Hepcidine - UZ Leuven...(Pre)analytische aspecten 1. Prohepcidine versus hepcidine Prohepcidine bij...

Diagnostische waarde en (pre)analytische aspecten

Apr. Edith Vermeulen21 april 2010

Hepcidine

Inhoud• Inleiding

– Rol hepcidine in het ijzermetabolisme

– Nood aan een nieuwe ijzermarker?

– Vraagstelling

• Appraisal– (Pre)analytische aspecten– Evidentie voor diagnostische waarde hepcidine

• Conclusies

• To do

• Referenties

1. Inleiding

Rol van hepcidine in het ijzermetabolisme

Makrofaag/ Enterocyt

Erytropoiese Hypoxie Inflammatie Ijzer

Bergamashi et al. 2009

Pietrangeloet al. 2004

1. Inleiding

Nood aan een nieuwe ijzermarker?

Castagna et al. 2009

Nood aan een nieuwe ijzermarker?1. Inflammatie

Weiss et al. 2005


1. Inflammatie

Nog plaats voor hepcidin?

• CHr (reticulocyte hemoglobin content)

• % HYPO (% hypochrome RBC)

Reeds ijzerdeficiënte erytropoiese

Hepcidin gevoeliger?

• sTfR/ log ferritin

sTfR/log ferritin

FerritinsTfRsTfR/log ferritin

InflammatieFerritinsTfRsTfR/log ferritin

Thomas et al. 2002

2. Kinderen hepcidine screening (in urine) ?


Brugnaraet al. 1999

3. Chronic kidney disease

EPO dosis snel verbruik ijzer transiënte functionele ijzerdeficiëntie = factor bij hyporesponsiviteit aan EPO

Opsporen: ferritine %HYPO CHr

Hepcidine Predictor van hyporesponsiviteit?


4. Hemochromatose

– Ferritine ↑, TSAT ↑

–DD/ secundaire ijzerstapeling

–Diagnose = genetica

– Therapie target: ferritin < 50 µg/L

= CONSENSUSWAARDE

Fysiologische relevantie?

Hepcidine waarde in therapie-monitoring?


1. Inleiding

Vraagstelling

Vraagstelling

• Welke (pre)analytische aspecten beïnvloeden hepcidine-bepaling?

• Verbetert hepcidine de diagnose van ijzerdeficiëntie bij kinderen of volwassenen?

• Heeft hepcidine een waarde bij hereditaire hemochromatose?

LITERATUURSTUDIE

2. Appraisal (1/3)

1. (Pre)analytische aspecten van hepcidine bepaling

(Pre)analytische aspecten van hepcidine bepaling

• Prohepcidine versus hepcidine

• Kwantitatieve bepalingsmethoden

• Urine of serum

• Pre-analytische aspecten

Hepcidine: - weinig antigene epitopen- sterke conservering tussen species

Bepaling lang problematisch…

Prohepcidine als surrogaat-markerCAVE oudere literatuur!

(Pre)analytische aspecten1. Prohepcidine versus hepcidine


Prohepcidine bij gezonde personen

Studie Correlatie met hepcidin

Correlatie met ijzerstatus/ anemie

Tiker et al. 2006 (n=42)26 terme, 16 aterme neonaten

Nee (ijzer/ transferrine/ ferritine)

Roe et al. 2007 (n=138) Nee (Hb/ ferritine/ TSAT/ sTfR/ serum ijzer)

Balogh et al. 2007 (n=20)Terme neonaten

Nee (serum ijzer/ TIBC/ TSAT/ ferritine/ WBC/ RBC/ Hb/ Hct/ MCV/ MCH/ MCHC/ reticulocyten)

Ulukol et al. 2007 (n=74)Gezonde kinderen 4-12 mo

Nee (ferritine)Uitgesproken fysiologische variatie

Kemna et al. 2008 (n=20) Nee Nee (sTfR/ TSAT/ ijzer/ NTBI/ ferritine)

Huang et al. 2008 (n=45) Nee Wel met sTfR, niet met ferritin


Prohepcidine bij stoornissen ijzer

Studie Correlatie met ijzerstatus/ anemie

Kulaksiz et al. 2004 (n=35 HH, n=59 nierinsufficiëntie met hemodialyse)

Significante verschillen tussen HH, gezonde controles, nierinsufficiëntie met/zonder renale anemie

Roe et al. 2007 (91 WT, 47 heterozygoot C282, 6 homozygoot)

Geen associatie met ferritine of TSAT, geen verschillen tussen de genotypes

Orhon et al. 2007 (kinderen van 4-6 mo: n=16 ferriprieve anemien=54 gezond)

Geen verschillen met/zonder anemieWijde fysiologische variatie

Kemna et al. 2008 (n=20 gezond, n=6 ferriprieve anemie, n=16 inflammatie, n=5 thalassemie)

Geen verschillen tussen de groepen


Kemna et al. 2008

Kulaksiz et al. 2003

Definitie cut-off?


• Prohepcidine: geen correlatie met ijzerabsorptie

Luukkonen et al. 2006, Hadley et al. 2006, Young et al. 2009, Roe et al. 2007

• Geen correlatie met hepcidine in inflammatieKemna et al. 2005, Kemna et al. 2008, Hoppe et al. 2009

• Andere aandoeningen: Hepatitis, hemodialyse, familiale amyloidose,…

Geen verband met hepcidine of ijzerstatus




• Urine of serum


(Pre)analytische aspecten2. Kwantitatieve bepalingsmethoden• Immunodot (Nemeth et al. 2004)

• Kwantitatieve (pro!)hepcidin ELISA DRG commercieel

beschikbaar (2004)

• Semikwantitatieve SELDI-TOF methoden door gebrek

interne standaard

• Kwantitatieve SELDI-TOF, LC MS/MS, HPLC MS/MS

• Kwantitatieve ELISA (Ganz et al. 2008), RIA methoden

• Kwantitatieve ELISA DRG commercieel beschikbaar (2009)

• “Round robin” van 8 analysemethoden (Kroot et al. 2009)

20

09

2

00

8

20

07

20

05

20

04

(Pre)analytische aspecten2. Kwantitatieve bepalingsmethoden

WIE IS WIE?

Ganz et al.Ashby et al.

Koliaraki et al.

Detail resultaten Kroot et al.

- “Most methods are similar in both analytical variation and between-sample variation”

- Analytische variabiliteit is klein i.v.m totale variatie

MAAR

Sterke verschillen in absolute waarden


Verklaring sterke verschillen?

(i) Verschillende calibratoren

(ii) Hepcidine aggregatie in staal of standaard?

(iii) Meten van verschillende fracties? (vrij/ gebonden/ totaal) (90% is α2-macroglobuline gebonden)

(iv) Interferentie van hepcidin-20 of hepcidin-22

Welke fractie biologisch relevant?





• Urine of serum


Kemna et al. 2007

Urine:

-Verschillen tussen klinische groepen significant

-Bredere variatie

(Pre)analytische aspecten3. Urine of serum?

Ganz et al. 2008 (n=24) Kroot et al. 2009 (n=24)(Idem bij Kemna et al.)

r =0.55



Confounding factors bij hepcidine-bepaling in urine en implicaties

Discrepanties tussen studies i.v.m. de correlatie met serumwaarden

Correlatie met serumwaarden onduidelijk

Isovormen hepcidine-20 en hepcidine-22

Dragen bij tot intermethode-verschillen Biologische relevantie twijfelachtig

Gewijzigde eigenschappen van hepcidine in urine?

“Hepcidine-activiteit” (binding aan ferroportin) onmeetbaar in urine

Nierkinetiek nog niet opgehelderd Interpretatie in nieraandoeningen onduidelijk

Meer invloed vries/dooi cycli Minder stabiel dan in serum

Verschillend diurnaal patroon Verschillend afnameprotocol nodig

Hogere between-sample CV bij urine dan serum, bij 6 verschillende methoden

Interpretatie onduidelijk Discrepantie met andere studie




• Urine of serum


(Pre)analytische aspecten4. Pre-analytische aspecten

• Diurnale variatie

• Trend naar hogere waarden bij ouderen?

Ganz et al. 2008


Wordt niet bevestigd


Pre-analytische factoren bij (serum) hepcidine bepaling

Diurnale variatie Circadiaans ritme, correleert met serum ijzer

Interindividuele variatie Significante verschillen tussen waarden man/ vrouwTrend naar hogere waarden bij ouderen?Correlatie met lichaamsgewicht (obesitas)Invloed van inspanning

Vries/dooi cycli, stabiliteit Afname door vries/dooi cycli is verwaarloosbaar.Hepcidine blijft 8 maand stabiel op -80°C (niet -20°C)Geen invloed van toevoeging protease-inhibitor

Hepcidin aggregatie Beschreven bij hoge concentraties

Adhesie aan plastic Beschreven bij hoge concentraties

2. Appraisal

2. Evidentie voor de diagnostische waarde van hepcidine

Vraagstelling




Diagnostische waarde van hepcidinebepaling

• Opsporen van ijzerdeficiëntie

– Anemie van chronische ziekte

– Chronische nieraandoeningen

– Kinderen

IRON DEFICIENCY

Diagnostische waarde: Ijzerdeficiëntie1. Anemie van chronische ziekte

Kemna et al. 2005

Hepcidine is een acute fase eiwit: meerwaarde?

• 3 studies in infectie/ inflammatie

1) Cherian et al. 2008

- 147 Afrikaanse vluchtelingen

2) Theurl et al. 2009

Hepcidine ACD > Controles > IDA

ACD > ACD +IDA

ACD+IDA = IDA


IDA n=12 Hb ↓ Geen inflammatie Ferritine 100 ng/mL

Ferritine 30-100 ng/mL sTfR/log ferritine < 1

ACD + IDA n=14

Hb ↓Chronische inflammatie

Ferritine 30-100 ng/mL sTfR/log ferritine > 2

Controles n=26

Hbnormaal

Geen inflammatie Normale ijzerstatus

Theurl et al. 2009


3) Lasocki et al. 2010

48 ICU patienten, >1 week verblijf, Hb < 100 g/L

Ijzerdeficiëntie “eminence based”

Patiënten met ID: hepcidine-val, ondanks CRP↑

Cut-off via 100 ROC-curves:

129.5 µg/L (sensitiviteit 50%; specificiteit 85%)


Babitt et al. 2010

Diagnostische waarde: Ijzerdeficiëntie2. Chronische nieraandoeningen


• Hepcidine ↑ bij CKD Ashby, Li, Zaritsky

• Hepcidine ↑ bij hemodialyse Ashby, Valenti, Costa

r = -0.12


Verband met eGFR: verdere opheldering nodig

Peters et al. 2010


Costa et al.

• Hepcidine verschilt niet significant tussen EPO-responders en niet-responders

(Ashby, Malyszko, Kato, Costa)

Significant hogere EPO doses bij deze patiënten

Predictie ESA responders versus non-responders?

Hepcidin ~ EPO dosis

Kinetische bepaling?Ashby, et al. 2009


Diagnostische waarde: Ijzerdeficiëntie3. Pediatrie

• Screening tool (in urine): ijzerdeficiëntie detecteren vóór het ontwikkelen van anemie

Geen data

Regulatie ijzerabsorptie > 9 maand

vb. ferroportin gen expressie

Pediatrie

• TMPRSS6 : Iron-refractory Iron-Deficiency anemia

hepcidin onaangepast hoog

vroege opsporing van belang

Cui et al. 2009

Vraagstelling




Diagnostische waarde van hepcidinebepaling

• Waarde bij hemochromatose

– Diagnose

– Opvolging therapie

IRON OVERLOAD

Table 5: Characteristics of the hereditary forms of iron overload

Classic

Juvenile

HJV-related

Hepcidin-related

TfR2-relatedferroportin

disease

gene HFE HJV HAMP TfR2 SLC40A1

OMIM type 1 2a 2b 3 4

interaction TfR1? BMP-R ferroportin transferrin hepcidin

frequency frequent rare very rare very rare rare

hepcidin (↓) ↓↓ ↓↓ ↓ ↑

severity ++ ++++ ++++ +++ +

C282Y homozygoot ↔ C282Y/H63D : Normaal à↑ hepcidin

HEPCIDIN/FERRITIN RATIO Swinkels et al. 2006

Diagnostische waarde: Hemochromatose1. Diagnose

Hepcidine onaangepast laag ten opzichte van ferritine

Bozzini et al. 2008

Swinkels et al. 2006

• Kan een hepcidine waarde als target worden gebruikt voor opvolging therapie?

Lijkt onlogisch

Deficiënte regulatie door hepcidin net aan basis ziekte

Diagnostische waarde: Hemochromatose2. Opvolging

+ Phlebotomy

Piperno et al.2007

Diagnostische waarde: Hemochromatose2. Opvolging

Ader-latingen

Ferritine

3. Conclusies

Conclusies (1)(Pre)analytische aspecten

• Prohepcidine

• Serum voorkeur, urine = ?

• Hepcidin-25 ELISA commercieel beschikbaar

• Geen harmonisatie tussen methoden, sterke

verschillen in absolute waarden

• Diurnale variatie: nuchtere afname ‘s ochtends

• Hepcidine heeft potentieel om onderliggende ijzerdeficiëntie op te sporen

• Geen gegevens van patiënten in “grijze zone”

• Nood aan prospectief gevalideerde cut-off

Conclusies (2)1. Anemie van chronische ziekte

• Niet predictief voor slechte respons op EPO

• Potentieel van kinetische bepaling???

Conclusies (2)2. Chronic kidney disease

3. Pediatrie

• Alle data met (waardeloze) prohepcidine

• Geen gegevens

• Richtinggevend in protocol voor genotypering

• Hepcidine studies aangewezen voor evalueren ferritine target in opvolging therapie

(HFE mutaties)

Conclusies (3)Hemochromatose

4. To Do

Studieprotocol

• Verzamelen stalen bij “duidelijke gevallen” ijzerdeficiëntie (n=50) en anemie van chronische ziekte (n=50) + gezonde controles (n=30)

Indien populaties duidelijk verschillen: prospectief valideren van cut-off bij 50 patiënten met anemie van onbekende origine

ACD IDA Onduidelijke origine

Anemie Hb < 11.5 g/dL Hb < 11.5 g/dL Hb < 11.5 g/dL

Chronische ziekte Ja

CRP >10 mg/L

TSAT 100 µg/L

Bedankt voor uw aandacht

5. Referenties

5. Referenties• Ashby DR, Gale DP, Busbridge M, Murphy KG, Duncan ND, et al. Plasma hepcidin levels are elevated but

responsive to erythropoietin therapy in renal disease. Kidney Int 2009; 75(9): 976-81

• Babitt JL, Lin HY. Molecular Mechanisms of Hepcidin Regulation: Implications for the Anemia of CKD. Am J Kidney Dis 2010 Feb 25. [Epub ahead of print]

• Balogh A, Szabó M, Kelen D, Bokodi G, Prechl J, et al. Prohepcidin levels during human perinataladaptation. Pediatr Hematol Oncol 2007; 24(5): 361-8

• Bergamaschi G, Villani L. Serum hepcidin: a novel diagnostic tool in disorders of iron metabolism. Haematologica 2009; 94(12): 1631-3

• Brugnara C. Iron deficiency and erythropoiesis: new diagnostic approaches. Clin Chem 2003; 49(10):1573-78

• Castagna A, Campostrini N, Zaninotto F, Girelli D. Hepcidin assay in serum by SELDI-TOF-MS and other approaches. J Proteomics 2010; 73(3): 527-36

• Cherian S, Forbes DA, Cook AG, Sanfilippo FM, Kemna EH, et al. An insight into the relationships between hepcidin, anemia, infections and inflammatory cytokines in pediatric refugees: a cross-sectional study. PLoS One 2008; 3(12): e4030

• Costa E, Swinkels DW, Laarakkers CM, Rocha-Pereira P, Rocha S, et al. Hepcidin serum levels and resistance to recombinant human erythropoietin therapy in haemodialysis patients. Acta Haematol2009; 122(4): 226-9 Nemeth E, Rivera S, Gabayan V,

• Ganz T, Olbina G, Girelli D, Nemeth E, Westerman M. Immunoassay for human serum hepcidin. Blood2008; 112(10): 4292-7

• Hadley KB, Johnson LK, Hunt JR. Iron absorption by healthy women is not associated with either serum or urinary prohepcidin. Am J Clin Nutr 2006; 84(1): 150-5

• Hoppe M, Lönnerdal B, Hossain B, Olsson S, Nilsson F, et al. Hepcidin, interleukin-6 and hematologicaliron markers in males before and after heart surgery. J Nutr Biochem 2009 Jan; 20(1): 11-6

• Huang X, Fung ET, Yip C, Zeleniuch-Jacquotte A. Serum prohepcidin is associated with soluble transferrin receptor-1 but not ferritin in healthy post-menopausal women. Blood Cells Mol Dis 2008; 41(3): 265-9

• Kato A, Tsuji T, Luo J, Sakao Y, Yasuda H, et al. Association of prohepcidin and hepcidin-25 with erythropoietin response and ferritin in hemodialysis patients. Am J Nephrol 2008; 28(1): 115-21

• Kemna E, Pickkers P, Nemeth E, van der Hoeven H, Swinkels D. Time-course analysis of hepcidin, serum iron, and plasma cytokine levels in humans injected with LPS. Blood 2005; 106(5): 1864-6

• Kemna EH, Tjalsma H, Podust VN, Swinkels DW. Mass spectrometry-based hepcidin measurements in serum and urine: analytical aspects and clinical implications. Clin Chem 2007; 53(4): 620-8

• Kemna EH, Kartikasari AE, van Tits LJ, Pickkers P, Tjalsma H, et al. Regulation of hepcidin: insights from biochemical analyses on human serum samples. Blood Cells Mol Dis 2008; 40(3): 339-46

• Koliaraki V, Marinou M, Vassilakopoulos TP, Vavourakis E, Tsochatzis E, et al. A novel immunological assay for hepcidin quantification in human serum. PLoS One 2009; 4(2): e4581.

• Kroot JJ, Kemna EH, Bansal SS, Busbridge M, Campostrini N, et al. Results of the first international round robin for the quantification of urinary and plasma hepcidin assays: need for standardization. Haematologica 2009; 94(12): 1748-52

• Kroot JJ, Hendriks JC, Laarakkers CM, Klaver SM, Kemna EH, et al. (Pre)analytical imprecision, between-subject variability, and daily variations in serum and urine hepcidin: implications for clinical studies. Anal Biochem 2009; 389(2): 124-9

• Kulaksiz H, Gehrke S, Janetzko A, Rost D, Bruckner T, et al. Pro-hepcidin: expression and cell specific localisation in the liver and its regulation in hereditary haemochromatosis, chronic renal insufficiency, and renal anaemia. Gut 2004; 53: 735–743

• Lasocki S, Baron G, Driss F, Westerman M, Puy H, et al. Diagnostic accuracy of serum hepcidin for iron deficiency in critically ill patients with anemia. Intensive Care Med 2010 Mar 6. [Epub ahead of print]

• Li H, Rose MJ, Tran L, Zhang J, Miranda LP. Development of a method for the sensitive and quantitative determination of hepcidin in human serum using LC-MS/MS. J Pharmacol ToxicolMethods 2009; 59(3): 171-80

• Luukkonen S, Punnonen K. Serum pro-hepcidin concentrations and their responses to oral iron supplementation in healthy subjects manifest considerable inter-individual variation. Clin Chem Lab Med 2006; 44(11): 1361-2

• Malyszko J, Malyszko JS, Mysliwiec M. Hyporesponsiveness to erythropoietin therapy in hemodialyzed patients: potential role of prohepcidin, hepcidin, and inflammation. Ren Fail 2009; 31(7): 544-8.

• Murphy AT, Witcher DR, Luan P, Wroblewski VJ. Quantitation of hepcidin from human and mouse serum using liquid chromatography tandem mass spectrometry. Blood 2007; 110(3): 1048-54

• Nemeth E, Keller C, Taudorf S, Pedersen BK, et al. IL-6 mediates hypoferremia of inflammation byinducing the synthesis of the iron regulatory hormone hepcidin. J Clin Invest 2004;113:1271–6

• Orhon FS, Ulukol B, Hanoluk A, Akar N. Serum pro-hepcidin levels in infants with iron deficiency anaemia. Int J Lab Hematol 2008; 30(6): 546-7

• Peters HP, Laarakkers CM, Swinkels DW, Wetzels JF. Serum hepcidin-25 levels in patients with chronic kidney disease are independent of glomerular filtration rate. Nephrol Dial Transplant 2010; 25(3): 848-53

• Piperno A, Girelli D, Nemeth E, Trombini P, Bozzini C, et al. Blunted hepcidin response to oral iron challenge in HFE-related hemochromatosis. Blood 2007; 110(12): 4096-100.

• Roe MA, Spinks C, Heath AL, Harvey LJ, Foxall R, et al. Serum prohepcidin concentration: no association with iron absorption in healthy men; and no relationship with iron status in men carrying HFE mutations, hereditary haemochromatosis patients undergoing phlebotomy treatment, or pregnant women. Br J Nutr 2007; 97(3): 544-9

• Swinkels DW, Janssen MCH, Bergmans J, Marx JJM. Hereditary hemochromatosis: Genetic complexicityand new diagnostic approaches. Clin Chem 2006; 52(6): 950-68

• Swinkels DW, Wetzels JF. Hepcidin: a new tool in the management of anaemia in patients with chronic kidney disease? Nephrol Dial Transplant 2008; 23(8): 2450-3

• Theurl I, Aigner E, Theurl M, Nairz M, Seifert M, et al. Regulation of iron homeostasis in anemia of chronic disease and iron deficiency anemia: diagnostic and therapeutic implications. Blood 2009; 113: 5277-86

• Thomas C, Thomas L. Biochemical markers and hematologic indices in the diagnosis of functional irondeficiency. Clin Chem 2002; 48(7): 1066-76

• Tiker F, Celik B, Tarcan A, Kilicdag H, Ozbek N, et al. Serum pro-hepcidin levels and relationships with iron parameters in healthy preterm and term newborns. Pediatr Hematol Oncol 2006; 23(4): 293-7

• Ulukol B, Orhon FS, Hanoluk A, Akar N. Serum pro-hepcidin levels and relationship with ferritin in healthy non-anaemic infants. Acta Haematol 2007; 118(2): 70-2

• Valenti L, Girelli D, Valenti GF, Castagna A, Como G, et al. HFE mutations modulate the effect of iron on serum hepcidin-25 in chronic hemodialysis patients. Clin J Am Soc Nephrol 2009; 4(8): 1331-7

• Weiss G, Goodnough L. Anemia of chronic disease. N Engl J Med 2005; 352: 1011• Weiss G, Theurl I, Eder S, Koppelstaetter C, Kurz K, et al. Serum hepcidin concentration in chronic

haemodialysis patients: associations and effects of dialysis, iron and erythropoietin therapy. Eur J ClinInvest 2009; 39(10): 883-90

• Young MF, Glahn RP, Ariza-Nieto M, Inglis J, Olbina G, et al. Serum hepcidin is significantly associated with iron absorption from food and supplemental sources in healthy young women. Am J Clin Nutr 2009; 89(2): 533-8

• Zaritsky J, Young B, Wang HJ, Westerman M, Olbina G, et al. Hepcidin--a potential novel biomarker for iron status in chronic kidney disease. Clin J Am Soc Nephrol 2009; 4(6): 1051-6.

Hepcidine - UZ Leuven...(Pre)analytische aspecten 1. Prohepcidine versus hepcidine Prohepcidine bij...

Documents

Transcript of Hepcidine - UZ Leuven...(Pre)analytische aspecten 1. Prohepcidine versus hepcidine Prohepcidine bij...