Genoom Samenvatting Week 1 – HC 1 t/m 7H5, blz. 263 – 316: DNA replicatie en DNA reparatieH4, blz. 202 – 260: Structuur van chromosomen, chromosomaal DNA en chromatineH1, blz. (1-11+) 16 – 22:Cellen en genomenWC 1 & WC 2

Hoorcollege 1 & 21 cel bevat alle genetische informatie.Slechts 1,5% van het genoom codeert voor eiwitten.De combinatie van eiwitten bepaalt of transcriptie geactiveerd of geremd wordt.

Technieken Kloneren; recombinant DNA m.b.v. restrictie-enzymen Transformatie-selectie bacteriekolonies PCR: 1e, 2e en 3e cyclus veel stukjes DNA produceren DNA microarrays identificatie van groepen genen die gelijktijdig gereguleerd worden.

rood: toenamegroen: afname

Heel veel essentiële eiwitten zijn uitwisselbaar.“Templated polymerization”: m.b.v. een template een polymeer maken.

Replicatie: van DNA naar DNA semi-conservatieve DNA replicatie Het meest nauwkeurige proces. m.b.v. DNA polymerase daarop staat een sterke selectiedruk.

Transcriptie (expressie): van DNA naar RNA m.b.v. RNA polymerase maakt heel snel enkelstrengs RNA massaproductie. Foutje is niet erg, omdat er zo veel RNA’s worden gemaakt slechts 1 verkeerd eiwit RNA kan allemaal verschillende structuren vormen: interne structuren ribosomen.

Flexibel vele conformaties mogelijk. Backbone kan buigen eiwitten kunnen eraan binden.

Translatie: van RNA naar eiwit Verschillende functies actie! Structuur, beweging, signalen Ribosomen: ingewikkelde 3D-structuur. RNA kan op zichzelf al als een enzym werken ribosomen.

1

Regulatie van genexpressie

Veel RNA weinig eiwit:RNA = slecht tevertalen/transleren.

Weinig RNA veel eiwit:RNA = goed tevertalen/transleren.

Autokatalytisch proces drijvende kracht is ATP.

Structuur van een eukaryotisch gen1. Exon: gebieden die coderen voor eiwit, 5’UTR en 3’UTR2. Intron: gebieden die niet coderen voor een eiwit splicing3. Regulatoire gebieden: begin/eind van gen, promoter, eiwitbinding, transcriptiefactoren

Veranderingen tijdens evolutie mutatie(s) genen dupliceren DNA segmenten wisselen horizontale transfer

2

Hoorcollege 3DNA replicatie

Dubbelstrengs DNA strengen scheiden H-bruggen verbreken.DNA polymerase start op RNA primer en synthetiseert van 5’ 3’.Okazaki fragmenten zijn in prokaryoten groot (1000-2000 bp) en in eukaryoten klein (100-200 bp).

Initiatie van replicatie ORI vorming replicatievorkORI: specifieke DNA sequentie;

AT-rijk, omdat A-T maar 2 H-bruggen heeft. Een AT-rijk stukje is dus makkelijk uit elkaar te trekken.

Initiator eiwitten: herkennen ORI

1. Initiator eiwitten binden aan ds ORI.2. Loading protein bindt aan DNA helicase.3. DNA helicase met loading protein bindt

aan initiator eiwitten.4. Loading protein laat los.5. DNA helicase ontwindt de 2 DNA

strengen.

3

DNA helicaseEen ring die bestaat uit 6 subeenheden, die zich om het DNA plaatsen.DNA helicase is een hexameer.Elke stap/draai die helicase doet kost 1 ATP veel ATP nodig celgaat dus ook pas repliceren als er voldoende energie is.2 typen DNA helicase:

1. 5’ 3’ op de leading strand (bij replicatie vooral)2. 3’ 5’ op de lagging strand

DNA primaseRNA primers zijn nodig voor replicatie. Voor de leading strand 1x bij ORI envoor de lagging strand voor ieder Okazaki fragment. DNA primaseplaatst de primer. Een RNA primer is 10 nt lang.DNA primase = een RNA polymerase

DNA polymeraseBouwt dNTP in door eerst 2fosfaatgroepen ervan te verwijderen.

Voert proofreading uit:1. Alleen als nieuwe dNTP covalent

gekoppeld is kan DNA polymeraseverder.

2. Als nieuwe dNTP niet juist is: 3’ 5’proofreading exonuclease knipt deonjuiste nucleotide eruit: 3’-OH over.

P Polymerisatie plaats: verlenging van de nieuwe DNA streng.E Bewerkings (editing) plaats = een exonuclease haalt de verkeerde nucleotide weg.

DNA polymerase bevat ook exonuclease activiteit bij Okazaki fragmenten door de RNA primers te verwijderen. Deze exonuclease activiteit gaat van 5’ 3’.

DNA ligase Verbindt Okazaki fragmenten en sluit DNA strengen. 5’-P en 3’-OH worden met elkaar verbonden m.b.v. ATP en water. DNA helicase gaat van 5’ 3’.

Single-strand DNA-binding Proteins (SSB’s)

4

Is specifiek: herkent enkelstrengs DNA. Coöperatieve binding van deze eiwitten: zodra één/een paar eiwitten gebonden zijn, volgen

al snel de volgende.

Een eiwit, bestaande uit 2 domeinen, kan 8 basen beschermen. Helix-destabiliserende eiwitten Binden stevig aan ssDNA, vormen starre structuur Binden coöperatief aan ssDNA Basen blijven beschikbaar als template

Sliding clamp & clamp loader Sliding clamp, clamp loader en ATP binden

aan elkaar. Clamp loader met sliding clamp herkent

de overgang van ds naar es en bindt aan de primer-template vertakking. Proces kost ATP.

Clamp loader laat los als de DNA polymerase bindt.

Sliding clamp houdt de DNA polymerase op het DNA en beweegt mee.

Sliding clamp laat los als het dsDNA tegenkomt.

De clamp loader en sliding clamp springen dus elke keer weer op ’t DNA.

Hoorcollege 4

5

DNA topoisomerase I Lost het opwindingsprobleem bij DNA replicatie op. Knipt even 1 streng van ds DNA open, DNA draait en breuk wordt hersteld. Heeft een tyrosine residu en die is zeer belangrijk voor de functie (= de active site). Top I gaat een tijdelijke covalente binding aan. Één DNA streng wordt opengeknipt, waardoor de andere streng terug kan draaien en de

spanning uit het DNA wordt genomen. DNA streng sluit weer en het proces heeft geen energie gekost.

DNA topoisomerase IIBacteriële replicatie: 2 circulaire DNA strengen zitten in elkaar.

Proces kost ATP.1. Breekt 1 ds helix.2. Andere helix kan passeren.3. Sluit de helix weer.

ORI’s en re-replicatieProkaryoot:

6

a. Bevat één ORI.b. Is volledig gemethyleerd bij de start: op ’t A-residu.c. Condities (voeding) gunstig.

Nieuwe ronde pas nadat al het DNA weer volledig gemethyleerd is, door Top II gescheiden is en ergunstige condities zijn.

Eukaryoot:a. Bevat meerdere ORI’s.

Niet alle ORI’s worden altijd gebruikt.Je kunt er een paar missen, maar bepaalde ORI’s niet.

b. Condities gunstig (overgang G1 naar S).c. Niet allemaal tegelijk: euchromatine eerst, dan heterochromatine.

Replicatie slechts één keer per celcyclus Prereplicatief complex (pre-RC)

wordt gevormd: Cdc6 houdt helicase vast en op

z’n plek Cycline-Cdk fosforyleert Cdc6 Cdc6 laat los Cdc6 wordt afgebroken en

fosforylatie door cycline-Cdkvan ORC vindt plaats

Initiatie van replicatie enreplicatie wordt afgemaakt.

Einde van de M-fase/begin G1-fasevindt synthese plaats van nieuw Cdc6

Signaal dat re-replicatie verhindert:De kinase, cycline-Cdk, die het Cdc6fosforyleert.

Fosforylatie zorgt voorconformatieverandering.

Replicatie van de telomerenNa zo’n 60 keer delen, geen intact DNA meer in de chromosomen.

7

Actief telomerase is aanwezig in geslachtscellen en kankercellen.Telomerase verlengt de OUDERSTRENG, omdat het telomerase een RNA template gebonden heeft.Telomerase = een reverse transcriptase, omdat het een RNA template gebruikt om DNA te maken.

2 aparte domeinen: één die het DNA bindt en één die het RNA bindt.

Telomeren hebben altijd een stukje overhangend 3’ en die zit verstopt in de T-loop. Enkelstrengs 3’ uiteinde vouwt zicht terug in het dsDNA van de telomeer bescherming chromosoomuiteinde.

Proeven gedaan:Overmaat aan veel te lange of te korte telomeren (in gisten):

na een aantal delingen herstelt de gemiddelde lengte zich.Een cel heeft eiwitten die kunnen meten wat een ideale telomeerlengte is.

Verschillen prokaryoten & eukaryoten

DNA repairSchade van buiten: warmte/straling/chemische reacties

8

Depurinering: deletie 5000 purines (A of G) verdwijnen per dag per cel.Deaminering: mutatie 100 C’s muteren naar U’s per dag per cel.

Base Excisie Repair (BER): 1 nucleotide Nucleotide Excisie Repair (NER): meerdere nucleotides

DNA glycosylasen herkennen en verwijderen foute base.AP endonuclease en fosfodiesterase verwijderen de verkeerde suikerfosfaat.

De foute ds DNA structuur wordt herkend door een multi-enzym complex. Een excisie nuclease knipt aan beide zijden en DNA helicase verwijdert het foute stuk.Bacteriën: gat van 12 nt. Mensen: gat van 30 nt.Gat wordt gesloten door DNA polymerase en DNA ligase.

Strand-directed mismatch repairDeze repair vindt direct, nadat DNA polymerase gepasseerd is, plaats.

9

Herkenning ouderlijke streng:in bacteriën: het wel of niet gemethyleerd zijn van A-residu’s.

Gemethyleerd ouderlijke streng.in eukaryoten: een “nick”.

In de lagging strand: tussen Okazaki fragmenten. In de leading strand: nog onbekend.

MutS bindt aan de fout, terwijl MutL het DNA scant voor een nick.

DNA replicatie/repair1 nucleotide mismatch per 1 x 109 nucleotiden per celdeling.Nauwkeurigheid door proofreading en mismatch repair.

Samenvatting repair Een groot aantal repair enzymen scant continu het DNA om schade te herstellen. Schade meestal in één van de twee DNA strengen. Onbeschadigde streng wordt als template gebruikt voor herstel. 3 belangrijk herstelroutes:

1. Base excisie repair: 1 nucleotide vervangenOorzaak fout: Deaminering & depurinering

2. Nucleotide excisie reapair: meerdere nucleotiden vervangenOorzaak fout: Pyrimidine dimeren & carcinogenen

3. Strand-directed mismatch repair:

ds DNA breuken

“Quick and Dirty” deletie FoutloosNiet-homologe end joining Homologe recombinatie

Niet-homologe end-joining Daarbij zijn Ku eiwitten betrokken.

Hoe ouder, hoe vaker de ‘niet-homologe end-joining’

10

methode voor DNA repair. ‘Quick and Dirty’ komt dan vaak voor.

Homologe recombinatie

Heteroduplex Genenuitwisseling bij meiose(productie van geslachtscellen).

Heteroduplex mismatch (NER) Niet alles gelijk, daarommismatch repair.

Chromosomen zonder crossover Chromosomen met crossover

Hoorcollege 5DNA bevat zo’n 3,2 x 109 bp, is verpakt in en verdeeld over 46 chromosomen.

11

Chromosomen Kunnen via kleuringen geïdentificeerd worden.

“Giemsa” is een kleurstof die bindt aan A-T rijke gebieden. De banden zijn specifiek voor elk chromosoom. DNA hybridisatie verft alle chromosomen een specifieke kleur men maakt specifiek

gekleurde stukjes DNA die binden aan bepaalde chromosomen 1 kleur per chromosoom.Zo kunnen afwijkingen ook ontdenkt worden, dus als chromosomen langer of korter zijn.

Genen hebben 3 belangrijke onderdelen: regulatoire DNA sequenties, exonen en introns.Definitie gen:

De functionele eenheid van erfelijkheid. Het gedeelte van DNA benodigd voor maken van een eiwit.

DNA bevat veel meer dan alleen informatie om eiwitten te maken.Het eiwitcoderende deel van chromosomen is slechts 1,5% van het genoom.42% van het genoom bestaat uit transposons zijn stukken DNA die zichzelf kunnen repliceren en die vervolgens ergens anders in het DNA terecht komen.

Relevante informatieHoe de relevante informatie te vinden in deze “chaos”?Belangrijke genomische informatie is geconserveerd/bewaard gebleven gedurende evolutie.

12

Door vergelijking van genomische volgorden van verwante soorten. Door vergelijking van gedeelten van chromosomen tussen verwante soorten.

Hele gedeelten van chromosomen komen voor als blokken in dezelfde volgorde: synteny.

Opbouw chromosomenChromosomen zijn opgebouwd uit chromatine.Chromatine = DNA + eiwit nucleosomenNucleosoom = DNA-eiwitcomplexDNA is in de cel altijd verpakt.

Opbouw nucleosoom: uit histonen H3 bindt met H4 en H2A met H2B. De H3&H4 binden met nog een H3&H4. Vervolgens binden er 2 H2A&B’s aan

de dubbele H3&H4. Een histon octameer is gevormd.

De histonstaarten steken uit.H1 is belangrijk om de 30nm chromatine vezel te vormen.

DNA-binding op een nucleosoom DNA is 1,7x om het nucleosoom gebonden. De ‘minor groove’ is samengedrukt op het

octameeroppervlak. AA, TT en TA geven de voorkeur om te binden

aan het octameeroppervlak. GC’s geven devoorkeur aan de ‘minor grooves’ aan debuitenkant.

De periodiciteit van DNA is 10,5 winding.Na (2x10,5) 21 windingen bindt elke keer de‘minor groove’ aan het octameeroppervlak.

NucleosomenNucleosomen zijn geen statische structuren dynamisch evenwicht er gaat vaak een lusje DNA even van het nucleosoom. Dit geeft de mogelijkheid voor andere eiwitten om te binden aan het eiwit. Enzymen die energie van ATP gebruiken, verplaatsen nucleosomen.

13

ATP-afhankelijke chromatine remodellersversnellen structuurveranderingen in chromosomen.

Histonstaarten Histonstaarten steken uit. De staarten van de kernhistonen zijn onderworpen aan post-translationele modificaties, de

zogenaamde epigenetic marks niet willekeurig. Lycines worden vooral gemodificeerd. Syrines kunnen gefosforyleerd worden.

Modificaties: methylering, fosforylering, acetylering en ubiquitylering.

Hoorcollege 6Genetische overerving vs. epigenetisch overerving

Overerving van eigenschappendoor verandering in het DNA.Gen aan mutatie: gen uit en dat wordt doorgegeven, zowel aan nieuwe somatische cellen, als aan nieuwe geslachtscellen.

Overerving van veranderingen via chromatine.Kunnen niet overerven via de geslachtscellen en blijven dus beperkt tot somatische cellen.In geslachtscellen blijft het dus normaal bij mutatie in chromatine.

Chromosomaal DNA is verdeeld in euchromatine en heterochromatine.Heterochromatine Euchromatine donkere kleuring centromeren en telomeren

lichtere kleuring voornamelijk in het nucleoplasma

14

voornamelijk aan de buitenkant van de kern repliceert laat in de S-fase transcriptioneel inactief, wordt dus niet afgelezen

voornamelijk binnenin de kern repliceert vroeg in de S-fase transcriptioneel actief

Facultatief Heterochromatine Chromosoomgedeelte dat, afhankelijk van de cel,

zich bevindt in hetero- dan wel euchromatine.

Barrières houden euchromatine enheterochromatine gescheiden.

“Position effect variegation” = een epigenetisch verschijnsel. Ontdekt in ogen van Drosophila. Stukje heterochromatine + barrière zijn verwisselt

met een gen op het euchromatine neiging omde nabijgelegen euchromatische genen teinactiveren zone van inactivatie verschiltin vroege embryocellen gen komt de ene keer wel tot expressie en de andere keer niet.

HistonstaartenDe histonstaarten worden veranderd op bepaalde plekken. De combinatie van post-translationele modificaties vormt een “code” voor bepaalde biologische processen.

Bepaalde modificaties zijn geassocieerd met bepaalde functies.Lysine kan meervoudig gemethyleerd óf kan één keer geacetyleerd worden:

een geacetyleerde lysine kan niet gemethyleerd worden.Aminozuren die gefosforyleerd kunnen worden: tyrosine, serine & threonine (Tyr, Ser, Thr)

Fosforylering: OH-groep wordt vervangen door een fosfaatgroep negatieve lading. Acetylering: verwijdering van de pluslading op lysine door toevoeging van acetyl (COCH3). Methylering: -H vervangen voor een (CH3-)methylgroep.

Histon codes lezenHet lezen van de “histon code”gebeurt door chromatine complexen.

Lineaire verspreiding van modificaties en het blokkeren daarvanLineaire verspreiding van histon modificaties en de vorming van heterochromatine:

Verspreiding van heterochromatine vorming kan op verschillende manieren geblokkeerd worden:

15

De code-schrijver is een enzym dat ‘n specifieke modificatie maakt aan 1 v/d 4 nucleosomale histonen. Hierna klapt de schrijver samen met een code-lezer eiwit dat het merk verspreid van nucleosoom naar nucleosoom d.m.v. het lezer-schrijver complex. Dit mechanisme werkt zoals dat de lezer hetzelfde histon-modificatiemerk herkent als dat de schrijver produceert.

(A) Barrière eiwit bindt aan een nucleaire porie en houdt zo de verspreiding van heterochromatine tegen.

(B) Barrière eiwit houdt de verspreiding van heterochromatine tegen.

(C) Barrière eiwit wist de histon merkers die voor verspreiding van heterochromatine zorgen.

CentromeerHet centromeer heeft een speciale vorm vanheterochromatine vormt een bindingsplaatsvoor de microtubuli.Herkenning voor de microtubuli:

1. Histonmodificatie:H3, K4 dimethylatie (2 CH3’s eraan) histon 3, lysine 4 (K = lysine).

2. Centromeerspecifieke histon H3 variant.

Verspreiding van eu- & heterochromatine bij DNA-replicatie/celdelingTwee verschillende mechanismen voor het overerven van: chromatine structuur & histon modificaties

16

Actieve genen Actieve genen bevinden zich in gene loops en hun transcriptie leidt tot decondensatie van

chromatine. De activatie van een gen leidt tot verplaatsing in de kern. De genen die actief zijn bevinden zich op een bepaalde plek. Als een gen inactief wordt, verplaatst die zich.

Hoorcollege 7Ontstaan van veranderingen defecten in repair & replicatie

Substitutie: enkele base Deletie: enkele base – gebieden Duplicatie: gebieden & heel genoom Inversie: gebieden stuk eruit en omgekeerd terug Translocatie: gebieden op ander chromosoom Transposon: insertie van zichzelf

Reconstructie van veranderingen gaat o.a. met behulp van fylogenetische DNA analyses.

Chromosomen vergelijken

Synteny: hele gedeelten van chromosomen komen voor als blokken in dezelfde volgorde. Muisgenoom is gekrompen t.o.v. de mens.

Gebruikelijke aannames fylogenetische bomen1. Veranderingen in DNA-sequenties, die vergeleken worden, zijn willekeurig.2. Veranderingen zijn neutraal: geen nadeel en worden doorgegeven aan nageslacht.3. Aantal veranderingen neemt toe met de tijd áltijd waar.4. Snelheid van veranderingen is (over een lange tijd) constant.

Exonen & intronsEiwitcoderend DNA is veel sterker geconserveerd exonen van verschillende organismen zijn veel meer homoloog dan introns (belangrijke) exonen veranderen nauwelijks over de tijd.

17

Conservatie1,5% van het humane genoom codeert voor eiwit.5% van het humane genoom is sterk geconserveerd eiwitcoderend DNA en regulatoir DNA en een groot deel is nog onbekend waar dat voor is. Fylogenetische analyses om tijd van afsplitsing te bepalen stukken van het DNA gebruiken die niet belangrijk zijn, waarvan mutaties ‘neutraal’ zijn.

“Nieuwe” genen

1. Mutatie

2. Genduplicatie

3. DNA segment uitwisseling

4. Horizontale overdracht

“Nieuwe” genen ontstaan vaak doorduplicatie en recombinatie van exonen.

Gen duplicaat1. Muteert verder en wordt belangrijk, omdat het een andere functie vervult.2. Muteert verder en functioneert niet meer. Wordt soms teruggevonden in sequentie als

pseudogen kan op den duur helemaal verdwijnen.

Soorten verwantschap tussen genen orthologe genen: hebben dezelfde functie in verschillende organismen. paraloge genen: hebben verschillende functies binnen een organisme. homologe genen: omvat genen (orthologe en paraloge), die qua volgorde verwant zijn.

Alle G’s homoloog.G1A paraloog aan

ortholoog paraloog G2A en G2B, maarzelfde functie verschillende functie ortholoog aan G1B.

18