Academiejaar 2015 – 2016

Genetische heterogeniteit bij Osteogenesis Imperfecta

–

Een continue zoektocht naar oorzakelijke mutaties

Staf Rokegem

Rebecca Van den Brande

Promotor: Dr. Sofie Symoens

Co-promotor: Prof. ing. Paul Coucke

Masterproef voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding

MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE

FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN

“De auteur en de promotor geven de toelating dit afstudeerwerk voor consultatie beschikbaar

te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de

beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting

uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit dit afstudeerwerk.”

Datum: 11 april 2016

Staf Rokegem

Rebecca Van den Brande Dr. Sofie Symoens

Dankwoord

De voorbije twee jaar hebben we veel tijd en inspanning toegewijd aan deze masterproef.

Als onderdeel van het curriculum van onze Master of Medicine, doelt een thesis op het

stimuleren van studenten in wetenschappelijk onderzoek en het kennis maken met zowel de

mogelijkheden als de beperkingen die het met zich meebrengt.

Dit leerproces zou nooit mogelijk zijn geweest zonder de bijdrage in tijd, kennis en ervaring

van onze promotor Dr. Sofie Symoens en de waakzame aanwezigheid van copromotor

Prof. Dr. Paul Coucke. Wij hadden hen graag bedankt voor hun tijd, constructieve opmerkingen,

hun enthousiasme en geruststellende woorden dewelke ons ondersteund hebben in het bereiken

van onze doelen. Dankzij hen is deze masterproef wat zij vandaag is.

Ook hadden wij graag Lynn Demuynck bedankt. Haar inzet om ons technieken aan te leren die

we niet of enkel in theorie kenden was onontbeerlijk voor de taak die wij moesten volbrengen.

De kloof tussen theorie en praktijk is er een die haast onmogelijk te overbruggen valt zonder

adequate begeleiding.

Ten slotte hadden wij graag elkaar bedankt. De laattijdige beslissing om samen te werken was

niet vanzelfsprekend. Hoewel weinig tijd voorhanden was om elkaars werkwijzen te leren

kennen, raakten deze toch vlot verzoend. Het kritisch benaderen van elkaars ideeën was een

drijfveer voor verandering, wat zeker heeft bijgedragen tot de kwaliteit van dit werk. Ook de

mentale steun was naar het einde toe een welkom geschenk.

Rebecca Van den Brande en Staf Rokegem

Afkortingenlijst

µl: microliter

ACAN: Aggrecan

ABI: Applied Biosystems

ADAMTS: A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs

ADAMTS20: ADAM Metallopeptidase With Thrombospondin Type 1 Motif, 20

ADD1: Adducin 1

AKT2: V-Akt Murine Thymoma Viral Oncogene Homolog 2

ALPL: Alkaline Phosphatase, Liver/Bone/Kidney

AP: Antarctic Phosphatase

BMP: Bone Morphogenetic Protein

Cas9: CRISPR associated protein 9

CDC27: Cell Division Cycle 27

CLSD: Cranio-lenticulo-sutural dysplasia

CMGG: Centrum voor Medische Genetica Gent

COG3: Component Of Oligomeric Golgi Complex 3

COL1A1: Collagen, Type I, Alpha 1

COL1A2: Collagen, Type I, Alpha 2

COP: Coat Protein

CRISPR: Clustered regularly-interspaced short palindromic repeats

CRS: Chain Recognition Sequence

CRTAC1: Cartilage Acidic Protein 1

CRTAP: Cartilage – associated protein

CTBP2: C-Terminal Binding Protein 2

CUX1: Cut-Like Homeobox 1

CyPB : Cyclophilin B

Cyp : Cyclophiline

ddNTP : Dideoxynucleotide

DLX: Distal-Less Homeobox

DMSO: Dimethylsulfoxide

DNA : Deoxyribonucleic acid (desoxyribonucleïnezuur)

ECM: Extracellulaire matrix

EDTA: Ethyleendiaminetetra-azijnzuur

ELK4: ELK4, ETS-Domain Protein (SRF Accessory Protein 1)

ERCC2: Excision Repair Cross-Complementation Group 2

Exo: Exonuclease

EYA1: EYA Transcriptional Coactivator And Phosphatase 1

Fe2+: Ijzerion

FKBP10: FK506 Binding Protein 10

fs: Frameshift mutatie

FUOM: Fucose Mutarotase

FZD: Frizzled receptor

GIGYF2: GRB10 Interacting GYF Protein 2

GP: GenomiPhi Product

GRIN3B: Glutamate Receptor, Ionotropic, N-Methyl-D-Aspartate 3B

GTP: Guanosine-5'-triphosphate

HSP47: Heat Shock Protein 47

HOX: Homeobox

IFITM5: Interferon Induced Transmembrane Protein 5

ILGF: Insuline-like growth factor

indel_ea: Inserties/deleties

kDa: Kilodalton

KLHL33: Kelch-Like Family Member 33

LRP: Low-density lipoprotein receptor-related protein 5

LEPRE1: Leucine Proline-Enriched Proteoglycan 1

LH: Lysine hydroxylase

MBTPS1: Membrane-Bound Transcription Factor Peptidase, Site 1

miss: Missense mutatie

MLBR: Major Ligand-Binding Region

mRNA: messenger Ribonucleic Acid (ribonucleïnezuur)

MSC: Mesenchymale stamcel

NCBI: National Center for Biotechnology Information

ng: nanogram

NGS: Next Generation Sequencing

NFKBID: Nuclear Factor Of Kappa Light Polypeptide Gene Enhancer In B-Cells Inhibitor,

Delta

NMD: Nonsense mediated decay

NTP: nucleoside triphosphate

O2: Dizuurstof

OH: hydroxyl

OI: Osteogenesis imperfecta

OPA1: Optic Atrophy 1

OSX: Osterix

P3H1: Prolyl 3-hydroxylase-1

P4H: Proly 4-hydroxylase

P4HA1: Prolyl 4-Hydroxylase, Alpha Polypeptide I

PCR: Polymerase Chain Reaction

PEDF: Pigment Epithelium Derived Factor

PhyloP-waarde: Phylogenetische P-waarde

PLEKHM2: Pleckstrin Homology Domain Containing, Family M (With RUN Domain)

Member 2

PPI: Peptidylprolyl cis-trans isomerasen

PPIB: Peptidylprolyl Isomerase B (Cyclophilin B)

PRDM2: PR Domain Containing 2, With ZNF Domain

PTC: Premature termination codon

RECK: Reversion-Inducing-Cysteine-Rich Protein With Kazal Motifs

(r)ER: (Ruw) endoplasmatisch reticulum

RUNX: Runt-Related Transcription Factor 2

RYK: Receptor-Like Tyrosine Kinase

SEC23B: Sec23 Homolog B, COPII Coat Complex Component

SERPINF1: Serpin Peptidase Inhibitor, Clade F, Member 1

SERPINH1: Serpin Peptidase Inhibitor, Clade H, Member 1

SIPA1L1: Signal-Induced Proliferation-Associated 1 Like 1

SMYD1: SET And MYND Domain Containing 1

SNP: Single nucleotide polymorfism

SP7: Sp7 Transcription Factor

splice: Splice site mutaties

stop: Nonsense mutatie

TAPT1: Transmembrane anterior posterior transformation 1

TAS2R45: Taste Receptor, Type 2, Member 45

TBX22: T-Box 22

TCF/LEF: T-cell factor/lymphoid enhancer factor

TGF: Transforming growth factor

TLD: Tolloid

TLL: Tolloid-like

TMEM38B: Transmembrane Protein 38B

TMPRSS11E: Transmembrane Protease, Serine 11E

TRAPPC12: Trafficking Protein Particle Complex 12

TRIC: Trimeric intracellular cation channel

TTN: Titin

UDP: Uridinedifosfaat

UPR: Unfolded Protein Reponse

VPS33B: Vacuolar Protein Sorting 33 Homolog B

VSVG-GFP: Vesicular Stomatitis Virus Glycoprotein with a Green Fluorescent Protein

WES: Whole Exome Sequencing

WGS: Whole Genome Sequencing

WNT1: Wingless-Type MMTV Integration Site Family, Member 1

ZNF595: Zinc Finger Protein 595

Inhoudstafel

1 Abstract 1

2 Inleiding 3

2.1 De extracellulaire matrix 3

2.2 Collageen 3

De Collageen Superfamilie 3

Classificatie en Nomenclatuur 4

Basisstructuur van type I collageen 5

Biosynthese van type I collageen 7

2.3 Osteogenesis imperfecta 14

Inleiding 14

Classificatie 14

Epidemiologie 17

Klinische diagnose 17

Differentiaal diagnose 18

Etiologie 18

Behandeling van OI 25

3 Methodologie 29

3.1 Overzicht patiënten 29

3.2 GenomiPhi DNA amplificatie 29

Uitvoering 30

3.3 Polymerase Chain Reaction (PCR) 30

Principe 30

Primers 31

Werkwijze 32

3.4 Labchip GX 33

Principe 33

Werkwijze 33

3.5 MiSeq Personal Sequencer 34

Principe 34

Werkwijze 34

3.6 Sanger sequencing 34

Principe 34

Werkwijze 36

Analyse 39

3.7 Exoom analyse 39

Variabelen 39

4 Resultaten 42

4.1 Screening patiënten 42

Resultatentabel 42

Bespreking resultaten 48

4.2 Exoomanalyse 50

Exoom 1: P11 51

Exoom 2: P12 61

Exoom 3: P13 65

5 Discussie 67

5.1 Screening gekende OI genen 67

5.2 Whole Exome Sequencing (WES) 68

Exoom 1 (P11) 68

Exoom 2 (P12) 69

Exoom 3 (P13) 70

Sterktes en zwaktes van Whole Exome Sequencing 71

Incidental Findings 71

5.3 Conclusie 73

6 Referenties 74

7 Bijlagen I

7.1 Gebruikte materialen I

Polymerase Chain Reaction (Bijlage 1) I

Sanger sequencing (Bijlage 2) II

7.2 Resultaten MiSeq III

OI panel 1 (Bijlage 3) III

OI panel 2 (Bijlage 4) IV

7.3 Sanger Sequencing Report VII

7.4 Ford – Variantclassificatie VIII

P1 – COL1A2 (Bijlage 5) VIII

P1 en P2 – CRTAP (Bijlage 6) IX

P1 – PLOD2 (Bijlage 7) X

P3, P6, P7 en P9 – TAPT1 – P1 (Bijlage 8) XI

P1, P3, P4, P7 en P9 – TAPT1 – P2 (Bijlage 9) XII

P4 – COL1A1 (Bijlage 10) XIII

P6 – COL1A1 (Bijlage 11) XIV

P7 – COL1A1 (Bijlage 12) XV

P5 – CREB3L1 (Bijlage 13) XVI

P6 – CREB3L1 (Bijlage 14) XVII

P7 – BMP1 (Bijlage 15) XVIII

P8 – PLS3 (Bijlage 16) XIX

P10 – BMP1 (Bijlage 17) XX

7.5 Exoomanalyse (Bijlage 18) XXI

1

1 Abstract

Inleiding: Osteogenesis imperfecta (OI) is een heterogene genetische aandoening waarbij

fragiliteit van het bot op de voorgrond staat. Secundair ziet men ook symptomen zoals scoliose,

toegenomen laxiteit in de gewrichten, blauwe sclerae en dentinogenesis imperfecta. Aan de

hand van klinische, radiologische en genetische bevindingen wordt de ziekte opgedeeld in

verschillende klassen. In 90% van de gevallen wordt OI autosomaal dominant overgeërfd en

wordt het veroorzaakt door mutaties in de genen COL1A1, COL1A2 en in zeldzame gevallen

IFITM5. COL1A1 en COL1A2 coderen voor het eiwit type I collageen, wat het

hoofdbestanddeel vormt van de extracellulaire botmatrix. IFITM5 speelt een rol in de initiële

fase van de mineralisatie.

In de overige 10% van de gevallen wordt osteogenesis imperfecta autosomaal recessief

overgeërfd en wordt het veroorzaakt door een grote verscheidenheid aan genen. Het merendeel

van deze genen speelt een rol in de collageenbiosynthesis. Ondanks de reeds uitgebreide lijst

aan gekende causale genen, werd voor enkele patiënten met de klinische diagnose van OI nog

geen causale mutatie geïdentificeerd. Het doel van deze thesis was dan ook om nieuwe,

potentieel causale genen op te sporen.

Methodologie: In het kader van deze thesis werden 10 patiënten met een klinische diagnose

van OI gescreend voor mutaties in de reeds gekende causale genen. Deze genen waren

opgenomen in OI panel 1 en 2, respectievelijk autosomaal dominant en autosomaal recessief

(met uitzondering van IFITM5 dat bij OI panel 2 hoort). De screening gebeurde door middel

van PCR, Next Generation Sequencing (MiSeq) en Sanger sequencing. Voor de analyse van

deze screening werd gebruik gemaakt van de software-programma’s Seqpilot en Alamut

Visual. Indien geen causale mutaties werden geïdentificeerd, werd overgegaan naar Whole

Exome Sequencing (WES) en analyse. In deze thesis werden 3 exomen geanalyseerd. Deze

waren niet afkomstig van de 10 door ons gescreende patiënten, maar van patiënten waarvoor

de OI screening en exoomsequencing reeds was uitgevoerd in het Centrum voor Medische

Genetica voor de aanvang van deze thesis.

Resultaten: Na de OI screening van de 10 patiënten werden bij deze patiënten door middel van

MiSeq 10 varianten gevonden in OI panel 1 en 30 varianten in OI panel 2. Van deze 40 varianten

waren er 28 vals positief of polymorfismen.

2

De overige 12 varianten werden bevestigd met Sanger sequencing. Aan 5 van deze varianten

werd een klasse 4 (likely pathogenic) toegekend, namelijk in P1, P4, P6, P7 en P8. In P1 ging

het om een mutatie in COL1A2, namelijk c.2314G>A (p.(Gly772Ser)), in P4, P6 en P7 om

mutaties in COL1A1 (respectievelijk c.484delC (p.(Gln162fs), c.370-2A>G (p.(Gly772Ser) en

c.1012G>A (p.(Gly338Ser). In P8 werd een mutatie in PLS3 vastgesteld, c.766C>T

(p.(Arg256*). Klasse 3 (uncertain significance) werd toegekend aan 2 varianten in P7 en P10.

In deze genen werden varianten gevonden in BMP1, respectievelijk c.1757G>A (p.(Arg586His)

en c.433+12A>G (p.(?)). Aan de overige 5 varianten werd een klasse 2 (likely benign)

toegekend. Het ging om varianten in P1, P2, P5 en P6. In P1 werden varianten in CRTAP

(c.558A>G, p.(=)) en PLOD2 (c.132A>G, p.(=)) gevonden. In P2 werd dezelfde variant

teruggevonden in CRTAP als in P1. In P5 en P6 werden varianten gevonden in CREB3L1,

c.288C>T (p.(=)) en c.651C>T (p.(=)) respectievelijk. De gevonden polymorfismen werden

tevens geklassificeerd, met uitzondering van de polymorfismen in CREB3L1 voor P7.

Na exoomanalyse werden RYK, AKT2, TRAPPC12, SEC23B, ACAN en PLEKHM2

geselecteerd als potentiële genen in Exoom 1. Uit Exoom 2 werden RYK, COG3, RAB1A, EYA1,

RECK, CRTAC1 en ADAMTS20 geselecteerd. Uit Exoom 3 werd enkel TAPT1 geselecteerd.

Discussie: Voor 5 van de 10 patiënten werd een causale variant gevonden na screening,

waarvan 4 patiënten een mutatie hadden in COL1A1/COL1A2 (P1, P4, P6, P7) en 1 patiënt een

mutatie in PLS3 (P8). De overige patiënten blijven genetisch onopgehelderd. Deze moeten

klinisch verder geëvalueerd worden. Indien de kliniek bij deze patiënten inderdaad sterk

suggestief is voor OI, kan men overgaan op Whole Exome Sequencing. De kandidaatgenen

voor OI die in deze thesis werden geselecteerd uit de exomen, zullen allereerst bevestigd

worden via Sanger sequencing. Hierna kan men overgaan naar segregatie-onderzoek binnen de

familie en uiteindelijk functionele studies zoals in vitro studies en zebravisstudies. Ondanks het

feit dat WES een krachtig hulpmiddel is, vermelden we ook de nadelen van deze techniek. Niet

alle varianten kunnen gedetecteerd worden met WES en de heterogeniteit van OI compliceert

de detectie van nieuwe causale genen. Ten slotte bespreken we de rapportering van incidental

findings, hetgeen een ethisch vraagstuk vormt.

3

2 Inleiding

2.1 De extracellulaire matrix

Bindweefsel bestaat in tegenstelling tot de andere weefsels vooral uit een extracellulaire matrix

en in mindere maten uit cellen. In de extracellulaire matrix van bindweefsel bevinden zich

meerdere proteïnen uit diverse proteïnefamilies. Deze proteïnen staan in voor de structurele

integriteit en verschillende fysiologische functies. (1)

De samenstelling en structuur van deze matrix verschilt van bindweefsel tot bindweefsel. De

expressie en synthese van structurele proteïnen en glycoproteïnen zijn namelijk

weefselspecifiek en dit resulteert in unieke functionele en biologische kenmerken. De cellen

aanwezig in de extracellulaire matrix zijn verantwoordelijk voor de synthese en het onderhoud

ervan, maar de extracellulaire matrix werkt op zijn beurt ook in op de cellen. Deze cel-matrix

interacties spelen een rol bij celmigratie en –aanhechting, celdifferentiatie en de regulatie van

genexpressie. Bovendien heeft de extracellulaire matrix ook invloed op de morfogenese en het

celmetabolisme. (1,2)

De belangrijkste proteïne in de extracellulaire matrix is het fibreuze proteïne collageen.

Collageen is vooral te vinden in de vervormbare weefsels zoals de huid, pezen en het hart, maar

is ook abundant aanwezig in botten, kraakbeen en tanden. (3)

2.2 Collageen

De Collageen Superfamilie

Tot op heden zijn reeds minstens 28 verschillende types collageen beschreven. Zij werden

opgelijst naar chronologische volgorde van ontdekking. (4) Indien de collagen-like peptiden in

rekening worden genomen, komt dit aantal al snel op 50 verschillende macromoleculen. Samen

worden zij ook wel de collageen superfamilie genoemd. (5)

4

Classificatie en Nomenclatuur

2.2.2.1 Nomenclatuur

Een collageen eiwit kan homotrimerisch1 of heterotrimerisch2 zijn, naargelang de samenstelling

van de triple helix. Een unieke naamgeving geeft de samenstelling van een collageen weer.

Type I collageen, waarvan de trimeer bestaat uit twee α1-ketens (α1(I)) en één α2-keten (α2(I)),

zal neergeschreven worden als [α1(I)]nα2(I). Hierbij slaat het Romeinse cijfer op het

betreffende collageen type, en n op het nummer van de α keten. (5)

2.2.2.2 Classificatie

Alle collagenen zijn trimeren bestaande uit drie α-ketens die een karakteristieke triple

helixstructuur vormen (zie 2.1.3.1). Onderling kunnen de collagenen wel aanzienlijk

verschillen in grootte, functie en distributie over de verschillende weefsels. (6,7)

Collagenen worden onderverdeeld in subfamilies op basis van de suprastructurele organisatie

die zij aannemen. Deze is afhankelijk van de organisatie van de helix domeinen in de

verschillende types. Daarnaast dragen ook andere niet-collageneuze domeinen bij tot de

functionele heterogeniciteit van de collageen familie. Type IV collageen heeft bijvoorbeeld een

soepelere helix waardoor deze meer geschikt wordt voor het verstevigen van basale

membranen. Type I collageen heeft echter een ononderbroken en lang helix domein waardoor

zij veel steviger zijn en zullen instaan voor bijvoorbeeld de botstevigheid. (7)

Er is ook een groep collagenen waarbij er onderbrekingen bestaan in de sequentie van het helix-

domein, Fibril-Associated Collagens with Interrupted Triple helices (FACIT-Collagenen)

genaamd. (4)

1 Homotrimerisch: De collageen-trimeer bestaat uit drie identieke α ketens

2 Heterotrimerisch: De collageen-trimeer bestaat uit een samenstelling van verschillende α ketens

5

Classificatie Collageen types Supramoleculaire structuur Fibril-vormende collagenen I, II, III Gestreepte fibrillen

V, XI Gestreepte fibrillen, behouden N-

terminale regulatorische domeinen

XXIV, XXVII Onbekend

FACIT collagenen IX, XII, XIV Geassocieerd met fibrillen, andere

interracties

FACIT-like collagenen XVI, XIX, XXI, XXII Interfaciale regios, basale membraan

zones

Netwerk-vormende collagenen

Basale membranen IV Kippengaas netwerk met laterale

associatie

Gekraald filament vormend VI Gekraalde filamenten, netwerken

Ankerende fibrillen VII Lateraal geassocieerde anti-parallele

dimeren

Hexagonale netwerken VIII, X Hexagonale roosters

Transmembraan collagenen XIII, XVII, XXIII, XXV Transmembraneus met oplosbare

ectodomeinen Gliomedines, ectodysplasine

Multiplexine collagenen XXVI, XXVIII Basale membranen, gekliefde C-

terminale domeinen beinvloeden

angiogenese

Andere moleculen met

collageen-domeinen

Acetylcholinesterase,

adiponectine, Clq, collectines,

surfactant, anderen

Collageen domeinen in non-

collageen moleculen

Figuur. 1: Classificatie van de tot nu toe gekende collageenmoleculen.

In het kader van OI zijn de fibrilvormende collagenen de belangrijkste subfamilie. De centrale

ononderbroken triple helix regio is bij hen de grootste component van het eiwit.

De manier waarop en verhouding waarmee de verschillende types collageen samen voorkomen

en in interactie gaan met de andere macromoleculen van de ECM, bepaalt de hogere structuur

en dus de functie van het weefsel waarin deze co-polymerisatie zich voordoet. (4)

2.2.2.3 Fibrilvormende collagenen

Deze subfamilie omvat de collageen types I, II, III, V, XI, XXIV en XXVII. Zij maken 90% uit

van het totale collageen. Hun torsiestabiliteit en treksterkte zorgen voor integriteit en stabiliteit

in weefsels zoals bot (type I en V collageen) en gewrichtskraakbeen (type II en XI collageen).

(2) Type I collageen komt het vaakst voor in bindweefsel en was het eerste collageen dat

ontrafeld werd. (8,9) De fibril-geassocieerde collagenen associëren met grote collageenfibrillen

en spelen waarschijnlijk een rol bij de regulatie van de diameter van de fibrillen.

Basisstructuur van type I collageen

De fundamentele structurele eenheid van collageen bestaat uit een lange (300 nm), dunne

(diameter van 1.5 nm) superhelix bestaande uit 2 pro-α1(I) en 1 pro-α-2(I) keten. Deze trimere

6

moleculen associëren tot polymeren van een hogere orde, fibrillen, die op hun beurt aggregeren

tot grote bundels, namelijk collageenvezels. (8,9)

Figuur 2. De moleculaire structuur van fibril vormende collagenen met de verschillende subdomeinen. De klievingsplaatsen

voor de N- en C-procollagenasen zijn aangeduid. Het gaat hier om een type I collageen.

2.2.3.1 Karakteristiek collageendomein

Ondanks de hoge structurele diversiteit binnen de collageenfamilie bezitten ze allemaal

eenzelfde supramoleculaire structuur: een rechtsdraaiende supercoil van 3 polypeptideketens

(‘triple helix’). (2,9) Elke van de drie ketens bevat een linksdraaiende helix met 18 aminozuren

per omwenteling. Dit karakteristieke collageen domein bevat verschillende herhalingen van het

Gly-X-Y tripeptide, het Gly-X-Y domein, waarin X meestal wordt ingevuld door een proline

en Y door 4-hydroxy-proline. Theoretisch kunnen deze plaatsen echter door eender welk

aminozuur worden bezet. (6) Op elke derde positie vindt men een glycine terug. De 3 ketens

draaien zich uiteindelijk rond een centrale axis tot de triple helix. Dit gebeurt zodanig dat alle

glycineresidu’s zich naar het centrum van de triple helix richten. Aangezien glycine het kleinste

aminozuur is, zorgt dit voor een nauw contact langs de centrale axis. De structuur van de triple

helix is sterk geconserveerd. Een normale triple helix is resistent tegen proteasen zoals pepsine,

trypsine en chymotrypsine en kan alleen afgebroken worden door specifieke collagenasen.

Onderbrekingen in de triple helix veroorzaken intramoleculaire flexibiliteit en laten specifieke

proteolytische splijting toe. Afhankelijk van het collageentype worden specifieke proline en

lysineresidu’s post-translationeel gemodificeerd door hydroxylatie. (2)

Deze modificaties zullen de ketens toelaten onderling waterstofbruggen te vormen die de helix

zullen stabiliseren. (6)

7

2.2.3.2 Flankerende niet-collageen domeinen

Hoewel het helix-domein het gebied is dat de collageenmoleculen hun unieke rol verleent,

hebben ook de flankerende non-helix domeinen een belangrijke functie. Het C-propeptide staat

in voor het initiëren van de helix vorming en de selectie van de nodige α-ketens (zie 2.1.4.3).

Het N-propeptide heeft een invloed op de uiteindelijke diameter van de primaire fibrillen

(zie 2.1.4.6). In tegenstelling tot de triple helix waarvan de structuur sterk geconserveerd is,

vindt men bij de niet-collagene domeinen meer structurele en functionele variabiliteit. (7)

Biosynthese van type I collageen

De biosynthese van fibrillaire collagenen werd reeds uitgebreid bestudeerd. Het proces is

complex en omvat meerdere intracellulaire en extracellulaire stappen, die allemaal bijdragen

tot de structurele en biomechanische eigenschappen van collageen. (10) De biosynthese van

collageen gaat van transcriptie van de betrokken genen tot de aggregatie van collageen

heterotrimeren in fibrillen. Elk type collageen wordt gecodeerd door een specifiek gen en deze

genen worden gevonden op een groot aantal verschillende chromosomen. Bij de synthese van

collageen type I coderen de genen COL1A1 en COL1A2, gelegen op chromosomen 17 en 7,

voor de propeptideketens pro-α-1(I) en pro-α-2(I) respectievelijk. (11)

8

Figuur 3. Overzicht van de collageen type I biosynthese. Collageen type I bestaat uit tweer α1-ketens en een α2-keten. Na

translatie worden de pro-α1- en pro-α2 ketens in het rER verwerkt. Vervolgens worden de drie ketens gealigneerd en het

vouwen van de triple helix gestart. Tijdens deze helixvorming worden post-translationele modificaties aangebracht. Een aantal

van de betrokken genen zijn weergegeven. Na transport naar het golgi-complex en exocytose via vesikels volgt klieving van

de N- en C-propeptiden van procollageen type I en wordt collageen type I gevormd. Vervolgens leid cross-linking van de

collageenmoleculen tot het vormen van fibrillen. Meerdere collageen type I fibrillen vormen collageen vezels. (12)

2.2.4.1 Transcriptie en Translatie

De selectie van genen en de mate van expressie van deze genen hangt vooral af van het type

cel. Daarnaast spelen ook groeifactoren en cytokines een rol. De Transforming growth factor-

beta (TGF-β) super familie en Insuline-like growth factor (ILGF) zullen bijvoorbeeld de

9

botvorming stimuleren. De meeste collageen genen bezitten een complex exon-intron patroon.

De messenger RNA’s (mRNA) van fibrillair collageen worden gecodeerd door meer dan 50

exonen, gaande van 54 tot 108 baseparen. Door meerdere transcriptie-initiatie plaatsen,

alternatieve splicing van exonen of een combinatie van beide kunnen binnen één cel meerdere

types mRNA gevonden worden. Naast splicing ondergaat het mRNA ook capping aan het 5’-

uiteinde en polydenylatie aan het 3’-uiteinde. (2) Deze pre-mRNA maturatie vindt plaats in de

nucleus en wordt mRNA processing genoemd. (9)

Dit matuur mRNA wordt naar het cytoplasma overgebracht waar het translatieproces zal starten

op de ribosomen van het ruw endoplasmatisch reticulum (rER). (7)

Het mRNA wordt door de ribosomen getranslateerd tot preprocollageenmoleculen. Deze

moleculen komen in het lumen van het rER terecht dankzij de herkenning van een

signaalpeptide. (2,9)

Initieel wordt een precursormolecule gevormd, procollageen genaamd. Procollageen bevat aan

zijn uiteinden C-en N-propeptiden. (2,13) Deze niet-helicale delen van procollageen maken de

molecule oplosbaar waardoor het zich vlot kan bewegen in de cel. (9)

2.2.4.2 Post-translationele modificatie

Na de synthese van de procollageen ketens op het ribosoom worden deze ketens geïmporteerd

in het endoplasmatisch reticulum. Hier zullen ze een reeks post-translationele modificaties

ondergaan. Deze stappen omvatten onder andere de modificatie van proline residu’s tot

hydroxyprolines, de modificatie van lysines tot hydroxylysines, N- en O-linked glycosylatie,

trimerisatie, zwavelbrugvorming, prolyl cis-trans isomerisatie en het vouwen van de triple

helix. Deze stappen gebeuren na het verwijderen van een signaalpeptide door specifieke

signaal-peptidasen. (14)

2.2.4.2.1 Hydroxylatie van proline

Hydroxylatie gebeurt voornamelijk op de prolines van de Y positie in het Gly-X-Y tripeptide

door het enzyme prolyl 4-hydroxylase, maar in mindere mate ook op de prolines op de X-positie

dankzij prolyl 3-hydroxylases. (10)

In de biosynthese heeft prolyl 4-hydroxylase een centrale rol. De 4-hydroxylproline residu’s

zijn immers essentieel voor de opvouwing van de collageen polypeptide ketens tot triple

helicale molecules (15) en voor het vormen van waterstofbruggen die bijdragen tot de

10

thermische stabiliteit van de triple helix. (7) De proly 4-hydroxylasen (P4H’s) zijn gelokaliseerd

in het lumen van het endoplasmatisch reticulum en katalyseren de vorming van 4-

hydroxyproline door de hydroxylatie van prolines in de Gly-X-Y sequenties van collageen en

meer dan 15 andere collagen–like proteïnen. Ongeveer ¼ van de aminozuren in de α-ketens van

fibrillair collageen zijn prolyl residu’s, waarvan ongeveer 50% een 4-hydroxylatie heeft

ondergaan. (7,16) Inhibitie van deze modificatie zal de triple helix formatie verhinderen en

leiden tot intracellulaire degradatie van de niet-opgevouwde ketens of vertraagde secretie van

het niet-functionele proteïne. (16)

Prolyl 4-hydroxylase is een tetrameer met een moleculair gewicht van 240 kDa en bestaat uit 2

α-units en 2 β-units met elk een gewicht van 64 kDa. Het behoort tot een groep van 2-

oxoglutaraat dioxygenases waartoe ook 2 andere enzymes van de collageen synthese behoren,

namelijk prolyl 3-hydroxylase en lysyl hydroxylases. Deze laatste twee enzymes bezitten dan

ook sterk gelijkaardige katalytische eigenschappen. (16)

Hoewel prolyl hydroxylatie op de Y-positie de norm is, komt ook hydroxylatie van prolines op

de X-positie voor. Dit is echter veel zeldzamer aangezien er per keten maar één zo’n residu

aanwezig is bij collageen type I. Toch heeft ook deze modificatie een belangrijke functie. (10)

Voor prolyl 3-hydroxylase-1 (P3H1), het enzyme dat verantwoordelijk is voor de katalysatie

van de conversie van proline naar 3-hydroxyproline in collageen type I, werd aangetoond dat

het een complex vormt met cartilage-associated protein (CRTAP) en cyclophlin B. Het P3H1

complex zou werkzaam zijn zowel als enzymcomplex en als een chaperone eiwit van de

collageen ketens en zou de premature aggregatie van collageen ketens voorkomen. (15)

2.2.4.2.2 Hydroxylatie van lysine

Ook lysine hydroxylatie is een essentiële post-translationele modificatie bij collageen. (10) Het

patroon en de omvang van deze modificatie beïnvloedt de fibrillogenese, de cross–linking en

de mineralisatie van de matrix. De covalente, intermoleculaire cross-linking is de laatste

modificatie in de biosynthese van collageen en is belangrijk voor de stabiliteit van collageen.

(17) Terzelfdertijd vormen deze residuen een ankerpunt voor het aanhechten van

carbohydraten. Drie vormen van lysyl hydroxylase zijn bekend: LH1, LH2 en LH3. Zij

bevinden zich allen in het endoplasmatisch reticulum. Deze enzymen zijn, net zoals prolyl 4-

hydroxylase en prolyl 3-hydroxylase, 2-oxoglutaraat dioxygenasen. Allen hebben zij het Fe2+

ion, 2-oxoglutaraat, O2 en ascorbaat (vitamine C) als cofactoren. (7,18)

11

De omvang van het aantal lysyl hydroxylaties hangt af van het weefsel. Alleen lysines op de Y

positie van het Gly-X-Y-triplet kunnen gehydroxyleerd worden. Voor LH2 werd aangetoond

dat deze specifiek in de telopeptide regio’s lysine hydroxyleert. Lysines en hydroxylysines in

de telopeptiden zijn substraten voor de enzymen die cross-linking initiëren, namelijk de lysine

oxidasen. De aard van de cross-linking wordt bepaald door de toestand van hydroxylatie van

de telopeptide lysines. (10,17)

2.2.4.2.3 Glycosylatie

O-linked glycosylatie van hydroxylysine is specifiek voor collageenproteïnen. Het gaat om de

covalente binding van galactose en glucose door Uridinedifosfaat (UDP)-carriers. Het enzyme

dat hiervoor verantwoordelijk is, was tot voor kort niet bekend. Recent onderzoek heeft

uitgewezen dat het om het multifunctionele enzym LH3 gaat, dat naast een lysyl hydroxylase

ook een galactosyltransferase en glucosyltransferase is.

LH3 is dus in staat om drie opeenvolgende reacties te katalyseren die nodig zijn voor de

vorming van galactosylhydroxylysine en glucosylgalactosyl-hydroxylysine. (10)

Glysosylatie zou een rol spelen bij collageenfibrillogenese, cross-linking, mineralisatie en

collageen-cel interacties. De helicale cross-linking residu’s α 1-87 zijn belangrijke glycosylatie

plaatsen in type I collageen. (16) Inactivatie van de gehele molecule is embryonaal lethaal. O-

linked glycosylatie is dus essentieel voor normale ontwikkeling. (10) Ondanks de kennis over

type I collageen glycosylatie zijn de precieze loci niet gekend. Deze informatie is belangrijk

om de rol van glycosylatie bij collageen biosynthese verder te begrijpen. (19)

2.2.4.2.4 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerisatie

De peptidebinding kan voorkomen in twee conformaties: cis of trans. Voor de meeste

aminozuren is de transconformatie energetisch gunstiger. Voor prolyl- en hydroxyprolyl-

bevattende peptidebindingen bestaat er door hun cyclische zijketens een minder groot

energetisch verschil tussen de twee conformaties. Daarom komen veel proline en

hydroxyprolines in de procollageen ketens voor in cisconformatie. (10) De snelle propagatie

van de triple helix vorming wordt echter verstoord door de aanwezigheid van deze cis-

peptidebinding. Deze peptidebindingen moeten geïsomeriseerd worden tot trans verbindingen

om de triple helix vorming verder te zetten. Deze stap wordt gekataliseerd door peptidylprolyl

cis-trans isomerasen (PPI) of immunophilines, waaronder de cyclophilines en FK506 binding

proteins. (20)

12

2.2.4.2.5 Zwavelbruggen

Protein disulphide isomerase (PDI) heeft als belangrijkste functie de katalysatie van de vorming

en herschikking van zwavelbruggen. PDI is betrokken bij de trimerisatie door de vorming van

intra- en intermoleculaire zwavelbruggen in de propeptide ketens. PDI bindt selectief aan niet-

opgevouwen ketens en is dus ook een chaperone eiwit. (10,21,22)

2.2.4.3 Chain Selection

De C-propeptiden spelen een cruciale rol in de correcte triple helix vorming. De stabiliteit van

de helix is gevoelig voor laterale shifts met één of meer Gly-X-Y repeats. Indien het docken

van de drie α-ketens zou berusten op de herkenning tussen de verschillende helix delen zouden

dergelijke shifts zeer courant gebeuren. Het onderling herkennen van helix domeinen is dan

ook weinig specifiek. (10)

Het C-propeptide treedt op als een trimerisatie-domein om deze shifts te voorkomen. De

aminozuursequenties in het C-propeptide domein zijn sterk geconserveerd behalve een sterk

variabele, discontinue sequentie van 15 aminozuren die de Chain Recognition Sequence (CRS)

wordt genoemd. Deze sequentie bevat de informatie die nodig is voor ketenherkenning. (10,23)

De globulaire structuur van het C-propeptide wordt gestabiliseerd door zwavelbruggen. (7,24)

De C-propeptiden van drie α-helixen verankeren zich d.m.v. zwavelbruggen en vormen op die

manier een zogenaamde zwavelknoop. Deze knoop treedt op als een permanente verbinding,

zelfs nadat de C-propeptiden worden gekliefd. De afgesplitste propeptiden worden uiteindelijk

door trypsine afgebroken. (25)

2.2.4.4 Helixvorming

Enzymen zoals PPI (peptidylprolyl cis-trans-isomerase) en collageen-specifieke chaperone-

eiwitten zoals Heat Shock Protein 47 (HSP47) zorgen ervoor dat de vorming en opvouwing van

de procollageen ketens vlot verloopt. (7) De meeste eiwitten zullen vouwen in een N-C richting,

waarbij het vouwen reeds cotranslationeel zal starten. Dit is niet het geval voor collageen, dat

in een C-N richting vouwt a.d.h.v. de eerder beschreven chain selection. (7,24)

2.2.4.5 Secretie, extracellulaire processing en modificatie

Na de vorming van procollageen worden de molecules verpakt in vesikels en getransporteerd

naar het Golgi network. (7,10) Proteïnen kunnen het endoplasmatisch reticulum (ER) enkel

verlaten indien deze op de correcte wijze zijn opgevouwen. Voor het transport van het ER naar

het Golgi apparaat zijn opeenvolgend zowel Coat Protein I (COPI) en Coat protein (COPII)

13

nodig. COPII staat in voor de export van eiwitten vanuit het ER, terwijl COPI daarentegen het

retrograde transport van resident eiwitten van het ER medieert. COPI zal ook transport van het

ER naar het Golgi apparaat bewerkstelligen. Proteïnen verplaatsen zich over het Golgi-apparaat

zonder ooit het lumen van de Golgi-cisternae te verlaten.

Na het verpakken van de eiwitten in secretoire vesikels in het Golgi-apparaat, worden zij

getransporteerd naar het plasmamembraan waar ze door de vesikels extracellulair worden

vrijgegeven. (24)

2.2.4.6 Fibrilogenese

De fibrilvorming die hierna plaatsvindt, wordt beïnvloed door de propeptiden van de

procollageenmoleculen. Een essentiële stap bij de fibrilvorming is dan ook de verwijdering van

de C-propeptiden en N-propeptiden door specifieke proteasen. C-proteinases zijn leden van de

familie van zink metalloproteïnasen (BMP-1, mTLD en TLL-1). N-proteïnasen zijn leden van

de ADAMTS familie (ADAMTS-2, ADAMTS-3 en ADAMTS-14). (7,2,24) Men gelooft dat

delen van het verwijderde C-propeptide en N-propeptide terugkeren in de cel om de

hoeveelheid collageen te reguleren (feedbackmechanisme). (9)

De functie van de N-propeptiden is nog niet volledig gekend en kan verschillen tussen de

verschillende collageen types, maar deze zou eventueel een rol kunnen spelen bij het reguleren

van de diameter van de fibrillen. (7,2)

Na processing van procollageen schikken de fibrilvormende collagenen zich spontaan in

geordende fibrillaire structuren. In deze ‘self-assembly’ zijn hydrofobische en elektrostatische

interacties tussen de collageenmonomeren betrokken. De oriëntatie van de fibrillen hangt af

van het weefseltype. De fibrilvorming wordt verder gestabiliseerd door covalente cross-linking.

Deze intermoleculaire cross-links zijn essentieel voor de fysieke en mechanische

eigenschappen van de collageen fibrillen en voor een stabiele netwerkvorming. (7,24)

14

2.3 Osteogenesis imperfecta

Inleiding

Osteogenesis imperfecta (OI) is een heterogene groep van ziektebeelden gekarakteriseerd door

gevoeligheid voor botbreuken met bewezen of veronderstelde defecten in de type I collageen

biosynthese. Naast fragiliteit van de beenderen ziet men secundair nog andere symptomen.

Scoliose, toegenomen laxiteit in de gewrichten, blauwe sclerae en dentinogenesis imperfecta

zijn hier enkele voorbeelden van. (16) De ernst van deze ziekte varieert en wordt naargelang

klinische, radiologische en genetische bevindingen onderverdeeld in verschillende types.

(2,11,26,27,3,28)

Classificatie

De huidige nomenclatuur en indeling van OI is nog steeds gebaseerd op het werk dat Prof.

David Sillence in 1979 verrichtte. De Sillence classificatie deelt de ziekte in volgens klinische

en radiologische bevindingen in 4 types. (2,11,3) Later breidde men deze classificatie verder

uit tot 8 types op basis van genetische verschillen. (2,3)

Het classificeren van OI volgens genetische verschillen heeft echter een weerslag op de

klinische praktijk. Met de oorspronkelijke classificatie volgens Sillence was het mogelijk op

basis van kliniek en radiologie de patiënten een plaats te geven in de classificatie. De uitbreiding

van de classificatie op basis van genetische verschillen had echter tot gevolg dat een genetische

screening noodzakelijk was om te beslissen tot welke groep de patiënt behoorde. Het klinische

beeld van de verschillende types was echter niet meer van elkaar te onderscheiden. (12) Een

voorstel werd gedaan om de classificatie te hervormen. (2,12,29)

De Nosology Group of the International Society of Skeletal Dysplasias besloot om de Sillence

classificatie als basis te gebruiken om de verdere ontdekkingen in op te lijsten. Vijf types van

OI werden weerhouden en de verschillende genen verantwoordelijk voor de aandoening werden

onderverdeeld bij het type aan de hand van het fenotype. (12,29,30)

Type 1 geeft een mild fenotype met afwezigheid van ernstige botafwijkingen, maar vaak met

vertebrale fracturen en milde scoliose. Het aantal breuken varieert van patiënt tot patiënt.

Andere symptomen bij OI type 1 zijn blauwe sclerae en vroegtijdige doofheid. Een verdere

onderverdeling in type IA en IB gebeurt op basis van het al dan niet voorkomen van

dentinogenesis imperfecta (niet aanwezig bij IA). (2,11,3,28,31)

15

Type 2 is lethaal door respiratoire insufficiëntie ten gevolge van meerdere ribfracturen (intra-

uterien) of door intracraniale bloedingen bij een vaginale geboorte. Prenataal ziet men het

buigen van de lange beenderen met meerdere breuken. (11,3,28,31) Type 2 wordt op basis van

radiologische bevindingen verder onderverdeeld in subklassen type IIA, IIB en IIC. (2,11)

Patiënten met type 3 overleven de neonatale periode, maar hebben een kleine gestalte en

graduele ledemaat- en ruggengraatafwijkingen door meerdere botbreuken. Dit kan ook leiden

tot de dood door respiratoire insufficiëntie, pneumonie, cor pulmonale of traumata. Deze

patiënten hebben blauwe sclerae, dentinogenesis imperfecta en scoliose. Radiologisch ziet men

‘popcorn epifysen’. (11,3,28,31)

Type 4 resulteert in milde tot matige buiging van de lange beenderen, osteoporose en milde

scoliose met eventueel een kleine gestalte tot gevolg. Het aantal breuken vermindert in de

puberteit. Dit type is vergelijkbaar met mild type 1 of type 3.

Het al dan niet hebben van blauwe sclerae en dentinogenesis imperfecta varieert van patiënt tot

patiënt. Het zijn vaak individuen die niet duidelijk in 1 van de vorige 3 categorieën passen.

(11,3,28,31)

Bij type 5 ziet men matige tot ernstige broze botten en calcificatie van het interosseus membraan

van de voorarm. Dit maakt pro- en supinatie van de voorarm moeilijk. Na een breuk of operatie

krijgt de patiënt ook vaak te maken met hyperplastische callusvorming. (2,26,3,31)

Aangezien de Sillence Classificatie nauw samenhangt met de klinische ernst van de ziekte, zal

men in de praktijk voornamelijk gebruik maken van deze classificatie. Een genetische

classificatie anderzijds kan nuttig zijn aangezien een verschillende genetische etiologie een

andere behandeling vereist. (31)

16

Table 1. A New OI Nomenclature Combined With Causative Genes (A) Phenotypes With Mild to Moderate

Severity, (B) Progressively Deforming and Perinatally Lethal Phenotypes

OI Syndrome

names

Type Gene MIM Locus Protein Product Inheritance

[A]

Non-deforming

OI with blue

sclerae

1 1. COL1A1

2. COL1A2

#166200

#166200

17q21.33

7q22.3

1. Collagen alpha-1(I) chain

2. Collagen alpha-2(I) chain

AD

AD

Common

variable OI with

normal sclerae

4 1. COL1A1

2. COL1A2

3. WNT1a

1. CRTAP

2. PPIB

3. SP7

1. PLS3

#16620

#166220

#615220

#610682

#259440

#613849

17q21.33

7q22.3

12q13.12

3p22.3

15q22.31

12q13.13

Xq23

1. Collagen alpha-1(I) chain

2. Collagen alpha-2(I) chain

3.Wingless-type MMTV

integration site family, member1

1. Cartilage-associated protein

2. Cyclophilin B (CyPB

3. Osterix

1. Plastin 3

AD

AD

AD

AR

AR

AR

XL

OI with

calcification in

interosseus

membranes

5 1. IFITM5 #610967 11p15.5 1. Interferon-induced

transmembrane protein 5

AD

[B]

Progressively

deforming

3 1. COL1A1

2. COL1A2

1. BMP1

2. CRTAP

3. FKBP10

4. LEPRE1

5. PLOD2

6. PPIB

7. SERPINF1

8. SERPINH1

9. TMEM38B

10. WNT1

11. CREB3L1

#259420

#259420

#614856

#610682

#610968

#610915

#609220

#259440

#613982

#613848

#615066

#615220

17q21.33

7q22.3

8p21.3

3p22.3

17q21.2

1p34.2

3q24

15q22.31

17p13.3

11q13.5

9q31.1

12q13.12

11q11

1. Collagen alpha-1(I) chain

2. Collagen alpha-2(I) chain

1. Bonemorphogeneticprotein

2. Cartilage-associated protein

3. Peptidyl prolyl cis-

transisomerase FKBP10

4. Prolyl 3-hydroxylase 1 (P3H1)

5. Procollagen-lysine, 2-

oxoglutarate 5-dioxygenase 2

6. Cyclophilin B (CyPB)

7. Pigment-epithelium-derived

factor (PEDF)

8. Heat shock protein 47 (HSP47)

9.Trimeric intracellular cation

channel B (TRIC-B)

10. Wingless-type MMTV

integration site family, member1

11. Old astrocyte, Specifically

induced substance (OASIS)

AD

AD

AR

AR

AR

AR

AR

AR

AR

AR

AR

AR

AR

Perinatally

lethal OI

2b 1. COL1A1

2. COL1A2

1. CRTAP

2. LEPRE1

3. PPIB

#166220

#166220

#610682

#610915

#259440

17q21.33

7q22.3

3p22.3

1p34.2

15q22.31

1. Collagen alpha-1(I) chain

2. Collagen alpha-2(I) chain

1. Cartilage-associated protein

2. Prolyl 3-hydroxylase 1 (P3H1)

3. Cyclophilin B (CyPB)

AD

AD

AR

AR

AR

a So far 12 families with AR OI due to WNT1 mutations have been described. Developmental delay was reported in

affected individuals from three families. It is uncertain whether this is part of the clinical phenotype resulting from

WNT1 mutations. (Fahaminiya et al. 2013; Pyott et al., 2013). A dominant WNT1 mutation appeared to cause early

onset osteoporosis. (Knaup et al., 2013; Laine et al., 2013) b In clinical practice subdivisions OI type II-A and OI type II-B are still in use. OI type II-A appears to be exclusively

caused by heterozygous mutations in the COL1A1/2 genes (van Dijk et al., 2010) c It has been reported that mutations in PLOD2 may also result in progressively deforming OI (Puig-Hervais et al.,

2012)

Figuur 4. De classificatie die tegenwoordig gebruikt wordt in de praktijk, is nog steeds sterk gebaseerd op de oorspronkelijke classificatie

van Sillence. (32)

17

Epidemiologie

De incidentie van OI wordt geschat op 6-7/100 000. (2,11) De prevalentie en incidentie van

types I-IV verschillen onderling. Voor type I zag men in Australië een prevalentie van 3-4 /100

000 en een incidentie van 3.5/100 000. Type II had een incidentie van 1-2/100 000. Wegens

het lethale karakter van type II zijn er geen prevalentiedata beschikbaar. Type III heeft een

prevalentie van 1-2/100 000 en een incidentie van 1.6/100 000. (11)

Van type IV werd lange tijd gedacht dat het om een zeldzaam type ging, maar dit bleek niet het

geval. (11) Types I en IV zijn namelijk verantwoordelijk voor meer dan de helft van de gevallen

van OI. (11,27) De prevalentie van lethaal OI ligt rond de 5/100 000. (2) De prevalentie van

type V is <1/100 000. (33)

Klinische diagnose

De ernst van de kliniek van OI varieert van geen symptomen bij geboorte tot prenatale lethale

botvervormingen. Deze grote variatie maakt het soms moeilijk om een diagnose te stellen. OI

wordt dan wel ingedeeld in verschillende types aan de hand van klinische en radiologische

eigenschappen maar er wordt een continuüm in ernst gezien. (3) De diagnose van OI kan zowel

prenataal als postnataal gebeuren.

2.3.4.1 Prenatale diagnose van OI

OI type II en III kunnen prenataal gediagnosticeerd worden dankzij echografie aangezien men

bij deze types prenatale breuken kan vaststellen. Bij type II ziet men reeds op 14 weken een

verminderde echogeniciteit van de foetale beenderen, gevolgd door meerdere breuken. Type III

is te zien op 18 weken en type IV na 20 weken. Voor type I, IV en V is prenatale echografische

diagnose onbetrouwbaar. (3,12)

2.3.4.2 Postnatale diagnose van OI

Postnatale diagnose kan gesteld worden aan de hand van tekenen en symptomen. Typische

extraskeletale afwijkingen zijn blauwe sclerae, dentinogenesis imperfecta, hyperlaxiteit van de

ligamenten en huid, gehoorverlies en de aanwezigheid van naadbeenderen. Blauwe sclerae zijn

echter ook te zien bij gezonde zuigelingen. (3,12)

Dentinogenesis imperfecta geeft de tanden van deze patiënten een gelig of doorschijnend

blauw-grijs aspect. Vaak zullen deze tanden prematuur uitvallen of zelfs breken.

18

Zij blijken een korte wortel te hebben en een abnormaal dentine kan worden aangetoond. (32)

Gehoorverlies is zeldzaam in de eerste 2 levensdecaden. (11)

De diagnose van OI is eenvoudig bij individuen met een familiale geschiedenis voor deze ziekte

of wanneer typische tekenen aanwezig zijn, maar de diagnose kan moeilijk zijn bij een atypisch

beeld zonder familieleden met dezelfde ziekte. Een bijkomende moeilijkheid in deze situatie is

dat er geen akkoord bestaat over het minimale aantal criteria voor de diagnose van OI. (3)

Differentiaal diagnose

Verschillende skeletaandoeningen kunnen verward worden met OI. Enkele van deze

aandoeningen zijn: Bruck syndroom, idiopathische autosomaal recessieve hyperfosfatemie,

hypofosfatemie, Cole-Carpenter syndroom, idiopathisch juveniele osteoporose,

kindermishandeling, Hajdu-Cheney syndroom of geïsoleerde dentinogenesis imperfecta (11,3)

Etiologie

Hoewel men voornamelijk gebruik maakt van de klinische classificatie (types I-V) van OI, kan

OI ook onderverdeeld worden in klassen volgens genetische verschillen. Voor de diagnose van

OI zal men beroep doen op een DNA analyse van COL1A1/2. Het DNA is hierbij afkomstig

van de huidfibroblasten of uit de witte bloedcellen. Met deze techniek kan men 90% van alle

type I collageen mutaties detecteren. Vervolgens worden ook recessieve genen gelinkt aan OI

onderzocht.(3)

2.3.6.1 Autosomaal dominante OI types (OI panel 1)

2.3.6.1.1 OI Types I-IV (COL1A1/COL1A2)

De dominante OI types I-IV worden veroorzaakt door mutaties in COL1A1 of COL1A2. Er

werden reeds meer dan 1000 varianten in deze genen gevonden. Het type van de mutatie en de

locatie beïnvloeden het fenotype. (3) Deze mutaties kunnen worden onderverdeeld in 2

categorieën: excluderende en includerende mutaties. Excluderende mutaties resulteren in de

exclusie van het product van het gemuteerde allel (nul allel). Slechts de helft van de normale

hoeveelheid type I collageen wordt geproduceerd.

Bij includerende mutaties wordt de abnormale keten mee geïncorporeerd in de heterotrimeer.

Moleculen die ketens bevatten met een mutatie in de triple helix zijn minder stabiel.

19

Type I wordt gekarakteriseerd door een reductie van 50% in type I collageen. Dit gebeurt

meestal door mutaties in één COL1A1 allel die leiden tot mRNA instabiliteit en

haploinsufficiëntie. (11) De mutaties in COL1A1 veroorzaken een prematuur terminatie codon

(PTC) dat nonsense-mediated decay (NMD) van het mRNA van de mutante transcripten

activeert. De meeste transcripten van het gemuteerde COL1A1 worden hierbij afgebroken zodat

slechts de helft van de normale hoeveelheid collageen wordt geproduceerd. (26)

Types II-IV resulteren in de verstrengeling van normaal en gemuteerd type I collageen door

substituties van glycine. Deze mutaties veranderen de structuur van type I collageen. Glycine

substituties in zowel de pro-α-1(I) als de pro-α-2(I)-keten leiden tot een vertraagde opvouwing

van de helix wat post-translationele overmodificatie met zich meebrengt. Het fenotype varieert

tussen mild en lethaal. In een pro-α-1(I)-keten vinden we lethale glycinesubstituties vooral terug

in de major ligand-binding regions (MLBR2 en MLBR3) wat wijst op het belang van interacties

tussen collageen en niet-collagene proteïnen. In de pro-α-2(I)-keten vinden we deze vooral in

proteoglycan binding sites regions. (26)

Een minder voorkomende mutatie die leidt tot OI is die in het domein coderend voor het

carboxyl-terminale propeptide. De meeste van deze mutaties resulteren in een includerende

mutatie en leiden tot een vertraagde opvouwing van de helix met post-translationele

overmodificatie. (11) Er bestaat een zekere homologie in de sequenties van procollageen

(tussen de verschillende types) maar de ketens moeten in een procollageen-specifieke manier

samenkomen. Het vermogen om de verschillende ketens te onderscheiden zit vervat in de

primaire sequentie van het C-propeptide, de chain recognition sequence (CRS) (zie 2.1.4.3).

Het C-propeptide moet correct opgevouwen zijn zodat CRS bloot komt te liggen. Het C-

propeptide bezit ook enkele sterk geconserveerde cysteïneresidu’s. Cys1268 en Cys1285 zijn

de enige cysteïnes die een rol spelen bij zwavelbruggen tussen de verschillende ketens..

Substitutie van deze cysteïneresidu’s resulteert dus in een verstoorde assemblage. Slecht 5%

van de pathologische varianten bij OI bevinden zich in het C-propeptide domein. (34) Mutaties

in het N-terminale propeptide leiden tot Ehler Danlos syndroom. (35)

2.3.6.1.2 OI type V (IFITM5)

Type V gaat gepaard met een mutatie in het gen voor interferon-induced transmembrane protein

5 (IFITM5). IFITM5 behoort tot de interferon-induced transmembrane protein family. Deze

eiwitten worden geïnduceerd door interferon en nemen deel aan een beschermend mechanisme

tegen virale infecties. IFITM5 daarentegen neemt niet deel aan dit mechanisme.

20

IFITM5 codeert voor secretoire en membraaneiwitten in osteoblasten en wordt geactiveerd

tijdens de initiële fase van de mineralisatie. Het OI type V is niet gelinkt aan loss of function

of haploinsufficiëntie van IFITM5. Klinisch ziet men een ernstigere vorm van OI met een kort

gestalte, het buigen van de lange beenderen, buigen van de extremiteiten, vertebrale compressie,

scoliose, blauwe sclerae en dentinogenesis imperfecta. (36)

2.3.6.2 Autosomaal recessief OI

Ongeveer 10% van alle gevallen van OI worden veroorzaakt door recessieve, causatieve

varianten in één van de reeds gekende genen of door varianten in nog niet ontdekte genen voor

OI. Deze genen coderen meestal voor proteïnen die een rol spelen in de biosynthese van type I

collageen.

2.3.6.2.1 OI Type VI (SERPINF1)

Verschillende onderzoeken suggereerden dat OI type VI veroorzaakt wordt door loss of

function mutaties in SERPINF1, het gen dat codeert voor Pigment Epithelium Derived Factor

(PEDF). (37) De mutaties in SERPINF1 bij OI gaven aanleiding tot een PTC (premature

translation-termination codons) met NMD (nonsense-mediated mRNA decay) van de

transcripten als gevolg. (11,26)

In het bot zorgt PEDF voor een upregulatie van osteoprotegerin, hetgeen de osteoclasten

maturatie inhibeert. Mutaties in SERPINF1 resulteren in lagere osteoprotegerin levels en in een

stijging van het aantal osteoclasten, met een verhoogde botresorptie tot gevolg.

OI type VI omvat ongeveer 4 % van alle gevallen. Patiënten met de diagnose van OI type VI

lijken gezond bij de geboorte en hebben geen breuken voor de leeftijd van 6 maanden. Het

histologische kenmerk dat OI type VI onderscheidt van andere vormen van OI is de grote

hoeveelheid van niet-gemineraliseerd osteoid en wazige tetracycline labels, die doen denken

aan osteomalacie. Dit gaat samen met de desorganisatie van de botmatrix waarbij het lamellair

patroon vervangen is door een visschaalpatroon. Patiënten met OI type VI lijken niet te

reageren op bisfosfaten zoals patiënten met een klassiek type I collageen defect.

Zowel de klinische als de histologische bevindingen van OI type VI suggereren dus een ander

uniek mechanisme. (37)

21

2.3.6.2.2 OI types VII, VIII en IX (CRTAP, LEPRE1 en PPIB)

CRTAP codeert voor het cartilage-associated protein, LEPRE1 voor prolyl 3-hydroxylase

(P3H1) en PPIB voor cyclophilin B (CyPB). Samen vormen deze 3 proteïnen een

endoplasmatische reticulum-resident complex (in een 1:1:1 ratio) dat instaat voor de 3-

hydroxylatie van proline 986 van collageen α1(I) en α1(II) en proline 707 in α2(I). (11,26)

Prolyl 3-hydroxylatie is één van de verschillende modificaties van de pro-α-ketens die bijdragen

tot een goede opvouwing, stabiliteit en secretie van het procollageen. CRTAP en LEPRE1

mutaties zijn geassocieerd met posttranslationele overmodificatie van de ketens van type I

collageen. Bij recessieve vormen van OI worden alle moleculen overgemodificeerd, terwijl dit

bij dominante vormen slechts bij de ½ of ¾ van de molecule het geval is. Toch kan het moeilijk

zijn om een onderscheid te maken tussen overmodificatie door structurele mutaties van de type

I collageen gene of door mutaties in het prolyl 3-hydroxylatie complex. (38)

CyPB is een eiwit dat gecodeerd wordt door het PPIB gen en het behoort tot de familie van de

cyclophilines (Cyps). De Cyps zijn een familie van peptidylprolyl cis-trans isomerasen

(PPIases) die instaan voor de cis-trans isomerisatie van peptide bindingen. Vroegere studies

hebben aangetoond dat CyPB direct interageert met procollageen, wat nodig is aangezien

procollageen veel cis-conformers bevat. Enkel trans-peptidebindingen kunnen echter

geïncorporeerd worden in de triple helix van collageen (zie 2.1.4.2.4). CyPB speelt ook een rol

als moleculaire chaperonne in het procollageen export en de secretie samen met HSP47. (39)

Meeste varianten in CRTAP, LEPRE1 en PPIB veroorzaken autosomaal recessieve lethale of

ernstige OI van het type IIB en type III. Als de variant zich in een startcodon bevindt, ziet met

een milder type. (11,26)

2.3.6.2.3 OI types X (SERPINH1)

Mutaties in het gen SERPINH1, dat codeert voor HSP47, geven aanleiding tot het klinische

type III van OI. Mutaties in SERPINH1 beïnvloeden de post-translationele modificatie van type

I procollageen niet. Het lijkt de transit van type I procollageen van het ER naar het Golgi-

apparaat te versnellen, maar de gehele transittijd van intracellulair naar extracellulair te

verlengen. De totale snelheid van type I procollageen productie lijkt echter wel normaal. Men

zag dat de triple helix van het gesecreteerde type I collageen gevoelig bleek voor proteasen op

bepaalde plaatsen. Veranderingen in de triple helix structuur kunnen de fibril assemblage

beïnvloeden en leiden tot een onregelmatige mineralisatie.

22

Bij mutaties van het SERPINH1-gen accumuleert protype I collageen als aggregaten in het ER

en de secretie is vertraagd. Bij muisstudies bleek ook de afsplitsing van de pro-α-1(I) N-

propeptide deficiënt in SERPINH1-/- fibroblasten. De producten van deze genen zullen

waarschijnlijk op een later stadium in de biosynthese met type I procollageen ketens

interageren. (40)

2.3.6.2.4 OI type XI (FKBP10)

Het FKBP10 gen codeert voor een chaperonne eiwit FKBP65 dat betrokken is bij de opvouwing

van protype I collageen. Mutaties in dit gen beïnvloeden de protype I collageen secretie.

Klinisch ziet men een fenotype met matig ernstige vorm van OI met recurrente fracturen van

de lange beenderen, beginnend in de kindertijd, waardoor een rolstoel eventueel kan nodig zijn.

Andere klinische kenmerken zijn progressieve kyfoscoliose, ernstige osteopenie, laxiteit van de

ligamenten, grijze sclerae, normaal gehoor en normale tanden. Het OI fenotype is milder dan

bij mutaties in de genen van het prolyl-3-hydroxylatie complex (CRTAP, LEPRE1 en PPIB)

alsook milder dan OI type 3 veroorzaakt door autosomaal dominante COL1A1/COL1A2

mutaties. Histologische kenmerken waren onder andere een vervormde lamellaire structuur en

een visschaalpatroon samen met verhoogd alkaline fosfatase in het serum. (41)

2.3.6.2.5 OI type XII (SP7)

SP7/OSX codeert voor een osteoblast-specifieke transcriptie factor, die essentieel is voor de

botvorming en osteoblastdifferentiatie. OSX speelt een belangrijke rol in de regulatie van de

differentatie van preosteoblasten naar osteoblasten, downstream van RUNX2, een andere

transcriptiefactor die belangrijk is bij osteoblastdifferentiatie. SP7/OSX komt specifiek in

corticale en trabeculaire osteoblasten tot expressie en in mindere mate ook in de

prehypertrofische chondrocyten in de groeischijf. De klinische aspecten van patiënten met een

mutatie in SP7 zijn recurrente breuken, milde botmisvormingen, vertraagde tanderuptie,

normaal gehoor en witte sclerae. (42)

2.3.6.2.6 OI type XIII (BMP1)

BMP1 codeert voor een gekend protease dat het C-propeptide van type I collageen afsplitst.

Hoewel andere bone morphogenetic proteins (BMP) tot de TGF-beta superfamilie behoren,

codeert dit gen voor een eiwit dat niet nauw samenhangt met andere gekende groeifactoren.

23

Processing van het C-propeptide van protype I collageen wordt uitgevoerd door de familie van

bone morphogenetic protein 1/Tolloid (BMP1/TLD-like) proteïnasen. Hoewel alle leden van

deze familie instaan voor processing van het C-propeptide, is BMP1 hierin het efficiëntst. Een

mutatie in bone morphogenetic protein 1 (BMP1) kan aanleiding geven tot een ernstige vorm

van recessieve OI. Klinisch ziet men een breed voorhoofd, een driehoekig gezicht, prominente

oren zonder gehoorsverlies, recurrente fracturen, buigen van de extremiteiten, hypermobiliteit

van de gewrichten, ernstige afwijkingen van de lange beenderen en een te grote uitrekbaarheid

van de ellebogen, polsen en interphalangeale gewrichten. Er is geen dentinogenesis imperfecta

aanwezig. (26,43)

2.3.6.2.7 OI type XIV (TMEM38B)

TMEM38B codeert voor Trimeric Intracellular Cation Channel B (TRIC-B), een component

van TRIC. TRIC is een monovalent cation-specifiek Ca2+ kanaal dat belangrijk is bij

celdifferentiatie. Het belang van intracellulair Ca2+ bij proliferatie, celdifferentiatie en cellulaire

functie werd reeds meerdere malen bevestigd. Mutaties in TMEM38B kunnen dus leiden tot een

verstoring van de intracellulaire Ca2+ signaling pathways in botcellen. Klinisch ziet men OI

type IV: botfragiliteit, osteoporose, gebogen ledematen, meedere breuken die kunnen leiden tot

pseudo-artrose en wormiaanse botten. Breuken doen zich voor prenataal en in de kindertijd en

verminderen in de puberteit. Ook worden soms blauw-grijze sclerae gezien. (44)

2.3.6.2.8 OI type XV (WNT1)

WNT1 is een gesecreteerd signaaleiwit dat interageert met twee transmembranaire

receptoreiwitten, namelijk Frizzled receptor (FZD) en Low-density lipoprotein receptor-related

protein 5 (LRP5). WNT1 kan dankzij deze interactie de canonical WNT pathway reguleren door

middel van de fosforylatie van β-catenine. Β-catenine kan hierdoor interageren met de

transcriptiefactor T-cell factor/lymphoid enhancer factor (TCF/LEF) in de nucleus. Op die

manier wordt doelgerichte genexpressie gemoduleerd. SP7 en ALPL (dit gen codeert voor een

alkaline fosfatase dat een belangrijke rol speelt bij botmineralisatie) zijn onder andere

downstream targets van WNT-signaling pathway. WNT-signaling is noodzakelijk in osteocyten

om normale bothomeostase te verkrijgen. Bovendien speelt het ook een rol in

osteoblastdifferentiatie en -proliferatie. Homozygote mutaties gaven aanleiding tot een ernstig

fenotype, OI type III. (45) Een heterzygote mutatie in WNT1, hetgeen autosomaal dominant

wordt overgeërfd, gaf echter geen aanleiding tot OI, maar tot early-onset osteoporose. (46)

24

2.3.6.2.9 CREB3L1

Om celschade te voorkomen verwijderen eukaryote cellen ongevouwen eiwitten uit het ER. Dit

systeem wordt de ‘Unfolded Protein Reponse’ (UPR) genoemd. De aanwezigheid van

ongevouwen of verkeerd gevouwen eiwitten wordt opgemerkt door UPR transducers. Zij

transducen dan deze signalen naar de nucleus voor de transcriptie van UPR-target genen, de

attenuatie van globale proteine translatie, en ER-geassocieerde degradatie. (47)

CREB3L1 codeert voor het eiwit OASIS, een transcriptiefactor betrokken bij de UPR. OASIS

is structureel sterk gelijkend op een van de UPR transducers: activating transcription factor 6

(ATF6). OASIS treedt dus op als een weefselspecifieke ER-stress transducer. (47,48)

Indien geen ER-stress aanwezig is, is OASIS ingebed in de ER membranen. Hierbij is het N-

terminale deel cytoplasmatisch gelocaliseerd. Als antwoord op ER-stress wordt OASIS naar

het Golgi getransloceerd waar het gekliefd wordt door resident proteases S1P/MBTPS1 and

S2P/MBTPS2. Het vrijgekomen N-terminaal cytosolische domein gaat dan naar de nucleus,

waar het de transcriptie van COL1A1 zal opreguleren en de secretie van botmatrixproteinen zal

stimuleren. (48,49) Het bindt direct met UPRE (unfolded protein response element) (UPRE-

like sequence) in de osteoblast specifieke COL1A1 promotor regio. Het reguleert geen COL1A1

in andere weefsels zoals bv de huid. (48)

OASIS-/- muizen werden geboren met ernstige osteopenie en spontane fracturen, wat sterk

aanleunt bij menselijke OI. (47,48)

2.3.6.2.10 PLS3

PLS3 (Plastin 3) codeert voor een eiwit dat betrokken is bij de vorming van filamenteuze actine

bundels. Dit eiwit is belangrijk voor de botgezondheid. PLS3 is X-gebonden. Men vond in 5

families een variant in dit gen die bij mannelijke patiënten (die hemizygoot zijn voor deze

variant) aanleiding gaf tot osteogenesis imperfecta type I. Bij oudere vrouwen die heterozygoot

waren voor deze variant zag men dat het risico op breuken tweemaal zo hoog was als bij

vrouwen die geen drager waren van deze variant. (50)

2.3.6.2.11 PLOD2

Hydroxylatie van lysine residuen is essentieel voor de stabiliteit van intermoleculaire cross-

linking in collageen, aangezien zij een bindingsplaats vormen voor carbohydraten. PLOD2

25

codeert voor lysine hydroxylase 2. Reeds 3 PLOD isozymes werden beschreven. Van deze 3

blijkt PLOD2 vooral tot expressie te komen in cellen met een osteoblastische activiteit. (51)

Lysine hydroxylase 2 bevindt zich op de cisternen van het rER, waar het de hydroxylatie zal

verzorgen met ijzerionen en ascorbaat (VitC) als cofactoren. (52)

Behandeling van OI

De huidige behandeling van OI is erop gericht de functionaliteit van de patiënt te maximaliseren

en de frequentie van het optreden van breuken te minimaliseren. Een multidisciplinaire aanpak

met o.a. een orthopedisch chirurg, een kinderarts, een fysiotherapeut en een maatschappelijk

werker is dan ook aangewezen. (53)

2.3.7.1 Farmacologische behandeling

2.3.7.1.1 Bisfosfaten

Orale en intraveneuze bisfosfaten kunnen worden gebruikt voor de meeste OI types (met

uitzondering van SERPINF1) (37), zowel bij kinderen als volwassenen.

Bisfosfaten verstoren de osteoclastvorming, de osteoclastoverleving en de cytoskeletale

dynamiek. (53) Verschillende studies wijzen op verbetering in botdensiteit en een daling van

de chronische botpijn. Het uiteindelijke doel van de behandeling met bisfosfaten is een daling

van het aantal breuken, het voorkomen van afwijkingen van de langere beenderen en

functioneel een verbetering te realiseren. Eventuele bijwerkingen van bisfosfaten zijn een

daling in het calciumserum en een griepreactie bij kinderen. Ook werd aanvankelijk gevreesd

dat het gebruik een mogelijk schadelijk effect op botgroei (longitudinaal) bij kinderen en

adolescenten met zich zou meebrengen, maar dit bleek niet het geval.(11,3,54,55) Andere

bijwerkingen zijn een snelle gewichtstoename, uveïtis en verstoring van botremodellering.

Over de langetermijneffecten van bisfosfaatgebruik is nog maar weinig bekend. (11,3,54)

2.3.7.1.2 Andere farmacologische interventies

Het gebruik van groeihormonen komt ook voor bij de behandeling van OI, zeker bij OI-

patiënten met een kleine gestalte. Toch brengt deze behandeling slechts bescheiden resultaten

met zich mee. Ook zijn de langetermijneffecten niet gekend. Volgens sommige studies zouden

groeihormonen een verhoogde bot turnover met zich meebrengen. (55,56)

26

Ook het parathyroïdhormoon werd overwogen voor de therapie bij OI. Dit resulteerde echter in

osteosacroom bij ratten. (11) Verder moet men bij deze patiënten de inname van Vitamine D

en calcium optimaliseren. (55)

2.3.7.2 Orthopedische behandeling

Intramedullaire staven (vooral bij OI type III en IV) kunnen worden ingebracht in het

beenmergkanaal om breuken te stabiliseren. Bij ernstige scoliose (type III en soms IV) kan men

chirurgie overwegen. Niet-chirurgisch interventies die bij OI kunnen gebruikt worden zijn

bracing en spalken. (11)

2.3.7.3 Fysiotherapie (rehabilitatie)

Een intensief rehabilitatie programma is vaak nodig, zeker bij types III en IV en in de kindertijd,

om de motoriek van de patiënt te verbeteren. (11)

2.3.7.4 Tandheelkundige behandeling

Patiënten met dentinogenesis imperfecta moeten opgevolgd worden door een ervaren tandarts.

Tandheelkundige ingrepen met een hoog risico op het afbreken van tanden moeten vermeden

worden. (55) Het plaatsen van kunstmatige kronen op de tanden van OI-patiënten kan

overwogen worden om infecties en faciale vervormingen te voorkomen. (11)

2.3.7.5 Behandeling voor gehoorverlies

Initieel stelt men bij OI conductief gehoorverlies vast, maar later wordt vaak ook een

neurosensorieel component gediagnosticeerd. OI-patiënten worden daarom best elke 3-5 jaar

audiologisch opgevolgd. In het begin biedt een hoorapparaat enige verbetering, later zal men

een stapedectomie moeten laten uitvoeren. Een cochleair apparaat zou ook eventueel beterschap

kunnen brengen, maar hiervoor bestaat nog onvoldoende bewijs. (11)

2.3.7.6 Toekomstbeeld van OI therapie

Hoewel de huidige behandeling de kwaliteit van leven van de patiënt sterk verbetert, kan OI

niet genezen worden. Het effect van de behandelingstechnieken zoals gentherapie,

beenmergtransplantatie en het gebruik van foetale mesenchymale stamcellen bij OI wordt dan

ook onderzocht (53)

27

2.3.7.6.1 Gentherapie

Gentherapie zou in de toekomst door silencing of vervanging van de causatieve variant een

oplossing kunnen bieden bij OI. (11,28) De meeste varianten bevinden zich in

COL1A1/COL1A2.

Bij de ernstigere types II-IV komen gemuteerde en normale ketens samen, bij het milde type I

is er een verminderde of geen expressie van het gemuteerde COL1A1 allel (haploinsufficiëntie).

Door gebruik van antisense-therapie zou men het allel kunnen silencen en overschakelen op

een milder type van OI. (11,28,55) Het probleem hierbij is het gebrek aan specificiteit voor het

gemuteerde allel. (11,28) Nieuwe technologie zoals het Crispr/Cas9 systeem zou in de toekomst

een volgende stap kunnen zijn in DNA correctie bij OI patiënten. (57) Het Crispr/Cas9 systeem

is afkomstig van bacteriën waar het een rol speelt in de verworven immuniteit tegen virussen

en plasmiden. Het eiwit Cas9 is een endonuclease dat door middel van een guide RNA streng

dat bindt met bepaalde target DNA sequenties site specifieke breuken kan tewerkstelligen in

het dubbelstrengig DNA. Dit mechanisme maakt het mogelijk om het genoom op een efficiënte

en precieze manier te modificiëren. (58)

2.3.7.6.2 Beenmergtransplantatie

Mesenchymale cellen van het beenmerg kunnen differentiëren in verschillende celtypes in

weefsels zoals bot, kraakbeen, spierweefsel en vetweefsel. Een beenmergtransplantatie zou dus

een oplossing kunnen bieden bij aandoeningen waarbij cellen betrokken zijn die voortkomen

uit de mesenchymale cellen. Dit is het geval bij OI. Bij kinderen met OI na een

beenmergtransplantatie zag men een toename in de groei en een verbetering van de botdensiteit.

De langetermijneffecten zijn echter niet gekend. (59)

2.3.7.6.3 Pre- en postnatale transplantatie van foetale mesenchymale stamcellen

Transplantatie van mesenchymale stamcellen kan potentieel de skeletale schade bij OI

verbeteren. Mesenchymale stamcellen (MSC’s) zijn multipotente cellen die kunnen

differentiëren in osteoblasten, chondrocyten en adipocyten en hebben een laag immunogeen

profiel. Daarom worden ze meestal niet afgestoten. In een muismodel zag men dat MSC’s

bijdroegen tot de progenitorpool, hetgeen verbetering van de collageeninhoud en verbetering

van de mineralisatie met zich meebracht. In een klinische studie bij kinderen met OI type III

gaf infusie met allogene MSC’s een verbetering van de mineralisatie en een verhoogde

28

groeisnelheid. Aangezien schade bij ernstige vormen van OI reeds prenataal zich voordoet, valt

er veel te zeggen voor prenatale MSC transplantatie, alvorens er zich bijkomend schade kan

ontwikkelen. Ook ziet men prenataal een hogere succesrate voor de innesteling van de graft,

meer tolerantie voor de donorcellen, een beter systemische distributie dankzij rechts-links

shunting en hogere proportionele celdosissen door de kleine omvang van de foetus. (60)

29

3 Methodologie

Aan de start van ons onderzoek werd ons het genetisch materiaal van tien patiënten aangeboden

waarbij de diagnose van OI klinisch was gesteld. Het startmateriaal is genomische DNA

(gDNA) geëxtraheerd uit EDTA bloed (na extractie uit leukocyten). Via onder andere PCR,

Next Generation Sequencing en Sanger sequencing werd gezocht naar de causale mutatie

verantwoordelijk voor het fenotype bij deze patiënten.

3.1 Overzicht patiënten

Patiënt Concentratie (ng/µl)

P1 398

P2 1282

P3 329

P4 178

P5 550

P6 275

P7 104

P8 117

P9 161

P10 203

3.2 GenomiPhi DNA amplificatie

Aangezien van elke patiënt slechts een beperkte hoeveelheid genetisch materiaal voor handen

was, werd eerst een amplificatie van al het genetisch materiaal gedaan. Dit gebeurde a.d.h.v.

een GenomiPhi™ DNA Amplification Kit. Deze methode maakt gebruik van de unieke

biochemische eigenschappen van Phi29 DNA polymerase om lineair genomisch (g) DNA te

amplificeren. Het geamplificeerde gDNA is representatief voor het originele staal, vertoont zeer

weinig amplificatie bias en bewaart SNP informatie.

Deze kit wordt bewaard op -70°C. De kit bevat volgende componenten:

Sample buffer: 1 x 0.9 ml.

Reactiebuffer: 1 x 0.9 ml.

Enzyme-mix: 1 x 100 μl.

30

Uitvoering

Vul epjes met

- 9µl Sample Buffer

- 1µl Template gDNA

Plaats de epjes vervolgens in de Thermal Cycler :

95°C – 3’

15°C – ∞

Voeg volgende zaken toe aan de epjes :

- 9µl Reactiebuffer

- 1µl Enzyme-mix

Plaats nu de epjes opnieuw in de Thermal Cycler :

30°C – 90’

65°C – 10’

15°C – ∞

De sequeneringsprocedure vraagt om een DNA concentratie van 20ng/µl. Het GenomiPhi

product (GP) wordt door verdunning naar deze concentratie gebracht. De amplificatie

produceert 4-7 µg DNA. De standaardverdunning bedraagt 171,5 µl water en 3,5 µl GP. Indien

bij PCR onvoldoende amplificatie is opgetreden kan men de concentratie van het GP nagaan.

De GenomiPhi procedure kan indien nodig op het oorspronkelijke DNA-materiaal worden

herhaald. De nodige verdunning kan ook manueel berekend worden nadat de concentratie van

het GenomiPhi materiaal is nagegaan.

3.3 Polymerase Chain Reaction (PCR)

Principe

PCR is een techniek om selectief specifieke DNA-fragmenten te amplificeren. Er is slechts een

kleine hoeveelheid DNA nodig om met PCR voldoende kopieën te genereren voor analyse met

conventionele laboratoriumtechnieken. Elke PCR-reactie vereist template DNA, primers,

nucleotiden en DNA polymerase.

31

DNA-polymerase is het enzyme dat de individuele nucleotiden aan elkaar linkt. De primers

bepalen welk DNA product precies wordt geamplificeerd. Het zijn korte DNA fragmenten met

een welbepaalde sequentie die complementair is aan het target DNA. Vanuit deze fragmenten

bouwt het DNA polymerase het PCR product verder uit.

Het mengsel met de 4 bovenstaande componenten wordt in een Thermal Cycler geplaatst

waardoor meerdere cycli van DNA amplificatie plaatsvinden. Dit gebeurt in 3 stappen:

Denaturatie: De machine verhoogt de temperatuur van het mengsel tot smeltpunt

van de twee complementaire DNA strengen van het target DNA zodat deze van

elkaar loskomen.

Hybridisatie: De temperatuur zakt zodat de specifieke primers kunnen binden aan

het target DNA.

Elongatie: De temperatuur stijgt opnieuw waardoor het DNA polymerase in staat is

de primers te verlengen door het toevoegen van nucleotiden.

Bij elke herhaling van deze drie stappen, wordt het DNA verdubbeld. Op die manier verkrijgt

men exponentiële amplificatie van DNA.

Primers

Primers worden ontworpen zodat deze specifiek zijn voor een bepaalde sequentie in het DNA

om te vermijden dat deze aspecifiek binden. De primers voor de screening voor OI waren reeds

aanwezig in het Centrum voor Medische Genetica bij de aanvang van deze thesis.

De primers zijn onderverdeeld in twee verschillende panels. De primers voor de dominante

vorm (COL1A1 en COL1A2, niet IFITM5) van OI zijn gegroepeerd als OI panel I. De primers

voor alle anderen zijn gebundeld in OI panel II. (Zie bijlage 3 en 4). De primers werden

ontworpen en gevalideerd via het Ford protocol. De sequenties van de primers, de ligging van

de primers in het genoom en de nummers van de assays (=primerparen) kunnen worden

teruggevonden op de Ford-website. Voor COL1A1 bevat OI panel I 36 assays, voor COL1A2

43 assays. OI panel II bevat 158 assays.

Voorheen had haast elke primer zijn eigen thermische omstandigheden nodig. Deze

arbeidsintensieve manier van werken is echter historisch. Nu wordt gebruik gemaakt van

zogenaamde ‘universele primers’. De reactie maakt gebruik van drie primers: een

sequentiespecifieke forward primer met een M13 sequentie aan het 5’ uiteinde, de specifieke

reverse primer en ten slotte de universele fluorescent gelabelde M13 primer.

32

Figuur 5. Amplificatieschema voor een enkele PCR reactie dmv universele primers. (A,B) De gearceerde velden duiden de

microsatteliet-specifieke primers aan. (C) Gegolfd veld: de universele M13(-21) sequentie. De ster representeerd het

fluorescente label, in dit geval 6-carboxy-fluorescine (FAM). (D) In de eerste PCR-cycli hybridiseert de forward primer met

de M13 staart op het PCR-product. (E) Deze producten dienen als doelwit voor de FAM-gelabelde universele M13 primer,

welke hybridiseert in latere cycli op lagere temperatuur (53°C). (F) Het eindproduct kan worden geanalyseerd dmv een laser

detectie systeem. Afbeelding afkomstig van (61)

De thermische omstandigheden worden gekozen zodat in de eerste cycli de forward primer met

de M13 sequentie hybridiseert met het opstapelende PCR product. Nadien wordt de temperatuur

verlaagd om het binden van de universele M13 primer te faciliteren. Op dit moment neemt de

universele M13 primer het over van de forward primer en wordt het PCR-product tevens

fluorescent gelabeled. (61) Het Ford-protocol gebruikt in dit onderzoek deze M13 primers.

Werkwijze

De PCR procedure verloopt als volgt. Maak een mengsel van volgende producten:

Componenten reactie Volume (µl)

Kapa2G Robust MM (2x) 5

Forward primer (1µM in TE – buffer) 2,5

Reverse primer (1µM in TE – buffer)

gDNA (20ng/µl) 2,5

33

Hierbij is het gDNA in ons geval het verdunde GenomiPhi product. Vortex het mengsel om een

egale verdeling van de producten te verzekeren. Na centrifugeren wordt de plaat in de Thermal

Cycler geplaatst.

Programma PCR Ford protocol (KAPA ROBUST 60) :

Temperatuur Tijd

95°C 3 minuten

95°C 15 seconden

35 cycli 60°C 10 seconden

72°C 15 seconden

72°C 10 minuten

3.4 Labchip GX

Principe

Om na te gaan of het DNA voldoende geamplificeerd is na PCR, wordt een elektroforese

uitgevoerd. Labchip GX is gebaseerd op traditionele principes van gelelektroforese die

getransfereerd worden naar een microchip. Dit laat toe de DNA- en RNA-fragmenten aan een

hoge snelheid van elkaar te scheiden en de verkregen informatie om te zetten naar een digitaal

formaat. Aan de bekomen banden kan men nagaan of amplificatie voldoende heeft

plaatsgevonden. In geval van onvoldoende intense banden kan men stellen dat de amplificatie

onvoldoende is. Men kan dan trachten de PCR procedure te herhalen.

Werkwijze

Allereerst dient de Labchip ‘geladen’ te worden. Vul voor elke gewenste reactie een

gereserveerde well met

- 17 µl water

- 3 µl van het gewenste PCR-product

Dek opnieuw de plaat af met een seal en centrifugeer. Het resultaat van de Labchip elektroforese

kan bekeken worden via de Labchip GX software.

De PCR-reactie is goed verlopen indien er 1 duidelijke band van de verwachte grootte te zien

is.

34

3.5 MiSeq Personal Sequencer

Principe

De vraag naar een goedkopere en snellere manier om te sequeneren leidde tot het ontwikkelen

van second generation sequencing methoden (Next Generation Sequencing (NGS)). Met NGS

wordt massive parallel sequencing uitgevoerd wat toelaat dat een volledig genoom, of exoom

in dit geval, op minder dan één dag wordt gesequeneerd. Dankzij NGS kan men de sequenties

van verschillende genen van het OI panel 1 en 2 gelijktijdig analyseren en dit voor verschillende

patiënten. In de laatste tien jaar zijn er verschillende NGS platformen ontwikkeld die massive

parallel sequencing aanbieden aan een lage prijs. Eén van de meest gebruikte platformen is

MiSeq Personal Sequencer van Illumina. MiSeq Personal Sequencer maakt gebruikt van de

sequencing-by-synthesis-methode om de amplificatieproducten te sequeneren.

De Miseq Personal Sequencer gebruikt in dit onderzoek is geschikt voor targeted panel

sequencing. Het dient te worden verduidelijkt dat met dit toestel geen exoomscreening kan

gebeuren. De verder genoemde data gebruikt voor de exoomanalyse zijn dan ook niet met dit

toestel verkregen. Hiervoor worden andere sequencingmachines gebruikt of wordt de

sequenering uitbesteed en extern uitgevoerd door bedrijven met een hogere capaciteit.

Werkwijze

Na de controle door de Labchip GX worden de PCR-producten per patiënt en per OI panel

gepoold. d.w.z. van elk PCR-product wordt 2 µl in 1 epje samengevoegd. Dit epje wordt

afgegeven aan de medewerkers die bevoegd zijn voor het bedienen van de MiSeq Personal

Sequencer.

De medewerkers van het Ford-team bereiden het staal voor (library prep) volgens het Nextera

protocol. Na het sequeneren worden de data verwerkt door het team met behulp van de

beschikbare software.

3.6 Sanger sequencing

Principe

De Sanger methode, die ook wel ‘dideoxy sequencing’ of ‘chain termination sequencing’ wordt

genoemd, maakt gebruik van dideoxynucleotiden (ddNTP’s) naast de normale nucleotiden

(NTP’s) die ingebouwd worden in het DNA. De ddNTP’s lijken zeer goed op nucleotiden.

35

Het verschil vindt men in een waterstofgroep (H) op het 3’ koolstof uiteinde in plaats van een

hydroxyl group (OH). Wanneer deze ddNTP’s in de sequentie worden ingebouwd, verhinderen

ze dat andere nucleotiden worden toegevoegd doordat er geen fosfodiester binding kan gevormd

worden tussen het dideoxynucleotide en het volgende nucleotide.

Voor de sequeneringsreactie is denaturatie van de dubbelstrengen een vereiste. Hiervoor wordt

het staal naar een hoge temperatuur gebracht. Vervolgens wordt een primer gehybridiseerd op

één van de template strengen. Deze primer is zo ontwikkeld dat het 3’ uiteinde naast de

gewenste DNA-sequentie gelokaliseerd is. Het DNA-polymerase voegt vervolgens nucleotiden

toe aan de groeiende keten, maar soms wordt een dideoxynucleotide toegevoegd in plaats van

een normaal nucleotide, wat resulteert in het beëindingen van de synthese. Dit wordt ‘chain

termination’ genoemd.

Figuur 6. Principe van de Sanger sequencing methode. Tijdens de sequencing reactie zijn zowel de klassieke nucleotiden

(dNTP’s) aanwezig als dideoxynucleotiden (ddNTP’s) aanwezig. At random worden tijdens de PCR reactie

dideoxynucleotiden (ddNTP’s) ingebouwd. De afwezigheid van de 3’-hydroxyl groep bij de ddNTP’s zorgt ervoor dat geen

verdere nucleotiden kunnen worden toegevoegd. Dit proces van ‘chain termination’ stop de polymerisatie van dat fragment.

De ddNTP’s zijn overeenkomstig de base die zij representeren fluorescent gelabeld. Na het scheiden van de fragmenten door

gelelectroforese wordt via een fluorescentiedetector elke base uitgelezen en een chromatogram opgesteld. (62)

36

Een belangrijk element in deze methode is dat alle reacties starten met hetzelfde nucleotide en

eindigen met een specifieke base. In een oplossing waar dezelfde DNA-streng steeds opnieuw

wordt gesynthetiseerd, zal de nieuwe keten, op alle plaatsen waar het ddNTP kan worden

ingebouwd, beëindigd worden. Er worden dus ketens met verschillende lengtes geproduceerd.

Wanneer de reacties zijn afgerond, wordt het DNA opnieuw gedenatureerd als voorbereiding

op de elektroforese. Na deze run wordt de gel aan een laser blootgesteld. De ddNTP’s zijn

fluorescent gemerkt naargelang de base die zij vertegenwoordigen. Op die manier kan het

eindproduct op een gel worden waargenomen. De uiteindelijk nucleotiden worden afgeleid uit

de frequentie van het signaal vanuit de gemerkte ddNTPs.

Werkwijze

Aan de hand van de resultaten van MiSeq wordt al dan niet overgegaan naar Sanger sequencing.

Van volgende genfragmenten wordt de DNA-sequentie volgens Sanger bepaald:

Een gekende causale mutatie (“CAUSAL MUTATION” in SeqPilot)

Een gekende unclassified variant (“CAUSALITY UNCLEAR” in SeqPilot)

Een variant die nog niet eerder werd gevonden

Een amplicon waarvoor onvoldoende coverage werd behaald

Enkel gekende polymorfismen (voorkomend bij amplicons met voldoende coverage) worden

niet met Sanger DNA-sequenering bevestigd.

Alvorens de Sanger sequencing kan worden gestart, moet voor de geselecteerde genfragmenten

opnieuw PCR en controle met de Labchip GX worden uitgevoerd. Voor genfragmenten met

onvoldoende coverage verloopt dit op dezelfde wijze als hierboven vermeld. Voor causale

mutaties en varianten wordt in plaats van de GenomiPhi verdunning een verdunning van het

originele DNA-staal gebruikt (20ng/µl). De Labchip controle verloopt zoals hierboven

beschreven (zie 3.4.2).

In de eerste stap van Sanger sequencing wordt een mix voorbereid van Exonuclease (Exo),

Antarctic Phosphatase (AP) en water. Deze eerste twee producten moeten op ijs geplaatst

worden. Per staal komen de componenten in volgende hoeveelheden voor:

37

Componenten reactie Volume per staal (µl)

Exonuclease 0,05

Antarctic Phosphatase 0,2

Water 0,75

De mix wordt hierna gevortexed en gecentrifugeerd. Vervolgens wordt 5 µl van de PCR-

producten in een PCR-plaat gepippeteerd. Hieraan wordt 1 µl van bovenstaande mix

toegevoegd. De plaat wordt vervolgens in de Thermal Cycler geplaatst met volgend programma

(Exo(s)AP programma):

Temperatuur Tijd

37°C 15 minuten

80°C 20 minuten

In tweede deel van de Sanger sequencing wordt opnieuw op ijs gewerkt. Twee mixen worden

voorbereid: één met forward primer, één met reverse primer. Per staal worden de componenten

in volgende hoeveelheden toegevoegd:

Componenten reactie Volume per staal (µl)

RR mix 0,5

ABI – Buffer 2

Water 4,5

DMSO 0,5

Primer (forward/reverse) 2

De mixen worden gevortexed en gecentrifugeerd. Vervolgens wordt 9 µl van de forward mix

en 9 µl van de reverse mix in de hiervoor gereserveerde wells van een PCR-plaat gepipetteerd

(elk genfragment dat geselecteerd werd na MiSeq, wordt zowel in forward als in reverse

richting gesequeneerd). Vervolgens wordt 1 µl van het Exo(s)AP-product toegevoegd. De plaat

wordt vervolgens in de Thermal Cycler geplaatst met volgend programma (Sequencing/Abi-

programma):

38

Temperatuur Tijd

95°C 5 minuten

95°C 10 seconden

25 cycli 55°C 5 seconden

60°C 4 minuten

15°C 10 minuten

Het derde deel van de Sanger sequencing heeft als bedoeling het bekomen PCR product te

zuiveren van alle achtergebleven producten en onzuiverheden. Voor deze stap zijn volgende

componenten nodig:

- Vortex de magnetic beads tot een homogene vloeistof is te zien

- Voeg 10 µl magnetic beads toe aan elk epje Sequencing/Abi-product

- Voeg 45 µl ethanol toe en pipetteer op en neer

- Plaats de epjes op een magnetische plaat

- Na 3 minuten: verwijder de ethanol

- Voeg 100 µl ethanol toe

- Plaats opnieuw op de magnetische plaat

- Na 10 seconden: verwijder de ethanol

Laat gedurende 15 minuten de epjes drogen aan de lucht. Op dit punt kunnen de beads, welke

nu het gezuiverde DNA-materiaal bevatten, ingevroren worden in afwachting van de analyse.

Voorafgaan aan de analyse:

- Voeg 10 µl water toe, meng de beads goed door op en neer te pipetteren

- Laat 3 minuten rusten

- Plaats de epjes gedurende 30 seconden op de magnetische plaat

Ten slotte wordt 30 µl van het gezuiverde PCR product in een nieuwe plaat gepipetteerd. De

plaat wordt afgesloten met een seal en zo aan het GSU overgedragen.

Componenten reactie

Magnetic beads

Ethanol 85%

Water

39

Analyse

3.6.3.1 SeqPilot

Analyse van de gesequeneerde DNA-sequenties gebeurt via de SeqPilot software. Deze

software wordt gebruikt om de sequentie te mappen en varianten te decteren. De sequentie van

de patiënt wordt vergeleken met een referentiesequentie uit de Ensembl databank. In het

SeqPilot programma kan men tevens zien of de sequencing niet vroegtijdig is afgebroken. Een

deel van het exon kan bijvoorbeeld niet gesequeneerd zijn of een flankerend intron kan

onvoldoende zijn mee gesequeneerd. Indien dit het geval is, moet het assay overeenkomstig dit

exon opnieuw gesequeneerd worden om varianten te kunnen uitsluiten.

3.6.3.2 Alamut Visual

Alamut Visual is software die de onderzoeker helpt de pathogenische status van de variant,

gevonden werden met MiSeq en bevestigd met Sanger Sequencing en SeqPilot, te bepalen.

Door de graad van conservatie van de sequentie in acht te nemen , door de splice sites te

bepalen, etc. kan de software voorspellen of de variant pathogeen is of niet.

3.7 Exoomanalyse

Bij het klinisch vermoeden van OI wordt een EDTA-bloedstaal afgenomen en verstuurd naar

een genetisch labo. Hier zal men screenen op mutaties in alle gekende genen voor OI. De

huidige screening in het labo van het Centrum voor Medische Genetica Gent (CMGG) bestaat

uit 2 panels zoals hierboven beschreven (zie 3.3.2).

Indien deze screening negatief is, wordt een weefselbiopt aangevraagd en tot Whole Exome

Sequencing (WES) overgegaan. Verscheidene variabelen worden tevens opgesteld die zullen

bijdragen tot het filteren van de data. De lijst van gevonden varianten en hun variabelen

opgesteld door de bio-informaticus wordt manueel doorgenomen. Aan de hand van deze

variabelen en locatie van de varianten wordt een inschatting gemaakt van de kans tot causaliteit.

Variabelen

3.7.1.1 Populatie- en CMGG frequentie

De frequentie van een variant kan reeds belangrijke informatie geven. De kans op causaliteit

bij een variant die in meer dan 2% van de bevolking voorkomt is dan ook klein. Dit is tevens

een gegeven dat wordt gehanteerd bij het classificeren van een variant (Zie Bijlage 5-16).

40

3.7.1.2 Coverage en Readings

De coverage en aantal reads van een variant geven aan hoeveel keer de variant werd herkend

door de sequencingmachine. De foutenmarge van deze apparaten verplicht ons echter tot het

kritisch benaderen van deze waarden. Een lage coverage maakt een vals positief resultaat

waarschijnlijker. Toch zal indien de andere variabelen veelbelovend zijn geprobeerd worden de

variant te bevestigen door opnieuw te sequeneren, ditmaal met Sanger sequencing, met de hoop

op hogere coverage waarden. Op die manier kan men aantonen of de variant daadwerkelijk

aanwezig is en dus een vals positief resultaat uitsluiten.

3.7.1.3 PhyloP Waarde

De PhyloP waarde (Phylogenetische P-waarden) is een maat voor de conservatie van het

aminozuur in de betreffende sequentie. De evolutie van het menselijk genoom heeft door

externe selectiedruk bepaalde genen in meer of mindere mate uitgeselecteerd. Functioneel

essentiële functies zijn dan ook sterk geconserveerd in ons genoom, terwijl andere minder vitale

zaken nog steeds in volle verandering zijn. De PhyloP waarde beschrijft de snelheid waarmee

een sequentie evolueert tegenover een neutraal overervingssysteem. Men spreek van

‘Acceleratie’ als het segment aan meer verandering onderhevig is dan wordt verwacht bij een

ad random overerving. Daartegenover staat een ‘Deceleratie’ welke erop wijst dat het segment

minder verandert dan verwacht wordt.

De PhyloP software maakt gebruik van vier verschillende statistische modellen om haar waarde

te produceren, elk met een vergelijkbare statistische kracht, ondanks hun theoretisch

verschillende benadering. (63)

3.7.1.4 Variant Allele Frequency (Vaf)

Allele frequenctie (af) is de relatieve frequentie van een allel op een specifieke locus in een

populatie, uitgedrukt als een fractie of percentage. Het is de fractie van alle chromosomen in de

populatie die drager zijn van dat allel. Variant allele frequency (Vaf) is dus de fractie allelen

die de variant bevatten tegenover het totaal aantal aanwezige allelen in de populatie. (64)

Hier gaat het echter telkens over één patiënt. Aangezien het menselijk genoom diploïd is, zal

voor elke variant de ‘populatie’ allelen dan ook 2 bedragen. Aangezien gesequeneerd wordt

door dezelfde locus te amplificeren met PCR zal men dus de frequentie van de variant in deze

artificiele populatie berekenen.

41

Uit deze waarde kan men afleiden of de variant homozygoot dan wel heterozygoot aanwezig

is. Waarden dicht bij 50% geven een heterogene variant aan, terwijl waarden die 100% naderen

homozygoot zijn.

Dit is uiteraard essentiële informatie in het zoeken naar causale varianten. In exoom 1 werd

bijvoorbeeld de voorkeur gegeven aan homozygote varianten gezien het overervingspatroon en

de consanguiniteit van de ouders.

3.7.1.5 Reference SNP nummer (rs-nummer)

Het Reference SNP-nummer (rs-nummer) is een nummer dat wordt gebruikt door onderzoekers

en databanken om naar een specifieke SNP te verwijzen. Het nummer staat voor een Reference

SNP cluster ID. (65)

Wanneer onderzoekers een SNP ontdekken, zenden zij een rapport van de SNP samen met de

flankerende sequentie naar de dbSNP database van het NCBI (National Center for

Biotechnology Information). Hier krijgt elk SNP een ss-nummer (submitted SNP). Als een

aantal SNPs op dezelfde locatie van het genoom blijken te liggen, zal het NCBI de

overeenkomende rapporteringen als deel van een groep rapporteren en clusteren in een unieke

reference SNP-cluster. Hieraan wordt dan een uniek rs-nummer toegekend. (65,66)

42

4 Resultaten

4.1 Screening patiënten

Resultatentabel

Legende

- c-notatie: nummering op nucleotide niveau

- p-notatie: nummering op eiwit niveau

- Predictie tools:

o Missense mutaties: SIFT, PolyPhen, Mutation Taster, Align GVGD, Grantham

o Silent, missense en intronische mutaties: splice site predictions (Human Splicing

Finder, Genesplicer, NNSPLICE, MaxEntScan, Splicesite finder like)

o Nonsense mutatie, deleties en inserties: NMD predictie

- NMD: nonsense mediated decay

- Vaf: zie 3.7.1.4

- Kleurencode:

o Groen: benigne variant (klasse 1 of 2)

Klasse 1: Benign

Klasse 2: Likely benign

o Blauw: pathogeniciteit onduidelijk (klasse 3)

Klasse 3: Uncertain significance

o Rood: pathogene variant

Klasse 4: Likely pathogenic

Klasse 5: Pathogenic

o Zwart: Vals positief

Patiënten waarin MiSeq geen varianten aangaf in OI panel 1 of 2 worden in onderstaande tabel

niet vermeld. Hetzelfde geldt voor de genen van OI panel 2 waarin bij geen enkele patiënt een

variant werd gevonden. Voor de volledige lijst van MiSeqresultaten (inclusief assays die te

weinig coverage hadden), zie Bijlage 3 en 4.

43

OI panel 1

Patiënt COL1A1 COL1A2 Exon Vaf

MiSeq Sanger Predictie

tools

Classificatie Commentaar

c-notatie p-notatie c-notatie p-notatie

P1 c.2314G>A p.(Gly772Ser) 38 49,822 CAUSAL MUTATION Bevestigd 5/5 positief Klasse 4:

likely

pathogenic

Glycine in alfa-

helix

P2 c.2867G>T

c.1243C>T

p.(Gly956Val)

p.(Arg415*)

40

19

Unknown variant

CAUSAL MUTATION

Vals

positief

Vals

positief

P4 c.484delC

c.2867G>T

p.(Gln162fs)

p.(Gly956Val)

6

40

44,348 CAUSAL MUTATION

Unknown variant

Bevestigd

Vals

positief

NMD

Voorspeld

Klasse 4:

likely

pathogenic

STOPCODON

P5 c.1283delC

c.1353+8

T>C

p.(Gly428fs)

19

20

Unknown variant

Unknown variant

Vals

positief

Vals

positief

P6 c.370-2A>G 5 61,364 Unknown variant Bevestigd Human Splicing

Finder positief

Klasse 4:

Likely

pathogenic

Verlies van

splice site

P7 c.1012G>A p.(Gly338Ser) 16 46,711 CAUSAL MUTATION Bevestigd 4/5 positief Klasse 4:

Likely

pathogenic

Glycine

verandering

P9 c.2867G>T p.(Gly956Val) 40 Unknown variant Vals

positief

44

OI panel 2

Patiënt CRTAP LEPRE1 Exon Vaf MiSeq Sanger Predictie tools Classificatie Commentaar

CN PN CN PN

P1 c.558A>G p.(=) 2 47,319 Unknown variant Bevestigd Geen effect op

splicing

Klasse 2: Likely

benign

Reeds causale

mutatie.

Synoniem.

P2 c.558A>G p.(=) 2 52,288 Unknown variant Bevestigd Geen effect op

splicing

Klasse 2: Likely

benign

Synoniem.

P3 c.1284C>T p.(=) 8 44,88 Unknown variant P18 Geen effect op

splicing

Klasse 2: Likely

benign

OI panel 2 (vervolg)

Patiënt SERPINH1 Exon Vaf MiSeq Sanger Predictie tools Classificatie Commentaar

c-notatie p-notatie

P1 c.392G>C p.(Gly131Ala) 2 Unknown variant Vals positief

P6 c.395_396insT p.(Ser132fs) 3 Unknown variant Vals positief

45

OI panel 2 (vervolg)

Patiënt BMP1 CREB3L1 Exon Vaf MiSeq Sanger Predictie

tools

Classificatie Commentaar

c-notatie p-notatie c-notatie p-notatie

P1 c.947A>G p.(Glu316Gly) 7 Unknown variant Vals positief

P5 c.288C>T

c.1052A>G

p.(=)

p.(Gln351Arg)

2

9

45,517 Unknown variant

Unknown variant

Bevestigd

Vals positief

Geen

effect op

splicing

Klasse 2: Likely

benign

Synoniem.

Reeds causale

mutatie

P6 c.651C>T p.(=)

(Asp217Asp)

5 46,809 Unknown variant Bevestigd Klasse 2: Likely

benign

Synoniem.

Reeds causale

mutatie

P7 c.1757G>A

p.(Arg586His)

c.1523+3delG

c.1524-

1_1524insG

13

11

12

47,929

91,099

96,207

Unknown variant

Unknown variant

Unknown variant

Bevestigd

P2

P3

3/5 positief

Klasse 3:

Uncertain

significance

Niet geclass

Niet geclass

Tegenstrijdige

argumenten

c.1525dupG

Fout Miseq

P9 c.284C>T p.(Ala95Val) 2 58,178 Unknown variant P16

P10 c.433+12A>G p.(=) 3 57,658 Unknown variant Bevestigd Klasse 3:

Uncertain

significance

46

OI panel 2 (vervolg)

Patiënt PLS3 PLOD2 Exon Vaf MiSeq Sanger Predictie

tools

Classificatie Commentaar

c-notatie p-notatie c-notatie p-notatie

P1 c.132A>G p.(=) 2 48,689 Unknown variant Bevestigd Geen effect op

splicing

Klasse 2: likely

benign

Reeds causale

mutatie.

P8 c.766C>T p.(Arg256*) 8 98,4 Unknown variant Bevestigd NMD voorspeld Klasse 4: Likely

pathogenic

STOPCODON

OI panel 2 (vervolg)

Patiënt TAPT1 Exon Vaf MiSeq Sanger Predictie

tools

Classificatie Commentaar

c-notatie p-notatie

P1 c.613-13T>A

c.613-3delT

p.(=)

p.?

5

5

47,674 Unknown variant

Unknown variant

P2

Vals positief

Klasse 1: Benign

P2 c.613-3delT p.? 5 Unknown variant Vals positief

P3 c.200-16A>C

c.613-13T>A

c.613-3delT

p.(=)

p.(=)

p.?

2

5

5

49,261

41,296

Unknown variant

Unknown variant

Unknown variant

P1

P2

Vals positief

Klasse 1: Benign

Klasse 1: Benign

P4 c.613-13T>A

c.613-3delT

p.(=)

p.?

5

5

51,111 Unknown variant

Unknown variant

P2

Vals positief

Klasse 1: Benign

P5 c.613-3delT p.? 5 Unknown variant Vals positief

P6 c.200-16A>C

c.613-13T>A

c.613-3delT

p.(=)

p.(=)

p.?

2

5

5

53,556

43,448

Unknown variant

Unknown variant

Unknown variant

P1

P2

Vals positief

Klasse 1: Benign

Klasse 1: Benign

P7 c.200-16A>C

c.613-13T>A

c.613-3delT

p.(=)

p.(=)

p.?

2

5

5

50

46,154

Unknown variant

Unknown variant

Unknown variant

P1

P2

Vals positief

Klasse 1: Benign

Klasse 1: Benign

P8 c.613-3delT p.? 5 Unknown variant Vals positief

47

P9 c.200-16A>C

c.613-13T>A

c.613-3delT

p.(=)

p.(=)

p.?

2

5

5

44,944

44,958

Unknown variant

Unknown variant

Unknown variant

P1

P2

Vals positief

Klasse 1: Benign

Klasse 1: Benign

P10 c.613-3delT p.? 5 Unknown variant Vals positief

48

Bespreking resultaten

Na screening van 10 patiënten gekend met OI fenotype, werd slechts bij 5 patiënten causale

mutaties (klasse 4 of 5) gevonden in de gekende OI genen, d.w.z. de genen opgenomen in OI

panels 1 en 2.

Voor P1 vonden we een heterozygote mutatie in COL1A2, namelijk c.2314G>A wat aanleiding

gaf tot een eiwitverandering p.(Gly772Ser). Het ging hier om een glycine in de α-helix van type

I collageen, wat een sterk argument is voor pathogeniciteit. De predictie tools voorspelden

bovendien een negatief effect. Deze mutatie werd geclassificeerd als klasse 4. Andere varianten

die bevestigd werden in P1, namelijk in c.558A>G in CRTAP en c.132A>G in PLOD2, waren

heterozygote synonieme mutaties. Aan beide varianten werd klasse 2 toegekend. Aangezien

mutaties in CRTAP en PLOD2 autosomaal recessieve OI veroorzaken, is het onwaarschijnlijk

dat heterozygote mutaties aanleiding geven tot het ziektebeeld (tenzij een 2de mutatie gevonden

wordt in deze genen (compound heterozygoot), maar dat was hier niet het geval). Ook geven

synonieme mutaties zelden aanleiding tot een verandering in het fenotype. Synonieme mutaties

kunnen wel eventueel een effect hebben op de splice site, maar de predictie tools voorspelden

geen splice site verandering. In combinatie met het feit dat voor deze patiënt reeds een causale

mutatie is geïdentificeerd in COL1A2 kunnen we concluderen dat deze varianten het ziektebeeld

niet veroorzaken bij deze patiënt. Ten slotte vonden we ook een polymorfisme in TAPT1, c.613-

13T>A (P2).

Bij P2 werd slecht één variant gevonden, namelijk c.558A>G in CRTAP. Dit is dezelfde

heterozygote synonieme variant als werd vastgesteld in P1. Dezelfde argumenten als

aangehaald bij P1 gelden hier: een heterozygote synonieme variant in CRTAP zonder effect op

de splice site is hoogstwaarschijnlijk niet pathogeen. Ook het feit dat deze variant in

verschillende patiënten werd teruggevonden is suggestief voor niet-causaliteit. Voor deze

patiënt werd dus geen causale mutatie geïdentificeerd binnen de gekende genen voor OI.

Bij P3 werden variant gevonden in de genen van OI panel 1 en 2. Het ging om een polymorfisme

in LEPRE1 (P18) en 2 polymorfismen in TAPT1, c.200-16A>C (P1) en P2 (zie P1).

Bij P4 werd een heterozygote mutatie in COL1A1 vastgesteld, namelijk c.484delC hetgeen

aanleiding gaf tot de eiwitverandering p.(Gln162fs). Deze frameshift gaf geen aanleiding tot

een glycineverandering in de α-helix, maar leidde wel tot nonsense mediated decay van het

mRNA door de introductie van een stopcodon. Dit is een sterk argument voor pathogeniciteit.

49

Aan deze mutatie werd een klasse 4 toegekend. Deze mutatie is waarschijnlijk de oorzaak van

OI bij deze patiënt. Verder werd ook een polymorfisme in TAPT1 vastgesteld, namelijk P2.

Bij P5 werd één variant vastgesteld, namelijk c.228C>T in CREB3L1. Dit is een heterozygote

synonieme variant waaraan klasse 2 werd toegekend. Aangezien mutaties in CREB3L1

aanleiding geven tot autosomaal recessieve OI, is het onwaarschijnlijk dat deze variant

aanleiding geeft tot het ziektebeeld. Bovendien gaat het om een synonieme variant zonder effect

op de splice site. We vermelden dat bij deze patiënt dat voor het gen FKBP10 één assay niet

gesequeneerd kon worden. Een deel van dit gen kon dus niet onderzocht worden en het is

mogelijk dat een mutatie zich in dit gen bevindt. Voor deze patiënt wordt best een nieuw DNA-

staal aangevraagd.

Bij P6 werd een causale mutatie in COL1A1 geïdentificeerd: c.370-2A>G. Dit leidt tot het

verloren gaan van de splice-acceptor site, waardoor een overslaan van exon 5 zeer

waarschijnlijk is. Aan deze variant werd een klasse 4 toegekend. In CREB3L1 werd een

heterozygote, synonieme variant vastgesteld zonder effect op splicing, namelijk c.651C>T

(p.(=)). Aan deze variant werd klasse 2 toegekend. In TAPT1 werden 2 polymorfismen

gevonden, P1 en P2.

Bij P7 werd eveneens een causale mutatie gevonden in COL1A1: c.1012G>A. Op eiwitniveau

gaat hierdoor een glycine verloren in de α-helix regio: p.(Gly338Ser). Aan deze variant werd

klasse 4 toegekend. Verder werd ook heterozygote variant gevonden in BMP1, namelijk

c.1757G>A (p.(Arg586His). De predictie tools voorspelden een negatief effect (3/5). Aan deze

variant werd een klasse 3 toegekend. Aangezien mutaties in BMP1 aanleiding geven tot

autosomaal recessieve OI, is het echter onwaarschijnlijk dat deze variant aanleiding geeft tot

het ziektebeeld. Bovendien werd bij deze patiënt reeds een causale mutatie gevonden in

COL1A1. In CREB3L1 werden tevens 2 varianten beschreven voor deze patiënt: c.1524-

1_1524insG en c.1523+3delG. Voor de eerste variant is echter geweten dat het MiSeq apparaat

deze variant keer op keer verkeerd interpreteert. In werkelijkheid gaat het hier over

c.1525dupG. Deze variant wordt sinds 2013 als polymorfisme gerapporteerd. De variant

c.1523+3delG werd niet geclassificeerd. Ten slotte vermelden we ook 2 polymorfismen in

TAPT1, P1 en P2.

Bij P8 werd een onbekende variant bevestigd in PLS3, welke aanleiding gaf tot een prematuur

stopcodon: c.766C>T , p.(Arg256*). Aangezien het hier gaat om een nonsense-mutatie is de

kans op NMRD groot. De variant werd dan ook geclassificeerd als klasse 4.

50

Voor P9 werden 3 polymorfismen teruggevonden, één in CREB3L1 (P16) en 2 in TAPT1 (P1

en P2).

Bij P10 werd een onbekende variant bevestigd in BMP1: c.433+12A>G. Aangezien aan geen

van de criteria voor classificatie werd voldaan wordt deze dan ook gerapporteerd als een variant

met klasse 3: Uncertain significance. Aangezien de substitutie zich 12 basenparen ver in het

intron bevindt, is de kans op pathogeniteit echter klein.

4.2 Exoomanalyse

De resultaten van de exoomsequencing worden weergegeven in een excelbestand (zie Bijlage

18) dat al snel meer dan 10 000 varianten bevat. Om in dit groot aantal varianten genen te

selecteren die interessant zijn voor OI, werd er gebruik gemaakt van filters. Het excelbestand

bevat ook verschillende tabbladen waarin varianten worden ingedeeld aan de hand van het type

mutatie (nonsense, frameshift, deleties/inserties en splice variants) wat de selectie ook

gemakkelijker maakt.

Analyse van het exoom gebeurt door eerst de nonsense mutaties (stop) te bekijken. Een

nonsense mutatie is een genetische mutatie in de DNA sequentie die resulteert in een stopcodon,

waardoor een korter, onvolledige eiwitproduct wordt geproduceerd. Dit eiwit is meestal niet

functioneel. Vaak is het mRNA na transcriptie van deze DNA sequentie het doelwit van

nonsense mediated decay, waardoor slechts de helft van de normale hoeveelheid van het eiwit

aanwezig is. Dit vormt bij autosomaal recessieve aandoeningen een probleem indien het om

een homozygote mutatie of een compound heterozygote mutatie gaat. (67)

Vervolgens werden de frameshift mutaties (fs) geanalyseerd. Een frameshift mutatie is een

mutatie die veroorzaakt wordt door een deletie of insertie waardoor het aflezen van de sequentie

verschuift. De sequentie wordt verstoord door de deletie of insertie van 1 of meer nucleotiden,

op voorwaarden dat het aantal nucleotiden geen veelvoud van 3 is. Indien het wel gaat om een

veelvoud van 3, veroorzaakt dit geen verschuiving in het leesraam.(68)

Deleties/inserties (indel_ea) worden als derde geanalyseerd. Dit betekent één of meer

nucleotiden verloren gaan (deletie) of worden toegevoegd (insertie). Het kan zelfs gaan tot

volledige gendeletie of genduplicatie. Indien het gaat om een deletie of insertie van 3

nucleotiden of een veelvoud hiervan, blijft het leesraam bewaard en is er dus geen sprake van

een frameshift mutatie.(69)

51

Splice site mutaties (splice) worden hierna onderzocht. Dit zijn mutaties in splice donor of

acceptor sites die interfereren met RNA splicing.(69)

Missense mutaties (miss) worden als laatste onderzocht. Een puntmutatie resulteert hier in een

aminozuursubstitutie. Aangezien hier slechts 1 aminozuur wordt vervangen, leidt dit minder

vaak tot pathogeniciteit als de ander mutaties. (69)(70)

Exoom 1: P11

4.2.1.1 Nonsense mutatie

De volgende filters werden toegepast op de resultaten:

- VAF > 50 (homozygoot)

- rs-nummer : In een eerste selectie zullen we dus enkel kijken naar varianten zonder rs-

nummer.

- Coverage > 30

- PhyloP > 3

Nadat deze filters werden ingeschakeld, werd 1 variant geselecteerd: SMYD1. Dit bleek geen

goede kandidaat voor OI. Wanneer de PhyloP-filter wordt aangepast zodat ook varianten met

onbekende PhyloP worden geïncludeerd, worden 5 extra varianten bekomen in 2 verschillende

genen (CDC27 en ZNF595). Wanneer het excelbestand meerdere varianten aangeeft in

hetzelfde gen, gaat het vaak om dezelfde variant die in verschillende transcripten wordt

teruggevonden. Ook van deze varianten werden geen weerhouden (dit op basis van de

literatuur). Hierbij werd gebruik gemaakt van de databanken OMIM en GeneCards. Na

raadplegen van deze databanken werd bijvoorbeeld duidelijk dat SMYD1 voornamelijk een rol

speelt in de ontwikkeling van het hart waardoor we dit gen konden uitsluiten.

Vervolgens werd de filter voor coverage aangepast zodat ook varianten met coverage < 30

werden weerhouden. Ook heterozygote varianten (vaf < 50) werden nu geïncludeerd. Vijf extra

varianten in 4 verschilledende genen (FUOM, CTBP2, GRIN3B en TAS2R45) werden bekomen.

CTBP2 leek aanvankelijk een goede kandidaat vanwege zijn rol in de WNT-signaling, maar

werd uiteindelijk toch niet weerhouden door het hoog aantal varianten dat werd teruggevonden

in dit gen in de drie exomen. Van de andere varianten werden geen weerhouden op basis van

de literatuur. Uiteindelijk werden ook de rs-nummers onderzocht. Dit leverde 27 extra varianten

op in 17 verschillende genen, waarvan geen enkele weerhouden werd.

52

4.2.1.2 Frameshift mutatie

Na het toepassen van de filters zoals bij nonsense mutaties werden geen varianten geselecteerd.

De filter voor PhyloP werd vervolgens aangepast zodat ook varianten met onbekende PhyloP

werden geïncludeerd. Er werden 9 varianten in 2 verschillende genen (ERCC2 en GIGYF2)

door middel van deze filters geselecteerd. Geen enkel variant werd weerhouden als kandidaat

voor OI na het raadplegen van de databanken.

Na inclusie van de heterozygote varianten werden 17 extra varianten in 12 genen geselecteerd.

Al deze varianten werden verworpen als kandidaat voor OI.

Indien de filter voor coverage werd aangepast zodat ook varianten met coverage < 30 werden

geïncludeerd, werden 23 extra varianten in 13 genen bekomen. Van de overige genen werden

de 2 varianten in het RYK gen weerhouden.

4.2.1.2.1 RYK

Gen Vaf Cov3 FR4 RR5 cNomen pNomen Transcript Frequentie

RYK 100 3 1 2 c.59_60insC p.Ala20fs NP_002949 Populatiefreq: /

CMGG freq: 0

GONL freq: 0

RYK 100 3 1 2 c.59_60insC p.Ala20fs NP_001005861

RYK (Receptor-like tyrosine kinase) is lid van de familie van groeifactor receptor proteïne

tyrosine kinasen. Het is een atypisch lid van de familie. Het verschilt van de andere leden door

een aantal verschillen in de geconserveerde residu’s in de activatiedomeinen en domeinen die

nucleotiden binden (71–73). Het eiwit dat door RYK wordt gecodeerd zou een rol spelen bij het

stimuleren van WNT signaling pathways. (71,72)

Uit onderzoek bleek dat RYK bij zoogdieren de rol vervult van coreceptor (samen met Frizzled)

van WNT liganden.

3 Coverage 4 Forward read 5 Reverse read

53

De WNT liganden zijn extracellulaire eiwitten die andere cellen stimuleren door middel van

specifieke receptoren zoals leden van de Frizzled familie en de coreceptor LRP5/6. Deze 3

elementen (LRP5/6, Frizzled en de WNT ligenden) vormen een receptor-ligand complex. (74)

Het extracellulaire domein van RYK vormt een ternair complex met Frizzled en WNT-1. Het

intracellulaire domein bindt met Dishevelled, hetgeen vereist is voor activatie van de WNT

pathway. (72,74) Stroomafwaarts inhibeert WNT signaling de kinase activiteit van GSK3β

zodat β-catenine accumuleert in het cytoplasma en getransloceerd wordt naar de nucleus.

Nucleaire β-catenine bindt leden van de LEF/TCF familie. Deze transcriptiefactoren activeren

de WNT target genen. (74)

Aangezien er reeds werd aangetoond dat mutaties in WNT-1 aanleiding kunnen geven tot OI, is

het plausibel dat mutaties in het RYK-gen ook tot OI kunnen leiden. RYK knock-out muizen

sterven vlak na de geboorte en vertonen afwijkingen zoals een volledige splijting van het

secundaire gehemelte en karakteristieke craniofaciale abnormaliteiten. (73)

Figuur 7. RYK, een atypisch tyrosine kinase dat een rol speelt in de WNT-signaling. Het is een WNT co-receptor

waarvan het extracellulair deel bindt met Frizzled en WNT-1 en het intracellulair deel met Dishevelled. Deze link

met Dishevelled heeft de inhibitie van GSK-3β tot gevolg, hetgeen leidt tot de opstapeling van β-catenine in het

cytoplasma en de translocatie van hiervan naar de nucleus. Door de daaropvolgende binding van β-catenine op

LEF/TCF activeren deze transcriptiefactoren de WNT target genen met o.a. uitgroei van neurieten tot gevolg (74)

54

4.2.1.3 Deleties/inserties

Indien de filters zoals bij de nonsense mutaties werden toegepast, werden geen varianten

geselecteerd. Na aanpassing van PhyloP zodat ook varianten met onbekende PhyloP

geïncludeerd worden, werden 27 varianten in 22 genen bekomen. Deze varianten bleken geen

goede kandidaten voor OI na het raadplegen van de databanken.

Vervolgens werden ook de heterozygote varianten (vaf < 50) onderzocht. Er werden op deze

manier 61 extra varianten in 38 genen geselecteerd, waarvan we geen weerhouden. Ten slotte

werden ook de rs-nummers bekeken. De 34 varianten in 12 genen die er op deze wijze

bijkwamen, werden verworpen.

4.2.1.4 Splice variants

Bij het toepassen van de filters zoals bij de nonsense mutaties, werd 1 variant bekomen in het

gen TBX22. Dit bleek geen goede kandidaat voor OI. Na aanpassing van PhyloP zodat ook

varianten met onbekende PhyloP geïncludeerd werden, bekwamen we 22 extra varianten in 12

genen, waarvan we geen weerhouden. Het analyseren van de heterozygote varianten (vaf < 50)

leverde 27 extra varianten op in 11 genen.

Van deze varianten werd CUX1 overwogen vanwege zijn rol als inhibitor van de collageen type

1, (75) maar werd uiteindelijk toch verworpen vanwege de diep intronische ligging van de

varianten (met dus minder waarschijnlijk een effect op de splice site). COG3, dat een

component is van het oligomere Golgi complex (76), werd eveneens verworpen vanwege de

diep intronische ligging van de variant. Van de overige varianten werden geen weerhouden.

Vervolgens werden ook varianten met een coverage < 30 geïncludeerd. Dit leverde 12 nieuwe

varianten op in 7 genen. P4HA1 werd weerhouden vanwege argumenten in de literatuur.

Wanneer we in alle varianten op zoek gaan naar andere varianten in P4HA1, bekomen we 5

varianten. De overige varianten met coverage < 30 bleken geen goede kandidaten voor OI.

Wanneer ook de rs-nummers bekeken worden, werden 33 extra varianten in 18 genen

geselecteerd. Geen van deze werden weerhouden.

55

4.2.1.4.1 P4HA1

Gen Vaf Cov FR RR CN PN Transcript Frequentie

P4HA1 100 4 1 4 c.-125-1G>A p.? NP_001136067 Populatiefreq: /

CMGG freq: 0

GONL freq: 0

P4HA1 100 4 1 4 c.-32-2899G>A p.? NP_001017962

P4HA1 100 4 1 4 c.-32-2899G>A p.? NP_001136068

P4HA1 100 4 1 4 c.-32-2899G>A p.? NP_000908

P4HA1 100 4 1 4 / / /

Van deze 5 transcripten werd enkel het eerste weerhouden vanwege zijn locatie ter hoogte van

de splice site acceptor. Posities -2, -1, +1 en +2 zijn namelijk het belangrijkst voor splicing.

Mutaties op deze plaats kunnen resulteren in de inclusie van intronen die normaal door splicing

uit het RNA verdwijnen. (77) P4HA1 codeert voor een component van prolyl 4-hydroxylase.

Dit enzyme speelt, zoals eerder vermeld (zie 2.1.4.2.1), een belangrijke rol in de collageen

synthese door katalysatie van de formatie van 4-hydroxyproline. Het eiwit waarvoor P4HA1

codeert is één van verschillende types van alpha subunits van het enzym. Dit alpha subunit

maakt deel uit van de katalytische site van het enzyme. (78,79)

4.2.1.5 Missense mutaties

Na het toepassen van de filters zoals bij nonsense mutaties werden 46 varianten gevonden. Na

het toepassen van 3 nieuwe filters om het aantal varianten te verminderen, namelijk de filters

voor predictie tools SIFT, PolyPhen en Mapp die op respectievelijk op ‘deleterious’, ‘probably

damaging/possibly damaging’ en ‘bad’ werden gezet, werden 4 varianten in 3 genen (ELK4,

NFKBID en TBX22) geselecteerd. Hiervan werd geen enkele variant weerhouden.

Vervolgens werden ook varianten met een onbekende uitkomst bij de prediction tools

geïncludeerd. Er werden 17 extra varianten in 4 genen (SIPA1L1, VPS33B, TTN, OPA1 en

ADD1) bekomen, waarvan we geen weerhouden. Na het uitschakelen van de predictie tool

filters, werden 25 extra varianten uit 10 genen bekomen. Uit deze varianten werden na

literatuurstudie 2 genen geselecteerd die goede kandidaten leken voor OI: AKT2 en TRAPPC12.

Ook de heterozygote varianten werden onderzocht. Na het inschakelen van de predictie tool

filters en de filters coverage > 30, PhyloP > 3 en rs-nummer = /, werden 15 extra varianten in

56

11 genen bekomen. Deze varianten waren geen goede kandidaten voor OI. Na het uitschakelen

van de prediction tool filters, werden 35 extra varianten in 22 genen bekomen. Hiervan werd

ACAN weerhouden. Na het inschakelen van de filters vaf < 50, coverage > 30, PhyloP > 1, rs-

nummer = / en de predictie tool filters, werden we 25 varianten in 18 genen bekomen. Hiervan

werd PLEKHM2 geselecteerd.

Voor het analyseren van de rs-nummers werden volgende filters toegepast: coverage > 30,

PhyloP > 3 en vaf > 50. Enkel varianten met een rs-nummer werden geselecteerd. Dit leverde

67 varianten op. Om dit nummer te verkleinen, werden ook de predictions tool filters

ingeschakeld. Er werd 23 varianten in 12 genen geselecteerd. Hiervan weerhouden we er geen.

Indien de prediction tools werden uitgeschakeld, werden 44 extra varianten bekomen in 25

genen. Hiervan werd SEC23B weerhouden.

4.2.1.5.1 AKT2

Gen Vaf Cov FR RR cNomen pNomen PhyloP Transcript Frequentie

AKT2 100 46 31 23 c.803C>T p.Ser268Leu 4,079 NP_001617 Populatie

freq: /

CMGG

freq: 0

GONL freq:

0

AKT2 100 46 31 23 c.617C>T p.Ser206Leu 4,079 NP_001229957

AKT2 100 46 31 23 c.617C>T p.Ser206Leu 4,079 NP_001229956

Het AKT2 gen codeert voor een eiwit dat behoort tot de subfamilie van serine/threonine kinases

die een SH2 (Src homologie 2)-like domein bevatten. AKT2 is één van de drie serine/threonine

kinases (AKT1, AKT2, AKT3) die men de AKT kinases noemt. (80,81) Deze kinases reguleren

vele processen waaronder metabolisme, profileratie, celoverleving, groei en angiogenese. (81)

Double-knockout muizen voor AKT1/AKT2 vertoonden een ernstige groeistoornis en stierven

kort na de geboorte. Verder zag men bij deze muizen verstoorde huidontwikkeling door een

proliferatiedefect, skeletal spieratrofie en verstoorde botontwikkeling. Deze defecten zag men

ook bij Insuline growth factor 1 receptor (IGF1R)-deficiënte muizen. (80,82) Knockdown van

AKT2 resulteert in de inhibitie van osteoblast differentiatie door zijn rol in de continue

signalering van IGF-activated pathways.

57

Deze pathway is noodzakelijk voor osteoblastdifferentiatie en gebeurt dankzij het BMP-2 gen.

Door interactie met osteogene transcriptiefactoren (DLX3, DLX5 en RUNX2) zorgen Bone

morphogenetic proteins (BMPs) ervoor dat deze stamcellen differentiëren tot osteoblasten.

AKT2 vervult de specifieke rol van gatekeeper van de osteogene differentiatie door regulatie

van RUNX2 gen expressie. (83)

4.2.1.5.2 TRAPPC12

Gen Vaf Cov FR RR cNomen pNomen PhyloP Transcript Frequentie

TRAPPC12 52,632 95 25 30 c.653

C>T

p.Ser218

Phe

5,048 NP_057114 Populatie

freq: /

CMGG

freq: 0

GONL

freq: 0

TRAPPC12 (Trafficking Protein Particle Complex 12) maakt deel uit van het TRAPP

multisubunit tethering complex. (84) Tethering is de initiële interactie tussen het vesikel en het

doelwitmembraam. Dit complex speelt een belangrijke rol bij het richten en de fusie van ER-

naar-Golgi transportvesikels met hun acceptor compartiment. (85)

TRAPPC12 bevat een tetratricopeptide repeat domein dat een rol speelt bij eiwitinteracties voor

hetero- en homo-interacties. Het eiwit is sterk geconserveerd doorheen de evolutie. Varianten

in TRAPPC12 hebben Golgi fragmentatie als gevolg onder de vorm van verspreide puncta. (86)

Het verlies van TRAPPC12 resulteert door deze fragmentatie in een deelse destabilisatie van

het complex in vivo. Als een onderdeel van TRAPP speelt TRAPPC12 waarschijnlijk een rol

in anterograad transport tussen het ER en het Golgi apparaat. Om het transport van ER naar

Golgi te visualiseren maakt men gebruik van een viraal glycoproteïne ts045 VSVG getagd met

een groen fluorescent proteïne (VSVG-GFP). Bij knockdown van TRAPPC12 zal dit eiwit

accumuleren in punctate structuren van het Golgi apparaat. (86)

58

Mutaties in TRAPPC2, een ander component van het TRAPP complex, werden reeds gelinkt

aan SEDT (spondyloepiphyseal dysplasia tarda).6

Patiënten met deze aandoening hadden kortere, extracellulaire collageen fibrillen die meer

uitgerafeld waren. Dit leidde tot de hypothese dat deze aandoening wordt veroorzaakt door een

defect in de collageen trafficking in de chondrocyten. (87)

4.2.1.5.3 ACAN

Gen Vaf Cov FR RR cNomen pNomen PhyloP Transcript Frequentie

ACAN 46,032 63 23 11 c.1708T>C p.Tyr570His 4,483 NP_037359 Populatie-

freq : /

CMGG

freq: 0

GONL

freq: 0

ACAN 46,032 63 23 11 c.1708T>C p.Tyr570His 4,483 NP_001126

Aggrecan maakt deel uit van de extracellulaire matrix van kraakbeen en is een proteogylcan.

Aan proteoglycanen zitten verschillende suikermoleculen bevestigd. Deze suikermoleculen

trekken water aan door de extreme ladingsdichtheid en zijn cruciaal voor de biomechanische

eigenschappen van kraakbeen. Hierdoor kan het kraakbeen compressie weerstaan en beschermt

het de beenderen. Aggrecan is het meest abundante proteoglycan in kraakbeen. In de vroege

ontwikkeling wordt het meeste kraakbeen omgezet in bot (ossificatie), uitgezonderd het

kraakbeen dat de uiteinden van de beenderen bedekt alsook het kraakbeen in de neus,

luchtwegen en het uitwendige oor. (88)

Aggrecan interageert met andere componenten van het kraakbeen dankzij het C-type lectine

domein van aggrecan, dat tenascines en fibulines bindt en het N-terminale G1 domein, dat

hyaluronzuur bindt. (89)

6 Spondyloepiphyseal dysplasia tarda is een genetische aandoening die gepaard gaat met verstoorde botgroei. De

aandoening doet zich voornamelijk voor ter hoogte van de wervelkolom en de epifysen. Symptomen treden op

tussen 6 en 10 jaar. (110)

59

Mutaties in het C-type lectine domein van aggrecan werden reeds gelinkt aan osteochondritis

dissecans. Dit is een aandoening fragmenten van het articulaire kraakbeen en het subchondrale

bot loskomen van het gewrichtoppervlak. Familiale osteochondritis dissecans is een zeldzame

aandoening met een stoornis is de chondroskeletale ontwikkeling, disproportionele groei en

vervorming van het skelet tot gevolg. Gezien zijn belangrijke rol in skeletale ontwikkeling en

kraakbeen, werd ACAN door ons in aanmerking genomen als kandidaatgen voor OI. (88,89)

4.2.1.5.4 PLEKHM2

PLEKHM2 is een gen dat een Pleckstrin homology domein (PH domein) bevat. Het wordt

gevonden in verschillende eiwitten die een rol spelen in intracellulaire signaling of een

bestanddeel zijn van het cytoskelet. (90) Het is vooral door dit laatste dat PLEKHM2 een

kandidaatgen is voor OI. Een afwijkende cytoskelet heeft namelijk zijn effect op

osteoblastproliferatie, collageen depositie, integrin en TGF-β signaling. Dit leidt tot

veranderingen in de eigenschappen van het bot, wat eventueel tot OI kan leiden. Bovendien

werd een afwijkende assemblage van het cytoskelet reeds gezien bij enkele patiënten met een

lethaal type OI (zie 4.2.3.1.1) (91)

4.2.1.5.5 SEC23B

Gen Vaf Cov FR RR cNomen pNomen PhyloP Transcript Frequentie

SEC23B 100 130 66 98 c.1298C

>T

p.Pro433

Leu

5,613 NP_116781 Populatie-

freq:

0,09131 SEC23B 100 130 66 98 c.1298C

>T

p.Pro433

Leu

5,613 NP_006354

Gen Vaf Cov FR RR cNomen pNomen PhyloP Transcript Frequentie

PLEKHM2 44,262 61 16 14 c.2699C>T p.Thr900

Met

2,385 NP_055979 Populatie-

freq: /

CMGG

freq: 0

GONL

freq: 0

60

SEC23B 100 130 66 98 c.1298C

>T

p.Pro433

Leu

5,613 NP_001166

217

CMGG

freq: 19

GONL freq:

0,152

SEC23B 100 130 66 98 c.1298C

>T

p.Pro433

Leu

5,613 NP_116780

SEC23B 100 130 66 98 c.1298C

>T

p.Pro433

Leu

5,613 NP_001166

216

Het eiwit dat door dit gen gecodeerd wordt is een lid van de SEC23 subfamilie van de

SEC23/SEC24 familie.

Deze familie is betrokken bij vesikel transport, meer bepaald bij COPII. COPII is het

manteleiwitcomplex dat betrokken is bij het transport van secretoire eiwitten van het ER naar

het Golgi-apparaat.

COPII eiwitten zijn essentieel voor de export van ongewoon grote moleculen vanuit het ER

naar het Golgi-apparaat. Deze proteïnen omvatten SAR1, het SEC23/24 complex en het

SEC13/31 complex. Biogenese van COPII wordt geïnitieerd door de activatie van SAR1, een

klein GTP-ase. Het membraangebonden SAR1-GTP recruteert dan het SEC23/24 complex.

Vervolgens recruteert het SAR1-SEC23/24 complex het SEC13/31 complex. Het is SEC23/24

dat instaat voor de herkenning van de moleculen.

Voor een homozygote missense mutatie in SEC23A, een ander lid van de SEC23 subfamilie,

werd reeds aangetoond dat zij gelinkt is aan Cranio-lenticulo-sutural dysplasia (CLSD), een

zeldzame autosomaal recessieve ziekte met skeletale defecten, hypomineralisatie en grote

fontanellen. (92) De mutatie gaat gepaard met de accumulatie van procollageen in het ER

veroorzaken. Deze mutatie zou een vroegtijdige dissociatie van COPII van het membraan

veroorzaken. Hierdoor kan procollageen niet in de vesikels worden geladen en blijft het achter

in het ER. Door mutaties worden extracellulaire matrixeiwitten (waaronder collageen) niet

gesecreteerd met abnormale craniofaciale en skeletale morfogenese tot gevolg. (93,94) Ook

stelde men reeds een heterozygote mutatie vast in SEC23A met defecten in de collageen secretie

tot gevolg. In dit geval vermoed men dat het ziektebeeld veroorzaakt wordt door een 2de mutatie

in een andere subunit van COPII of in een cargomolecule zoals collageen. (92)

61

Exoom 2: P12

Voor Exoom 2 werden bij een eerste analyse geen kandidaatgenen geselecteerd. De genen die

hieronder vermeld zijn, werden gevonden na een meer uitgebreide analyse. De inculsie van

deze genen is gebaseerd op de informatie die werd gevonden in de databanken OMIM en

GeneCards. Verder literatuurstudie omtrent deze kandidaten is vereist voordat men kan

overgaan naar de volgende stap in de analyse.

4.2.2.1 Nonsense mutaties

Na het toepassen van de filters zoals in exoom 1, werden 1 variant geselecteerd, TMPRSS11E.

Dit bleek geen goede kandidaat voor OI. Hierna werd de filter voor PhyloP aangepast zodat

ook varianten met een onbekend PhyloP werden geïncludeerd. Er werden 4 extra varianten

geselecteerd in 1 gen. Deze bleek geen goede kandidaat voor OI.

Na het aanpassen voor vaf zodat zowel homo- als heterozygote varianten werden geïncludeerd,

werd 1 extra variant hieruit gefilterd. Deze bleek geen goede kandidaat voor OI. Vervolgens

werden ook varianten met coverage < 30 geïncludeerd. Er werden 9 extra varianten in 6 genen

geselecteerd. Van deze varianten werd geen enkele weerhouden. Bij de heterozygote varianten

werden opnieuw varianten gevonden in CTBP2, zoals in exoom 1.

4.2.2.2 Frameshift mutatie

Na het toepassen van de filters zoals in exoom 1, werden geen varianten geselecteerd. De

PhyloP filter werd ook aangepast zodat ook varianten met onbekende PhyloP-waarde werden

geïncludeerd. Dit leverde 1 variant op, KLHL33, die werd verworpen.

Wanneer ook varianten met coverage < 30 werden onderzocht, werden 14 nieuwe varianten in

12 genen geselecteerd. De varianten in het gen RYK werden weerhouden. Bij het onderzoeken

van de heterozygote varianten werden 15 extra varianten in 11 genen bekomen. Ook hier duikt

het gen CTBP2 op. De andere varianten bleken geen goede kandidaten.

Gen Vaf Cov FR RR cNomen pNomen PhyloP Transcript Frequentie

RYK 100 3 1 2 c.9_10insG p.Arg4fs / NP_002949 Populatiefreq: /

CMGG freq: 0

GONL freq: 0

RYK 100 3 1 2 c.9_10insG p.Arg4fs / NP_001005861

62

4.2.2.3 Deleties

Wanneer de filters van exoom 1 werden toegepast, werden geen varianten geselecteerd. Daarom

werd de PhyloP filter aangepast zodat ook varianten met onbekende PhyloP in het exoom

werden geïncludeerd. Er werden 28 varianten in 21 genen bekomen. Van deze varianten werd

COG3 als een potentiële kandidaat geselecteerd.

Ook de varianten met coverage <30 werden onderzocht. Dit leverde 16 extra varianten in 12

genen op, waarvan er geen geselecteerd werden.

4.2.2.3.1 COG3

Gen Vaf Cov FR RR cNomen pNomen Transcript Frequentie

COG3 100 68 20 48 c.2474_2475

delTGinsCA

p.Leu825

Ser

NP_113619 Populatiefreq: /

CMGG freq: 0

GONL freq: 0

COG3 codeert voor een onderdeel van het Golgi complex, wat bestaat uit 8 subunits nodig voor

de normale Golgi morfologie en localisatie. Defecten in COG resulteren in defecten in de

eiwitglycosylatie.(76)

4.2.2.4 Splice site mutaties

Bij het toepassen van de filters zoals in exoom, werd 1 variant geselecteerd, PRDM2. Deze was

geen goede kandidaat voor OI. Vervolgens werd de PhyloP filter toegepast om ook varianten

met een onbekende PhyloP toe te laten. Dit leverde 18 extra varianten in 7 genen op. Uit deze

18 varianten werd COG3 vanwege zijn rol als component in het Golgi complex als mogelijke

kandidaat gezien, maar vanwege zijn locatie diep intronisch bleek dit toch geen goede

kandidaat.

Ook de heterozygote varianten werden onderzocht. Er werden 26 extra varianten in 14 genen

geselecteerd. Geen van deze werden weerhouden.

De PhyloP filter werd vervolgens verlaagd zodat ook waarden met PhyloP>0 werden

geïncludeerd. Er werden zo 5 extra varianten in 4 genen bekomen. Hiervan werd RAB1A

weerhouden.

63

Vervolgens werden ook varianten met coverage < 30 geïncludeerd. Er werden 30 extra

varianten in 12 genen geselecteerd, waarvan geen enkele werd weerhouden.

4.2.2.4.1 RAB1A

Gen Vaf Cov FR RR cNomen pNomen PhyloP Transcript Frequentie

RAB1A 40,541 37 15 2 c.96A>T / 0,932 NP_056358 Populatiefreq: /

CMGG freq: 0

GONL freq: 0 RAB1A 40,541 37 15 2 c.96A>T / 0,932 NP_004152

RAB1A codeert voor een lid van de Ras superfamilie van GTPasen. Dit GTPase regelt het

vesikeltransport van het ER naar het Golgi-apparaat. (95)

4.2.2.5 Missense mutaties

Wanneer de filters werden toegepast zoals in exoom 1, werden 20 varianten in 13 genen

geselecteerd. Hiervan werden EYA1 en RECK weerhouden. Vervolgens werd de PhyloP filter

aangepast zodat ook varianten met een onbekende PhyloP werden geïncludeerd. Er werden 62

extra varianten in 36 genen bekomen. Hiervan werd CRTAC1 weerhouden.

Vervolgens werd de PhyloP filter aangepast naar PhyloP > 2. Er werden 7 extra varianten in 5

genen geselecteerd. Hiervan werd ADAMTS20 weerhouden.

Ook de heterozygote varianten werden onderzocht. Volgende filters worden toegepast: vaf <

50, coverage > 30, PhyloP > 3 en rs-nummer = /. Er werden 46 varianten geselecteerd. Om dit

aantal terug te dringen werden de filters voor de predictie tools SIFT (deleterious), Polyphen

(probably damaging/possibly damaging) en Mapp (bad) gebruikt. Op deze wijze werden 6

varianten in 6 genen bekomen. Deze waren geen goede kandidaten voor OI.

4.2.2.5.1 EYA1

Gen Vaf Cov FR RR cNomen pNomen PhyloP Transcript Frequentie

EYA1 55,952 84 25 32 c.901C>

T

p.Arg301

Trp

3,999 NP_742056 Populatie-

freq: /

CMGG

freq: 0

EYA1 55,952 84 25 32 c.898C>

T

p.Arg300

Trp

3,999 NP_001275

503

64

EYA1 55,952 84 25 32 c.817C>

T

p.Arg273

Trp

3,999 NP_742057 GONL freq:

0

EYA1 55,952 84 25 32 c.916C>

T

p.Arg306

Trp

3,999 NP_742055

EYA1 55,952 84 25 32 c.550C>

T

p.Arg184

Trp

3,999 NP_001275

504

EYA1 55,952 84 25 32 c.916C>

T

p.Arg306

Trp

3,999 NP_000494

EYA1 codeert voor een eiwit dat noodzakelijk is voor de normale embryonale ontwikkeling van

het craniofaciale skelet en het skelet van de romp.(96)

4.2.2.5.2 RECK

Gen Vaf Cov FR RR cNomen pNomen PhyloP Transcript Frequentie

RECK 53,191 188 59 72 c.1657G

>T

p.Gly553

Cys

5,613 NP_066934 Populatie-

freq: /

CMGG

freq: 0

GONL

freq: 0

MMP’s zijn endopeptidases die een belangrijke rol spelen in de ECM turnover. RECK is een

MMP-regulator. (97) Osteogenesis en botremodellering zijn MMP dependente processen. (98)

4.2.2.5.3 CRTAC1

Gen Vaf Cov FR RR cNomen pNomen Transcript Frequentie

CRTAC1 69,231 65 32 21 c.499G>

A

p.Val167Met NP_06052

8

Populatiefreq:

0,86498

CMGG freq: 4

GONL freq:

0,081

65

Dit gen codeert voor een extracellulair matrix proteïne in de articulaire diepe zone van

kraakbeen. Mutaties in dit gen gaan gepaard met botbreuken.(99)

4.2.2.5.4 ADAMTS20

Gen Vaf Cov FR RR cNomen pNomen PhyloP Transcript Frequentie

ADAM

TS20

50,3

36

149 48 54 c.4598A>G p.His1533

Arg

2,142 NP_079279 Populatie-

freq: /

CMGG

freq: 0

GONL

freq: 0

Het eiwit speelt een rol in het transport van ER naar Golgi-apparaat. (100)

Exoom 3: P13

Voor Exoom 3 werd slechts 1 variant weerhouden. De analyse van het exoom gebeurde op

gelijkaardige wijze zoals gezien bij Exoom 1 en 2. Het ging om een splice site mutaties in

TAPT1.

4.2.3.1.1 TAPT1

Gen Vaf Cov FR RR c.Nomen p.Nomen PhyloP Transcript Frequentie

TAPT1 100 57 19 39 c.1108-

1G>C

/ 5,774 NP_699196 Populatie-

freq: /

CMGG freq: 0

GONL freq: 0

TAPT1 (transmembrane anterior posterior transformation) codeert voor een sterk

geconserveerd, transmembranair eiwit. Een mutatie in het ortholoog bij muizen gaf aanleiding

tot posterior-naar-anterior transformaties in het axiale skelet. Deze transformaties waren

gelijkaardig aan diegenen die gezien werden bij HOXC8 en HOXC9 gen mutaties.

66

Specificatie van de wervelkolom gebeurt vroeg in de ontwikkeling en HOX-genen spelen hier

een belangrijke rol in. Deze genen coderen voor transcriptiefactoren die genen die downstream

gelegen zijn kunnen activeren of onderdrukken. (101) TAPT1 zou stroomafwaarts van

homeobox C8 werken als effector waar het de transductie van extracellulaire informatie, nodig

voor de ontwikkeling van het axiale skelet, bewerkstelligt. (102)

TAPT1 werd onlangs bevestigd als causaal gen voor OI en reeds geïncludeerd in OI panel 2.

Het zou van belang zijn bij het transport van intracellulaire eiwitten en de organisatie van

organellen zoals het Golgi-apparaat. Het speelt waarschijnlijk ook een rol bij de ciliaire

assemblage en signaling. Door deze functies kan het inwerken op de osteogenese door

osteoblastdifferentiatie en chondrocytdifferentiaties te beïnvloeden. In vitro studies toonden

aan dat TAPT1 gelokaliseerd was in het centrosoom en/of in de regio van het ciliair basaal

lichaam en dat defecten in TAPT1 aanleiding gaven tot verandering in het opvouwen en de

secretie, alsook een effect hebben op de morfologie van het Golgi-apparaat en transport van het

plasmamembraan naar het Golgi-apparaat. Met zebravisstudies werd aangetoond dat

knockdown van tapt1b (zebravisortholoog van TAPT1) aanleiding gaf tot ernstige craniofaciale

afwijkingen, microcefalie en veralgemeende vertraagde ossificatie.(103)

67

5 Discussie

Het opzet van deze thesis was om voor Osteogenesis imperfecta, een klinisch en genetisch

heterogene aandoening, nieuwe potentieel causale genen op te sporen. De meest voorkomende

vorm van osteogenesis imperfecta is de dominante vorm met mutaties in COL1A1 en COL1A2,

die ongeveer 90% van de gevallen verklaart. De overige 10% wordt verklaard door mutaties in

recessief overgeërfde genen, met uitzondering van IFITM5, dat dominant overerft.

Ondanks de steeds groeiende lijst van causale genen, worden er elk jaar nog nieuwe causale

varianten geïdentificeerd in de reeds gekende genen. Vooraleer een nieuw gen effectief kan

beschouwd worden als een nieuw OI gen, moeten verschillende stappen doorlopen worden.

Wanneer een patiënt zich aanmeldt met een fenotype van OI, moet allereest een screening van

de gekende varianten gebeuren. Indien deze screening geen mutaties oplevert, kan men

overgaan op Whole Exome Sequencing (WES) of eventueel Whole Genome Sequencing

(WGS). Analyse van het exoom levert vaak kandidaatgenen op voor OI. Het bevestigen van de

causaliteit van deze kandidaatgenen gebeurt later via functionele studies, zoals bijvoorbeeld in

vitro studies en zebravis studies.

5.1 Screening gekende OI genen

De screening bij 10 patiënten gekend met OI fenotype leverde bij 5 patiënten een causale

mutatie op (klasse 4 of 5) in de gekende OI genen (uit OI panel 1 en 2). Van deze 5 causale

mutaties werden 4 gevonden in genen die coderen voor type I collageen (COL1A1/COL1A2).

Eén causale mutatie werd gevonden in PLS3.

In P1 werd een klasse 4 mutatie in COL1A2 vastgesteld, namelijk c.2314G>A wat aanleiding

gaf tot een eiwitverandering p.(Gly772Ser). Dit glycine bevond zich in de α-helix van type I

collageen.

Bij P4 was er sprake van een klasse 4 mutatie in COL1A1, namelijk c.484delC hetgeen

aanleiding gaf tot de eiwitverandering p.(Gln162fs) wat leidde tot nonsense mediated decay

(NMD) van het mRNA door de introductie van een stopcodon.

Bij P6 werd een causale mutatie in COL1A1 geïdentificeerd: c.370-2A>G. Dit leidt tot het

verloren gaan van de splice-acceptor site, waardoor een overslaan van exon 5 zeer

waarschijnlijk is.

68

Bij P7 werd eveneens een klasse 4 mutatie gevonden in COL1A1: c.1012G>A (p.(Gly338Ser)).

Ook hier bevindt het glycine zich in de α-helix.

Bij P8 werd een klasse 4 mutatie bevestigd in PLS3, welke aanleiding gaf tot een prematuur

stopcodon: c.766C>T , p.(Arg256*). Aangezien het hier gaat om een nonsense-mutatie is de

kans op NMD groot.

Het merendeel van de gevonden causale mutaties veroorzaakt een verandering in type I

collageen. Dit wijst op het belang van dit eiwit in de pathogenese. Ook zien we bij 2 van deze

mutaties veranderingen in glycines in de α-helix, wat de importantie van deze glycines

benadrukt voor een goede werking van het eiwit. Toch werd ook één causale variant vastgesteld

in een gen uit OI panel 2. Hoewel minder frequent de oorzaak van OI, mogen deze genen niet

vergeten worden.

P2, P3, P5, P9 en P10 blijven na deze screening genetisch onopgehelderd. De volgende stap

bij deze patënten is het evalueren van de kliniek. Indien de kliniek sterk suggestief is voor OI,

kan overgegaan worden naar Whole Exome Sequencing (WES) om op zoek te gaan naar nieuw

genen voor OI.

5.2 Whole Exome Sequencing (WES)

In het kader van deze thesis werden 3 exomen geanalyseerd. Dit waren niet de exomen van de

gescreende patiënten, maar van andere patiënten die reeds gescreend waren in het Centrum voor

Medische Genetica.

Exoom 1 (P11)

Voor Exoom 1 werden na analyse van het exoom 7 genen weerhouden als kandidaatgenen voor

OI: RYK, P4HA1, AKT2, TRAPPC12, SEC23B, ACAN en PLEKHM2.

Van de homozygote varianten leek RYK aanvankelijk een goede kandidaat vanwege de aard

van de mutatie (frameshift) en door zijn rol in WNT signaling pathway. De coverage van deze

variant was echter zeer laag, wat een fout in de sequenering kan betekenen. Dit samen met het

feit dat deze varianten gelegen waren in exon 1, hetgeen een moeilijk te sequeneren exon is,

wijst erop dat deze varianten waarschijnlijk vals positieven zijn. Bovendien werd ook Exoom

2 een variant gevonden in het RYK gen (zie 5.2.2). Toch kunnen we deze varianten niet negeren

vanwege de functie van dit eiwit. Verder analyse met Sanger sequencing is dan ook vereist.

69

P4HA1 is vanwege zijn rol in de collageenbiosynthese een zeer interessante kandidaat voor OI.

De variant in P4HA1 die ons het meest interesseerde was gelegen op de -1 positie, hetgeen een

belangrijke positie is voor splicing. Toch zou het, aangezien de coverage van deze variant zeer

laag is, kunnen gaan om een vals positief resultaat. Deze variant zal verder geanalyseerd worden

met Sanger sequencing.

De andere homozygote varianten, AKT2, TRAPPC12 en SEC23B, waren missense mutaties. Dit

soort mutaties geeft minder vaak aanleiding tot pathogeniciteit. De variant in SEC23B had

daarenboven een hoge populatiefrequentie (9,1%). Het is onwaarschijnlijk dat een variant met

zo’n hoge populatiefrequentie een relatief zeldzaam ziektebeeld als OI kan veroorzaken (zelfs

al gaat het om een recessieve vorm). Vanwege de rol van SEC23B in COPII vesikel transport

zal deze variant toch verder geanalyseerd worden.

De heterozygote varianten, ACAN en PLEKHM2, vinden bijval in de literatuur als

kandidaatgenen voor OI, maar een homozygote variant lijkt waarschijnlijker door de

consanguïniteit van de ouders.

Exoom 2 (P12)

De analyse van exoom 2 leverde aanvankelijk geen interessante varianten op. Na een tweede,

meer uitgebreide analyse werden volgende genen geselecteerd: RYK, COG3, EYA1, RECK,

CRTAC1, ADAMTS20 en RAB1A,. Deze genen werden voornamelijk geselecteerd op basis van

informatie uit de databanken GeneCards en OMIM. Verdere literatuurstudie omtrent deze

genen is dus nog vereist vooral er kan worden overgegaan naar de volgende stap in de analyse.

Bij de homozygote varianten zien we opnieuw RYK opduiken zoals in exoom 1. De varianten

bevinden zich ook deze keer in exon 1 en de coverage is laag. Dit wijst nogmaals in de richting

van een vals positief resultaat. Ook hier zullen we de varianten verder analyseren met Sanger

sequencing.

COG3 werd geselecteerd vanwege zijn rol als onderdeel van de normale morfologie en

localisatie van het Golgi complex. De predictie tool PolyPhen voorspelt echter een benigne

effect (SIFT en Mapp zijn niet gekend).

EYA1 codeert voor een eiwit dat een rol speelt in de ontwikkeling van het craniofaciale skelet

en in de ontwikkeling van het skelet van de romp. Ook is de PhyloP-waarde hoog, wat wijst op

een sterke conservatie van dit gen. Wel zagen we dat enkel SIFT en PolyPhen een negatief

effect voorspellen bij deze varianten, Mapp is niet gekend.

70

RECK is een MMP-regulator en speelt via MMP’s een rol in de osteogenesis en

botremodellering. SIFT, PolyPhen en Mapp voorspelde bij deze variant een negatief effect. De

PhyloP-waarde was hoog wat wijst op een sterke conservatie van dit gen.

CRTAC1 codeert voor een extracellulair matrix proteïne in kraakbeen. Enkel PolyPhen

voorspelde bij dit gen echter een negatief effect, SIFT en Mapp waren niet gekend. Bovendien

was de populatiefrequentie voor deze variant relatief hoog (8%).

ADAMTS20 speelt een rol in het transport van ER naar het Golgi-apparaat. Voor andere leden

van de ADAMTS-familie, namelijk ADAMTS-2, ADAMTS-3 en ADAMTS-14 werd reeds

aangetoond dat ze een rol spelen in de fibrilogenese van type I collageen (zie 1.1.4.6). De

predictie tools SIFT en PolyPhen voorspellen voor deze variant echter een benigne effect, enkel

Mapp geeft een negatief effect aan.

Bij de heterozygote varianten werd RAB1A geselecteerd. Heterozygote varianten zijn hier

opnieuw minder waarschijnlijk door de consanguïniteit van de ouders. Dit gen codeert voor een

GTPase dat het vesikeltransport regelt van het ER naar het Golgi-apparaat. Tegenargumenten

voor dit gen zijn de lage PhyloP-waarde en het grote verschil tussen het aantal forward reads

en het aantal reverse reads (respectievelijk 15 en 2). Dit laatste zou kunnen wijzen op een fout

tijdens de sequencing.

Exoom 3 (P13)

Voor exoom 3 selecteerden we slechts één variant, namelijk c. 1108-1G>C in TAPT1. Deze

variant was interessant vanwege zijn positie op -1. Het gen codeert voor een sterk

geconserveerd transmembranair eiwit.

Dit gen werd onlangs bevestigd als causaal gen voor OI en werd reeds geïncludeerd in OI panel

2. TAPT1 is een voorbeeld van een gen dat gevonden werd dankzij exoomsequencing. TAPT1

zou een rol spelen in transport van intracellulaire eiwitten en de organisatie van organellen zoals

het Golgi-apparaat. Verder is het ook belangrijk bij de ciliaire assemblage en signaling. Op deze

wijze kan het inwerken op de osteogenese door osteoblastdifferentiatie en

chondrocytdifferentiaties te beïnvloeden. Het werd later bevestigd met in vitro studies en

zebravisstudies. In vitro studies toonden aan dat TAPT1 gelokaliseerd was in het centrosoom

en/of in de regio van het ciliair basaal lichaam en dat defecten in TAPT1 aanleiding gaven tot

verandering in het opvouwen en de secretie, alsook een effect hebben op de morfologie van het

Golgi-apparaat en transport van het plasmamembraan naar het Golgi-apparaat. (103)

71

Sterktes en zwaktes van Whole Exome Sequencing

Whole Exome Sequencing is een efficiënte techniek om de allelen die aan de basis liggen van

zeldzame Mendeliaanse aandoeningen op te sporen. Naast de eiwit-coderende sequenties,

waarin zich de meerderheid van de causale varianten bevinden, worden ook splice acceptor en

donor sites gesequeneerd. Bovendien is deze techniek ondanks het steeds dalen van de prijs nog

steeds zo’n 5 keer goedkoper dan Whole Genome Sequencing. Ook is de ruwe data van Whole-

Exome sequencing qua grootte ongeveer één zesde van de ruwe data van Whole Genome

sequencing. Analyse van het exoom is dus minder tijdrovend. (104)

Hoewel Whole-Exome Sequencing (WES) een doeltreffend hulpmiddel is voor het

identificeren van nieuwe genen in verband met OI, heeft deze techniek ook haar beperkingen.

De belangrijkste beperking van Whole Exome sequencing is dat slechts 1% van het gehele

genoom wordt geanalyseerd. Deze techniek mist dus varianten in intronische sequenties alsook

structurele varianten zoals translocaties en inversies.

(102,104,105)(105)(105)(105)(105)(104)(104)(104)(104) Ook varianten in mitochondriaal

DNA worden gemist.

Een andere beperking is dat WES gecompliceerd wordt door genetische heterogeniteit zoals het

geval is bij OI alsook door gedupliceerde sequenties in het genoom. (105) Bij aandoeningen die

genetisch zeer heterogeen zijn, is het deel van het genoom dat bezet wordt door genen die,

wanneer zij mutaties bevatten, aanleiding geven tot ziekte (‘mutational target’) te groot. De

kans om 2 patiënten te vinden met mutaties in hetzelfde gen wordt dan ook veel kleiner. (106)

Door een tekort aan informatie over de functies van bepaalde genen is het bovendien soms

moeilijk een onderscheid te maken tussen schadelijke en benigne varianten. Varianten met deze

onbekende significantie zijn moeilijk te interpreteren. (105)

Incidental Findings

Bij WES en WGS kunnen incidental findings voorkomen. Incidental findings omvatten

bevindingen die als bijproduct van een diagnostische handeling worden bekomen, en

daarenboven niet te vermijden zijn. Een radioloog kan niet vermijden dat bij een thoracale

röntgenopname, met als doel hartfalen te evalueren, tevens een massa in de long wordt ontdekt.

(107) De snelheid waarmee NGS-technieken evolueren zorgen voor een gebrek aan

standaardisatie omtrent dergelijke zaken. Het ACMG (American College of Medical Genetics

and Genomics) richtte in 2012 een werkgroep op rond incidental findings in WGS (Whole

Genome Sequensing), om te grote verschillen in beleid omtrent incidental findings te

72

vermijden. (108) In 2013 werd door de werkgroep richtlijnen gepubliceerd, die als houvast

moesten dienen voor de klinische labo’s. In deze richtlijnen werd een extra panel van 56 genen

vooropgesteld. Er werd aangeraden dit panel bij elke indicatie voor WGS mee te screenen, en

de resultaten te rapporteren ongeachte de wil en leeftijd van de patiënt. (109)

Er ontstond echter grote verontwaardiging door dit voorstel om bij elke aanvraag van WGS het

extra panel te screenen en te rapporteren ongeacht de leeftijd en wil van de patiënt. (107,108)

Deze inbraak op de autonomie van de patiënt leidde tot een zekere uiting van protest. Het

algemene antwoord luidde dan ook: ‘Choice Matters’. (107)

Informed consent is zeker een struikelblok. De keuze omtrent het al dan niet ontvangen van

bepaalde resultaten in de klinische genetica blijkt complexer dan initieel gedacht. De data

betrokken bij klinische genetica blijft groeien. Deze info in een relevant en beperkt pakket

communiceren naar de verschillende stakeholders vormt dan ook een grote uitdaging. (108)

Een ander probleem omtrent dit extra panel was dat volgens peers de definitie van incidental

findings niet gerespecteerd werd in de richtlijnen. In de aanbevelingen wordt aangemoedigd

een bijkomende, doelbewuste analytische inspanning te leveren. Immers, indien men ervoor

kiest bepaalde genen niet te screenen, zijn er ook geen resultaten te melden. Er wordt dan ook

vanuit verschillende hoeken gepleit voor het erkennen dat het in de richtlijnen een bewust

zoeken naar secundaire bevindingen betreft. Een vorm van opportunistische screening

dus.(107)

Voor het gebruik van WGS/WES voor opportunistische screening is weinig tot geen evidentie

voorhanden. Tot op heden wordt WES slechts in specifieke klinische scenario’s toegepast,

bijvoorbeeld wanneer andere conventionele genetische tests falen in het verklaren van de

kliniek van de patiënt.

De richtlijnen echter opteren voor een opportunistische screening, wat niet noodzakelijk in een

klinische setting gebeurt. (107) Het gaat dus over een gebruik van WES in een compleet andere

populatie en setting dan deze waar we tot op dit moment vertrouwd mee zijn. Het effect van

dergelijk beleid op harde eindpunten is dan ook niet gekend. (108)

Er werd geconcludeerd dat op dit moment nog te weinig evidentie bestaat om een standard-of-

care op te stellen. Er is naast een robuuste dialoog ook nood aan empirische data betreffende de

kwaliteiten en zwaktes van WGS en WES in de algemene populatie. (107,108) Talrijke studies

zijn op dit moment aan de gang om deze data te vergaren.

73

Op dit moment hebben vele genetische labo’s hun eigen wetten omtrent het rapporteren van

secundaire bevindingen. In het centrum voor medische genetica UZ gent worden deze

gerapporteerd, maar enkel indien zij als klasse 4 of klasse 5 worden geclassificeerd. In deze

thesis werden verschillende secundaire bevindingen gevonden in exoom 1 en 2, maar geen van

hen konden als klasse 4 of 5 worden geclassificeerd.

5.3 Conclusie

De doelstelling van deze thesis was om nieuwe potentiële genen voor OI op te sporen. WES en

WGS zijn krachtige tools die steeds meer worden aangewend om naar deze genen op zoek te

gaan. Toch gaat het screenen van de OI panels hier nog steeds aan vooraf. Voor 5 van de 10

patiënten die voor deze thesis gescreend werden, werd een causale mutatie gevonden in de reeds

gekende genen voor OI. Enkel als er in de gekende genen geen causale mutatie wordt gevonden

en de kliniek zeer suggestief is voor OI, gaat men over naar WES en/of eventueel WGS. In het

kader van deze thesis zijn we erin geslaagd door middel van WES van drie patiënten een aantal

kandidaatgenen voor het OI voorop te stellen:

RYK, P4HA1, AKT2, TRAPPC12, SEC23B, ACAN, PLEKHM2, COG3, EYA1, RECK,

CRTAC1, ADAMTS20 en RAB1A.

Toch zien we dat deze krachtige hulpmiddelen ook schade kunnen berokken. De vraagstukken

omtrent bijvoorbeeld incidental findings adresseren is daarom een must. Gedeelde aandacht en

inzet is dan ook vereist om een kwaliteitsvolle implementatie van genomische geneeskunde in

de gezondheidszorg te verzekeren.

We vermelden ten slotte dat het verhaal hier niet ten einde is. Deze genen zijn potentieel

causaal, maar voor ze kunnen opgenomen worden in de OI panels moeten de varianten allereerst

bevestigd worden met Sanger sequencing. Indien ze bevestigd worden, zal men een segregatie-

onderzoek binnen de familie uitvoeren. Uiteindelijk zullen ook functionele studies verricht

worden zoals bijvoorbeeld in vitro studies en zebravis- en/of muisstudies. Op deze manier

zouden ze in de toekomst voor enkele patiënten uitsluitsel kunnen bieden.

74

6 Referenties

1. Lodish HF. Molecular cell biology. New York : W.H. Freeman and Co.; 2013.

2. Van Dijk FS, Pals G, Van Rijn RR, Nikkels PGJ, Cobben JM. Classification of

Osteogenesis Imperfecta revisited. Eur J Med Genet. 2010;53(1):1–5.

3. Rauch F, Glorieux FH. Osteogenesis imperfecta. Lancet. 2004;363(9418):1377–85.

4. Mienaltowski MJ, Birk DE. Structure, physiology, and biochemistry of collagens. Adv

Exp Med Biol [Internet]. 2014;802:5–29. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24443018

5. Hulmes DJS. Collagen diversity, synthesis and assembly. Collagen Struct Mech.

2008;15–47.

6. Brinckmann J. Collagens at a glance. Top Curr Chem. 2005;247:1–6.

7. Gelse K, Pöschl E, Aigner T. Collagens - Structure, function, and biosynthesis. Adv Drug

Deliv Rev. 2003;55(12):1531–46.

8. Rauch F, Glorieux FH. Osteogenesis imperfecta. Lancet [Internet].

2004;363(9418):1377–85. Available from:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0140673604160510

9. Diegelmann RF. Collagen Metabolism. Medscape; 2001.

10. Fratzl P. Collagen: Structure and mechanics. Collagen: Structure and Mechanics. 2008.

1-506 p.

11. Van Dijk FS, Cobben JM, Kariminejad A, Maugeri A, Nikkels PGJ, Van Rijn RR, et al.

Osteogenesis imperfecta: A review with clinical examples. Molecular Syndromology.

2011. p. 1–20.

12. Van Dijk FS, Sillence DO. Osteogenesis imperfecta: Clinical diagnosis, nomenclature

and severity assessment. Am J Med Genet Part A. 2014;164(6):1470–81.

13. Gajko-Galicka A. Mutations in type I collagen genes resulting in osteogenesis imperfecta

in humans. Acta Biochim Pol [Internet]. 2002;49(2):433–41. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12362985

14. Gelse K, Pöschl E, Aigner T. Collagens—structure, function, and biosynthesis. Adv

Drug Deliv Rev [Internet]. 2003;55(12):1531–46. Available from:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169409X03001820

15. Myllyharju J. Prolyl 4-hydroxylases, the key enzymes of collagen biosynthesis. Matrix

Biol. 2003;22(1):15–24.

16. Hudson DM, Eyre DR. Collagen prolyl 3-hydroxylation: a major role for a minor post-

translational modification? Connect Tissue Res [Internet]. 2013;54(4-5):245–51.

Available from:

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3995746&tool=pmcentrez

&rendertype=abstract

17. Yamauchi M, Sricholpech M. Lysine post-translational modifications of collagen.

Essays Biochem [Internet]. 2012;52:113–33. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3499978/

18. Canty EG, Kadler KE. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. J Cell Sci.

2005;118(Pt 7):1341–53.

75

19. Terajima M, Perdivara I, Sricholpech M, Deguchi Y, Pleshko N, Tomer KB, et al.

Glycosylation and cross-linking in bone type I collagen. J Biol Chem.

2014;289(33):22636–47.

20. Brinckmann J, Notbohm H, Müller PK. Collagen Biosynthesis. Collagen:Primer in

Structure, Processing and Assembly. 2005. p. 254.

21. Ishikawa Y, Bächinger HP. A molecular ensemble in the rER for procollagen maturation.

Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 2013. p. 2479–91.

22. Wilson R, Lees JF, Bulleid NJ. Protein disulfide isomerase acts as a molecular chaperone

during the assembly of procollagen. J Biol Chem. 1998;273(16):9637–43.

23. Bourhis J-M, Mariano N, Zhao Y, Harlos K, Exposito J-Y, Jones EY, et al. Structural

basis of fibrillar collagen trimerization and related genetic disorders. Nat Struct Mol Biol

[Internet]. Nature Publishing Group, a division of Macmillan Publishers Limited. All

Rights Reserved.; 2012;19(10):1031–6. Available from:

http://dx.doi.org/10.1038/nsmb.2389

24. Canty EG, Kadler KE. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. J Cell Sci

[Internet]. 2005;118(7):1341–53. Available from:

http://jcs.biologists.org/joces/118/7/1341.full.pdf

25. Boudko SP, Engel J, Bächinger HP. The crucial role of trimerization domains in collagen

folding. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 2012. p. 21–32.

26. Marini JC, Blissett AR. New Genes in Bone Development: What’s New in Osteogenesis

Imperfecta. J Clin Endocrinol Metab [Internet]. Chevy Chase, MD: Endocrine Society;

2013;98(8):3095–103. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3733862/

27. van Dijk FS, Dalgleish R, Malfait F, Maugeri A, Rusinska A, Semler O, et al. Clinical

utility gene card for: osteogenesis imperfecta. Eur J Hum Genet [Internet]. Macmillan

Publishers Limited; 2013;21(6). Available from:

http://dx.doi.org/10.1038/ejhg.2012.210

28. Gajko-Galicka A. Mutations in type I collagen genes resulting in osteogenesis imperfecta

in humans. Acta Biochim Pol. 2002;49(2):433–41.

29. Valadares ER, Carneiro TB, Santos PM, Oliveira AC, Zabel B. What is new in genetics

and osteogenesis imperfecta classification? J Pediatr (Rio J) [Internet]. Sociedade

Brasileira de Pediatria; 2014;90(6):536–41. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25046257

30. Shaker JL, Albert C, Fritz J, Harris G. Recent developments in osteogenesis imperfecta

[ v1 ; ref status : indexed , http://f1000r.es/5ao ] Referee Status : 2015;4:2–11.

31. Roy Morello PWE. Osteogenesis Imperfecta. :30. Available from:

http://www.oif.org/site/DocServer/A_Chapter_on_Osteogenesis_Imperfecta_by_Roy_

Morello_and_.pdf

32. Van Dijk FS, Sillence DO. Osteogenesis imperfecta: Clinical diagnosis, nomenclature

and severity assessment. Am J Med Genet A [Internet]. Oxford, UK: BlackWell

Publishing Ltd; 2014;164(6):1470–81. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4314691/

33. Forin V. Osteogenesis imperfecta type 5 [Internet]. [cited 2016 Mar 31]. Available from:

http://www.orpha.net/consor/cgi-bin/OC_Exp.php?lng=en&Expert=216828

34. Symoens S, Hulmes DJS, Bourhis J-M, Coucke PJ, De Paepe A, Malfait F. Type I

76

Procollagen C-Propeptide Defects: Study of Genotype–Phenotype Correlation and

Predictive Role of Crystal Structure. Hum Mutat [Internet]. 2014;35(11):1330–41.

Available from: http://dx.doi.org/10.1002/humu.22677

35. Dalgleish R. The Human Collagen Mutation Database 1998. Nucleic Acids Res.

1998;26(1):253–5.

36. Hanagata N. IFITM5 mutations and osteogenesis imperfecta. J Bone Miner Metab

[Internet]. 2015;1–9. Available from: http://dx.doi.org/10.1007/s00774-015-0667-1

37. Homan EP, Rauch F, Grafe I, Lietman C, Doll JA, Dawson B, et al. Mutations in

SERPINF1 Cause Osteogenesis Imperfecta Type VI. J Bone Miner Res [Internet].

Hoboken: Wiley Subscription Services, Inc., A Wiley Company; 2011;26:2798–803.

Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3214246/

38. Baldridge D, Schwarze U, Morello R, Lennington J, Bertin TK, Pace JM, et al. CRTAP

AND LEPRE1 MUTATIONS IN RECESSIVE OSTEOGENESIS IMPERFECTA. Hum

Mutat [Internet]. 2008;29(12):1435–42. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2671575/

39. van Dijk FS, Nesbitt IM, Zwikstra EH, Nikkels PGJ, Piersma SR, Fratantoni SA, et al.

PPIB Mutations Cause Severe Osteogenesis Imperfecta. Am J Hum Genet [Internet].

Elsevier; 2009;85(4):521–7. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2756556/

40. Christiansen HE, Schwarze U, Pyott SM, AlSwaid A, Al Balwi M, Alrasheed S, et al.

Homozygosity for a Missense Mutation in SERPINH1, which Encodes the Collagen

Chaperone Protein HSP47, Results in Severe Recessive Osteogenesis Imperfecta. Am J

Hum Genet [Internet]. Elsevier; 2010;86(3):389–98. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2833387/

41. Kelley BP, Malfait F, Bonafe L, Baldridge D, Homan E, Symoens S, et al. Mutations in

FKBP10 Cause Recessive Osteogenesis Imperfecta and Bruck Syndrome. J Bone Miner

Res [Internet]. Wiley Subscription Services, Inc., A Wiley Company; 2011;26(3):666–

72. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3179293/

42. Lapunzina P, Aglan M, Temtamy S, Caparrós-Martín JA, Valencia M, Letón R, et al.

Identification of a Frameshift Mutation in Osterix in a Patient with Recessive

Osteogenesis Imperfecta. Am J Hum Genet [Internet]. Elsevier; 2010;87(1):110–4.

Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2896769/

43. Martínez-Glez V, Valencia M, Caparrós-Martín JA, Aglan M, Temtamy S, Tenorio J, et

al. Identification of a Mutation Causing Deficient BMP1/mTLD Proteolytic Activity in

Autosomal Recessive Osteogenesis Imperfecta. Hum Mutat [Internet]. 2012;33(2):343–

50. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3725821/

44. Volodarsky M, Markus B, Cohen I, Staretz-Chacham O, Flusser H, Landau D, et al. A

Deletion Mutation in TMEM38B Associated with Autosomal Recessive Osteogenesis

Imperfecta. Hum Mutat [Internet]. 2013;34(4):582–6. Available from:

http://dx.doi.org/10.1002/humu.22274

45. Pyott SM, Tran TT, Leistritz DF, Pepin MG, Mendelsohn NJ, Temme RT, et al. WNT1

mutations in families affected by moderately severe and progressive recessive

osteogenesis imperfecta. Am J Hum Genet [Internet]. The American Society of Human

Genetics; 2013;92(4):590–7. Available from:

http://dx.doi.org/10.1016/j.ajhg.2013.02.009

46. Keupp K, Beleggia F, Kayserili H, Barnes AM, Steiner M, Semler O, et al. Mutations in

77

WNT1 cause different forms of bone fragility. Am J Hum Genet. 2013;92(4):565–74.

47. Murakami T, Saito A, Hino S, Kondo S, Kanemoto S, Chihara K, et al. Signalling

mediated by the endoplasmic reticulum stress transducer OASIS is involved in bone

formation. Nat Cell Biol [Internet]. 2009;11(10):1205–11. Available from:

http://dx.doi.org/10.1038/ncb1963

48. Symoens S, Malfait F, D’hondt S, Callewaert B, Dheedene A, Steyaert W, et al.

Deficiency for the ER-stress transducer OASIS causes severe recessive osteogenesis

imperfecta in humans. Orphanet J Rare Dis [Internet]. 2013;8:154. Available from:

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3850743&tool=pmcentrez

&rendertype=abstract

49. CREB3L1 Genecards [Internet]. Available from: http://www.genecards.org/cgi-

bin/carddisp.pl?gene=CREB3L1&keywords=CREB3L1

50. van Dijk FS, Zillikens MC, Micha D, Riessland M, Marcelis CLM, de Die-Smulders CE,

et al. PLS3 mutations in X-linked osteoporosis with fractures. N Engl J Med.

2013;369(16):1529–36.

51. Ha-Vinh R, Alanay Y, Bank RA, Campos-Xavier AB, Zankl A, Superti-Furga A, et al.

Phenotypic and molecular characterization of Bruck syndrome (Osteogenesis imperfecta

with contractures of the large joints) caused by a recessive mutation in PLOD2. Am J

Med Genet. 2004;131 A(2):115–20.

52. PLOD2 - Genecards [Internet]. Available from: http://www.genecards.org/cgi-

bin/carddisp.pl?gene=PLOD2&keywords=PLOD2

53. Niyibizi C, Wang S, Mi Z, Robbins PD. Gene therapy approaches for osteogenesis

imperfecta. Gene Ther [Internet]. 2004;11(4):408–16. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14724682

54. Glorieux FH. Experience with bisphosphonates in osteogenesis imperfecta. Pediatrics.

2007;119 Suppl(March 2007):S163–5.

55. Thomas IH, DiMeglio LA. Advances in the Classification and Treatment of

Osteogenesis Imperfecta. Curr Osteoporos Rep [Internet]. 2016;1–9. Available from:

http://link.springer.com/10.1007/s11914-016-0299-y

56. Antoniazzi F, Bertoldo F, Mottes M, Valli M, Sirpresi S, Zamboni G, et al. Growth

hormone treatment in osteogenesis imperfecta with quantitative defect of type I collagen

synthesis. J Pediatr [Internet]. 1996 Sep [cited 2016 Apr 4];129(3):432–9. Available

from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S002234769670077X

57. Besio R, Forlino A. New frontiers for dominant osteogenesis imperfecta treatment:

gene/cellular therapy approaches. Cold Spring Harb Perspect Med. 2013;1.

58. Doudna JA, Charpentier E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.

Science (80- ) [Internet]. 2014;346(6213):1258096–1258096. Available from:

http://www.sciencemag.org/content/346/6213/1258096.long

59. Horwitz EM, Prockop DJ, Gordon PL, Koo WWK, Fitzpatrick LA, Neel MD, et al.

Clinical responses to bone marrow transplantation in children with severe osteogenesis

imperfecta. Blood [Internet]. 2001 Mar 1;97(5):1227–31. Available from:

http://www.bloodjournal.org/content/97/5/1227.abstract

60. Götherström C, Westgren M, Shaw SWS, Åström E, Biswas A, Byers PH, et al. Pre- and

Postnatal Transplantation of Fetal Mesenchymal Stem Cells in Osteogenesis Imperfecta:

A Two-Center Experience. Stem Cells Transl Med [Internet]. Durham, NC, USA:

78

AlphaMed Press; 2014;3(2):255–64. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3925052/

61. Schuelke M. An economic method for the fluorescent labeling of PCR fragments. Nat

Biotechnol. 2000;18(February):233–4.

62. Sanger sequencing [Internet]. Available from: http://www.vce.bioninja.com.au/aos-3-

heredity/molecular-biology-technique/sequencing.html

63. Pollard KS, Hubisz MJ, Rosenbloom KR, Siepel A. Detection of nonneutral substitution

rates on mammalian phylogenies. Genome Res. 2010;20(1):110–21.

64. Gillespie JH. Population Genetics: A concise guide [Internet]. A Concise Guide. 2004.

214 p. Available from:

http://books.google.com/books?id=KAcAfiyHpcoC&printsec=frontcover&dq=populati

on+genetics+gillespie&hl=&cd=1&source=gbs_api\npapers3://publication/uuid/8113D

0CA-1F97-486B-84B7-86B37ACBE7DB

65. rs-nummers [Internet]. Available from: https://customercare.23andme.com/hc/en-

us/articles/202907650-What-are-all-the-rs-numbers-rsids-

66. Bhagwat M. Searching NCBI’s dbSNP database. Curr Protoc Bioinforma.

2010;(SUPP.32).

67. Nonsense mutation [Internet]. [cited 2016 Apr 3]. Available from:

http://www.nature.com/scitable/definition/nonsense-mutation-228

68. Frameshift mutation / frame-shift mutation; frameshift [Internet]. [cited 2016 Apr 3].

Available from: http://www.nature.com/scitable/definition/frameshift-mutation-frame-

shift-mutation-frameshift-203)

69. Paepe A De. Klinische genetica. Gent: Universiteit Gent; 2015.

70. Lodish BA, Zipursky SL. Mutations : Types and Causes. Molecular Cell Biology 4th

Edition [Internet]. 4th ed. 2000. p. Section 8.1 Mutations: Types and Causes. Available

from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21578/

71. RYK Gene(Protein Coding): Receptor-Like Tyrosine Kinase [Internet]. [cited 2016 Feb

27]. Available from: http://www.genecards.org/cgi-

bin/carddisp.pl?id_type=entrezgene&id=6259

72. Victor A. McKusick AH. RYK RECEPTOR-LIKE TYROSINE KINASE; RYK

[Internet]. 1995. Available from: http://www.omim.org/entry/600524

73. Lu W, Yamamoto V, Ortega B, Baltimore D. Mammalian Ryk Is a Wnt Coreceptor

Required for Stimulation of Neurite Outgrowth. Cell [Internet]. 2004;119(1):97–108.

Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S009286740400892X

74. Ryk: A Wnt Co-receptor at the Intersection of Frizzled & Dishevelled [Internet]. [cited

2016 Feb 27]. Available from: https://www.rndsystems.com/resources/articles/ryk-wnt-

co-receptor-intersection-frizzled-dishevelled

75. Fragiadaki M, Ikeda T, Witherden A, Mason RM, Abraham D, Bou-Gharios G. High

doses of TGF-β potently suppress type I collagen via the transcription factor CUX1. Mol

Biol Cell. 2011;22:1836–44.

76. COG3 Gene (Protein Coding): Component Of Oligomeric Golgi Complex 3 [Internet].

[cited 2016 Apr 3]. Available from: http://www.genecards.org/cgi-

bin/carddisp.pl?gene=COG3

77. Burset M, Seledtsov IA, Solovyev V V. Analysis of canonical and non-canonical splice

79

sites in mammalian genomes. Nucleic Acids Res [Internet]. Oxford, UK: Oxford

University Press; 2000;28(21):4364–75. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC113136/

78. P4HA1 Gene(Protein Coding): Prolyl 4-Hydroxylase, Alpha Polypeptide I [Internet].

[cited 2016 Mar 16]. Available from: http://www.genecards.org/cgi-

bin/carddisp.pl?gene=P4HA1

79. PROCOLLAGEN-PROLINE, 2-OXOGLUTARATE-4-DIOXYGENASE, ALPHA

SUBUNIT, ISOFORM 1; P4HA1 [Internet]. Available from:

http://www.omim.org/entry/176710

80. Peng X, Xu P-Z, Chen M-L, Hahn-Windgassen A, Skeen J, Jacobs J, et al. Dwarfism,

impaired skin development, skeletal muscle atrophy, delayed bone development, and

impeded adipogenesis in mice lacking Akt1 and Akt2. Genes Dev [Internet]. Cold Spring

Harbor Laboratory Press; 2003;17(11):1352–65. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC196068/

81. AKT2 Gene(Protein Coding): V-Akt Murine Thymoma Viral Oncogene Homolog 2

[Internet]. [cited 2016 Feb 28]. Available from: http://www.genecards.org/cgi-

bin/carddisp.pl?gene=AKT2

82. V-AKT MURINE THYMOMA VIRAL ONCOGENE HOMOLOG 2; AKT2 [Internet].

[cited 2016 Feb 28]. Available from: http://www.omim.org/entry/164731

83. Mukherjee A, Wilson EM, Rotwein P. Selective Signaling by Akt2 Promotes Bone

Morphogenetic Protein 2-Mediated Osteoblast Differentiation. Mol Cell Biol [Internet].

American Society for Microbiology (ASM); 2010;30(4):1018–27. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2815574/

84. TRAFFICKING PROTEIN PARTICLE COMPLEX, SUBUNIT 12; TRAPPC12

[Internet]. [cited 2016 Mar 16]. Available from:

http://www.omim.org/entry/614139?search=TRAPPC12&highlight=trappc12

85. Sacher M, Jiang Y, Barrowman J, Scarpa A, Burston J, Zhang L, et al. TRAPP, a highly

conserved novel complex on the cis-Golgi that mediates vesicle docking and fusion.

EMBO J [Internet]. 1998;17(9):2494–503. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1170591/

86. Scrivens PJ, Noueihed B, Shahrzad N, Hul S, Brunet S, Sacher M. C4orf41 and TTC-15

are mammalian TRAPP components with a role at an early stage in ER-to-Golgi

trafficking. Mol Biol Cell [Internet]. The American Society for Cell Biology;

2011;22(12):2083–93. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3113772/

87. Sacher M, Jiang Y, Barrowman J, Scarpa A, Burston J, Zhang L, et al. TRAPP, a highly

conserved novel complex on the cis-Golgi that mediates vesicle docking and fusion.

EMBO J. 1998;17(9):2494–503.

88. ACAN [Internet]. [cited 2016 Mar 16]. Available from:

https://ghr.nlm.nih.gov/gene/ACAN

89. Stattin E-L, Wiklund F, Lindblom K, Önnerfjord P, Jonsson B-A, Tegner Y, et al. A

Missense Mutation in the Aggrecan C-type Lectin Domain Disrupts Extracellular Matrix

Interactions and Causes Dominant Familial Osteochondritis Dissecans. Am J Hum Genet

[Internet]. Elsevier; 2010;86(2):126–37. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2820178/

90. Gene Family: Pleckstrin homology domain containing (PLEKH) [Internet]. [cited 2016

80

Mar 16]. Available from: http://www.genenames.org/cgi-bin/genefamilies/set/682

91. Bianchi L, Gagliardi A, Maruelli S, Besio R, Landi C, Gioia R, et al. Altered cytoskeletal

organization characterized lethal but not surviving Brtl+/− mice: insight on phenotypic

variability in osteogenesis imperfecta. Hum Mol Genet [Internet]. 2015;24(21):6118–33.

Available from: http://hmg.oxfordjournals.org/content/24/21/6118.abstract

92. Boyadjiev SA, Kim S-D, Hata A, Haldeman-Englert C, Zackai EH, Naydenov C, et al.

Cranio-lenticulo-sutural dysplasia associated with defects in collagen secretion. Clin

Genet [Internet]. Blackwell Publishing Ltd; 2011 Aug 1;80(2):169–76. Available from:

http://dx.doi.org/10.1111/j.1399-0004.2010.01550.x

93. Kim S-D, Pahuja KB, Ravazzola M, Yoon J, Boyadjiev SA, Hammamoto S, et al.

SEC23-SEC31 the Interface Plays Critical Role for Export of Procollagen from the

Endoplasmic Reticulum. J Biol Chem [Internet]. 9650 Rockville Pike, Bethesda, MD

20814, U.S.A.: American Society for Biochemistry and Molecular Biology;

2012;287(13):10134–44. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3323018/

94. Townley AK, Feng Y, Schmidt K, Carter DA, Porter R, Verkade P, et al. Efficient

coupling of Sec23-Sec24 to Sec13-Sec31 drives COPII-dependent collagen secretion

and is essential for normal craniofacial development. J Cell Sci [Internet].

2008;121(18):3025–34. Available from:

http://jcs.biologists.org/content/121/18/3025.abstract

95. RAB1A Gene (Protein Coding): RAB1A, Member RAS Oncogene Family [Internet].

[cited 2016 Apr 3]. Available from: http://www.genecards.org/cgi-

bin/carddisp.pl?gene=RAB1A

96. EYA1 Gene (Protein Coding): EYA Transcriptional Coactivator And Phosphatase 1

[Internet]. [cited 2016 Apr 3]. Available from: http://www.genecards.org/cgi-

bin/carddisp.pl?gene=EYA1&keywords=EYA1

97. RECK Gene (Protein Coding): Reversion-Inducing-Cysteine-Rich Protein With Kazal

Motifs [Internet]. [cited 2016 Apr 3]. Available from: http://www.genecards.org/cgi-

bin/carddisp.pl?gene=RECK&keywords=RECK

98. Accorsi-Mendonça T, Paiva KB da S, Zambuzzi WF, Cestari TM, Lara VS, Sogayar

MC, et al. Expression of matrix metalloproteinases-2 and -9 and RECK during alveolar

bone regeneration in rat. J Mol Histol [Internet]. 2007;39(2):201–8. Available from:

http://dx.doi.org/10.1007/s10735-007-9152-z

99. CRTAC1 Gene (Protein Coding): Cartilage Acidic Protein 1 [Internet]. [cited 2016 Apr

3]. Available from: http://www.genecards.org/cgi-

bin/carddisp.pl?gene=CRTAC1&keywords=CRTAC1

100. ADAMTS20 Gene (Protein Coding): ADAM Metallopeptidase With Thrombospondin

Type 1 Motif, 20 [Internet]. [cited 2016 Apr 3]. Available from:

http://www.genecards.org/cgi-

bin/carddisp.pl?gene=ADAMTS20&keywords=ADAMTS20

101. Howell GR, Shindo M, Murray S, Gridley T, Wilson LA, Schimenti JC. Mutation of a

Ubiquitously Expressed Mouse Transmembrane Protein (Tapt1) Causes Specific

Skeletal Homeotic Transformations. Genetics [Internet]. Copyright © 2007 by the

Genetics Society of America; 2007;175(2):699–707. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1800629/

102. TAPT1 Gene(Protein Coding): Transmembrane Anterior Posterior Transformation 1

81

[Internet]. [cited 2016 Mar 16]. Available from: http://www.genecards.org/cgi-

bin/carddisp.pl?gene=TAPT1&keywords=TAPT1

103. Symoens S, Barnes AM, Gistelinck C, Malfait F, Guillemyn B, Steyaert W, et al. Genetic

Defects in TAPT1 Disrupt Ciliogenesis and Cause a Complex Lethal

Osteochondrodysplasia. Am J Hum Genet [Internet]. 2015;97(4):521–34. Available

from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0002929715003316

104. Goh G, Choi M. Application of Whole Exome Sequencing to Identify Disease-Causing

Variants in Inherited Human Diseases. Genomics Inform [Internet]. Korea Genome

Organization; 2012 Dec 31;10(4):214–9. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3543920/

105. GENOMIC STRATEGY CONSULTING. Exome Sequencing: The Next Wave in

Identifying Rare Genes, Making Diagnoses, and Finding Effective Treatments. 2011;

106. Gilissen C, Hoischen A, Brunner HG, Veltman JA. Disease gene identification strategies

for exome sequencing. Eur J Hum Genet [Internet]. Nature Publishing Group;

2012;20(5):490–7. Available from:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3330229/

107. Burke W, Matheny Antommaria AH, Bennett R, Botkin J, Clayton EW, Henderson GE,

et al. Recommendations for returning genomic incidental findings? We need to talk!

Genet Med. 2013;15(11):854–9.

108. Roche MI, Berg JS. Incidental Findings with Genomic Testing: Implications for Genetic

Counseling Practice. Curr Genet Med Rep [Internet]. 2015;3(4):166–76. Available from:

http://link.springer.com/10.1007/s40142-015-0075-9

109. Green RC, Berg JS, Grody WW, Kalia SS, Korf BR, Martin CL, et al. ACMG

recommendations for reporting of incidental findings in clinical exome and genome

sequencing. Genet Med [Internet]. 2013;15(7):565–74. Available from:

http://www.nature.com/gim/journal/v15/n7/full/gim201373a.html\nhttp://www.nature.c

om/gim/journal/v15/n7/pdf/gim201373a.pdf\nhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23

788249

110. X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda [Internet]. [cited 2016 Apr 3]. Available

from: https://ghr.nlm.nih.gov/condition/x-linked-spondyloepiphyseal-dysplasia-tarda

I

7 Bijlagen

7.1 Gebruikte materialen

Polymerase Chain Reaction (Bijlage 1)

Thermo-Fastqf® 96, non-skirted: 0,2 ml 96-well PCR plate (Thermo Scientific)

VWR International Vortex

Centrifuge Sigma (Model: 2 – 16P

Epjes

o Microcentrifuge Tubes (transparant): 1,5 ml

o Safe Seal Microcentrifuge Tubes: 0,65 ml (Sorenson BioScience, Inc)

o Thermo-Tube (transparant): 0,2 ml (Thermo Scientific)

o Thermo Scientific 8 – tube strips w/ Ultraclear attached caps 0,2 ml

Pipettips

o Pipettip voor Gilson Repetman: Brand PD – tips sterile 0,5 ml

o Grenier Bio – one 10 µl filter tips steriel

o Thermo Scientific ART tips Barrier and Non – filtered pipette tips 20 µl/100

µl/200 µl/1000 µl

Pipetten

o Gilson Repetman

o Pipet 1-10µl (Gilson)

o Pipet 0,2-2µl (Gilson)

o Pipet P20 (Gilson)

o Pipet P1000 (Gilson)

o Multichannel Thermo Scientific Finnipipette F1 1-10µl

o Multichannel Gilson 0,5 – 10µl

Seals

o Adhesive PCR Film: transparante thermo-seal

Thermal Cycler Applied Biosystems 2720

Steriele, latex- en poedervrije handschoenen (Ecoshield® )

Labojas

II

Sanger sequencing (Bijlage 2)

Thermoqf-Fast® 96, non-skirted: 0,2 ml 96-well PCR plate (Thermo Scientific)

VWR International Vortex / Vortex Genie-2

Centrifuge

o Eppendorf 5415D

o Eppendorf 5430

Epjes

o Microcentrifuge Tubes (transparant): 1,5 ml

o Safe Seal Microcentrifuge Tubes: 0,65 ml (Sorenson BioScience, Inc)

o Thermo-Tube (transparant): 0,2 ml (Thermo Scientific)

o Thermo Scientific 8 – tube strips w/ Ultraclear attached caps 0,2 ml

Pipettips

o Pipettip voor Gilson Repetman: Brand PD – tips sterile 0,5 ml

o Sapphire by Grenier Bio – one 10 µl filter tips steriel

o Thermo Scientific ART tips Barrier and Non – filtered pipette tips 100µl

Pipetten

o Gilson Repetman

o Pipet 1-10µl (Gilson)

o Pipet P1000 (Gilson)

o Multichannel Thermo Scientific Finnipipette F1 1-10µl/10 – 100 µl

o Multichannel Thermo Electron Corporation 1 – 10µl

o Multichannel Gilson 0,5 – 10µl

Seals

o Adhesive PCR Film: transparante thermo-seal

o Seal voor GSU

Thermal Cycler Applied Biosystems 2720

Magnetische plaat

Steriele, latex- en poedervrije handschoenen (Ecoshield® )

Labojas

III

7.2 Resultaten MiSeq

OI panel 1 (Bijlage 3)

OI Panel 1 Patiënt D1408886 – P1 D1315158 – P2 D1314678 – P3 D1409121 – P4 D1313320 – P5

COL1A1 Assay (Exon) 33(5), 39(5) 13(40), 22(21), 29(20),

29(19), 29(19), 31(6),

33(5), 34(3), 36(51) P47,

39(5), 44(15), 49(13)

18(32), 33(5),

34(2), 36(51), 39(5)

13(40), 30(9), 31(6),

33(5), 36(51), 39(5),

41(29) P39, 44(14)

22(22), 29(19),

29(20), 29(20), 33(5),

34(2), 36(51), 39(1)

COL1A2 Assay (Exon) 13(22), 15(18), 16(20),

17(19), 25(34), 26(38),

30(40), 33(46), 34(42),

7(10), 8(9), 9(16)

14(23), 17(19) P15, 2(2),

26(38), 39(11)

11(15), 20(26),

27(37), 28(36),

37(49), 20(26)

11(15), 20(26), 25(34),

28(36), 33(46), 36(50),

41(32) P75, 44(52),

20(26)

Resultaat Sanger Positief/Negatief POSITIEF NEGATIEF NEGATIEF POSITIEF NEGATIEF

OI Panel 1 Patiënt D1408842 – P6 D1408840 – P7 D1411248 – P8 D1411333 – P9 D1313320 – P10

COL1A1 Assay (Exon) 17(31), 24(16), 25(25),

27(23), 33(5), 39(5)

24(16), 33(5), 36(51),

39(5)

22(21), 33(5) P31,

34(2), 36(51) P47,

39(5)

13(40), 14(35), 16(33)

P14, 17(31), 30(9),

33(5), 39(5), 6(43),

7(40), 8(39), 9(45)

22(22), 29(21), 33(5),

34(2), 36(51) P47,

39(5), 44(15)

COL1A2 Assay (Exon) 22(28), 23(30), 24(31),

25(34), 26(38), 27(37),

28(36), 29(39)

/ / / 20(26), 25(34),

26(38), 7(9), E26(26)

Resultaat Sanger Positief/Negatief POSITIEF POSITIEF NEGATIEF NEGATIEF NEGATIEF

IV

OI panel 2 (Bijlage 4)

OI Panel 2 Patiënt D1408886 – P1 D1315158 – P2 D1314678 – P3 D1409121 – P4 D1313320 – P5

CRTAP Assay(Exon) 2(1), 4(2) 2(1), 4(2), 8(6), 9(7) / 2(1), 8(6), 9(7) 1(1), 2(1)

LEPRE1 Assay(Exon) / 10(8), 16(2), 17(1), 18(1) 10(8), 8(10) 10(8), 15(3), 16(2), 17(1), 18(1),

3(13), 8(10), 9(9)

17(1), 18(1)

PPIB Assay(Exon) / / / / 4(1)

FKBP10 Assay(Exon) 17(2), 2(1), 9(7) 11(8), 13(10), 17(2), 2(1),

6(5), 7(5), 9(7)

2(1), 9(7) 11(8), 13(10) 11(8),2(1), 9(7)

SP7 Assay(Exon) 7(3) 9(2) 9(2)

SERPINH1 Assay(Exon) 13(5), 6(2) 6(2), 6(2) 6(2) 6(2) 12(6), 13(6), 6(2)

SERPINF1 Assay(Exon) 8(8) 8(8) 4(4), 8(8) 2(2), 4(4) P4, 6(6), 8(8)

BMP1 Assay(Exon) 1(1), 16(14) 1(1), 10(11), 3(5), 5(5),

7(7)

1(1), 27(19) 1(1), 27(19) P18 1(1), 24(16), 27(19),

3(5), 5(5)

TMEM38B Assay(Exon) 6(1)

WNT1 Assay(Exon) 1(1), 3(3)

PLS3 Assay(Exon) 1(6), 10(8), 11(4),

14(16), 2(11), 3(3),

4(7), 5(9)

1(6), 10(8), 14(16) 10(8), 14(16) 1(6), 10(8), 14(16) 1(6), 10(8), 14(16),

15(5), 2(11),4(7)

PLOD2 Assay(Exon) 25(8), 28(5), 32(2),

41(20)

40(15) 24(9), 33(1), 40(15),

41(20), 9(16)

CREB3L1 Assay(Exon) 10(11) P2, 11(12)

P3,7(7), 7(7)

10(11) P2, 11(12) P3, 3(3),

6(6)

10(11) P2, 11(12)

P3

10(11) P2, 11(12) P3, 3(3) 10(11) P2, 11(12) P3,

12(2), 13(9), 3(3)

IFITM5 Assay(Exon) 1(1) 1(1), 2(2) 1(1) P3, 2(2)

V

TAPT1 Assay(Exon) 1(1), 14(12), 15(2)

P1, 16(3), 5(5) P2,

5(5)

1(1), 16(3), 5(5) 1(1), 15(2) P1,

16(3), 5(5) P2, 5(5)

1(1), 10(11), 12(13), 14(12),

15(2) P1, 16(3), 18(4), 5(5) P2,

5(5), 9(10)

1(1), 15(2), 16(3), 5(5)

Resultaat

Sanger

Positief/Negatief POSITIEF POSITIEF NEGATIEF NEGATIEF POSITIEF

OI Panel 2 Patiënt D1408842 – P6 D1408840 – P7 D1411248 – P8 D1411333 – P9 D1313320 – P10

CRTAP Assay(Exon) 2(1) 2(1) 2(1) 2(1) P1, 9(7)

LEPRE1 Assay(Exon) / / 14(4) 3(13)

PPIB Assay(Exon) / / 10(4)

FKBP10 Assay(Exon) 2(1) P3 2(1) 2(1) 2(1) P18 2(1)

SP7 Assay(Exon) / /

SERPINH1 Assay(Exon) 6(3) 6(3) 6(3), 6(3) 6(3) 6(3)

SERPINF1 Assay(Exon) / / / / 8(8)

BMP1 Assay(Exon) / 1(1), 18(16), 23(13),

27(19), 28(16)

1(13) 1(1), 27(19) P6, 3(5),

5(5)

14(15), 16(14),

24(16), 27(19), 3(5),

4(3), 5(5), 6(6)

TMEM38B Assay(Exon) / / / /

WNT1 Assay(Exon) / / / /

PLS3 Assay(Exon) 10(8), 14(16) 10(8), 14(16), 8(14) 1(6), 10(8), 10(8),

8(14)

1(6), 10(8), 10(8),

14(16), 4(7)

10(8), 14(16), 3(3),

4(7), 5(9), 8(14)

PLOD2 Assay(Exon) / / 26(7), 27(6), 28(5),

29(4), 30(3) P5,

32(2), 33(1), 40(15)

/ 41(20) P30

VI

CREB3L1 Assay(Exon) 10(11) P2, 11(12) P3,

5(5), 7(7)

10(11) P2, 11(12) P3 10(11) P2, 11(12) P3,

3(3)

10(11) P2, 11(12) P3,

12(2) P16, 3(3)

10(11) P2, 11(12) P3,

3(3)

IFITM5 Assay(Exon) / 1(1) P3 / 1(1) P3, 2(2) 1(1), 2(2)

TAPT1 Assay(Exon) 1(1), 15(2) P1, 16(3),

5(5), 5(5)

1(1), 15(2) P1, 16(3),

5(5) P2, 5(5)

1(1), 5(5) 1(1), 15(2) P1, 16(3),

5(5) P2, 5(5)

1(1), 16(3), 5(5), 4(4)

Resultaat

Sanger

Positief/Negatief NEGATIEF NEGATIEF POSITIEF NEGATIEF NEGATIEF

VII

7.3 Sanger Sequencing Report

Sequencing Report van de mutatie gevonden in CRTAP-4 toont een nucleotideverandering van A naar G zowel in de forward als reverse read (heterozygoot).

VIII

7.4 Ford – Variantclassificatie

P1 – COL1A2 (Bijlage 5)

IX

P1 en P2 – CRTAP (Bijlage 6)

X

P1 – PLOD2 (Bijlage 7)

XI

P3, P6, P7 en P9 – TAPT1 – P1 (Bijlage 8)

XII

P1, P3, P4, P7 en P9 – TAPT1 – P2 (Bijlage 9)

XIII

P4 – COL1A1 (Bijlage 10)

XIV

P6 – COL1A1 (Bijlage 11)

XV

P7 – COL1A1 (Bijlage 12)

XV

I

P5 – CREB3L1 (Bijlage 13)

XV

II

P6 – CREB3L1 (Bijlage 14)

XV

III

P7 – BMP1 (Bijlage 15)

XIX

P8 – PLS3 (Bijlage 16)

XX

P10 – BMP1 (Bijlage 17)

XX

I

7.5 Exoomanalyse (Bijlage 18)

Voorbeeld Excel-bestand exoom