HandleidingPhysarym polycephalum

Rogier van der Mark Per-Ivar Kloen Marten Hazelaar

Dit is een handleiding voor het kweken en onderhouden van één of meerere kolonies van de slijmschimmel Physarum polycephalum. Het biedt achtergrondinformatie over dit wonderlijke organisme en geeft hopelijk ideeën voor eigen onderzoek, of onderzoek door leerlingen. In de bijlagen is een hele beknopte handleiding (bijlage 1) van dit beschrijvende deel opgenomen.

Een schimmel?Physarum polycephalum (PP) is een a-cellulaire slijmschimmel. Anders dan de naam doet vermoeden is PP geen echte schimmel zoals dat in de biologiemethodes staat. Er ontbreekt een echte celwand al is PP deze wel in staat om te maken. Er zijn geen cellen maar er is spraken van één grote cel. PP behoort tot de Physarales, subklasse Myxogastromycetidae, klasse Myxomycetes, divisie Myxostelida. PP komt in bossen met een gematigd klimaat van Amerika voor. Het grootste deel van de slijmschimmels leeft van rottend hout of ander dood plantaardig materiaal. Voor zover bekend komt PP niet in Nederland voor maar andere slijmschimmels wel.

LevenscyclusDe levenscyclus van PP is opmerkelijk. Voortplanting gaat zowel ongeslachtelijk als geslachtelijk. Hieronder volgt een beschrijving per levensstadium met verwijzingen naar foto’s in de bijlage 2.

PlasmodiumDit is het ‘vegetative’ stadium van PP. Het plasmodium is één grote cel met vaak een veelvoud van kernen (2N). Het beweegt zich als een enorme amoebe en is in staat op buizen te maken. Hierdoor ontstaat er een netwerk waardoor het plasmodium door middel van chemotaxis op zoek kan naar voedsel. Wanneer er een voedselbron wordt waargenomen groeit het plasmodium een buis in de richting van de bron (zie foto 1, bijlage 2) waarna het de voedingsstoffen kan opnemen. Het plasmodium houdt van koele (tussen de 20 en 25 graden Celsius) en donkere plekken. Wanneer het plasmodium in het licht komt zal het zich proberen terug te trekken naar een donkere plek.

ScrelotiumWanneer het plasmodium niet aan het licht kan ontsnappen en heeft geen voedingsstoffen en/of water zal het een overlevingsstadium vormen: het sclerotium. Door dit sclerotium is PP in staat temperaturen te overleven tot 70-80 graden Celsius (Blackwell et al. 1984). Het sclerotium bestaat uit honingraad structuur met ‘cellen’ met 0-4 kernen (Chet and Henis 1975, Andreson 2007). Wanneer je het sclerotium koel en droog bewaart kan het tientallen jaren overleven. Onder de juiste omstandigheden (donker, voedsel en water) zal het plasmodium weer zichtbaar worden. Het sclerotium ziet er uit als een dikke korts en kan variëren van roodbruin tot donkergeel. tijdens het vormen van een sclerotium zal het plasmodium zich steeds compacter terugtrekken en steeds donkerder van kleur worden (zie foto’s 2 t/m 4, bijlage 2)

Sporangia en sporenWanneer een, met name hongerend, plasmodium een lichtprikkel krijgt en er is genoeg vocht zal het plasmodium overgaan tot het vormen van sporangia met daarin sporen (Sauer et al 1969). De sporen (N) komen in kleine zwarte vruchtlichamen op steeltjes(zie foto 5 t/m 7, bijlage 2). Ze worden gevormd doordat een deel van de kernen aanwezig in het plasmodium in meiose gaan.

MyxamoebeUit de sporen komen in een waterig milieu een cel met één kern. Dit stadium wordt een myxamoeba(N) genoemd. Het is te vergelijken met een vrijlevende amoebe en net als veel amoebe vormt de myxamoebe in een waterig milieu twee flaggellen. De myxamoeba kan ongunstige omstandigheden overleven door het vormen van een ronde cyste van cellulose. Zowel de rondkruipende als rondzwemmende myxamoebe is in staat tot voortplanting door middel van mitose. Wanneer er genoeg myxomoeba bij elkaar zijn volgt er seksuele voortplanting en ontstaat door versmelting van twee myxomoeba een zygote (2N). De zygote deelt door mitose in een meerkernige cel, het plasmodium.

KwekenHet houden van PP is relatief eenvoudig. Doordat het plasmodium zich onder andere voedt met bacteriën en sporen van schimmels (Stephenson en Stempen 1984) is de noodzaak om steriel te werken niet erg groot. Dat wil niet zeggen dat er geen infectie kan optreden. Het is goed om de twee volgende vuistregels (Adamatzky 2010-1) te onthouden:

- Als het gaat ruiken is het plasmodium te nat.- Als het harig wordt (andere schimmels) is het te droog.

Hierna volgt een beschrijving van twee kweek- en vermenigvuldigings-methodes voor PP en de invloed van een aantal abiotische factoren.

Kweken in kleine hoeveelhedenHet kweken en in stand houden van een plasmodium kan op vele materialen. Het is waargenomen (Adamatzky 2010-1, blz 20) dat Physarum polycephalum om vele verschillende substraten kan groeien. Als plasmodium groet PP in omvang en gewicht. Om het plasmodium in stand te houden is een vochtige omgeving essentieel. Bij te weinig vocht wordt het sclerotium geïnduceerd en is PP kwetsbaar voor met name schimmel-infecties. Substaten zoals agaragar en poreus materiaal zoals keukenpapier (filtreerpapier) werken erg goed. Keukenpapier is goedkoop in gebruik maar droogt ook redelijk snel uit. Agar heeft dit nadeel niet maar is daarentegen weer duurder in gebruik. Daarnaast kost het gieten van platen met agar natuurlijk ook tijd. Voor standaard pertrischalen (90mm) passen ronde koffiefilters type 1 precies. Een aantal lagen filter in een petrischaal voldoet prima als substraat voor PP, is goedkoop en makkelijk in gebruik. Als voedsel wordt vaak havermout gebruikt. Voor onze onderzoeken hebben we gebruik gemaakt van geplette hele havermout. Deze is in elke reformwinkel te krijgen. Havermout uit een pak (zoals Quaker) is ook geschikt maar is vaak kleiner, gebroken in kleinere stukken. Hierdoor wordt het precies plaatsen en verwijderen van havermoutvlokken lastiger. Ondanks dat havermout vaak in de onderzoeken gebruikt worden zijn er vele soorten voedingsbronnen waar PP op gedijt. Het is leuk om uit te proberen wat het ‘favoriete’ voedsel is van PP. In een paar simpele testjes die door ons zijn uitgevoerd blijkt

PP als groeiend plasmodium een voorkeur te hebben voor vet- en eiwit-rijke (bijvoorbeeld kaas) voedselbronnen. Dit is overigens anders dan in onderzoeken wordt gevonden (Ueda 1975) waar voor een groeiend plasmodium een eiwit- en koolhydratenrijke voedselbron de voorkeur heeft.

Kweken in grote hoeveelhedenWanneer je voor bijvoorbeeld een groot onderzoek of voor een aantal klassen plasmodium nodig hebt is het kweken en in stand houden van een groter plasmodium aan te raden. De hier beschreven methode kost in aanloop-fase wat aandacht maar is daarna veel minder intensief en makkelijker om te onderhouden dan het kweken van kleine hoeveelheden in bijvoorbeeld petrischalen. De beschreven methode is gebaseerd op de kweekmethode van Camp (Camp 1936).

OpstartenVoor het kweken van grote hoeveelheden is een afsluitbare (niet luchtdicht!) plastic bak, wat filterpapier en een petrischaal nodig. De bodem van de petrischaal wordt ondersteboven gebruikt en bedekt met filterpapier. Knip een stuk uit dat groter is dan de diameter van de petrischaal zodat het overige papier over de randen van het petrischaaltje gevouwen kunnen worden. Je kunt het eventueel met een elastiekje zorgen dat het filterpapier op z’n plek blijft zitten. Hierna vul je de plastic bak met een laagje water. Genoeg om ervoor te zorgen dat de randen van het filterpapier in het water hangen maar niet zoveel dat de bovenkant (voorheen de onderkant) onder water komt te staan. Je kunt hierop eventueel nog extra rond filterpapier leggen. Het is de bedoeling dat de bovenkant van petrischaal nat is maar niet onder water staat. Hierna kun je bijvoorbeeld een ‘besmette’ vlok overbrengen op het filterpapier. Door het plasmodium elke dag te bestrooien met vermalen havermout groeit het plasmodium snel groter. Let erop dat je op en niet teveel naast het plasmodium strooit. Dit vergroot, zeker in deze aanloop-fase, het gevaar op een infectie. Wanneer het plasmodium een redelijke omvang heeft zal het door het water proberen langs de wanden ‘te ontsnappen’. Op dit punt is het genoeg om om een de dag het water te vervangen en elke dag wat havermout te strooien. Dit kost niet meer dan een paar minuten. Wanneer het plasmodium zo groot is is het ook haast niet meer vatbaar voor infecties.

OnderhoudenNiet al het havermout wordt verteerd, er kan zich een behoorlijk dikke ‘korst’ ophopen. Het is goed dit na verloop van tijd te vervangen en/of te verwijderen. Je kunt er ook voor kiezen om in plaats van vermalen havermout hele havermoutvlokken te gebruiken. De aanloop-fase duurt hierdoor langer maar het verwijderen van ‘gebruikte’ havermoutvlokken gaat makkelijker.

Met het verzorgen van PP in deze methode komt er telkens een beetje licht op het plasmodium. Dit kan een trigger zijn voor het vormen van sporangia. Zeker wanneer er weinig of geen voedsel wordt aangeboden zal dit het geval zijn(Guttes 1961). Wanneer je dit niet wilt zorg er dan voor dat de tijd in het licht zo klein mogelijk is en dat er elke dag voldoende voedsel wordt aangeboden. Om juist tot spoorvorming te komen spreekt het voor zich om het tegenovergestelde te doen.

OogstenWanneer het plasmodium voldoende is gegroeid zal het door het water, langs de wanden proberen te ‘ontsnappen’ (zie foto’s 8 en 9, bijlage 2). Het plasmodium heeft wanneer het door water groeit een wat meer ronde, compacte vorm (zie foto 10, bijlafe 2). Om plasmodium zonder substraat te oogsten kun je met een plat voorwerp het plasmodium van de wanden af schrapen. Hierna kun je het overbrengen op een nieuw substraat. Ondanks dat je de structuur met deze methode verstoort, beschadig je het plasmodium niet. Een andere manier die goed werkt is het bekleden van de wanden van de bak met papier. Het plasmodium zal hier op kruipen (zie foto 9, bijlage 2) waarna je alleen het papier met plasmodium erop verwijdert. Door dit papier op een ander substraat te leggen zal het plasmodium het papier weer verlaten, op zoek naar een voedselbron. Deze methode is ook er handig om bij het induceren van het sclerotium.

Een andere methode om het plasmodium te vermenigvuldigen is om een substraat waar het plasmodium op groeit in kleinere stukjes te delen. Wanneer je bijvoorbeeld de agar met plasmodium erop in stukjes snijdt en op een nieuw substraat brengt zal het stukje plasmodium weer uitgroeien tot een groter plasmodium. Het is onze ervaring dat stukjes agar van 1 x 1 cm goed werken.

Langer bewarenHet in stand houden van een gezond plasmodium kost bijna elke dag tijd. Wanneer er langere tijd geen plasmodium nodig is kan er het sclerotium geïnduceerd worden. Zoals al eerder beschreven is PP in dit stadium lang en zonder onderhoud te bewaren. Een begroeit stukje papier, bij voorkeur zonder voedingsbron, is een goed startpunt om dit stadium te induceren. Leg het stukje papier in het licht maar voorkom direct zonlicht. Wanneer het plasmodium niet uit het licht kan kruipen zal het het overlevingsstadium, het sclerotium gaan vormen. Het uitdrogen van het plasmodium moet geleidelijk gaan. Een petrischaal waar de deksel scheef staat werkt goed. Als het goed is zal het plasmodium zich zeer compact terug trekken. Hierbij wordt de kleur vaak donkerder geel tot lichtbruin. om vervolgens het sclerotium te vormen. Hierbij is de temperatuur zeer bepalend (Gray 1939). Rond de 20 graden zal het plasmodium een sclerotium maken. Bij hoge temperaturen, warmer dan 32 graden en lage temperaturen, lager dan 12 graden, zal dit niet gebeuren. Wanneer dit stukje papier met het sclerotium erop droog en donker bewaart wordt is het nog vele jaren levensvatbaar. Ook wanneer je dit papier het in stukken knipt blijft dit zo. Om het plasmodium weer ‘tot leven’ te wekken leg je het stukje papier op een geschikt substraat met een voedingsbron, bijvoorbeeld een havermoutvlok, erbij. Binnen een paar uur tot twee dagen zal het plasmodium weer tevoorschijn komen.

A-biotische factorenHet ontbreken van spieren en klieren betekend niet dat PP geen gedrag vertoont. Het is leuk om te kijken op welke factoren PP reageert. Er is al veel onderzocht en vaak zijn de onderzoeksverslagen openbaar. Een geweldige bron voor eigen onderzoek. Hieronder staan een aantal a-biotische factoren die wellicht aanzet geven tot het vormen van een eigen onderzoeksvraag.

LichtHet plasmodium heeft een afkeer van licht en zal van het licht af bewegen (negatieve foto-taxis). Wanneer het plasmodium niet aan het licht kan ontsnappen en wanneer er ook geen voedsel bron is maar wel genoeg vocht maakt het plasmodium sponrangia. (Sauer et al 1969). Al eerder is beschreven dat het wanneer er naast voedsel ook geen vocht aanwezig is het plasmodium onder invloed van licht het sclerotium zal vormen. Naast deze twee reacties is er nog een derde reactie op licht van het plasmodium. Het blootstellen aan UV en blauw monochromatisch licht zorgt ervoor dat het plasmodium in stukken uiteen valt. elke stuk bevat ongeveer acht (Kakiuchi et al. 2001) kernen. Hierna, wanneer de omstandigheden weer gunstig zijn, kunnen de stukken weer samenkomen om samen een plasmodium te vormen. Het plasmodium is meestal licht geel tot donker geel van kleur. Hierdoor is het ongevoelig (bron) voor geel licht (600-650 nm). Wanneer je met time-lapse techniek opnames wilt maken is, om het plasmodium niet te storen, een geelfilter aan te raden.

TemperatuurDe temperatuur is direct van invloed op de snelheid van de levenscyclus (Gray 1939). Het plasmodium groeit bij lagere temperaturen langzamer dan bij temperaturen van rond de 20 graden Celsius. Je kunt de groei van het plasmodium behoorlijk vertragen door bijvoorbeeld in de koelkast bij 8 graden te plaatsen. Te hoge temperaturen hebben het zelfde effect (Gray 1939), ze vertragen de levenscyclus. Zoals al eerder is gemeld heeft de temperatuur ook invloed op de vorming van sporangia. Je zou grofweg kunnen zeggen dat tussen de 20 tot 25 graden PP alle levensstadia doorloopt. Waarbij opgemerkt moet worden dat er natuurlijk meer factoren van invloed zijn op diverse levensstadia.

ZuurgraadDe pH is net als temperatuur direct van invloed op de levenscyclus van PP (Gray 1939). De invloed van de zuurgraad en de temperatuur hangen sterk samen (Gray 1939). Uit het werk van Grag (Gray 1939) valt de volgende vuistregel te halen: hoe verder van de optimum temperatuur van 20-25 graden hoe belangrijker de zuurgraad wordt. Hierbij geldt hoe lager de pH hoe beter. De pigmenten in PP zijn pH gevoelig. Dat maakt PP een levende pH indicator. In het rondkruipende plasmodium is de pH rond de 6,8 (Heiple en Taylor 1980). Dit komt overeen met een citroengele kleur. De pH van het substraat is van invloed op de pH in het plasmodium (Seifriz en Zetzmann 1935) en daardoor ook op de kleur. Het plasmodium is rood bij een pH van 1, geel bij een pH van 7 en groengeel bij een pH van 8.

CalciumHet ion calcium is noodzakelijk voor de voortbeweging van het plasmodium (Hatano 1970). Zonder de aanwezigheid van calcium is het plasmodium niet in staat te bewegen. Daarnaast heeft calcium ook effect op de groei (Terry, Stefanski en Eisemann 2009). Een hoge calcium concentratie stimuleert de groei op korte termijn maar hindert de groei op lange termijn.

ZoutAllerlei in-organische zouten hebben een afstotende werking voor het groeiend plasmodium (Ueda 1975). Wanneer er zoutkristallen op het substaat worden gelegd zal PP deze plek mijden. Hoe groter de concentratie van het zout hoe sterker het afstotende effect (Adamatzky 2010).

ZwaartekrachtUit onze waarnemingen en onderzoek blijkt PP gevoelig te zijn voor het zwaartekrachtveld (geotaxis). Wanneer het substraat verticaal wordt georiënteerd (tegen de zwaartekracht in) heeft dit effect op de richting waarin het plasmodium groeit. (Wolke, Niemeyer en Achenbach 1987)

GalvanotaxisTot slot willen we nog noemen dat het plasmodium in staat is stroom te geleiden en waar te nemen. Er zijn publicaties verschenen waarin het plasmodium een actief deel van een elektronische schakeling is (Tsuda, Zauner en Gunji 2007). Het plasmodium is in staat stroom waar te nemen en zal aangetrokken worden door de positieve pol (Anderson 1951).

Referenties

Seifriz, W., & Zetzmann, M. (1935). A slime mould pigment as indicator of acidity. Protoplasma, 23(1), 175-179.

Heiple, J. M., & Taylor, D. L. (1980). Intracellular pH in single motile cells. The Journal of cell biology, 86(3), 885-890.

Terry, L. C., Stefanski, J. M., & Eisemann, B. A. (2009). Effects of Calcium on Growth of Physarum polycephalum. Bios, 80(4), 159-163.

UEDA, TETSUO, et al. (1975) Threshold phenomena in chemoreception and taxis in slime mold Physarum polycephalum. The Journal of general physiology, 65.2: 223-234.

Terry, L. C., Stefanski, J. M., & Eisemann, B. A. (2009). Effects of Calcium on Growth of Physarum polycephalum. Bios, 80(4), 159-163.

2-Adamatzky, A. "Routing Physarum with repellents." The European Physical Journal E 31.4 (2010): 403-410.

1-Adamatzky, A. (Ed.). (2010). Physarum machines: computers from slime mould (Vol. 74). World Scientific.

Gray, W. D. (1939). The relation of pH and temperature to the fruiting of Physarum polycephalum. American journal of botany, 709-714.

Guttes, E., Guttes, S., & Rusch, H. P. (1961). Morphological observations on growth and differentiation of< i> Physarum polycephalum</i> grown in pure culture. Developmental biology, 3(5), 588-614.

Camp, W. G. (1936). A method of cultivating myxomycete plasmodia. Bulletin of the Torrey Botanical Club, 205-210.

Wolke, A., Niemeyer, F., & Achenbach, F. (1987). Geotactic behavior of the acellular myxomycete Physarum polycephalum. Cell biology international reports, 11(7), 525-528.

Anderson, J. D. (1951). Galvanotaxis of slime mold. The Journal of general physiology, 35(1), 1-16. ISO 690

Tsuda, S., Zauner, K. P., & Gunji, Y. P. (2007). Robot control with biological cells. Biosystems, 87(2), 215-223.

Bijlage 1: Beknopte handleiding PP

Bijlage 2

Foto 1: Een plasmodium met een protoplasmatisch buizen netwerk

Foto 2: plasmodium in het licht Foto 3: plasmodium in het lichteen uur later

Foto 4: plasmodium in het lichtweer een uur later

Foto 5: Sporangia in de kweekbak

Foto 6: Sporangia onder de bioculair (10x)

Foto 7: Sporen onder de microscoop (400x)

Foto 8: Plasmodium in de kweekbak met netwerk door het water.

Foto 9: plasmodium ‘ontsnapt’ via de wanden waar een papiertje op zit.

Foto 10: compacte vorm van het plasmodium dat in water groeit onder de binoculair (10x)