde) ANS gebruikt (Russel en Roussel, 2007; Wilson, 2007; Hanto et al, 2010; Ghys et al, 2014).

Echter, als imperfecte gouden standaard zorgt sCr (in combinatie met BUN) voor een veel te late detectie van nierschade en is het dus mede verantwoordelijk voor de hoge mortaliteit na ANS (Aamer et al, 2016; Mohamed et al, 2017).

Vroege detectie en interventie bij ANS is eveneens belangrijk omdat een episode van ANS aanleiding kan geven tot de ontwikkeling van CNZ (De Loor et al, 2016). De ontwikkeling van CNZ na ANS is een gekende complicatie bij de kleine huisdieren (Bartges, 2012). Bij het paard is de prevalentie van CNZ algemeen relatief laag, maar ANS kan ook hier een rol spelen bij het onstaan van chronische nierproblemen (Schott, 2007). Bij het varken is CNZ niet beschreven als op zich staande diergeneeskundige problematiek. CNZ kan bij varkens wel geïnduceerd worden in experimentele studies (Misra et al, 2006)

Een ideale biomerker voor nierschade detecteert het renaal insult voor de GFR vermindert en de sCr stijgt. Idealiter geeft deze renale merker ook een indicatie van de plaats in het nefron, waar de schade is ontstaan. Een snelle verandering van de waarden bij verbeteren en verslechteren van de nierfunctie is gewenst. In de literatuur wordt gesuggereerd, dat mogelijks enkel een combinatie van verschillende biomerkers de vereiste sensitiviteit en specificiteit kan bereiken (Trof et al, 2006; Lisowska-Myjak, 2010).

Page 25: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

23

In de humane geneeskunde bestaat er zeker nog een nood aan verder onderzoek, met name ook wat de pediatrische patient betreft. Biggen dienen hierbij als gevalideerd model voor de pediatrische (septische) patient en bewezen reeds hun meerwaarde ten opzichte van de meer traditionele knaagdiermodellen, omwille een meer vergelijkbare cardiovasculaire en renale anatomie en fysiologie naar de mens toe (Fink en Heard, 1990; Parker en Watkins, 2001; Castellheim et al, 2008; Gasthuys et al, 2017). Ook in de diergeneeskunde zou het gebruik van dergelijke nieuwe biomerkers een indicatie kunnen geven of verder behandelen nog verantwoord is. Zo kunnen een lange lijdensweg voor het dier en hogere behandelingskosten voor de eigenaar vermeden worden. Wegens het relatief beperkt aantal stalen (12 veulens en 8 biggen met 10 en 2 controledieren, respectievelijk) zijn de resultaten van het onderzoek louter descriptief. Niettemin kan hierdoor reeds een eerste inzicht verworven worden omtrent de betrouwbaarheid en praktische inzetbaarheid van NGAL en CHI3L1. Vervolgonderzoek kan dan uitgebreidere aantallen juveniele patienten includeren om deze proof-of-concept te valideren. Het langetermijndoel is dat de data van deze masterproef met beperkt onderzoek een aanzet vormen voor de introductie van betere niermerkers in het dagelijks klinisch gebruik, zodat door vroegtijdig ingrijpen morbiditeit en mortaliteit significant verlaagd kunnen worden (Trof et al., 2006).

3 Onderzoek 3.1 Materiaal en Methoden 3.1.1 Onderzoek van de porciene stalen

De porciene stalen voor het beperkt onderzoek van deze masterproef waren afkomstig van een pediatrisch sepsis-model voor de humane geneeskunde dat werd ontwikkeld door de onderzoeksgroep Farmacologie en Toxicologie (doctoraatsthesis Laura Dhont) van de vakgroep Toxicologie, Farmacologie en Biochemie, faculteit diergeneeskunde te Merelbeke. Het doel van deze dierenproef is de studie van de effecten van LPS op de GFR en de renale plasma flow (RPF) bij juveniele biggen. Een bijkomend luik is de histopathologische beoordeling van het nierweefsel van deze biggen.

Onderzoeksopzet

Acht mannelijke biggen werden aangekocht bij Seghers Hybrid (Wuustwezel, België). Het betrof dieren van een homozygoot stress-resistente kruising tussen het Belgisch landras en Large White. De leeftijd van de varkens bedroeg 2 weken bij de start van de proef met een lichaaamsgewicht (LG) van gemiddeld 18,53 ± 1,82kg. Na aankomst werden de biggen in groep gehuisvest in standaard varkensstallen op de faculteit diergeneeskunde te Merelbeke. Voeding en water werd ad libitum voorzien. Er werden bij alle varkens katheters geplaatst in de vena jugularis.

Page 26: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

24

Na een uitvastperiode van 12u werden de biggen intramusculair met morphine (0,1 mg/kg LG) (Morphine HCl®, Sterop, Anderlecht, België), midazolam (0,5 mg/kg LG ) (Dormicum®, Roche, Vilvoorde, België) en ketamine (10 mg/kg LG)(Nimatek®, Dechra, Lille, België) gepremediceerd. Vervolgens werd een algemene anesthesie uitgevoerd met propofol (Proopvet®, Abbott Animal Health, Maidenhead, UK) en onderhouden met sevoflurane (SevoFlo®, Ecuphar, Oostkamp, België). Tijdens de anesthesie werd bij alle biggen een centrale blijfkatheter in de rechter vena jugularis geplaatst (dubbel-lumen catheter, 7 Fr, 60 cm; Arrow® International). Tijdens de operatie werd eveneens een chip in de musculus gluteus maximus geplaatst (Lifechip Biothermo®, Allflex, Vitré, Frankrijk) om de lichaamstemperatuur te meten. Na deze ingreep werden de biggen apart gehuisvest met een halsverband om verplaatsing van de katheter te voorkomen. De blijfkatheters werden tijdens het hele experiment twee keer dagelijks met gehepariniseerde fysiologische injectieoplossing (NaCl 0,9%) geflusht. De halsverbanden werden dagelijks vervangen. Een dag na het inbrengen van de blijfkatheters werden 3 merkers voor hetzij de GFR (iohexol iohexol, 64.7 mg/kg LG)(Omnipaque 300 (GE Healthcare, Eindhoven, Nederland) en creatinine (40 mg/kg LG)) of de RPF (para-aminohipuurzuur of PAH, 10 mg/kg BW)) toegediend. Op basis hiervan werd de basale GFR en RPF van elk varken bepaald. Twee dagen nadien (“wash-out” periode van de 3 merkers) werd bij 8 biggen een LPS-infuus (E.coli 0111:B4,InVivogen, Toulouse, Frankrijk) opgestart. Deze 8 biggen werden ad random in vier groepen van elk 2 dieren verdeeld, die verschillende dosissen (nl. 0,75, 2, 5 µg/kg/u LPS) via het infuus ontvingen. Elk varken kreeg eveneens een infusie met fysiologische zoutoplossing (6ml/kg/u). Twee biggen dienden als controledieren en kregen enkel een infuus met 0,9% NaCl (6ml/kg/u). Alle varkens werden 36u klinisch opgevolgd via de lichaamstemperatuur, de hartslag en de ademhaling. Vier uur en 24u na opstarten van het LPS-infuus werd nog eens een cocktail van de boven vermelde merkers (iohexol, creatinine en PAH) toegediend. Staalnames van urine en plasma Voor de start van het LPS-infuus en op 4 en 24 uur erna werden bloedstalen (0,5 ml en 1ml, respectievelijk) genomen op kalium-EDTA buisjes (Vacutest®, Piove di Sacco, Kima, Italië). De stalen werden direct op ijs bewaard en binnen de 2u gecentrifugeerd (2850xg, 10 min, 4°C) en gealiquoteerd. De zo verkregen plasma stalen werden dan bij minstens -80°C ingevroren. Bij de varkens werd een stoma aangelegd zodat de urine in een urinezakje terecht kwam. Om de 4 uur werd het urinezakje geledigd en werden minstens twee aliquots urine (1ml) ingevroren bij -80°C. Op 36u na de start van het infuus werden alle biggen geëuthanaseerd met een overdosis natrium-pentobarbital (Sodium pentobarbital 20%®, Kela, Hoogstraten, België). Onmiddellijk na euthanasie werden stalen van de nier genomen voor morfologische evaluatie.

Page 27: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

25

Voorbereiding van de stalen voor analyse De analyses vonden 13 maanden na de initiële dierproef plaats. Ontdooien van de stalen gebeurde bij kamertemperatuur, zoals aanbevolen in de handleidingen van de enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) kits. De urine werd afgecentrifugeerd gedurende 3 minuten op 447g (=1400 rpm) om sediment te verwijderen, daarna werd de pH gemeten. Deze bleek voor alle urinestalen aanvaardbaar (nl. tussen 6-8). Het plasma werd macroscopisch voor hemolyse geëvalueerd (waarbij enkele licht hemolytische stalen werden geïdentificeerd) en onmiddellijk voor gebruik gemengd met behulp van een vortex mixer. Bijkomend onderzoek van de T0 stalen op Creatinine (Cr) Om eventueel aanwezige initiële nierproblemen te kunnen diagnosticeren werden alle T0 stalen op Cr onderzocht. Voor gezonde varkens tot 8 weken oud moet de Cr concentratie lager liggen dan 76,9 µmol/L (Dubreuil en Lapierre, 1994). Dit was zo voor alle biggen (Tabel 3). Er kan dus worden geconcludeerd, dat alle proefdieren een intacte nierfunctie hadden bij start van de proef (voor zover dit door Cr beoordeelbaar is). Tabel 3 Concentraties van Cr in het plasma van 14 dagen oude biggen voor LPS challenge.

3.1.1.1 NGAL analyses op urine en plasma De analyses voor NGAL gebeurden met behulp van een ELISA-kit (Abcam£, Pig Lipocalin-2 ELISA-kit, 96 wells). Deze kit was reeds gevalideerd voor zowel urine als plasma bij varkens. Er werd met een preliminaire test gewerkt om de verdunningen te optimaliseren. Hierbij werden de aanbevelingen in de manual gevolgd: stalen waarbij lage concentraties werden verwacht, zoals alle T0 en de controlestalen (LPS 0) werden 1/1000 verdund, stalen waarbij hogere concentraties werden verwacht (T4 en T24 van LPS 2 en LPS 5) werden 1/5000 verdund. Op basis van de OD waarden van de preliminaire test werd beslist om het aanbevolen verdunningsschema grotendeels aan te houden voor plasma: alle T0 stalen en alle stalen van de controle biggen (LPS 0) werden 1/1000 verdund; alle T4 en T24 stalen van de LPS 0,75; 2 en LPS 5 groepen werden 1/5000 verdund. Verder werd bij de varkens 1.0 en 2.0 een bijkomende verdunning van 1/7000 uitgevoerd voor T4 en T24. Voor de urinestalen werd hetzelfde principe toegepast als voor de plasmastalen nl. verdunningen van 1/1000 of 1/5000, naargelang de verwachte concentratie. Bijkomend werden enkele verdunningsreeksen uitgevoerd: voor varken 3.5 en 3.6 (beide LPS 0,75) werd het T24 staal 1/1000, 1/2000 en 1/5000 verdund; voor varken 3.7 (LPS 5) en 3.8 ( LPS 2) werd T4 1/5000 en 1/10000 verdund.

Varken 1 2 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8

sCr (µmol/L)

46 44,2 48,6 57,5 63,6 45,1 49,5 51,3 49,5 47,7

Page 28: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

26

De verdunde stalen werden samen met de standaarden in de antilichaam-gecoate wells geplaatst. Na incubatie (60 minuten, bij kamertemperatuur op een schudder (200rpm)) volgde een wasstap en het toevoegen van het varken-NGAL antilichaam in oplossing. Daarna werd terug geïncubeerd en gewassen. Er werd HRP strepatavidin solutie toegevoegd aan de wells en terug geïncubeerd en gewassen. Na toevoegen van het substraat werd voor exact 10 minuten in het donker geïncubeerd. Dan werd de stopsolutie toegevoegd en voorzichtig gemengd door schudden. Na 30 minuten werd de plaat spectofotometrisch uitgelezen op een golflengte van 450nm. De OD waarden werden door Deltasoft£ omgezet in concentraties op basis van de standaardcurve. Enkel de resultaten waar de OD waarden op de standaardcurve lagen werden voor de interpretatie gebruikt. 3.1.1.2 CHI3L1 analyses op urine en plasma De analyses gebeurden met een commerciële ELISA-kit (Elabscience£, ELISA-kit CHI3L1(Cartilage Glycoprotein-39), formaat: 8x12 wells). Deze kit was reeds gevalideerd voor serum en plasma, maar niet voor urine. Volgens de producent kunnen echter ook andere “biologische vloeistoffen” geanalyseerd worden. Zoals voor NGAL werd ook bij deze ELISA een preliminaire test uitgevoerd. De stalen werden verdund zoals in de handleiding aanbevolen: voor plasma werden alle stalen van de controlegroep (LPS 0) en de T0’s van de LPS 0,75; 2 en 5 groepen 1/10 verdund. De rest van de serum stalen werd 1/100 verdund. Voor de urinestalen werd voor meer uiteenlopende verdunningen gekozen omdat de kit niet specifiek voor urine was gevalideerd: er werd 1/2 verdund voor alle T0 stalen en voor alle stalen van de controlegroep. Alle T4 stalen werden 1/5 verdund, bij T4 van de LPS 5 groep werd een bijkomende verdunning van 1/20 gekozen. Voor de T24 stalen van de LPS 2 en5 groepen werden verdunningsreeksen van 1/5, 1/10, 1/20 en 1/50 uitgevoerd. Voor de T24 stalen van LPS 0,75 werden verdunningen van 1/5 en 1/20 uitgevoerd. De resultaten van deze preliminaire test toonden aan dat slechts één optische densiteits (OD)-waarde binnen de standaardcurve viel. Daarom werd voor de finale analyse het volgend verdunningsschema gekozen: een verdunning van 1/5 voor alle plasmastalen, bijkomende verdunningen van 1/10 bij T4 van de LPS 5 groep. De urinestalen werden allemaal 1/2 verdund, behalve T4 van de LPS 5 groep, hier werden bijkomend nog de verdunningsreeksen 1/5, 1/10 en 1/20 uitgevoerd. Een verdunningsreeks van 1/5, 1/10, 1/20, 1/40 werd uitgevoerd voor varken 3.8 aangezien dit dier tijdens de proef al verdacht werd van klinische nierschade (dalende GFR). De procedure beschreven in de manual werd gevolgd. Samengevat werden de verdunde stalen en de standaarden in de antilichaam gecoate wells geplaatst en geïncubeerd (90 minuten bij 37°C). Dan werd het antilichaam in oplossing toegevoegd. Hierna werd nog eens geïncubeerd (60 minuten bij 37°C). Na herhaald wassen volgte de toevoeging van het HRP strepatavidin conjugaat en incubatie (30 minuten bij 37°C).

Page 29: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

27

Dan werd nog eens gewassen en het substraat bijgevoegd. Na 25 minuten incubatie bij 37°C werd de stopsolutie toegevoegd en de plaat werd spectofotometrisch uitgelezen op een golflengte van 450nm. De OD waarden werden door Deltasoft£ omgezet in concentraties op basis van de standaardcurve. Enkel de resultaten waar de OD waarden op de standaardcurve lagen werden voor de interpretatie gebruikt. 3.1.2 Onderzoek van de equiene stalen Inclusie-protocol voor de veulens verdacht op sepsis De groep veulens voor het beperkt onderzoek van deze masterproef werd met behulp van een inclusie-protocol geselecteerd. Geïncludeerd werden alle veulens, die tijdens de periode vanaf 26.04.2018 tot en met 11.06.2018, op de kliniek inwendige geneeskunde van de faculteit diergeneeskunde in Merelbeke werden aangeboden met minstens twee van de volgende symptomen: hyper- of hypothermie, tachycardie, tachypnee of hyperventillatie, lethargie, afwezige zuigreflex, anorexie, donker geïnjecteerde of bleke mucosae (eventueel aanwezigheid van een schokzoom), verlengde capillaire/ jugulaire vullingstijd, opgezette gewrichten, aanwezigheid van een leknavel, leukocytose/ -penie, neutrofilie/-penie, verhoogde hematocriet, thrombocytopenie, verlaagde Immunoglobuline G (IgG) concentratie van < 8 g/l, gestegen serum amyloïd A (SAA) concentratie van > 4 µg/ml. Samen met minstens twee van de reeds opgesomde symptomen kunnen geïnjecteerde sclera, conjunctivaal oedeem, ataxie, neurologische symptomen, kolieksymptomen, een slechte perifere pols, koude extremiteiten, zwakke perifere pulsatie, diarree, verminderde borborygmi, slechte groei, hypovolemie, acidose en hypotensie eveneens tekenen zijn voor sepsis bij veulens.

Deze lijst is gebaseerd op literatuur rond equiene sepsis (Roy, 2004; Sanchez, 2005) en werd in samenwerking met Prof. dr. Gunther Van Loon van de dienst inwendige ziekten opgesteld. Zoals vermeld in de literatuurstudie geeft sepsis een uiteenlopend klinisch beeld, waardoor de lijst van mogelijke symptomen relatief lang is. Immers, niet alle veulens die op basis van deze lijst werden geïncludeerd waren septicaemisch: verschillende andere etiologiën kunnen de bovengenoemde symptomen veroorzaken. Retrospectief werd daarom met behulp van de patiëntendocumentatie voor elk veulen een sepsis score (Wong et al, 2017) bepaald (Tabel 21, zie bijlage). Een sepsis score van >10 en/of een positieve bloedcultuur werd dan finaal als sepsis geclassificeerd.

Page 30: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

28

VEULEN SEPSIS SCORE BLOEDCULTUUR 1 14 niet uitgevoerd 2 12 negatief, maar isolatie van kiemen uit gewricht

en navel op autopsie 3 6 negatief 4 13 positief 5 8 negatief 6 3 positief 7 12 positief 8 0 niet uitgevoerd

9 3 niet uitgevoerd 10 16 positief

11 17 positief 12 17 niet uitgevoerd

Uit de resultaten van deze scoring en de uitslagen van de bloedculturen konden we concluderen, dat veulens 1, 2, 4, 6, 7, 10, 11 en 12 hoogstwaarschijnlijk sepsis hadden ontwikkeld. Positieve bloedculturen bevestigen het vermoeden van sepsis bij veulen 4, 6, 7, 10 en 11. Bij veulen 2 werden op autopsie kiemen geïsoleerd uit de navel en uit een gewricht, wat eveneens een sterke indicatie is voor sepsis. Bij veulen 1, 8, 9 en 12 werd er geen bloedcultuur uitgevoerd. Veulen 3, 5, 8 en 9 vertonen een sepsis score < 10, hier leek dus geen klinische sepsis aanwezig te zijn. De klinische presentatie van veulen 8 en 9 leek eerder koliekgeassocieerd, terwijl bij veulen 3 white muscle disease werd gediagnosticeerd. Veulen 5 werd aangeboden met PAS (dystocie met nadien reanimatie) wat een predilectiefactor kan zijn voor sepsis. De bloedcultuur van dit veulen was echter negatief en de sepsis score <10. Staalnames van urine en serum van de veulens verdacht van sepsis Bij de gehospitaliseerde veulens werd routinematig bloed genomen in het kader van algemeen onderzoek en een overblijvend deel van de verzamelde volumes bloed kon voor dit onderzoek worden gebruikt. De bloedname gebeurde in de regel direct na aankomst van de veulens op de dienst inwendige ziekten, soms werd het T1 staal echter ook pas na één dag op de kliniek genomen. Het bloed werd ontnomen uit de vena jugularis. Dit werd ofwel met behulp van een venoject-naald aangesloten op een vacutainer systeem (BD Vacutainer£) gedaan, of door directe bloedafname in een spuit (met 21G of 22G naald), en het achteraf overbrengen van het bloed in een vacutainer (BD Vacutainer£). De stalen werden na centrifugatie in de koelkast geplaatst. Staalname van urine was enkel mogelijk indien de veulens een blaaskatheter kregen, en het plaatsen van de urinesonde gebeurde in de regel pas nadat alle onderzoeken waren afgesloten en de dieren op stal werden geplaatst.

Tabel 4 Sepsis scores en uitslagen van de bloedculturen van zieke veulens verdacht op sepsis.

Page 31: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

29

De urine werd direct uit de blaaskatheter opgevangen, na verwerpen van de eerste straal. Een volume van minimum 10 ml werd op deze manier in een afsluitbaar recipiënt verzameld en achteraf in de koelkast geplaatst. In de regel werden de stalen één of maximaal twee dagen in de koelkast bewaard. Het serum moest enkel nog worden gealiquoteerd, de urine werd vooraf bijkomend gecentrifugeerd (3 minuten, 447g) en gealiquoteerd en in de diepvries bij -80° geplaatst. Van acht stalen (patiënten 2, 3, 4 en 5; zowel het T1 als het T2 staal) werd het serum niet koel bewaard maar direct bij -20°C ingevroren en na 10 dagen overgeplaatst in de -80° diepvries, aliquotering gebeurde bij deze stalen slechts onmiddellijk voor de analyses. De T1 urine stalen van patiënt 7, 8 en 9, evenals het T2 staal van patiënt 7 werden pas na 12 tot 15 dagen bewaring in de koelkast gecentrifugeerd en gealiquoteerd, de serum stalen gealiquoteerd en in de diepvries bij -80° geplaatst. Inclusie en staalnames van de controlegroep Omwille van de praktische haalbaarheid (noodzaak van ethische commissie bij staalnames bij gezonde veulens, moeilijkheid om eigenaars te vinden die hiermee akkoord gaan) werd ervoor gekozen om volwassen paarden te gebruiken als controlegroep. Hiervoor werden paarden gekozen die voor electieve chirurgische ingrepen op de dienst Heelkunde en Anesthesie van de faculteit diergeneeskunde te Merelbeke werden aangeboden. De staalnames gebeurden in samenspraak met Dr. Stijn Schauvliege. Bij alle paarden werd pre-operatief een klinisch onderzoek uitgevoerd. Geen van de paarden had op het moment van de ingreep systemische klachten en er werden geen afwijkingen op klinisch onderzoek vastgesteld. Van de 12 controlepaarden ondergingen 3 paarden castratie (controlepaarden 3, 5 en 11), 2 paarden werden geopereerd wegens osteochondrosis dissecans (controlepaarden 4 en 8) en bij 2 paarden werd een lokale tumor verwijderd (controlepaard 6: uier sarcoma; controlepaard 1: squameus cel carcinoma ter hoogte van de penis). Verder werden de dieren aangeboden voor keratomaexcisie (7), het hechten van een kleine wonde (geen spoedgeval, 9), staande laryngoplastie (10) en voor de verzorging van een gesloten navelbreuk (12). Van controlepaard 1 en 11 kon enkel serum verzameld worden (geen urineproductie door n. pudendus blok en uiteindelijk niet gesondeerd, respectievelijk), daarom moest nog een bijkomend paard bemonsterd werden (controlepaard 12), hier was echter duidelijke hemolyse waar te nemen in het serum, zodat er werd besloten om in plaats daarvan serum van een ander controlepaard te bemonsteren. De staalnames voor serum gebeurden onmiddelijk voor inductie van de anesthesie. Het bloed werd via een katheter in de vena jugularis afgenomen in een spuit en dan overgeplaatst in een vacutainer (BD Vacutainer£). Alle paarden kregen een urinesonde voor de duur van het ingreep. De urine werd direct uit de blaaskatheter opgevangen, na verwerpen van de eerste straal. Een volume van minimum 10 ml werd op deze manier in een afsluitbaar recipiënt verzaameld. De serumstalen werden na 10-15 minuten stollingstijd bij

Page 32: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

30

kamertemperatuur gecentrifugeerd (5 minuten, 3500 RPM) en daarna in de koelkast geplaatst. Aliquotatie en plaatsen in de diepvries bij -80°C volgde binnen enkele uren. De urinestalen werden direct na staalname in de koelkast geplaatst en eveneens binnen enkele uren gecentrifugeerd (3 minuten, 447g), gealiquoteerd en in de diepvries bij -80° geplaatst. Voorbereiding van de stalen voor analyse Alle analyses op de equiene stalen werden 9 tot 11 maanden na staalname uitgevoerd. De stalen werden bij kamertemperatuur ontdooid en volgens de aanbevelingen in de handleiding voorbereid. Het serum werd voor gebruik gehomogeniseerd met behulp van een vortex-mixer. Bijkomende tests om de effecten van hemolyse na te gaan Zowel bij de veulens (serum) als bij de biggen (plasma) vertoonden enkele stalen lichte hemolyse. Aangezien er bij de analyses van CHI3L1 nog enkele wells beschikbaar waren, werd getest welke effect hemolyse zou hebben op de resultaten. Voor CHI3L1 was de gevoeligheid van de test niet verminderd door hemolyse (“spiked” geen hemolyse 56,83 ng/ml versus 56,68 ng/ml “spiked”met hemolyse). SCr concentraties bij veulens verdacht van sepsis De bepaling van sCr bij neonatale veulens is enkel nuttig indien er seriële metingen worden uitgevoerd aangezien frequent verhoogde concentraties optreden zonder einige vorm van renale ziekte. Ook sterk verhoogde concentraties zijn niet noodzakelijk een indicatie voor aanwezige nierschade (Chaney, 2010). Op basis hiervan kon dus bij geen enkel veulen definitief nierschade worden gediagnosticeerd. Er waren van de veulens 2, 3, 4, 5 en 10 serumopvolgstalen beschikbaar. Van deze veulens toonden enkel veulen 5 en 10 een verhoogde sCr concentratie op T1. Naar T2 toe nam deze concentratie bij beide veulens terug af naar een normaalwaarde. Voor de andere veulens was er enkel nog een verhoogde concentratie bij veulens 1 en 12. Aangezien voor deze dieren geen opvolgstalen beschikbaar waren kunnen we niet met zekerheid zeggen dat de hoge sCr waarden een teken voor nierschade zijn.

Page 33: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

31

Tabel 5 SCr concentraties bij veulens verdacht van sepsis. Referentiewaarden: 71-194 µmol/L. “-“: geen staal beschikbaar. *bij veulen 3 werd er volgens de patiëntenfiche op dag van aankomst een onmeetbaar verhoogde sCr gevonden. Een tweede en derde analyse van het staal dat 2 dagen nadien werd genomen vertoonde een concentratie van 58 en 62 µmol/L (dus gemiddeld 60), respectievelijk.

3.1.2.1 NGAL analyses van de serum- en urinestalen Voor de analyses van NGAL werd gekozen voor een commercieel beschikbare ELISA kit (Bioporto� porcine NGAL ELISA kit car.no. KIT 004) die oorspronkelijk ontwikkeld werd voor de bepaling van NGAL in urine, plasma, serum en weefselextracten bij varkens. Door kruisreactie van de antistofcoating met equiene NGAL kan de kit echter ook worden gebruikt voor stalen afkomstig van paarden. Dit werd recent gevalideerd door Jacobsen et al (2018). Hierdoor werd dan ook besloten om bij deze kit geen preliminaire test uit te voeren. De stalen werden verdund volgens de aanbevelingen in de handleiding, die ook Jacobsen et al hadden toegepast: elk staal werd zowel 1/1000 als 1/5000 verdund, behalve de controlestalen die enkel 1/1000 werden verdund. De rest van de plaat werd opgevuld met duplexen. Na incubatie (60 minuten, afgedekt op kamertemperatuur op een schudder) werd 3 keer gewassen met wassolutie. Hierna werd het pig-NGAL antilichaam, het HRP-conjugaat en tetramethylbenzidine (TMB) substraat toegevoegd met daartussen telken een wasstap. Na toevoegen van de stopsolutie werd de absorbantie afgelezen op 450 nm. 3.1.2.2 CHI3L1 analyses van de serum- en urinestalen Voor de analyses van CHI3L1 werd een ELISA kit gebruikt die gevalideerd is voor “van paarden afkomstige onverdunde lichaamsvloeistoffen” (Mybiosource� Horse Cartilage Glycoprotein 39/YKL40 ELISA kit, 12x8 well plate). Omdat serum en urine niet expliciet werden vermeld en omdat er nog geen literatuurgegevens beschikbaar waren, werd met een preliminaire test gewerkt om de optimale verdunningen te achterhalen voor beide matrices.

Veulen 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

sCr (µmol/L)

T1

320

49

*

74

222

127

-

70

66

1036

168

308

T2 - 46 38 84 148 - 170 - - 129 - -

Leeftijd (dagen)

2 1 2 <24u <24u <24u 8 0 3 0 0 1

Page 34: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

32

Bij deze eerste test werden stalen van 6 veulens (veulen 1, 2, 3, 5, 7 en 10) geanalyseerd die bijzonder verdacht waren van nierschade (op basis van een hoge sCr, ureum, klinische evolutie), en dus van potentieel verhoogde CHI3L1 concentraties. Van drie van deze 6 veulens werden de urinestalen gebruikt (veulen 3, 5, en 7) waarbij verdunningen van 1/1 en 1/2 werden uitgevoerd, één volume staal bleef onverdund. Van de andere 3 veulens (veulen 1, 2 en 10) werden de serumstalen geanalyseerd, met dezelfde verdunningen als voor de urinestalen. Voor de analyse werden de stalen en de standaarden in de wells geplaatst en er werd direct HRP-conjugaat toegevoegd. Daarna werd 60 minuten bij 37°C geïncubeerd. De wells werden gewassen, daarna werd het TMB substraat toegevoegd. Na een incubatietijd van 15 minuten (37°C, in het donker) werd de stopsolutie toegevoegd. Na 5 minuten werd de OD afgelezen op een golflengte van 450 nm. Enkel de OD-waarden van de onverdunde stalen lagen bij de preliminaire test binnen de standaardcurve, daarom werd besloten om de rest van de stalen steeds onverdund te analyseren.

4 Resultaten De OD waarden van alle porciene en equiene stalen werden met behulp van Deltasoft£ omgezet in concentraties. Indien er in het kader van inter- en/of intra-assay vergelijkingen meerdere concentraties beschikbaar waren voor één staal, wordt het gemiddelde weergegeven in de tabellen. 4.1 Resultaten van de porciene analyses 4.1.1 Resultaten voor NGAL Tabel 6 NGAL concentraties in het plasma van biggen voor (T0) en tijdens (T4 en T24) LPS challenge.

Dosis LPS NGAL concentratie in plasma (ng/ml) T0 T4 T24 Varken

LPS 0 176,51 241,73

155,95 138,63

135,96 201,72

3.1 3.4

LPS 0,75 252,10 315,45

393,25 543,92

391,36 615,86

3.6 3.5

LPS 2 223,77 117,53

569,76 583,79

563,49 1169,23

3.3 3.8

LPS 5 149,57 112,24 177,01 204,28

659,63 569,91 1114,14 817,29

702,11 685,50 920,13 2684,04

3.7 3.2 1 2

Voor elk van de controledieren (LPS 0) was de T0 concentratie de hoogste gemeten concentratie.

Page 35: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

33

Bij varken 3.1 daalde de concentratie van NGAL in het plasma naar de latere tijdstippen toe. Bij varken 3.4 was er een daling in concentratie van T0 naar T4 waar te nemen, daarna steeg de concentratie in geringe mate. Daarentegen was de T0 concentratie bij alle varkens die LPS kregen de laagste gemeten concentratie. De grootste concentratieverschillen per varken waren te observeren voor de LPS 5 groep, gevolgd van de LPS 2 en de LPS 0,75 groep. Een uitzondering is varken 3.8. Hier is de toename van T0 naar T24 zeer groot, daarentegen het ander varken uit de LPS 2 groep (varken 3.3) slechts een toename van 345,99 ng/ml van T0 naar T4 vertoont en de concentratie daarna licht daalt op T24. Ook bij varken 3.6 (LPS 0,75) neemt de concentratie van T4 naar T24 in geringe mate af. Dit fenomeen kan niet opgemerkt worden in de LPS 5 groep. Tabel 7 Mediaan en range voor de NGAL concentraties in het plasma van biggen voor (T0) en tijdens (T4 en T24) LPS challenge.

Groep Mediaan Range

LPS 0, 0,75, 2 en 5 (T0) + LPS 0 (T4 en T24), n=14

176,76 203,21

LPS 0,75 (T4 en T24), n=4 468,59 224,50

LPS 2 (T4 en T24), n= 4 576,77 605,74

LPS 5 (T4 en T24), n=8 759,70 2114,13

De plasmaconcentraties voor varkens na LPS challenge (T4 en T24) uit de LPS 0,75, 2 en 5 groepen zijn hoger dan de concentraties van varkens die (nog) geen LPS challenge zijn ondergaan (T0 van LPS 0, 0,75, 2 en 5 + T4 en T24 van LPS 0). Er is ook een toename in de concentratie naarmate de LPS dosis verhoogt: de concentratie voor de LPS 0,75 groep ligt gemiddeld lager dan bij de LPS 2 groep en deze ligt op haar beurt terug lager dan het gemiddelde van de LPS 5 groep. Tabel 8 NGAL concentraties in de urine van biggen voor (T0) en tijdens (T4 en T24) LPS challenge. “-“ geen staal beschikbaar

Dosis LPS NGAL concentratie in urine (ng/ml) T0 T4 T24 Varken

LPS 0 60,12 -

40,99 -

122,45 98,95

3.1 3.4

LPS 0,75 - -

17,37 450,68

19,80 40,06

3.6 3.5

LPS 2 - -

325,63 410,92

255,75 -

3.3 3.8

LPS 5 - 171,56

384,20 369,45

- 699,29

3.7 3.2

Page 36: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

34

Voor urine zijn er relatief weinig waarden beschikbaar, vooral op T0. De concentraties gemeten bij de controlebiggen (LPS 0) en de T0 concentraties van de LPS groepen zijn, anders dan in plasma, niet de laagste waarden. Varken 3.6 (LPS 0,75) vertoont zowel op T4 als ook op T24 lagere NGAL concentraties dan eender welk controlevarken of T0 staal. Varken 3.5 heeft op T4 een NGAL concentratie die daalt op T24. Ook voor varken 3.3 (LPS 2) daalt de concentratie van T4 naar T24, maar minder extreem. Voor varken 3.2 (LPS 5) zien we een trend van stijgende NGAL concentraties. Tabel 9 Mediaan en range voor de NGAL concentraties in de urine van biggen voor (T0) en tijdens (T4 en T24) LPS challenge.

De concentraties van NGAL in urine waren het laagst voor de varkens die (nog) geen LPS hadden toegediend gekregen en stegen naarmate de geïnfundeerde LPS dosis toenam. Anders dan voor NGAL in plasma was de concentratie van de LPS groepen op T4 hoger dan voor tijdstip T24. Dit hangt waarschijnlijk ook samen met het feit dat er op T24 slechts één waarde van de uit de LPS 2 en 5 groep afkomstige biggen beschikbaar was. 4.1.2 Resultaten voor CHI3L1 Tabel 10 CHI3L1 concentraties in het plasma van biggen voor (T0) en tijdens (T4 en T24) LPS challenge. BQL: below quantification limit, “Lower level of quantification” of LLOQ = 62,5 pg/ml

Groep Mediaan Range

LPS 0, 0,75, 2 en 5 (T0) + LPS 0 (T4 en T24), n=5

98,95 130,57

LPS 0,75 (T4 en T24), n=4 29,93 433,32

LPS 2 (T4 en T24), n= 3 325,63 155,17

LPS 5 (T4 en T24), n=4 384,20 329,84

Dosis LPS CHI3L1 concentratie in plasma (ng/ml) T0 T4 T24 Varken

LPS 0 0,74 BQL

BQL BQL

BQL 0,81

3.1 3.4

LPS 0,75 BQL BQL

BQL 5,25

4,52 BQL

3.6 3.5

LPS 2 BQL BQL

5,61 BQL

4,81 BQL

3.3 3.8

LPS 5 1,48 BQL BQL BQL

3,88 BQL BQL BQL

1,59 4,86 BQL BQL

3.7 3.2 1 2

Page 37: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

35

De analyses voor porciene CHI3L1 leverden slechts een gering aantal kwantificeerbare waarden op. Voor de meeste stalen lag de concentratie onder de kwantificatielimiet (“below the quantification limit ”; BQL) van de ELISA kit. De hoogste gemeten concentraties waren afkomstig van varkens na LPS challenge. Het is opmerkelijk dat enkel de concentraties van varken 3.7 voor alle tijdstippen binnen de standaardcurve lagen. Tabel 11 Mediaan en range, voor de CHI3L1 concentraties in het plasma van biggen voor (T0) en tijdens (T4 en T24) LPS challenge. Voor alle stalen met een concentratie BQL werd 0,03 ng/ml genomen om de mediaan te berekenen (LLOQ/2).

Groep Mediaan Range

LPS 0, 0,75, 2 en 5 (T0) + LPS 0 (T4 en T24), n=14 98,95 130,57

LPS 0,75 (T4 en T24), n=4 29,93 433,32

LPS 2 (T4 en T24), n= 4 325,63 155,17

LPS 5 (T4 en T24), n=8 384,20 329,84

Tabel 12CHI3L1 concentraties in de urine van biggen voor (T0) en tijdens (T4 en T24) LPS challenge. BQL: below quantification limit, “Lower level of quantification” of LLOQ = 62,5 pg/ml, “-“: geen staal beschikbaar

Ook voor urine waren er slechts weinig waarden beschikbaar, door het geringer aantal verzamelde stalen enerzijds en door een aantal stalen waarbij de concentratie onder het kwantificatielimiet lag anderszijds. De concentraties verschilden nauwelijks, ongeacht of het varken LPS ontving of niet. Enkel voor varken 3.7 werd op T4 een duidelijk verhoogde concentratie gevonden in vergelijking met de andere waarden. Voor varken 3.8 was geen enkele concentratie in urine of plasma kwantificeerbaar.

Dosis LPS CHI3L1 concentratie in urine (ng/ml) T0 T4 T24 Varken

LPS 0 0,10 -

BQL -

BQL 0,16

3.1 3.4

LPS 0,75 - -

BQL 0,22

BQL 0,22

3.6 3.5

LPS 2 - -

0,25 BQL

0,23 -

3.3 3.8

LPS 5 - BQL

1,55 BQL

- 0,22

3.7 3.2

Page 38: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

36

4.2 Resultaten van de equiene analyses 4.2.1 Resultaten voor NGAL Tabel 13NGAL concentraties in het serum van zieke veulens en controlepaarden. Veulen 1, 2, 4, 6, 7, 10 en 12: septicaemisch volgens sepsis score en/of positieve bloedcultuur. Veulen 3, 5, 8, 9 en 12: ziek, maar niet septicaemisch. “-“: geen staal beschikbaar

Ziek veulen NGAL concentratie in serum (ng/ml)

Controlepaard NGAL concentratie in serum (ng/ml)

T1 T2 1 2902,50 - 1 78,44

2 55,27 201,43 2 21,01 3 417,99 161,71 3 20,01 4 547,82 156,01 4 44,59 5 1233,29 389,12 5 70,79 6 260,87 - 6 32,25 7 - 149,48 7 22,63 8 286,18 - 8 13,42 9 24,78 - 9 14,81 10 110,20 377,84 10 56,46 11 504,29 - 12 1159,65 -

De zieke veulens vertoonden hogere NGAL serumconcentraties vergeleken met de controlegroep. Extreem hoge concentraties waren aanwezig bij veulen 1, 5 en 12, voor elk werd de hoogste concentratie op T1 gemeten. Veulen 1 en 12 vallen op met hoge sepsis scores (14 en 17, respectievelijk), terwijl veulen 5 niet als septicaemisch werd gediagnosticeerd op basis van bloedcultuur en sepsis scoring. Veulen 2 en 9 vertoonden lage NGAL concentraties, deze concentraties zijn vergelijkbaar met de gemeten concentraties bij de controlegroep. Bij de veulens 2, 3, 4, 5 en 10 waren er opvolgstalen beschikbaar. Bij veulen 3, 4 en 5 dalen de NGAL concentraties en bij veulen 2 en 10 stegen deze van T1 naar T2.

Page 39: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

37

Tabel 14 Mediaan en range voor de NGAL concentraties in het serum van zieke veulens en controlepaarden

NGAL concentratie in serum (ng/ml) Mediaan Range

Sepsis (veulen 1, 2, 4, 7, 10, 11, 12 ; n= 7)

289,64 2847,23

Ziek door andere etiologie (veulen 3, 5, 6, 8, 9; n= 5)

286,18 1208,51

Sepsis T1 (veulen 1, 2, 4, 10, 11, 12 ; n=6)

526,05 2847,23

Sepsis T2 (veulen 2, 4, 7, 10 ; n=4)

178,72 228,37

Ziek door andere etiologie T1 (veulen 3, 5, 6, 8, 9; n= 5)

286,18 1208,51

Ziek door andere etiologie T2 (veulen 3, 5; n= 2)

275,42 227,41

Controle (n=10)

27,44 65,03

De mediaan voor veulens met sepsis is iets hoger dan voor de niet septicaemische, zieke veulens. De hoogste mediaan kan gezien worden bij veulens met sepsis op T1. De mediaan voor T2 is daarentegen hoger voor de groep zieke, niet-septicaemische veulens. Tabel 15 NGAL concentraties (ng/ml) in de urine van zieke veulens en controlepaarden. Veulen 1, 2, 4, 6, 7, 10, 11 en 12: septicaemisch volgens sepsis score; veulen 3, 5, 8 en 9 ziek, maar niet septicaemisch volgens sepsis score. “-“: geen staal beschikbaar

Alle urinaire NGAL waarden, met uitzondering van veulen 2 (T1 en T2) en veulen 4 (T2), waren duidelijk hoger bij de zieke veulens dan bij de controlegroep.

Ziek veulen NGAL concentratie in urine (ng/ml)

Controlepaard NGAL concentratie in urine (ng/ml)

T1 T2 1 3419,10 - 1 5,37

2 30,79 11,70 2 32,80 3 3170,64 2858,96 3 8,13 4 123,50 17,18 4 7,30 5 1342,44 390,55 5 4,14 6 116,45 - 6 3,69 7 140,81 - 7 14,90 8 - - 8 56,97 9 - - 9 4,21 10 - - 10 5,92 11 572,17 - 12 - -

Page 40: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

38

De hoogste concentraties in urine waren aanwezig bij veulen 1, 3 en 5. Veulen 1 was septicaemisch, veulen 3 had white muscle disease. Veulen 5 werd aangeboden met PAS. Voor de veulens 2, 3, 4 en 5 waren opvolgstalen beschikbaar. De NGAL concentratie daalde voor elk van deze veulens. Bij veulen 3, 4 en 5 daalden deze concentraties eveneens in het plasma, bij veulen 2 was er een (lichte) toename te zien in het plasma. Zowel de T1 als ook de T2 waarde van dit veulen in de urine was vergelijkbaar met de waarden gemeten bij de controledieren, in het plasma was de T1 waarde eveneens laag. Tabel 16 Mediaan en range voor de NGAL concentraties in de urine van zieke veulens en controlepaarden.

NGAL concentratie in urine (ng/ml)

Mediaan Range

Sepsis (veulen 1, 2, 4, 7, 10, 11, 12 ; n= 7)

123,50 3407,40

Ziek door andere etiologie (veulen 3, 5, 6, 8, 9; n= 5)

1342,44 3054,19

Sepsis T1 (veulen 1, 2, 4, 10, 11, 12 ; n=6)

140,81 3388,31

Sepsis T2 (veulen 2, 4, 7, 10 ; n=4)

14,44 5,48

Ziek door andere etiologie T1 (veulen 3, 5, 6, 8, 9; n= 5)

1342,44 3054,19

Ziek door andere etiologie T2 (veulen 3, 5; n= 2)

1624,75 2458,41

Controle (n=10)

6,61 53,27

De hoogste mediaan kan voor de urinaire concentraties van NGAL gezien worden bij de groep veulens die ziek waren, maar geen sepsis hadden. De mediaan voor de controledieren was het laagst, gevolgd van de mediaan van de sepsis veulens op T2.

Page 41: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

39

4.2.2 Resultaten voor CHI3L1 Tabel 17CHI3L1 concentraties (ng/ml) in het serum van zieke veulens en controlepaarden. Veulen 1, 2, 4, 6, 7, 10, 11 en 12: septicaemisch volgens sepsis score; veulen 3, 5, 8 en 9 ziek, maar niet septicaemisch volgens sepsis score. “-“: geen staal beschikbaar

Ziek veulen CHI3L1 concentratie in serum (ng/ml)

Controlepaard CHI3L1 concentratie in serum (ng/ml)

T1 T2

1 21,84 - 1 15,54

2 14,84 16,35 2 5,71

3 70,76 49,31 3 14,21

4 13,39 12,91 4 17,46

5 12,13 11,19 5 15,23

6 14,65 - 6 12,38

7 - 16,31 7 8,87

8 34,63 - 8 12,00

9 8,93 - 9 13,07

10 20,50 14,97 10 15,29

11 14,46 -

12 15,23 -

De concentraties voor CHI3L1 in het serum liggen dicht bij elkaar voor de groepen van zieke en gezonde individuen. Enkel veulen 3 toonde duidelijk verhoogde CHI3L1 concentraties in het serum. Naar analogie met NGAL werden ook voor CHI3L1 de mediaan en range gegevens in serum opgelijst (Supplement tabel 22).

Page 42: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

40

Tabel 18CHI3L1 concentraties (ng/ml) in de urine van zieke veulens en controlepaarden. Veulen 1, 2, 4, 6, 7, 10, 11 en 12: septicaemisch volgens sepsis score; veulen 3, 5, 8 en 9 ziek, maar niet septicaemisch volgens sepsis score. “-“: geen staal beschikbaar

Ziek veulen CHI3L1 concentratie in urine (ng/ml)

Controlepaard CHI3L1 concentratie in serum (ng/ml)

T1 T2 1 23,42 - 1 20,49

2 13,83 22,08 2 15,23 3 BQL 25,23 3 7,32 4 18,42 16,92 4 18,04 5 22,37 26,67 5 12,95 6 22,57 - 6 17,52 7 13,33 - 7 23,29 8 - - 8 17,52 9 - - 9 20,04 10 - - 10 17,40 11 6,14 - 12 - -

Voor urine was er eveneens weinig verschil tussen de CHI3L1 concentratie bij zieke en gezonde veulens. Zo werd de laagste concentratie bij veulen 11 en niet bij één van de controledieren gemeten. De hoogste waargenomen concentratie was die van veulen 5 (T2) gevolgd door de T2 concentratie van veulen 3, ook al was de concentratie op T1 beneden kwantificatielimiet van de ELISA-kit. Vergelijkt men de evoluties van T1 naar T2 in serum en urine lijken deze ongeveer overeen te komen voor veulen 2 (14,84 naar 16,35 ng/ml voor serum en 13,83 naar 22,08 ng/ml in urine) en veulen 4 (13,39 naar 12,91 ng/ml voor serum en 18,42 naar 16,92 ng/ml voor urine), maar niet voor veulen 5 (12,13 naar 11,19 ng/ml voor serum en 22,37 naar 26,67 ng/ml). De mediaan en range gegevens van de resultaten voor CHI3L1 in urine bevinden zich in bijlage (Tabel 23)

Page 43: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

41

5 Discussie Resultaten van de porciene stalen Enkel voor varken 3.8 en 2 kan met zekerheid van sepsis-geïnduceerde nierschade worden gesproken aangezien er een gedaalde GFR werd vastgesteld tijdens de proef. Bij varken 3.8 waren er eveneens macroscopische en microscopische tekenen van nierschade aanwezig (opgezette nier, bloedingen en afgeplatte tubuluscellen, respectievelijk). De histologische onderzoeken van de andere nieren waren op moment van indienen van deze masterproef nog niet uitgevoerd. De nier van varken 3.6 leek echter eveneens macroscopisch veranderd. Bij varken 3.8 (LPS 2) was NGAL sterk verhoogd, de concentraties in het plasma verzesvoudigden na toediening van LPS. De concentratie van varken 1 in plasma was vergelijkbaar hoog als die van varken 3.8 en 2, mogelijks heeft dit varken dus ook nierschade ontwikkeld. Bij dit varken was er geen informatie over de GFR beschikbaar. De NGAL concentratie op T4 van varken 3.8 was ook in de urine verhoogd, een staal voor T24 was helaas niet beschikbaar, noch voor varken 1 en 2. NGAL vertoonde bij deze steriele experimentele sepsis studie een dosis-afhankelijke respons op de hoeveelheid LPS voor zowel urine als ook plasma. We kunnen concluderen dat er een samenhang tussen de NGAL concentratie en de ernst van sepsis lijkt te bestaan. Door middel van NGAL was het eveneens mogelijk om de bij varken 2 en 3.8 aanwezige nierschade aan te tonen. Histologisch onderzoek moet nu verder uitwijzen in welke mate er bij de andere dieren nierschade aanwezig was. De CHI3L1 concentraties waren gemiddeld hoger bij biggen na LPS infuus dan bij biggen die enkel fysiologische zoutoplossing kregen. Dit onderscheid was echter te gering om een betrouwbare differentiatie tussen zieke en gezone dieren toe te laten. Ondanks de manifeste nierschade van varken 3.8 en 2 kon CHI3L1 noch in de urine noch in het plasma worden gedetecteerd. Omwille van het gering aantal stalen en het nog beperkter aantal interpreteerbare resultaten kunnen echter geen definitieve uitspraken gemaakt worden over het nut van CHI3L1 als niermerker bij biggen met sepsis. Zowel bij NGAL als ook bij CHI3L1 konden we het fenomeen van dalende concentraties van T4 naar T24 vaststellen. Voor NGAL was dit ook bij de controlegroep te zien. Een verbeterde perfusie van de nier door de verstrekte vochttherapie is hier hoogstwaarschijnlijk de reden van. Verder onderzoek met een tweede groep varkens zonder vochttherapie of met verhoogde dosissen van LPS zou mogelijks een duidelijker klinisch beeld van nierschade kunnen veroorzaken.

Page 44: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

42

Resultaten van de equiene stalen Over het algemeen was de concentratie van NGAL zowel in het serum als in de urine van zieke veulens hoger dan bij de controledieren. Enkel bij veulen 2 en 9 werden op T1 waarden in het serum waarden gemeten die vergelijkbaar laag waren als die van de controlegroep. Ook in de urine werden bij veulens 2 (T1 en T2) en veulen 4 (T2) waarden zoals voor de controlegroep gemeten. Deze twee veulens evolueerden pas na een aantal dagen op de kliniek (7 en 9 dagen, respectievelijk) in een slechtere richting. Veulen 9 vertoonde lichte kolieksymptomen. De veulens 1, 5 en 12 vertoonden opvallend hoge concentraties van NGAL in serum. Veulens 1 en 12 hadden sepsis. Veulen 5 kwam toe in een kritische toestand (prematuur, PAS met convulsies), maar bleek geen septicaemie te ontwikkelen. De hoogste concentraties in urine vertoonden veulens 1, 3 en 5. Bij veulen 3 was er met zekerheid een verstoring van de nierfunctie aanwezig. De concentraties van NGAL voor veulen 3 waren in de urine opvallend hoog, terwijl ze in het serum slechts op T1 en dan nog matig verhoogd waren. Dit suggereert dat de urinaire concentratie beter geschikt is voor schatting van de nierfunctie. Veulen 1 had een nog hogere concentratie in de urine dan veulen 3. Het veulen vertoonde net zoals veulen 3 een verhoogde sCr concentratie bij aankomst. Het dier werd direct geëuthanaseerd omwille van een slechte diagnose. Mogelijks was er dus ook bij dit veulen nierschade aanwezig. De CHI3L1 concentratie van veulen 3 in het serum was zowel op T1 als op T2 verhoogd tegenover de concentraties van zowel de andere zieke veulens als van de controlegroep. Ook bij veulen 8 werd er een matige verhoging van CHI3L1 vastgesteld (T1) in het serum. Het werd met een meconiumobstipatie aangeboden. Nierschade lijkt bij dit dier weinig waarschijnljk, ook omdat de sCr concentratie normaal was. De verschillen tussen de basale waarden en de concentraties bij de zieke veulens waren echter klein voor alle veulens (behalve voor veulen 3) waardoor het enkel voor veulen 3 mogelijk is om met einige zekerheid te discrimineren tussen gezond en ziek. Beperkingen van het onderzoeksdeel van deze masterproef De grootste beperking voor de interpretatie van de resultaten van zowel de equiene en porciene analyses is het feit dat er (nog) geen controle van de nierschade door histologisch en bacteriologisch onderzoek van het nierweefsel kon plaatsvinden. Zo kon wel een verband tussen sepsis en verhoogde NGAL concentraties worden vastgesteld maar enkel voor varken 2 en 3.8 kan met zekerheid van sepsis-geïnduceerde nierschade worden gesproken. Een andere beperking was het relatief gering aantal geïncludeerde patiënten (veulens, n=12; biggen, n= 10). Verder waren er niet voor alle dieren alle stalen beschikbaar: bij de biggen was niet voor elk moment urine beschikbaar (loskomen urinezakje, lage urineproductie), bij de veulens was er niet altijd een opvolgstaal beschikbaar (euthanasie, geen staal genomen). Hierdoor werden er dan ook geen statistische analyses uitgevoerd voor dit onderzoek en werden alle resultaten louter descriptief weergegeven.

Page 45: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

43

De selectie van de merkers voor het onderzoeksgedeelte werd voor beide diersoorten begrensd door de commerciële beschikbaarheid van de immunoassays. De CHI3L1 kits voor zowel paard als varken vertoonden hierbij minder goede eigenschappen dan de NGAL kits. Zo waren beide CHI3L1 kits niet gevalideerd voor de gebruikte matrices (Porciene CHI3L1-kit niet gevalideerd voor urine, equiene CHI3L1-kit noch voor serum noch voor urine). Het feit dat stalen onverdund of zeer laag verdund werden geanalyseerd en dat er hoge temperaturen (37°C voor beide CHI3L1-kits) moesten worden gebruikt, duiden op een zwakke antigen-antilichaam binding. Het porcien LPS model heeft als beperking dat het niet helemaal de klinische situatie tijdens sepsis nabootst. Het geleidelijk aan toedienen van een endotoxine zoals LPS heeft als nadeel dat er geen primaire plaats van infectie aanwezig is, de sepsis is steriel, en kan dus ook geen vermeerdering van kiemen plaatsvinden. Een betere optie om dit te imiteren zijn peritonitis sepis modellen waarbij er faecaal materiaal wordt ingebracht in de buikholte (bijvoorbeeld door “cecal ligation and puncture” of “colon ascendens stent peritonitis") met als gevolg het ontstaan van peritonitis en sepsis (Zanotti-Cavazzoni en Goldfarb, 2009). Mogelijks kon deze “steriele” sepsis door LPS enkel bij varken 3.8 (en 1 en 2) nierschade veroorzaken. Verder was het interessant geweest om de sCr naast op T0 ook op T4 en T24 te bepalen en dan deze concentraties met die van NGAL en CHI3L1 waarden te vergelijken. Door de exogene toediening van creatinine in functie van de GFR metingen was dit echter zinloos. Een probleem bij de veulens was, dat de periode tussen staalname en collectie/verdere verwerking en het behandelen van de stalen niet consistent was, sommige stalen zaten immers een relatief lange periode in de koelkast voor ze verder werden verwerkt. Verder komt de T1 voor sommige veulens niet overeen met de dag van aankomst, wat het onoverzichtelijk maakte om deze te vergelijken. Hierdoor zijn sommige sCr waarden vroeger genomen dan de stalen voor de CHIL1 en NGAL analyses. De data van aanbieding/staalname en collectie bevinden zich in bijlage (Tabel 20). Er moet ook worden opgemerkt dat er volwassen paarden werden gebruikt als controlegroep, aangezien het niet mogelijk was genoeg gezonde veulens te kunnen bemonsteren (aanvraag ethische commissie vereist, eigenaars vinden die ermee akkoord gaan). Mogelijks kunnen de concentraties van NGAL en CHI3L1 eveneens afwijken in de eerste dagen na de partus, zoals dit voor sCr het geval is. Hieruit zou volgen dat er misschien helemaal geen differentiatie tussen ziek en gezond heeft plaatsgevonden door verhoogde NGAL concentraties. Echter, de nieren van veulens zijn normaal gezien al volledig ontwikkeld bij de zodat een vertraagde GFR de reden voor een aanwezige hypercreatininemie zou zijn (Chaney et al, 2010). NGAL en CHI3L1 zouden dit als functionele niermerkers niet mogen aantonen. Een bijkomende beperking was de onvolledig informatie over de veulens vanuit de patiëntendocumentatie. Hieruit werd bijvoorbeeld niet duidelijk welke preparaten voor hoe lang werden toegediend. Hierdoor konden er geen verbanden gelegd worden tussen eventuele effecten van bepaalde geneesmiddelen (aminoglycosiden) op de NGAL en CHI3L1 concentraties. Er waren eveneens niet voor elk veulen alle benodigde parameters beschikbaar voor de sepsis scoring.

Page 46: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

44

6 Conclusie In dit onderzoek vertoonde NGAL bij de biggen zowel in urine als in plasma een dosis-afhankelijke respons. De door een dalende GFR bevestigde, sepsis-geïnduceerde nierschade kon bij 2 biggen kwantitatief aangetoond worden in het plasma. Voor één ervan (varken 2) waren er geen urinestalen beschikbaar zodat dit niet bevestigd kon worden in urine. Voor het tweede varken (3.8) was enkel een T4 staal beschikbaar, dit was eveneens verhoogd. Voor CHI3L1 kan geen definitieve conclusie worden genomen omdat er te weinig interpreteerbare resultaten waren. Niettemin kon de aanwezige nierschade bij varken 3.8 en 2 niet worden aangetoond bij dit onderzoek. De NGAL concentratie in serum en urine tonen mogelijks ANS aan, ongeacht de etiogie. Dit werd echter in het kader van dit onderzoek niet nagegaan door bevestigende histologische analyses. Veulens 1, 3 en 5 vertonen echter zowel verhoogde urinaire NGAL concentraties als ook verhoogde urinaire concentraties van CHI3L1 in combinatie met verhoogde sCr concentraties op minstens één moment. Dit is een sterke indicatie voor aanwezige nierschade. Verhoogdeurinaire concentraties van NGAL en CHI3L1 zouden dus mogelijks ANS kunnen detecteren bij veulens. Op basis van dit onderzoek kan echter geconcludeerd worden dat er geen discriminatie volgens de etiologie van de nierschade mogelijk is.

Page 47: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

45

7 Referentielijst 1. Bartges JW. Chronic kidney disease in dogs and cats. Vet Clin North Am Small Anim Pract 2012; 42(4): 669-92, vi. 2. Bhandari V, Wang C, Rinder C, Rinder H. Hematologic profile of sepsis in neonates: neutrophil CD64 as a diagnostic marker. Pediatrics 2008; 121(1): 129-34. 3. Castellheim A, Thorgersen EB, Hellerud BC, et al. New biomarkers in an acute model of live Escherichia coli-induced sepsis in pigs. Scand J Immunol 2008; 68(1): 75-84. 4. Chvojka J, Sykora R, Krouzecky A, et al. Renal haemodynamic, microcirculatory, metabolic and histopathological responses to peritonitis-induced septic shock in pigs. Crit Care 2008; 12(6): R164. 5. Dahlem DP, Neiger R, Schweighauser A, et al. Plasma Symmetric Dimethylarginine Concentration in Dogs with Acute Kidney Injury and Chronic Kidney Disease. J Vet Intern Med 2017; 31(3): 799-804. 6. De Loor J, Decruyenaere J, Demeyere K, Nuytinck L, Hoste EA, Meyer E. Urinary chitinase 3-like protein 1 for early diagnosis of acute kidney injury: a prospective cohort study in adult critically ill patients. Crit Care 2016; 20: 38. 7. Dellinger RP, Levy MM, Rhodes A, et al. Surviving sepsis campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock: 2012. Crit Care Med 2013; 41(2): 580-637. 8. Dieterle F, Perentes E, Cordier A, et al. Urinary clusterin, cystatin C, beta2-microglobulin and total protein as markers to detect drug-induced kidney injury. Nat Biotechnol 2010; 28(5): 463-9. 9. Faubel S, Lewis EC, Reznikov L, et al. Cisplatin-induced acute renal failure is associated with an increase in the cytokines interleukin (IL)-1beta, IL-18, IL-6, and neutrophil infiltration in the kidney. J Pharmacol Exp Ther 2007; 322(1): 8-15. 10. Geor RJ. Chapter 17.8 - Acute Renal Failure. In: Robinson NE, ed. Current Therapy in Equine Medicine (Fifth Edition). Saint Louis: W.B. Saunders; 2003: 839-44. 11. Han WK, Waikar SS, Johnson A, et al. Urinary biomarkers in the early diagnosis of acute kidney injury. Kidney Int 2008; 73(7): 863-9. 12. Hanto DW, Maki T, Yoon MH, et al. Intraoperative administration of inhaled carbon monoxide reduces delayed graft function in kidney allografts in Swine. Am J Transplant 2010; 10(11): 2421-30. 13. Hoskins JD. Feline Neonatal Sepsis. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice 1993; 23(1): 91-100. 14. Jacobsen S, Berg LC, Tvermose E, Laurberg MB, van Galen G. Validation of an ELISA for detection of neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) in equine serum. Vet Clin Pathol 2018; 47(4): 603-7. 15. Langenberg C, Bagshaw SM, May CN, Bellomo R. The histopathology of septic acute kidney injury: a systematic review. Crit Care 2008; 12(2): R38. 16. Langenberg C, Gobe G, Hood S, May CN, Bellomo R. Renal histopathology during experimental septic acute kidney injury and recovery. Crit Care Med 2014; 42(1): e58-67. 17. Li Z, Kanitz E, Tuchscherer M, et al. Kinetics of Physiological and Behavioural Responses in Endotoxemic Pigs with or without Dexamethasone Treatment. Int J Mol Sci 2019; 20(6).

Page 48: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

46

18. Lipcsey M, Carlsson M, Larsson A, et al. Effect of a single dose of tobramycin on systemic inflammatory response-induced acute kidney injury in a 6-hour porcine model. Crit Care Med 2009; 37(10): 2782-90. 19. Mohamed OM, Abo Elleil HM, Hussein HS. Role of Urinary Chitinase 3 Like Protein 1 for Early Detection of Acute Kidney Injury in Adult Critically Ill Patients. The Egyptian Journal of Hospital Medicine 2017; 69(3): 1978-88. 20. Murphy GJ, Lin H, Coward RJ, et al. An initial evaluation of post-cardiopulmonary bypass acute kidney injury in swine. Eur J Cardiothorac Surg 2009; 36(5): 849-55. 21. Ostermann M, Straaten HM, Forni LG. Fluid overload and acute kidney injury: cause or consequence? Crit Care 2015; 19: 443. 22. Palm CA, Segev G, Cowgill LD, et al. Urinary Neutrophil Gelatinase-associated Lipocalin as a Marker for Identification of Acute Kidney Injury and Recovery in Dogs with Gentamicin-induced Nephrotoxicity. J Vet Intern Med 2016; 30(1): 200-5. 23. Ripanti D, Dino G, Piovano G, Farca A. Application of the Sequential Organ Failure Assessment Score to predict outcome in critically ill dogs: preliminary results. Schweiz Arch Tierheilkd 2012; 154(8): 325-30. 24. Russell KE, Roussel AJ. Evaluation of the ruminant serum chemistry profile. Vet Clin North Am Food Anim Pract 2007; 23(3): 403-26, v. 25. Savage CJ. Urinary clinical pathologic findings and glomerular filtration rate in the horse. Vet Clin North Am Equine Pract 2008; 24(2): 387-404, vii. 26. Schott HC, 2nd. Chronic renal failure in horses. Vet Clin North Am Equine Pract 2007; 23(3): 593-612, vi. 27. Seely JC. A brief review of kidney development, maturation, developmental abnormalities, and drug toxicity: juvenile animal relevancy. J Toxicol Pathol 2017; 30(2): 125-33. 28. Soerensen KE, Nielsen OL, Birck MM, et al. The use of sequential organ failure assessment parameters in an awake porcine model of severe Staphylococcus aureus sepsis. APMIS 2012; 120(11): 909-21. 29. Stefan Silbernagl AD. Sesam Atlas van de fysiologie: Sesam; 2003. 30. Traas AM. Resuscitation of canine and feline neonates. Theriogenology 2008; 70(3): 343-8. 31. Wang H, Zhang M, Mao H, et al. Serum neutrophil gelatinase-associated lipocalin and proinflammatory cytokines in pigs with septic versus non-septic acute kidney injury. Int Urol Nephrol 2015; 47(2): 413-20. 32. Weber EJ, Sanchez LC, Giguere S. Re-evaluation of the sepsis score in equine neonates. Equine Vet J 2015; 47(3): 275-8. 33. Wilson ME. Examination of the urinary tract in the horse. Vet Clin North Am Equine Pract 2007; 23(3): 563-75, v. 34. Wong DM, Ruby RE, Dembek KA, et al. Evaluation of updated sepsis scoring systems and systemic inflammatory response syndrome criteria and their association with sepsis in equine neonates. J Vet Intern Med 2018; 32(3): 1185-93. 35. Wong DM, Wilkins PA. Defining the Systemic Inflammatory Response Syndrome in Equine Neonates. Vet Clin North Am Equine Pract 2015; 31(3): 463-81. 36. Zanotti-Cavazzoni SL, Goldfarb RD. Animal models of sepsis. Crit Care Clin 2009; 25(4): 703-19, vii-viii.

Page 49: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

47

37. Aamer HG, El-Ashker MR, Nour EM, Wafa EW, Youssef MA. Sepsis-Induced Acute Kidney Injury in Equine: Current Knowledge and Future Perspectives. Journal of Equine Veterinary Science 2017; 50: 84-95. 38. Alberti C, Brun-Buisson C, Burchardi H, et al. Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study. Intensive Care Med 2002; 28(2): 108-21. 39. B. Maddens BG, R. Vanholder, D. Demon, J. Vanmassenhove, K. Gevaert, E. Meyer. Chitinase-like proteins are candidate biomarkers for sepsis-induced acute kidney injury. The american Society for Biochemistry and Molecular biology 2012. 40. Bellomo R, Kellum JA, Ronco C. Acute kidney injury. The Lancet 2012; 380(9843): 756-66. 41. Chen YC, Jenq CC, Tian YC, et al. Rifle classification for predicting in-hospital mortality in critically ill sepsis patients. Shock 2009; 31(2): 139-45. 42. Coca SG, Yalavarthy R, Concato J, Parikh CR. Biomarkers for the diagnosis and risk stratification of acute kidney injury: a systematic review. Kidney Int 2008; 73(9): 1008-16. 43. David M. Wong PAW, Fairfield T. Bain, Charles W. Brockus. Neonatal Encephalopathy in foals. Vetlearn 2011. 44. David P. Basile KF, Dorothee Weihrauch, Naoichiro Hattan and William M. Chilian. Angiostatin and matrix metalloprotease expression following ischemic acute renal failure. Am J Physiol Renal Physiol 2004; 286: 893-903. 45. de Geus H. Biomarkers for AKI: Erasmus University Rotterdam; 2013. 46. Doi K, Leelahavanichkul A, Yuen PS, Star RA. Animal models of sepsis and sepsis-induced kidney injury. J Clin Invest 2009; 119(10): 2868-78. 47. Eckardt KU, Bernhardt WM, Weidemann A, et al. Role of hypoxia in the pathogenesis of renal disease. Kidney Int Suppl 2005; (99): S46-51. 48. Evans RG, Goddard D, Eppel GA, O'Connor PM. Factors that render the kidney susceptible to tissue hypoxia in hypoxemia. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2011; 300(4): R931-40. 49. Ferguson MA, Waikar SS. Established and emerging markers of kidney function. Clin Chem 2012; 58(4): 680-9. 50. Fink MP, Heard SO. Laboratory models of sepsis and septic shock. Journal of Surgical Research 1990; 49(2): 186-96. 51. Furr M. Systemic inflammatory response syndrome, sepsis, and antimicrobial therapy. Clinical Techniques in Equine Practice 2003; 2(1): 3-8. 52. Furr M. Systemic Inflammatory Response Syndrome, Sepsis, and Antimicrobial Therapy. Clinical Techniques in Equine Practice 2003; 2(1): 3-8. 53. G. Segev CP, B. LeRoy, L.D. Cowgill, and J.L. Westropp. Evaluation of Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin as a Marker of Kidney Injury in Dogs. J Vet Intern Med 2013; 27: 1362–7. 54. Geor RJ. Acute renal failure in horses. Vet Clin North Am Equine Pract 2007; 23(3): 577-91, v-vi. 55. Geus HRHD. Biomarkers for AKI. 2013. 56. Gold JR, Chaffin K, Burgess BA, Morley PS. Factors Associated With Nonsurvival in Foals Diagnosed With Perinatal Asphyxia Syndrome. Journal of Equine Veterinary Science 2016; 38: 82-6.

Page 50: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

48

57. Gomez H, Ince C, De Backer D, et al. A unified theory of sepsis-induced acute kidney injury: inflammation, microcirculatory dysfunction, bioenergetics, and the tubular cell adaptation to injury. Shock 2014; 41(1): 3-11. 58. Han WK, Bailly V, Abichandani R, Thadhani R, Bonventre JV. Kidney Injury Molecule-1 (KIM-1): a novel biomarker for human renal proximal tubule injury. Kidney Int 2002; 62(1): 237-44. 59. Holly MK, Dear JW, Hu X, et al. Biomarker and drug-target discovery using proteomics in a new rat model of sepsis-induced acute renal failure. Kidney Int 2006; 70(3): 496-506. 60. J. De Loor SD, P. Smets, B. Maddens, and E. Meyer. Urinary Biomarkers for Acute Kidney Injury in Dogs. J Vet Intern Med 2013; 27: 998–1010. 61. Liangos O, Perianayagam MC, Vaidya VS, et al. Urinary N-acetyl-beta-(D)-glucosaminidase activity and kidney injury molecule-1 level are associated with adverse outcomes in acute renal failure. J Am Soc Nephrol 2007; 18(3): 904-12. 62. Lisowska-Myjak B. Serum and urinary biomarkers of acute kidney injury. Blood Purif 2010; 29(4): 357-65. 63. Martin Furr MKT, and Lucy Edens. Prognosis for Neonatal Foals in an Intensive Care Unit. J Vet Intern Med 1997; 11: 183-8. 64. Mitchell L P. Fink MD, Facs, and Stephen 0. Heard, M.D. Laboratory Models of Sepsis and Septic Shock. Journal of Surgical Research 1990; 49: 186-96. 65. Morgenthaler NG, Struck J, Christ-Crain M, Bergmann A, Muller B. Pro-atrial natriuretic peptide is a prognostic marker in sepsis, similar to the APACHE II score: an observational study. Crit Care 2005; 9(1): R37-45. 66. Pascal Dubreuil HL. Biochemistry Reference Values for Quebec Lactating Dairy Cows, Nursing Sows, Growing Pigs and Calves. Can J Vet Res 1997; 61: 235-9. 67. Roy MF. Sepsis in adults and foals. Vet Clin North Am Equine Pract 2004; 20(1): 41-61. 68. Sanchez LC. Equine neonatal sepsis. Vet Clin North Am Equine Pract 2005; 21(2): 273-93, v. 69. Schott HC. Review of Azotemia in Foals. AEEP procedings 2011; 57: 328-238. 70. Seely KA, Holthoff JH, Burns ST, et al. Hemodynamic changes in the kidney in a pediatric rat model of sepsis-induced acute kidney injury. Am J Physiol Renal Physiol 2011; 301(1): F209-17. 71. Siew ED, Ware LB, Ikizler TA. Biological markers of acute kidney injury. J Am Soc Nephrol 2011; 22(5): 810-20. 72. Singer M, Deutschman CS, Seymour CW, et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA 2016; 315(8): 801-10. 73. Sutherland A, Thomas M, A Brandon R, et al. Development and validation of a novel molecular biomarker diagnostic test for the early detection of sepsis; 2011. 74. Takahira R, Yonemura K, Yonekawa O, et al. Tryptophan glycoconjugate as a novel marker of renal function. The American Journal of Medicine 2001; 110(3): 192-7. 75. Tesch G, Yang N, Yu H, et al. Intrinsic renal cells are the major source of interleukin-1 synthesis in normal and diseased rat kidney; 1997. 76. Trof RJ, Di Maggio F, Leemreis J, Groeneveld AB. Biomarkers of acute renal injury and renal failure. Shock 2006; 26(3): 245-53.

Page 51: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

49

77. Vaala WE. Peripartum Asphyxia Syndrome in Foals. AEEP procedings 1999; 247-253. 78. Vesely DL. Natriuretic peptides and acute renal failure. American Journal of Physiology-Renal Physiology 2003; 285(2): F167-F77. 79. Vesely DL. Natriuretic peptides and acute renal failure. Am J Physiol Renal Physiol 2003; 285. 80. Watkins SJ. Experimental models of Gram-negative sepsis. British Journal of Surgery 2001; 88: 22-30. 81. Watson RS en Carcillo JA. Scope and epidemiology of pediatric sepsis. Pediatr Crit Care Med 2005; 6(3 Suppl): S3-5. 82. Wheeler DS, Devarajan P, Ma Q, et al. Serum neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) as a marker of acute kidney injury in critically ill children with septic shock. Crit Care Med 2008; 36(4): 1297-303. 83. Wichterman KA, Baue AE, Chaudry IH. Sepsis and septic shock—A review of laboratory models and a proposal. Journal of Surgical Research 1980; 29(2): 189-201. 84. Wilkins PA. Hypoxic Ischemic Encephalopathy: Neonatal Encephalopathy. Recent Advances in Equine Neonatal Care 2003. 85. Zarjou A en Agarwal A. Sepsis and acute kidney injury. J Am Soc Nephrol 2011; 22(6): 999-1006. 86. Zanotti-Cavazzoni en Goldfarb. Animal models of sepsis. Crit Care Clin. 2009; 25(4):703-719.

Page 52: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

50

8 Bijlagen

Tabel 19 Algemene informatie over het ziekteverloop en de afijkende parameters bij aankomst op de kliniek

Veulen

Leeftijd bij aanbieding (in dagen)

Anamnese Symptomen bij aankomst (enkel afwijkende parameters opgelijst)

Evolutie in kliniek

1 2 - gestuwde slijmvliezen - Htc 22% - leukopenie (2x109/L) - neutropenie (33%), - lymfocytopenie (29%) - thrombocytopenie (87x109/L) - laag TE (49g/L) - onmeetbaar lage glucose

Euthanasie na aankomst omwille van slechte prognose

2 1 prematuur (10 dagen te vroeg)

- hypothermie (36,5°C) - hypomotiele darmen - lactaat 6,6mmol/L - kalium te hoog (geen waarden op

fiche) - Htc 25,5% - lymfocytopenie (27%) - ureum 11,5 mmol/L - TE laag (43 g/L) - As te laag (6 g/L) - BACTEC NEGATIEF

Na 8 dagen arthritis linker carpus opgemerkt, punctie: 93000 leukocyten/mm3. Euthanasie omwille van slechte prognose

3 2 niet kunnen rechtstaan

- gedehydrateerd (huidturgor) - lethargisch - myoglobinurie - SG urine: 1.027 - hypothermie (37,5°C) - gestuwde slijmvliezen - echo: komeetstralen bilat., grote

blaas - Htc 53% - Na 123 mmol/L - K 7,7 mmol/L - Ca 1,17 mmol/L - Cl 80 mmol/L - Leukocyten 16,5x109/L - Neutrofilie 90% - Lymfocyten 8% - Verhoogde creatinine - SAA 262 µg/ml - Se 91µg/l, - Vit E 0,9 mg/l, - Spierenzymes verhoogd (niet

meetbaar)

Diagnose: white muscle disease, veulen ontwikkelde ook een pneumonie. Vit E en Se werden gesupplementeerd en na 4 weken waren de spierenzymes terug gedaald en de SAA normaal, veulen mocht naar huis.

4 0 prematuur (3 weken te vroeg), niet kunnen rechtstaan

- hypothermie (37,1°C) - versterkt ademgeruis - hypomotiele darmen - Htc 47% - Lactaat 7,3 mmol/L - TE 45 g/L - BACTEC NEGATIEF

Veulen kreeg plasma, vloeistoftherapie, glucose, aminozuren, vetten en antibiotica per infuus. Echo: komeetstralen rechts en links, Bloedcultuur nadien positief. 9 dagen na aanbieding werd het veulen geëuthanaseerd.

5 0 dystocie (achterstevoren), reanimatie na geboorte nodig. Thuis antibiotica

- comateus, convulsies - hypothermie (38,1°C) - gestuwde mucosae - afwezig zuigreflex - lactaat 4,3 mmol/L - sCr > - As 7 g/L - BACTEC NEGATIEF

Veulen kreeg plasma, vloeistoftherapie, glucose, aminozuren, vetten en antibiotica per infuus. Verder kreeg het veulen midazolam voor de behandeling van de convulsies. Het veulen ontwikkelde zich goed en kon na 10 dagen de kliniek verlaten.

Page 53: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

51

gekregen + infuus

6 0 Zwak, niet kunnen rechtstaan, merrie heeft geen goede melkproductie

- retractie buigpezen achteraan - hypothermie (37,2°C) - versterkt ademgeruis - leukocytose (11,8x109/L) - neutrofilie (79%) - SAA 18µg/ml - Po2 23,8 mmHg - lactaat 4,5 mmol/L - TE 37 g/L - Glucose 92 mg/dl - BLOEDCULTUUR POSITIEF

Veulen kreeg plasma, vloeistoftherapie, glucose, aminozuren, vetten en antibiotica per infuus. Oxytetracycline en ontstekingsremmers voor peesretractie. Op dag drie koorts, etter aan de navelstomp zichtbaar. Op echo sterk verdikte navelene + stijging van SAA (1029 µg/ml). De navel werd chirurgisch verwijderd en de navelvene in de diepte afgebonden. Uit de purulente uitvloei werden Enterococcen en methicilline resistente stafylococcen geïsoleerd. 14 dagen na aankomst in de kliniek mochten veulen en merrie terug naar huis.

7 8 merrie laat veulen niet drinken, eerste dagen leek alles goed, dan werd het veulen zwak, heeft thuis antibiotica gekregen

- hypothermie (36,7°C) - hypomotiele darmen - BCS 2/9 - leukocytose (17,5x109/L) - TE 43 g/L - albumine 20 g/L - ureum 17,2 mmol/L - As: 4 g/L

Parenterale voeding en plasma toegediend, verder breed-spectrum antibiotica en maagbeschermers. Het veulen kreeg extra zuurstof. Na een week had het veulen longontsteking. Aanpassing van de antibiotica. Veulen kreeg enkele dagen nadien diarree en kreeg daarvoor pro-biotica. Het veulen bleef heel mager ondanks goede eetlust (korrels + melk). 3 weken na aanbieding ontwikkelde het veulen koorts en arthritis in meerdere gewrichten. Euthanasie omwille van slechte prognose.

8 0 koliek - geen afwijkingen op klinisch onderzoek, As > 8 g/L

- echo: licht opgezette dunne darmen in liesstreek, rectaal onderzoek: harde mestballen

- leukocytose 11,3x109/L - neutrofilie 79% - lyfocytopenie (18%)

Toediening van anti-tetanus serum (ATS) en clysma. Na 2 dagen mocht het veulen de kliniek verlaten.

9 3 koliek, persen

- versterkt ademgeluid - echo: licht opgezette dunne darmen - geen afwijkingen op BOZ, As: > 8 g/

Het veulen kreeg clysma en werd geobserveerd. Het mocht na 2 dagen de kliniek verlaten.

10 0 red bag delivery, prematuur (4 dagen te vroeg), niet drinken, diarree

- hypothermie (37,3°C) - verhoogde HF 140/min - gestuwde slijmvliezen - laxiteit van de buigpezen - bilateraal entropion - hypermotiele darmen rechts - Htc 51% - TE 39 g/L - Glucose 126 mg/dl - Lactaat 12,2 mmol/L - leukocytopenie (2,95x109/L) - sCr 1036 µmol/L - BLOEDCULTUUR POSITIEF (S.

gallinarum)

Er werd plasma, infuus en breed spectrum antibiotica toegediend. Het veulen ontving probiotica en darmbeschermers. Het entropion werd gecorrigeerd. Het veulen kreeg pijnstillers maar blijf toch ongemakkelijk. Het veulen toonde erge kolieksymptomen zodat er in de nacht voor operatie werd gekozen. Het colon was licht verplaatst en sterk tympanisch. Er werd gas afgezogen en het colon werd terug in de fysiologische positie gelegd. Na operatie werd het bloed op antistoffen gecontrolleerd en aangezien deze nog steeds te laag werden, besloten om nog eens 2L plasma toe te dienen. Na de operatie evolueerde het veulen goed, de sCr daalde terug naar 129 µmol/L (ref.: 71-194µmol/L). Het dronk zelf bij de merrie. Het veulen ontwikkelde vier dagen na aankomst op de kliniek een abces ter hoogte van de insteekplaats van de katheter. Deze werd leeg geduwd en gereinigd. Twee dagen later kreeg het veulen koorts. Op bloedonderzoek zag men een leukocytose (13,96x109/L, ref.: 3,5-9x109/L) en verhoogde SAA concentratie (652 µg/ml, ref.: <4 µg/ml) Er werden ontstekingsremmers toegediend. Ter hoogte van de linker sprong was een uitgesproken subcutane zwelling aanwezig. Op Radiologie waren er echter geen afwijkingen te zien, daarom werd enkel een steunverband geplaatst. Het veulen mocht 19 dagen na aanbieding de kliniek verlaten.

Page 54: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

52

11 0 niet

kunnen recht staan, zwak

- HF 140/min - AH 68/min - versterkt inspiratoir ademgeruis - echo: komeetstralen rechts en links

cranioventraal - K 4,32 mmol/L - lactaat 10,1 mmol/L - glucose 72 mg/dl - leukocyten normaal, wel neutrofilie

(80%) en lymfocytopenie (19%) - thrombocyten 272x109/L - TE 44 g/L - albumine 22% - SAA 167 µg/ml

Er werden radiografische opnames gemaakt om de ossificatie van de verschillende beenderen na te gaan. Er was onvoldoende ossificatie aanwezig. Er werd een diepe neusswab genomen met een positieve uitslag voor EHV-5 (EHV-1,2 en 4: negatief, Streptococcus, Influenza en Rhinovirus type A testten negatief). De merrie testte positief voor EHV-2, 5 en voor Streptococcus equi equi. Er werd een blijfkatheter geplaatst en het veulen kreeg 1L Hartmann-shockinfuus. Er werden 3L plasma geïnfundeerd. Verder werd er een polyionisch infuus toegediend om de ioneninbalansen terug te stabiliseren. Er werd ook een infuus met glucose, lipide en aminozuren toegediend. Anti-tetanusserum, vitamine E, selenium, maagbeschermers en een multivitamine preparaat werden eveneens volstrekt. Het veulen werd aan de zuurstofmachine aangesloten (6L/min). Het veulen dronk goed, controleradiografiën vertoonden een progressieve ossificatie van de gewrichten. Veulen en merrie mochten de kliniek 10 dagen na aanbieding verlaten.

12 1 moeilijke partus, niet kunnen rechtstaan, leknavel

- HF 132/min - AH 96/min - hypomotiele darmen bilateraal - Htc 22% - BE -8,1 meq/L - lactaat 17 mmol/L - leukocytose (10,1x109/L) - As: < 2 g/L - sCr: 308 µmol/L - ureum: 9,2 mmol/L

Er werd een blijfkatheter geplaatst. Er werden antibiotica, ontstekingsremmers en plasma (3L) toegediend. Het veulen werd ieder uur melk uit de papfles aangeboden. Het veulen dronk goed. Alle benen werden gebandageerd en er werd fysiotherapie toegepast. Het veulen begon na enkele uren sterk te ademen. Met behulp van echografie en radiografie werden 3 verplaatste ribfracturen gediagnosticeerd. Er was emfyseem aanwezig. Wegens de slechte prognose door ribfracturen, erge retractie van de pezen en koorts werd beslist om het veulen te euthanaseren.

Page 55: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

53

Tabel 20 Data van aanbieding, staalname en staalcollectie van de veulens verdacht op sepsis.

Veulen Datum aankomst/staalname/ collectie

Datum staalname/ collectie opvolgstaal

1 26.04.18 26.04.2018/ 27.04.2018

Euthanasie na aankomst

2 05.05.18 07.05.2018/ 17.05.2018

8.05.2018/ 17.05.2018

3 05.05.18 07.05.2018/ 17.05.2018

8.05.2018/ 17.05.2018

4 06.05.18 07.05.2018/ 17.05.2018

8.05.2018/ 17.05.2018

5 06.05.18 07.05.2018/ 17.05.2018

8.05.2018/ 17.05.2018

6 16.05.18 16.05.2018/ 17.05.2018

geen opvolgstaal genomen

7 8.05.18 16.05.2018/ 31.05.2018

19.05.2018/ 31.05.2018

8 18.05.2018 18.05.2018/ 31.05.2018

niet gesondeerd

9 16.05.2018 19.05.2018/ 31.05.2018

niet gesondeerd

10 30.05.18 31.05.2018/ 1.06.2018

1.06.2018/ 4.06.2018

11 31.05.18 10.06.2018/ 11.06.2018

geen opvolgstaal genomen

12 10.06.2018 11.06.2018/ 14.06.2018

geen opvolgstaal genomen

Page 56: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

54

Tabel 21 Sepsis scoring van de veulens verdacht van sepsis. “-“ waarde niet beschikbaar “x” aanwezig

Veulen parameter score 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Bloed-onderzoek

Neutrofielen (cellen/µL) <1000 <2000 2000-4000 of >12000 8000-12000 Normaal

4 3 2 1 0

4 0 0 0 - 0 0 - - 0 4 0

Aantal staafkernige neutrofielen (cellen/µL)

>500 >200 50-200 <50

4 3 2 0

0 0 0 0 - 0 0 - - 0 - 0

Aanwezigheid toxische korreling

Duidelijk Moderaat Licht Geen

4 3 2 0

0 0 0 0 - 0 0 - - 0 - 0

Lymfocyten (cellen/µL) t 550 - - - - - - 3 --

- -0 -0 -

Fibrinogeen (mg/dL) >600 400-600 <400

2 1 0

- - - - - - - - - -- -- -

Glucose in bloed (mmol/L) <50 50-75 >75

2 1 0

2 0 0 0 0 0 - - 0 0 1 4

Lactaat in bloed (mmol/L) >10 > 7 > 5 > 2,5 < 2,5

4 3 2 1 0

0 2 0 3 1 1 - - 0 4 4 3

IgG (mg/dL) 200-400 400-800 > 800

3 2 0

3 2 0 2 2 2 2 0 0 2 3 3

Creatinine (mg/dL) t 4 3 3 0 3 0 - 0 0 - - 3 0 0

Klinisch onderzoek

Petechiën, geïnjecteerde sclera, hypopyon, anteriore uveïtis (non-traumatisch)

Duidelijk Moderaat Licht Afwezig

3 2 1 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Diarree en/of gezwollen gewrichten en/of dyspnee

Aanwezig Afwezig

3 0

0 3 0 3 0 0 3 0 3 3 3 0

Hypotonie, coma, lethargie, convulsies

Duidelijk Licht Normaal

2 1 0

2 0 0 0 2 0 0 0 0 0 1 0

Voor- geschiedenis

Prematruriteit (drachtduur in dagen)

<300 300-310 311-330 >330

3 2 1 0

0 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0

Placentitis, vaginale uitvloei voor partus, dystocie, zieke merrie, veulen geboren na

Aanwezig Afwezig

3 0

0 0 0 0 3 0 0 0 0 3 0 3

Page 57: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

55

inductie, keizersnede, drachtduur >365

SIRS aanwezig? (minstens 3 van de onderstaande criteria en 1 ervan moet een afwijkende lichaamstemperatuur of een afwijkende lymfocytentelling zijn)

0 4 0 4 0 0 4 0 0 0 0 4

SEPSIS SCORE 14

12

6 13

8 3 12

3 16 17 17

SIRS Leeftijd veulen 0-3 d. 4-14 d. Temperatuur (°C) >39,2 of <37,2 >39,2 of <37,2 x x x

Hartfrequentie >115 >120 x x x x x x x Tachypnee >56 >56 x x x x Leukocytose/ of -penie

(cellen/µL) >14,4 of <6,9 >12,5 of <4 x x x x x x

Bloedlactaat >5 >2,5 x - x x x Bloedglucose <50 <50 x

Tabel 22 CHI3L1 concentraties in het serum bij zieke veulens en controlepaarden.

CHI3L1 concentratie in serum (ng/ml) Mediaan Range Sepsis (veulen 1, 2, 4, 7, 10, 11, 12 ; n= 7)

15,10 8,93

Ziek door andere etiologie (veulen 3, 5, 6, 8, 9; n= 5)

14,65 61,83

Sepsis T1 (veulen 1, 2, 4, 10, 11, 12 ; n=6)

15,04 8,46

Sepsis T2 (veulen 2, 4, 7, 10 ; n=4)

15,64 3,44

Ziek door andere etiologie T1 (veulen 3, 5, 6, 8, 9; n= 5)

14,65 61,83

Ziek door andere etiologie T2 (veulen 3, 5; n= 2)

30,25 38,13

Controle (n=10)

13,64 11,75

Page 58: INNOVATIEVE BIOMERKERS VOOR DE VROEGE DIAGNOSE EN …

56

Tabel 23 CHI3L1 concentraties in de urine van zieke veulens en controlepaarden.

CHI3L1 concentratie in urine (ng/ml) Mediaan Range Sepsis (veulen 1, 2, 4, 7, 10, 11, 12 ; n= 7)

16,92 17,27

Ziek door andere etiologie (veulen 3, 5, 6, 8, 9; n= 5)

23,90 4,30

Sepsis T1 (veulen 1, 2, 4, 10, 11, 12 ; n=6)

13,83 17,27

Sepsis T2 (veulen 2, 4, 7, 10 ; n=4)

19,50 5,16

Ziek door andere etiologie T1 (veulen 3, 5, 6, 8, 9; n= 5)

22,47 0,20

Ziek door andere etiologie T2 (veulen 3, 5; n= 2)

25,95 1,44

Controle (n=10)

17,52 15,97