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III. Materiales y Métodos III. MATERIALES Y METODOS III.1. PLAN DE TRABAJO El plan de trabajo seguido consta de tres fases: Fase 1: Cuantificación de la capacidad bactericida en base a un patrón de nisina. Fase 2: Caracterización de Lactococcus lactis: curva de crecimiento y actividad antilisteria. Fase 3: Formulación de un medio óptimo para la producción de metabolitos con actividad antilisteria a partir de Lactococcus lactis. En la figura III.1. se muestra de forma esquematizada el plan de trabajo el cual se detalla a continuación. Fase 1: Cuantificación de la capacidad bactericida en base a un patrón de Nisina Una de las problemáticas que se plantea a la hora de evaluar la actividad bactericida de un microorganismo o/y sus productos metabólicos, es estandarizar los resultados obtenidos. Una forma de hacerlo es expresar los resultados en base a un patrón, siendo el más utilizado, en este caso, la nisina. Para poder lograr este objetivo es necesario previamente elaborar un patrón de dosis-respuesta que relacione la actividad bactericida de diferentes dosis de nisina frente a la respuesta inhibitoria observada sobre una determinada cepa diana, listeria en el presente trabajo. Así, 19

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Material y metodos

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III. Materiales y Mtodos

III. Materiales y Mtodos

III.MATERIALES Y METODOS

III.1. PLAN DE TRABAJO

El plan de trabajo seguido consta de tres fases:

Fase 1: Cuantificacin de la capacidad bactericida en base a un patrn de nisina.

Fase 2: Caracterizacin de Lactococcus lactis: curva de crecimiento y actividad antilisteria.

Fase 3: Formulacin de un medio ptimo para la produccin de metabolitos con actividad antilisteria a partir de Lactococcus lactis.

En la figura III.1. se muestra de forma esquematizada el plan de trabajo el cual se detalla a continuacin.

Fase 1: Cuantificacin de la capacidad bactericida en base a un patrn de Nisina

Una de las problemticas que se plantea a la hora de evaluar la actividad bactericida de un microorganismo o/y sus productos metablicos, es estandarizar los resultados obtenidos. Una forma de hacerlo es expresar los resultados en base a un patrn, siendo el ms utilizado, en este caso, la nisina. Para poder lograr este objetivo es necesario previamente elaborar un patrn de dosis-respuesta que relacione la actividad bactericida de diferentes dosis de nisina frente a la respuesta inhibitoria observada sobre una determinada cepa diana, listeria en el presente trabajo. As, posteriormente trasladar la respuesta observada en el caso de los microorganismos en estudio a una actividad equivalente de nisina.

Fase 2: Caracterizacin de Lactococcus lactis: curva de crecimiento y actividad antilisteria.

La actividad antimicrobiana de las bacterias cido lctica (BAL) se debe en gran medida a los metabolitos que estos microorganismos son capaces de generar. As, con la finalidad de determinar en qu momento de su desarrollo el Lactococcus lactis produce una mayor concentracin de sustancias antimicrobianas se: a) modeliz su curva de crecimiento, en un medio ptimo de crecimiento y b) se evalu la actividad antilisteria de los metabolitos (sustrato parcialmente purificado: SPP) producidos en las distintas fases de crecimiento.

Fase 3: Formulacin de un medio optimo para la produccin de metabolitos con actividad antilisteria a partir de Lactococcus lactis.

En este apartado se testaron diferentes formulaciones con la finalidad de obtener un medio que permitiese un optimo desarrollo de la actividad antilisteria de L. lactis. Se trabajo con dos cepas de L. lactis (CECT 539 y 4434) y los componentes utilizados en las formulaciones testadas fueron: sacarosa, peptona, extracto de levadura, fosfato potsico, cloruro sdico y sulfato de magnesio. La determinacin del medio ptimo se efectu considerando la actividad antilisteria de los SPPs obtenidos para cada uno de los medios testados y utilizando la tcnica de anlisis de superficie de respuesta (MSR).

FASE 1

FASE 1

(CUANTIFICACIN DE LA CAPACIDAD BACTERICIDA EN BASE A UN PATRN DE NISINAMicroorganismo indicadorListeria innocuaPatrn dosis-respuestaCARACTERIZACIN DE Lactococcus lactis: CURVA DE CRECIMIENTO Y ACTIVIDAD ANTILISTERIACurva de crecimientoMicroorganismo Lactococcus lactisSPP (sustrato parcialmente purificado)Microorganismos:Lactococcus lactis CECT539Lactococcus lactis CECT 4434Componentes del medio: sacarosa, peptona, extracto de levadura, KH2PO4, NaCl, MgSO4Mtodo de la superficie de respuesta (MSR)Evaluacin actividad antilisteriaFORMULACIN DE UN MEDIO PTIMO PARA LA PRODUCCIN DE METABOLITOS CON ACTIVIDAD ANTILISTERIA A PARTIR DE L. lactisMedio optimoSustancia activaNISINA)

FASE 2

FASE 3

Figura III.1 Esquema del plan de trabajo.

III.2. MATERIA PRIMA

III.2.1.Microorganismos

Los microorganismo productores de sustancias bactericidas/bacteriostticas utilizados para el presente estudio fueron Lactococcus lactis spp. lactis CECT 539 y CECT 4434. Como microorganismo indicador se utiliz Listeria innocua CECT 4030. Todos los microorganismos se obtuvieron en forma de lifilos y procedan de la Coleccin Espaola de Cultivos Tipo (CECT).

III.2.2. Medios de cultivo y reactivos

Los medios de cultivo comerciales utilizados fueron: De Man, Rogosa y Sharpe Broth (Scharlau) (MRS caldo), Brain Heart Infusion Broth (Scharlau) (BHI caldo), De Man, Rogosa y Sharpe agar (MRS agar) (Scharlau), Brain Heart Infusion Agar (BHI agar) (Difco).

Para los medios formulados se utilizaron los siguientes reactivos (Li et al., 2002): sacarosa (Scharlau), peptona (Scharlau), extracto de levadura (Scharlau), KH2PO4 (Scharlau), NaCl (Scharlau), MgSO4.7H2O (Scharlau).

III.3.3. Preparacin del patrn de nisina

Se preparo una solucin de nisina (2000 UI/mL) adicionando 0.2 g de nisina comercial 106 UI/g en 100 mL de agua destilada estril con un pH ajustado a 5.3 para una correcta disolucin (Pongtharangkul, 2004).

III.3.METODOLOGA

III.3.1.Aspectos generales

III.3.1.1. Recuperacin de las cepas liofilizadas y preparacin de inculos

La recuperacin de las cepas liofilizadas utilizadas en el presente estudio se llev a cabo de acuerdo con las instrucciones de la coleccin Espaola de Cultivo Tipo (CECT).

Una vez revitalizadas las cepas se inocul 1 mL de la suspensin obtenida en 250 mL de medio de cultivo (MRS caldo para L. lactis y BHI caldo para L. innocua) y se incub durante 12 horas a la temperatura ptima de crecimiento del microorganismo, 37C para L. innocua y 30C para L. lactis, obteniendo as las denominadas soluciones madre.

A partir de las soluciones madre se inocul 2mL en matraces con 800 mL de los correspondientes medios de cultivo, MRS caldo BHI caldo, en funcin del microorganismos considerado. Estos nuevos matraces fueron incubados 12 horas a 30/37C en funcin del microorganismo.

Transcurrido este tiempo, se centrifugaron los cultivos celulares a 11000 rpm y 5 C

durante tres ciclos de 5 minutos (centrifuga 5804 Eppendorf, Alemania).

Finalizada la centrifugacin el pellet obtenido se resuspendi con agua destilada estril y seguidamente se distribuy en alcuotas de 1 mL en eppendorfs a los que se les aadi un 15 % de glicerol.

La muestras as obtenidas (inculos) fueron inmediatamente almacenadas a -80C hasta su utilizacin.

La concentracin de clulas viables en los inoculos as preparados fue de 109 ufc/mL para L. innnocua y 1010 ufc/mL para L. lactis (CECT 539 y CECT 4434).

III.3.1.2. Obtencin del sustrato parcialmente purificado (SPP)

El sustrato parcialmente purificado (SPP) se puede definir como el producto obtenido tras el crecimiento de L. lactis en un determinado medio de cultivo y posterior inactivacin de la clulas microbianas. Dicho sustrato contendra los metabolitos microbianos con actividad antimicrobiana. Para la obtencin del sustrato parcialmente purificado se sigui la metodologa definida por Cabo et al. (1999); Guerra y Pastrana (2002) con pequeas variaciones para ajustarla a las cepas bacterianas utilizadas en este trabajo.

En primer lugar, las cepas de L. lactis se inocularon en el o los medios de cultivo pertinente, en funcin del estudio a realizar, y stos se incubaron a la temperatura ptima de crecimiento (30C).

Transcurrido el tiempo de incubacin, el cual ser funcin del estudio realizado, se ajust el pH a 3.5 mediante la adicin de HCl 5N, para evitar la adsorcin de los metabolitos sobre las superficies de las clulas.

Tras 10 minutos de resposo, se pasteuriz en un bao de agua a 80C durante 3 minutos con la finalidad de inactivar las clulas microbianas sin alterar los productos metablicos, fundamentalmente las bacteriocinas. Posteriormente, se enfro en bao de hielo durante 15 minutos.

Para finalizar, la muestra fue sometida a centrifugacin a 5000 rpm durante 10 minutos a 4C en una centrfuga (centrifuga 5804 Eppendorf) obtenindose as los sobrenadantes libres de clulas sustrato parcialmente purificado (SPP). El pH de los sobrenadantes se ajust a 6.2 con NaOH 1N y estos fueron almacenados en refrigeracin hasta su uso.

III.3.1.3. Evaluacin de la capacidad bactericida

Para evaluar la actividad antimicrobiana se utilizaron dos tcnicas: la tcnica de difusin en agar y la tcnica de dilucin en caldo.

a.-Tcnica de la difusin en agar:

El mtodo de la gota en agar o mtodo de difusin en agar se basa en la capacidad de difusin de una cierta sustancia o disolucin, en un agar o medio de cultivo solid (Garriga et al., 2001; Montville y Winkowski, 2001; Guerra y Pastrana, 2002; Turcotte et al., 2003).

A tal efecto, se prepararon unas placas Petri inoculadas con el microorganismo indicador (L. innocua) para lo cual se tuvo en cuenta la carga microbiana a inocular en cada placa, por lo que a partir de un vial ultracongelado se realizaron las diluciones deseadas hasta alcanzar una carga final de 106ufc/mL.

En cada placa se pipete 1mL de L. innocua y se verti BHI agar (45C), se agit convenientemente y se dej solidificar a temperatura ambiente. Una vez solidificado el agar, las placas se mantuvieron en nevera (4C) durante 30 minutos. Transcurrido ese tiempo, se sacaron y se realizaron aspticamente 5 agujeros (pocillos) con un sacabocados de 9 mm de dimetro (Figura III.2.). En cuatro de los pocillos se inocularon las distintas sustancias a testar (nisna o SPP, segn el caso) a razn de 100 L y el quinto pocillo se utiliz como control negativo. Tras un periodo de incubacin de 24 horas a 37C se midieron los dimetros de los halos de inhibicin obtenidos.

Figura III.2. Evaluacin de la capacidad bactericida mediante la tcnica de difusin en agar, esquema de la distribucin de los pocillos de las placas Petri.

b.- Tcnica de dilucin en caldo

Esta tcnica se basa en la preparacin de una serie tubos inoculados con el microorganismo diana (L. innocua) y las diferentes sustancias a testar, nisina SPP en funcin del estudio a realizar. La concentracin de L. innocua inoculada fue de 106ufc/mL. A continuacin, se incuban los tubos durante 20 horas a una temperatura de 37C, tras lo cual se enumeran los niveles residuales de L. innocua mediante recuento en placa en BHI agar.

III.3.2. Cuantificacin de la capacidad bactericida en base a un patrn de nisina

Con la finalidad de poder evaluar la actividad antimicrobiana de los productos metablicos producidos por L. lactis se opt por expresar dicha actividad en base a un patrn de nisina. A tal efecto, se tuvo que establecer la relacin dosis-respuesta para dicho patrn, para poder trasladar las respuestas observadas en el caso de los metabolitos de L. lactis a una concentracin equivalente de nisina. Para medir la actividad antimicrobiana del patrn de nisina se eligi como cepa indicadora o diana L. innocua y se testaron las respuestas observadas para diferentes concentraciones de nisina utilizando las dos tcnicas descritas en el apartado III.3.1.3. (difusin en agar y dilucin en caldo).

En ambos casos se parti de una disolucin de nisina de 2000 mg/L equivalente a 2000 UI/mL (apartado III.2.2.1.) A partir de esta disolucin se obtuvieron disoluciones con diferentes concentraciones de nisina.

En el caso de la tcnica de difusin en agar (ver apartado III.3.1.3.a.) se testaron las siguientes concentraciones de nisina: 25, 50, 200, 500, 1000, 1100, 1200 mg/L).

En el caso de la tcnica de dilucin en caldo (apartado III.3.1.3.b.) se prepararon 11 diluciones con las concentraciones en nisina que se muestran en la tabla III.1., cada una de ellas en un tubo con las cantidades de nisina y caldo BHI correspondientes. A partir de la dilucin 11, correspondiente a 100 mg/L, se realizaron el resto de diluciones segn se muestra en la tabla III.1. Una vez obtenidas las distintas concentraciones de nisina se procedi como viene indicado en el apartado III.3.1.3.b. En los tubos de ensayo se mezclaron 1 mL de las distintas disoluciones de nisina con 1 mL de L. innocua a una concentracin de 106 ufc/mL, considerndose como concentracin de nisina testada la correspondiente a concentracin de nisina en incubacin (tabla III.1.). La concentracin mnima inhibitoria (CMI) se estableci como la mnima concentracin de nisina que conlleva una inhibicin total del crecimiento de listeria.

Tabla III.1. Preparacin de los tubos para la prueba de la actividad antilisteria del patrn de nisina segn la tcnica de dilucin en tubo.

Dilucin

Volumen de nisina

(mL)

Volumen de caldo BHI

(mL)

Concentracin de nisina

(mg/L)

Concentracin

de la nisina en incubacin

(mg/L)***

1

5

0

2000

1000

2

4.5*

0.5

1800

900

3

4.0*

1.0

1600

800

4

3.5*

1.5

1400

700

5

3.0*

2.0

1200

600

6

2.5*

2.5

1000

500

7

2.0*

3.0

800

400

8

1.5*

3.5

600

300

9

1*

4.0

400

200

10

0.5*

4.5

200

100

11

0.5 *

9.5

100

50

12

4.0**

1.0

80

40

13

3.0**

2.0

60

30

14

2.0**

3.0

40

20

15

1.0**

4.0

20

10

* Concentracin de partida: 2000 mg/L

** Concentracin de partida: 100 mg/L procedente de la dilucin 11

*** Concentracin final en el tubo de ensayo

III.3.3. Caracterizacin de lactococcus lactis: curva de crecimiento y actividad antilisteria.

Con la finalidad de determinar en qu momento de su desarrollo el L. lactis produca mayor concentracin de metabolitos antimicrobianos se: a) modeliz su curva de crecimiento en un medio ptimo de crecimiento y b) se evalu la actividad antilisteria de los metabolitos producidos (SPP) a lo largo de dicha curva de crecimiento.

III.3.3.1. Modelizacin de la curva de crecimiento de L. lactis

Para obtener la curva de crecimiento se inoculo L. lactis (CECT 539) en caldo MRS, obtenindose una concentracin inicial aproximada de 104ufc/mL. A continuacin, se incub 21 horas a 30C tomndose muestra cada hora y a tiempo 0 (antes de introducir los tubos en la estufa).

Tras cada toma de muestra se enumeraron los microorganismos mediante recuento en placa en MRS agar. Tras el registro de los datos se representaron los valores de unidades formadoras de colonias (ufc/mL) frente al tiempo obtenindose as la curva de crecimiento.

Posteriormente se realiz la modelizacin de las curvas de crecimiento en base a los modelos cinticos de Gompertz (ecuacin 1) y Baranyi (ecuacin 2).

(ecuacin 1)

Donde: N= carga microbiana (log ufc/mL)

N0= carga microbiana inicial (log ufc/mL)

C= cantidad de crecimiento que se da al aumentar t indefinidamente (log ufc/mL)

M=tiempo al que la velocidad de crecimiento es mxima (h)

B= velocidad de crecimiento relativa en el tiempo M (h-1)

t= tiempo (h)

(ecuacin 2)

Donde:N= carga microbiana (log ufc/mL)

N0= carga microbiana inicial (log ufc/ml)

max= velocidad mxima de crecimiento ([log ufc/mL]h-1)

m=parmetro de curvatura

Nmax= carga microbiana mxima (log ufc/mL)

Los datos experimentales (ufc/mL) obtenidos de la curva de crecimiento, se modelizaron con ayuda del programa informatico DMFit 2.0 para Excel (Baranyi y Roberts, 1994), adems la aplicacin proporciona los siguientes parmetros de crecimiento: = velocidad de crecimiento (log ufc/mLh-1); = tiempo de latencia (h); DP=mxima densidad poblacional (log ufc/mL); No= carga microbiana inicial (log ufc/mL) y R2= coeficiente de correlacin.

III.3.3.2. Curva de crecimiento y actividad antilisteria del SPP

En este punto se determino la actividad antilisteria de los metabolitos producidos por L. lactis (SPP) respecto a su nivel de crecimiento.

A tal efecto, se procedi como en el apartado anterior (III.3.3.1.) incubndose L. lactis en caldo MRS. Se tomo muestra cada hora durante 24 horas, determinndose las ufc/mL y extrayndose el SPP tal y como se indica en el apartado III.3.1.2. La actividad antimicrobiana se determino frente a Listeria innocua (actividad antilisteria) utilizando la tcnica de difusin en agar (apartado III.3.1.3.a.).

III.3.4. Formulacin de un medio ptimo para la produccin de metabolitos con actividad antilisteria a partir de Lactococcus lactis

El objetivo que se pretendi conseguir en esta fase del trabajo fue formular un medio ptimo de crecimiento para L. lactis que permitiese alcanzar una mxima produccin de metabolitos con propiedades antisteria. A tal efecto, se utiliz la metodologa de superficie de respuesta (MSR). La metodologa de superficie de respuesta es un grupo de tcnicas matemticas y estadsticas tiles para el modelado y anlisis en aplicaciones donde la respuesta de inters est influenciada por varias variable y donde el objetivo es el optimizar (maximizar minimizar) esa respuesta (Chacin, 2000).

En este trabajo, mediante esta tcnica se pretendi identificar los ingredientes del medio de cultivo que tienen efecto significativo sobre la produccin de sustancias metablicas con actividad antimicrobiana (fundamentalmente bacteriocinas) a partir de L. lactis.

III.3.4.1.Diseo factorial fraccionado (DFF)

En la fase inicial de este estudio se utiliz un diseo factorial fraccionado (DFF), este tipo de diseo reduce el nmero de experimentos a realizar en comparacin con los diseos factoriales clsicos (Li et al., 2002). Los ingredientes o factores del medio de crecimiento considerados fueron: sacarosa, peptona, extracto de levadura, KH2PO4, NaCl y MgSO4.7H2O (apartado III.2.2.).

Para cada uno de estos factores se consideraron 2 niveles (inferior y superior) (tabla III.2.). La variable dependiente o respuesta considerada fue la actividad antilisteria del SPP extraido cuando el L. lactis se desarrollaba en los diferentes medios testados.

De acuerdo con los diseos factoriales y teniendo en cuenta que en el presente diseo se han considerado 6 factores con dos niveles, se tratara de un diseo 26 o sea conllevara a la realizacin de 64 experimentos. Este nmero se redujo utilizando un diseo factorial fraccionado (DFF) de tipo 26-2 siendo en este caso necesarios 16 experimentos. A partir de este diseo se estim las respuestas medias para un modelo lineal de primer orden (Li et al., 2002). En la tabla III.3. se muestra el diseo utilizado.

Tabla III.2. Concentracin de los distintos componentes del medio de cultivo considerando los niveles inferior, medio y superior.

Componente

Niveles

Inferior (g/L)

Medio (g/L)

Superior (g/L)

Sacarosa

6,667

10

13,333

Peptona

6,667

10

13,333

Extracto de levadura

6,000

10

14,000

KH2PO4

6,667

10

13,333

NaCl

1,000

2

3,000

MgSO4.7H2O

0,047

0,1

0,167

Tabla III.3. Diseo experimental factorial fraccionado (DFF)

n ensayo/ formulacin

Factores

X1

X2

X3

X4

X5

X6

1

- 1

- 1

- 1

- 1

- 1

- 1

2

+1

- 1

- 1

- 1

+1

+1

3

- 1

+1

- 1

- 1

+1

- 1

4

+1

+1

- 1

- 1

- 1

+1

5

- 1

- 1

+1

- 1

+1

+1

6

+1

- 1

+1

- 1

- 1

- 1

7

- 1

+1

+1

- 1

- 1

+1

8

+1

+1

+1

- 1

+1

- 1

9

- 1

- 1

- 1

+1

- 1

+1

10

+1

- 1

- 1

+1

+1

- 1

11

- 1

+1

- 1

+1

+1

+1

12

+1

+1

- 1

+1

- 1

- 1

13

- 1

- 1

+1

+1

+1

- 1

14

+1

- 1

+1

+1

- 1

+1

15

- 1

+1

+1

+1

- 1

- 1

16

+1

+1

+1

+1

+1

+1

Factores: X1, X2, X3, X4, X5 y X6

Niveles: inferior (-1) y superior (+1)

Conociendo los valores correspondientes a los factores (variable independiente) y las respuestas (variable dependiente=actividad antilisteria) se represento matemticamente el modelo MSR mediante una ecuacin que relacionase las respuestas obtenidas con los factores considerados. En este caso se utiliz un modelo de primer orden (lineal) sin interacciones o productos cruzados (ecuacin 3). La tcnica de optimacin se elige segn se alcance el objetivo deseado con el menor gasto de recursos

(Ecuacin 3)

Donde Y es la variable respuesta, 0.6 son los coeficientes de regresin lineal; X1X6 las variables independientes y es el error aleatorio (Montgomery, 2003).

La metodologa seguida en esta fase del proyecto se detalla a continuacin:

a) Preparacin de los diferentes medios de crecimiento e incubacin de L. lactis

b) Extraccin del SPP

c) Determinacin de la actividad antilisteria del SPP

a) Preparacin de los medios de cultivo

Para la preparacin de los 16 ensayos a realizar se pesaron cada uno de los componentes del medio (sacarosa, peptona, extracto de levadura, KH2PO4, NaCl y MgSO4.7H2O) y se disolvieron en un volumen final de 250 mL de agua destilada, en la tabla III.4. se indican las concentraciones testadas en los 16 experimentos programados.

A continuacin, se ajust el pH a 6.8 utilizando NaOH 5N y/o HCl 5N y se esteriliz en autoclave durante 20 minutos a 121C. Posteriormente, a los medios estriles se les inocul L. lactis CECT 539 o CECT 4434, obtenindose una concentracin inicial aproximada de 104 ufc/mL. Posteriormente, los medios inoculados se incubaron 12 horas a 30 C.

Tabla III.4. Concentracin de los distintos componentes del medio a testar para cada uno de los ensayos

n ensayo/ formulacin

Factores

X1(g/L)

X2 (g/L)

X3 (g/L)

X4 (g/L)

X5 (g/L)

X6 (g/L)

1

6,667

6,667

6,000

6,667

1,000

0,047

2

13,333

6,667

6,000

6,667

3,000

0,167

3

6,667

13,333

6,000

6,667

3,000

0,047

4

13,333

13,333

6,000

6,667

1,000

0,167

5

6,667

6,667

14,000

6,667

3,000

0,167

6

13,333

6,667

14,000

6,667

1,000

0,047

7

6,667

13,333

14,000

6,667

1,000

0,167

8

13,333

13,333

14,000

6,667

3,000

0,047

9

6,667

6,667

6,000

13,333

1,000

0,167

10

13,333

6,667

6,000

13,333

3,000

0,047

11

6,667

13,333

6,000

13,333

3,000

0,167

12

13,333

13,333

6,000

13,333

1,000

0,047

13

6,667

6,667

14,000

13,333

3,000

0,047

14

13,333

6,667

14,000

13,333

1,000

0,167

15

6,667

13,333

14,000

13,333

1,000

0,047

16

13,333

13,333

14,000

13,333

3,000

0,167

X1: Sacarosa, X2: Peptona, X3: Extracto de levadura, X4: KH2PO4, X5: NaCl, X6: MgSO4.7H2O

b) Extraccin del SPP

Tras las 12 horas de incubacin se extrajo el sustrato parcialmente purificado tal y como se indica en el apartado III.3.1.2.

c) Determinacin de la actividad antilisteria del SPP

La actividad antimicrobiana de los productos metablicos de las dos cepas en estudio L.lactis CECT 539 y CECT 4434 se evalu frente al microorganismo indicador L. innocua utilizando la tcnica de dilucin en tubo (III.3.1.3.b.). A tal efecto, partiendo de los sobrenadantes o sustratos parcialmente purificados (SPP) extrados como se indica en el apartado anterior, se testaron diferentes diluciones de los mismos para lo cual se mezcl un determinado volumen de SPP y agua destilada tal y como se indica en la tabla III.5.

A continuacin, se tom 1 mL de cada una de las diluciones anteriores y se aadi 1 mL del cultivo de L. innocua (106 ufc/mL) y se incub 20 horas a 37 C Tras el periodo incubacin se determin la concentracin residual de L. innocua mediante recuento en placa en BHI agar obtenindose la curva dosis-respuesta con los datos obtenidos. La concentracin mnima inhibitoria CMI del sobrenadante es la concentracin ms baja a la cual se inhibe el crecimiento total de 106 ufc/mL de L. innocua

Tabla III.5. Diluciones de sobrenadante (SPP) testadas.

Dilucin

Volumen (mL)

SPP

agua estril

SPP en incubacin

1

2

0

1

2

1,9

0,1

0.95

3

1,8

0,2

0,9

4

1,7

0,3

0.85

5

1,6

0,4

0,8

6

1,5

0,5

0.75

7

1,4

0,6

0,7

8

1,3

0,7

0.65

9

1,2

0,8

0,6

10

1,1

0,9

0.55

11

1

1

0,5

12

0,9

1,1

0.45

13

0,8

1,2

0,4

14

0,7

1,3

0.35

15

0,6

1,4

0,3

16

0,5

1,5

0.25

17

0,4

1,6

0,2

18

0,3

1,7

0.15

19

0,2

1,8

0,1

Finalmente, se estableci una relacin de equivalencia entre la concentracin mnima inhibitoria de la nisina y la concentracin mnima inhibitoria del volumen del sobrenadante. As, la actividad en IU/mL del volumen del sobrenadante de la dilucin en la que se produce la completa inhibicin del crecimiento de L. innocua se puede calcular segn la ecuacin (4)

As (IU/mL) = Ap (IU) / Vs (mL) (Ecuacin 4)

Dnde:

As (IU/mL): Actividad del sobrenadante del medio de optimizacin en estudio.

Ap (IU): Actividad de la nisina patrn con la concentracin mnima inhibitoria.

Vs (mL): Volumen del sobrenadante de la dilucin en la que se produce la completa inhibicin del crecimiento de L. innocua.

Paralelamente a la determinacin de la actividad antilisteria de los SPPs se determin el pH del medio de cultivo a partir del cual se obtuvieron los distintos sustrato parcilemente purificados, o sea el pH de los medios elaborados con las 16 formulaciones testadas antes de la extraccin del SPP. A tal efecto se utiliz un pHmetro porttil Crison

III.3.4.2. Diseo central compuesto (DCC).

Para describir la naturaleza de la superficie de respuesta en la regin optima, se utiliz un Los diseos centrales compuestos son diseos de tratamientos factoriales 22 con 2*2 combinaciones adicionales llamadas puntos axiales. En este estudio se considero nicamente la propiedad de rotabilidad consistente en que la varianza de los valores estimados sea constante en puntos equidistantes del centro del diseo. As el valor de para un diseo con dos factores es de =1.414.

Para los clculos estadsticos las variables independientes Xi fueron codificadas como xi de acuerdo con la ecuacin 5.

xi= (Xi - X0)/X (Ecuacin 5)

Donde xi=valores codificados adimensionales de la variable Xi; X0=valor de Xi en el punto central; X=cambio en la magnitud de la variable.

Para dos factores se obtienen ecuaciones de la superficie de respuesta de segundo orden (ecuacin 6).

(Ecuacin 6)

Donde Y es la variable respuesta, 0, 1 y 2 son los coeficientes de regresin lineal; X1 y X2 son las variables independientes (Figueroa, 2003)

Por otro lado el rango de concentraciones de los factores a ensayar se ampli con respecto al utilizado cuando se ensayaron los seis factores.

III.3.5. Anlisis de los resultados

Los anlisis de la varianza, los valores de los coeficientes de las regresiones y otros anlisis estadsticos se efectuaron mediante el software Statgraphics Centurion XV (Manugistics, Rockville, MD, USA).

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1

2

5

3 4