Gebruik van selectieve media voor - UZ Leuven · Gebruik van selectieve media voor Burkholderia...
Transcript of Gebruik van selectieve media voor - UZ Leuven · Gebruik van selectieve media voor Burkholderia...
Gebruik van selectieve media voor Burkholderia cepacia complex bij
mucoviscidose
Apr. D. Kieffer
24/03/2009
Mucoviscidose
cystic fibrosis of taaislijmziekte
• mutaties thv CFTR-gen
• autosomaal recessecief
• blanke populatie
• dragerschap: ± 1/22
± 1/2000 geboortes in België
± 40-50 kinderen/jaar
± 1100 mucopatiënten in België(Belgische Vereniging voor Strijd tegen Mucoviscidose)
24/03/2009 3Apr. D. Kieffer
US
Nat
ion
al L
ibra
ry o
f M
edic
ine
Mucoviscidose
Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator
• Cl- kanaal: actief transport
• andere ionenkanalen (ORCC, ROMK1en ROMK2, ENaC)
• ATP-transport
• invloed exo- & endocytose
• organel pH-regulatie
24/03/2009 4Apr. D. Kieffer
Li et al. Sheng Li Xue Bao 2007; 59: 416-430
Mucoviscidose
Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator
deficiënties:
• verstoord ionen transport
• viskeuze kliersecreties
• verstoorde klaring thv
– longen
– GI tractus
– voortplantingsorganen
– ...
24/03/2009 5Apr. D. Kieffer
Li et al. Sheng Li Xue Bao 2007; 59: 416-430
Mucoviscidose
respiratoire problematiek: morbiditeit & mortaliteit
24/03/2009 6Apr. D. Kieffer
chronische obstructie
chronische kolonisatie -inflammatie
destructie longparenchym
antibiotica en resistentie
Mucoviscidose
respiratoire problematiek: chronische infecties
24/03/2009 7Apr. D. Kieffer
Gib
son
, RL, B
urn
s, JL, and
Ram
sey, BW
. AJR
CC
M 1
68
(91
8-9
51
); 20
03
.
Naam Alternatieve benamingB. cepacia B. cepacia genomovar I
B. multivorans B. cepacia genomovar II
B. cenocepacia B. cepacia genomovar III
B. stabilis B. cepacia genomovar IV
B. vietnamiensis B. cepacia genomovar V
B. dolosa B. cepacia genomovar VI
B. ambifaria B. cepacia genomovar VII
B. anthina B. cepacia genomovar VIII
B. pyrrocinia B. cepacia genomovar IX
B. cepacia complex
Walter Burkholder (1950, onion rot)
• wijd verspreid in bodem/water
• G- (niet vergistende) bacillen
• B. cepacia complex: ≠ genomovars
24/03/2009 8Apr. D. Kieffer
Ho
lmes et al. Em
Infect D
is1
99
8; 4
: 22
1-2
27
Nieuwe spp.*B. ubonensis
B. arboris
B. diffusa
B. latens
B. metallica
B. seminalis
B. contaminans
B. lata*: Vanlaere et al. Int J Syst Evol Microbiol
B. cepacia complex
B. cepacia complex pathogeniciteit:
• AB resistentie (intrinsiek + verworven)
• biofilm formatie en quorum sensing
• transmissie (vb. ET12, adhesie en motiliteit)
B. cepacia complex & mucoviscidose:
• “cepacia syndroom” (± 20 %)
• ↑ morbiditeit & mortaliteit
• ↓ prognose longtranslantatie
24/03/2009 9Apr. D. Kieffer
infectiecontrole!
B. cepacia complex
Infectiecontrole is doeltreffend maar strikt
– Bcc dragers geen contact niet-Bcc dragers
– aparte consultaties
– aparte zomer- en/of sportkampen,...
Infectiecontrole: accurate B. cepacia complex identificatie!
– vals positief: (psycho)sociale gevolgen voor de patiënt
– vals negatief: besmetting van niet-Bcc dragers
– Bcc: B. cenocepacia, B. multivorans, andere?
– Niet-Bcc: verwant pathogeen spp. (Pandoraea, Inquilinus)
24/03/2009 10Apr. D. Kieffer
B. cepacia complex
B. cepacia complex & microbiologische identificatie:
• Beperkte fenotypische variabiliteit
• Sterk evoluerende taxonomie foutieve identificatie?
• Mengflora
Screening: selectieve bodems?
Genotypering Bcc referentielaboratoria (UGent)24/03/2009 11Apr. D. Kieffer
Miller M & Gilligan P. J Clin Microbiol 2003
Huidige praktijk UZ Leuven
24/03/2009 12Apr. D. Kieffer
Monster van mucoviscidose patiënt
Gram-kleuring
Cultuur (incubatie 24u-48u, 37°C)• Bloed agar
• Haemophilus agar (Haemophilus spp.)
• Mannitol Salt agar (Staphylococcus spp.)
• MacConkey Agar (Gram-negatieve spp.)
sputum wisser
Critical Appraisal
VRAAG 1:Welke evidentie biedt de literatuur voor het gebruik van een selectieve bodem voor Burkholderia cepacia complex bij de verwerking van respiratoire stalen van mucopatiënten?
Evidentie uit de literatuur
24/03/2009 16Apr. D. Kieffer
Vanaf 1985: intrinsieke resistentie selectiviteit
• Gilligan et al. (1985): PC agar – kristalviolet, ticarcilline, polymyxine B
• Welch et al. (1987): OFPBL agar – bacitracine, polymyxine B
• Henry et al. (1997): BCSA– kristalviolet, gentamicine, vancomycine, polymyxine B
testmedium referentie # stalen # Bcc
stalen
incubatie (dagen)
# isolaten groei Bcc (%)
# isolaten groei niet-Bcc
testmedium referentie testmedium referentie
Gilligan et al.
(1985)
PC agar MacConkey 169 35 3 35 (100%)
21 (60%)
6 221
Welch et al.
(1987) OFPBL agar MacConkey 725 58 5 58
(100%) 19
(33%) 180 geen data
Henry et al.
(1997) BCSA
MacConkey
NVT 205 2 204 (99,5%)
99 (48%)
geen data geen data OFPBL agar 205 (100%)
PC agar 190 (93%)
Henry et al.
(1999)
BCSA
OFPBL
296 81 3 81 (100%)
78 (96%) 40
263
PC agar 68 (84%)
116
Evidentie uit de literatuur
24/03/2009 17Apr. D. Kieffer
testmedium referentie # stalen # Bcc
stalen
incubatie (dagen)
# isolaten groei Bcc (%)
# isolaten groei niet-Bcc
testmedium referentie testmedium referentie
Gilligan et al.
(1985)
PC agar MacConkey 169 35 3 35 (100%)
21 (60%)
6 221
Welch et al.
(1987) OFPBL agar MacConkey 725 58 5 58
(100%) 19
(33%) 180 geen data
Henry et al.
(1997) BCSA
MacConkey
NVT 205 2 204 (99,5%)
99 (48%)
geen data geen data OFPBL agar 205 (100%)
PC agar 190 (93%)
Henry et al.
(1999)
BCSA
OFPBL
296 81 3 81 (100%)
78 (96%) 40
263
PC agar 68 (84%)
116
Evidentie uit de literatuur
24/03/2009 18Apr. D. Kieffer
testmedium referentie # stalen # Bcc
stalen
incubatie (dagen)
# isolaten groei Bcc (%)
# isolaten groei niet-Bcc
testmedium referentie testmedium referentie
Gilligan et al.
(1985)
PC agar MacConkey 169 35 3 35 (100%)
21 (60%)
6 221
Welch et al.
(1987) OFPBL agar MacConkey 725 58 5 58
(100%) 19
(33%) 180 geen data
Henry et al.
(1997) BCSA
MacConkey
NVT 205 2 204 (99,5%)
99 (48%)
geen data geen data OFPBL agar 205 (100%)
PC agar 190 (93%)
Henry et al.
(1999)
BCSA
OFPBL
296 81 3 81 (100%)
78 (96%) 40
263
PC agar 68 (84%)
116
Evidentie uit de literatuur
24/03/2009 19Apr. D. Kieffer
testmedium referentie # stalen # Bcc
stalen
incubatie (dagen)
# isolaten groei Bcc (%)
# isolaten groei niet-Bcc
testmedium referentie testmedium referentie
Gilligan et al.
(1985)
PC agar MacConkey 169 35 3 35 (100%)
21 (60%)
6 221
Welch et al.
(1987) OFPBL agar MacConkey 725 58 5 58
(100%) 19
(33%) 180 geen data
Henry et al.
(1997) BCSA
MacConkey
NVT 205 2 204 (99,5%)
99 (48%)
geen data geen data OFPBL agar 205 (100%)
PC agar 190 (93%)
Henry et al.
(1999)
BCSA
OFPBL
296 81 3 81 (100%)
78 (96%) 40
263
PC agar 68 (84%)
116
Evidentie uit de literatuur
24/03/2009 20Apr. D. Kieffer
testmedium referentie # stalen # Bcc
stalen
incubatie (dagen)
# isolaten groei Bcc (%)
# isolaten groei niet-Bcc
testmedium referentie testmedium referentie
Gilligan et al.
(1985)
PC agar MacConkey 169 35 3 35 (100%)
21 (60%)
6 221
Welch et al.
(1987) OFPBL agar MacConkey 725 58 5 58
(100%) 19
(33%) 180 geen data
Henry et al.
(1997) BCSA
MacConkey
NVT 205 2 204 (99,5%)
99 (48%)
geen data geen data OFPBL agar 205 (100%)
PC agar 190 (93%)
Henry et al.
(1999)
BCSA
OFPBL
296 81 3 81 (100%)
78 (96%) 40
263
PC agar 68 (84%)
116
Evidentie uit de literatuur
24/03/2009 21Apr. D. Kieffer
Evidentie uit de literatuur
24/03/2009 22Apr. D. Kieffer
Henry et al. (1999):
• BCSA vs OFPBL en PC agar
• BCSA: hoge sensitiviteit
• BCSA: betere selectiviteit
• BCSA: hoger % goede groei
• BCSA: snellere groei
Commercieel beschikbare selectieve Bcc bodems
Evidentie uit de literatuur
24/03/2009 23Apr. D. Kieffer
PC agar(BD)
OFPBL(BD)
BCSA(BioMérieux)
BC agar(Lab M)
BC agar(Oxoid)
BC agar(Mast)
nutriënten enzym. ferment
(NH4)2SO4
MgSO4
Fe(NH4SO4)2
agar
pancreas ferment
agar
caseïne peptone
gist extract
NaCl
saccharose
agar
caseïne
gelatine peptone
K2SO4
MgCl2agar
peptone
gist extract
(NH4)2SO4
MgSO4
Fe(NH4SO4)2
agar
peptone mengsel
(NH4)2SO4
MgSO4
Fe(NH4SO4)2
agar
buffer K2HPO4
KH2PO4
NaCl
K2HPO4
K2HPO4
KH2PO4
K2HPO4
KH2PO4
indicator natriumpyruvaat
fenolrood
lactose
broomthymol-
blauw
lactose
fenolrood
natriumpyruvaat
fenolrood
natriumpyruvaat
fenolrood
selectieve
agentia
galzouten
kristalviolet
ticarcilline
(100 mg/L)
polymyxine B
( 3.106 U/L)
bacitracine
(200 mg/L)
polymyxine B
(3.106 U/L)
kristalviolet
gentamicine
(10 mg/L)
vancomycine
(2,5 mg/L)
polymyxine B
(6.106 U/L)
ticarcilline
(100 mg/L)
polymyxine B
(3.106 U/L)
galzouten
kristalviolet
gentamicine
(5 mg/L)
ticarcilline
(100 mg/L)
polymyxine B
(1,5.106 U/L)
galzouten
kristalviolet
ticarcilline
(100 mg/L)
polymyxine B
(3.106 U/L)
Commercieel beschikbare selectieve Bcc bodems
Evidentie uit de literatuur
24/03/2009 24Apr. D. Kieffer
testmedium # Bcc stalen incubatie
(dagen)
# isolaten groei Bcc
(%)
Revets et al.
(1996)
Mast BC agar
54 ?
54 (100%)
OFPBL agar 50
(92,6%)
Wright et al.
(2001)
Mast BC agar
53 7
53 (100%)
BCSA 53
(100%)
Vermis et al.
(2003)
Mast BC agar
69 2
69
(100%)
Oxoid BC agar 64
(92,8%)
LAB M BC agar 55
(80%)
BCSA 68
(98,5%)
Mast BC agarof
BCSA
Commercieel beschikbare selectieve Bcc bodems
Evidentie uit de literatuur
24/03/2009 25Apr. D. Kieffer
testmedium # Bcc stalen incubatie
(dagen)
# isolaten groei Bcc
(%)
Revets et al.
(1996)
Mast BC agar
54 ?
54 (100%)
OFPBL agar 50
(92,6%)
Wright et al.
(2001)
Mast BC agar
53 7
53 (100%)
BCSA 53
(100%)
Vermis et al.
(2003)
Mast BC agar
69 2
69
(100%)
Oxoid BC agar 64
(92,8%)
LAB M BC agar 55
(80%)
BCSA 68
(98,5%)
Mast BC agarof
BCSA
Amerikaanse Cystic Fibrosis Foundation (2001):
• sterke aanbeveling (IA) selectieve Bcc bodem
• BCSA, OFPBL of Mast BC agar (Saiman et al. 2003)
Evidentie uit de literatuur
24/03/2009 26Apr. D. Kieffer
land # laboratoria % implementatie Bcc media
Tablan et al. (1987) Verenigde Staten 115 12%
Shreve et al. (1999) Verenigde Staten 142 73%
Zhou et al. (2006) Verenigde Staten 150 99%
Balke et al (2008) Duitsland 17 70%
Critical Appraisal
VRAAG 2:Welke resultaten komen voort uit een praktische evaluatie van een selectieve bodem voor Burkholderia cepacia complex te UZ Leuven?
Praktische evaluatie
24/03/2009 28Apr. D. Kieffer
Monster van mucoviscidose patiënt
Gram-kleuring
Cultuur (incubatie 24-48u, 37°C)
• Bloed agar
• Haemophilus agar
• Mannitol Salt agar
• MacConkey agar
sputum wisser
+ Mast BC agar
• 24-48u, 37°C
• 1-5 d, KT
• 4 maanden
• 302 stalen
Praktische evaluatie
24/03/2009 29Apr. D. Kieffer
Monster van mucoviscidose patiënt
Gram-kleuring
Cultuur (incubatie 24-48u, 37°C)
• MacConkey agar
groei: 159/302
isolaten: 173/302
sputum wisser
+ Mast BC agar
groei: 22/302
isolaten: 23/302
Praktische evaluatie
24/03/2009 30Apr. D. Kieffer
Isolaten op Mast BC agar:• korte reeks (Kligler, citraat en MIU); • lange reeks biochemische testen:
– lysine en ornithine decarboxylase activiteit,– oxidatie glucose, maltose, lactose,
xylose, sucrose en adonitol,– oxidase activiteit,– pigment productie,– groei bij 42°C,– ONPG-productie– nitraat tot nitriet reductase activiteit,– aesculine hydrolyse,– gelatine vervloeiing;
• VITEK® 2;• Gaschromatografie;• MALDI-TOF MS analyse
Organime # isolaten Mast B. cepacia agar # isolaten MacConkey agar24u 48u 168u 24u 48u
Bcc genomovars (isolaat #) 8 1 2 1 9
- B. multivorans (# 1)
- B. multivorans (# 2)
- B. multivorans (# 3)
- B. multivorans (# 4)
- B. multivorans (# 5)
- B. multivorans (# 6)
- B. multivorans (# 7)
- B. multivorans/B. cepacia (# 8)*
- B. vietnamiensis/B. cepacia (#9)
- B. vietnamiensis/B. cepacia (#10)
- B. vietnamiensis/B. cepacia (#11)
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
-
1
1
-
1
1
1
1
1
1
1
1
Achromobacter spp. 1 1 2
Chryseobacterium spp. 1 1
Elizabethkingia spp. 1 1
Enterococcus spp. 1 2 - -
Ralstonia spp. 1 1 - -
Stenotrophomonas spp. 1 - -
Zonder éénduidige identificatie** 2 - -
Praktische evaluatie
24/03/2009 31Apr. D. Kieffer
Praktische evaluatie
24/03/2009 32Apr. D. Kieffer
EuroCareCF: referentie stammenpakket
• 25 Bcc en Bcc-verwante isolaten
• gelijkaardige resultaten, behalve:
Mast BC agar:+ B. cenocepacia isolaten
MacConkey agar:+ S. maltophilia,
+ A. xylosoxidans,
+ R. respiraculi,
+ B. gladioli
B. cepaciaB. multivoransB. cenocepaciaB. stabilisB. vietnamiensisB. dolosaB. pyrrocinia
B. gladioliR. mannitolilyticaR. respiraculiR. pickettiiR. insidiosaP. apistaP. sputorumP. pulmonicolaP. pnomenusaS. maltophiliaA. xylosoxidansI. limosus
Praktische evaluatie
24/03/2009 33Apr. D. Kieffer
isolaatVITEK® 2 identificatie
MacConkey agar Mast B. cepacia agar bloed agar
B cepacia Moraxella spp
Acinetobacter lwoffii
Burkholderia cepacia complex Burkholderia cepacia complex
B multivorans
(stam1)
Burkholderia cepacia complex Burkholderia cepacia complex Burkholderia cepacia complex
B multivorans
(stam 2)
Burkholderia cepacia complex Burkholderia cepacia complex Burkholderia cepacia complex
B multivorans
(stam 3)
Burkholderia cepacia complex Burkholderia cepacia complex Burkholderia cepacia complex
B cenocepacia
(stam 1)
Aeromonas spp Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa
B cenocepacia
(stam 2)
Moraxella spp
Acinetobacter lwoffii
Pseudomonas aeruginosa Geen identificatie
B cenocepacia
(stam 3)
Acinetobacter baumanii complex Burkholderia cepacia complex Burkholderia cepacia complex
B cenocepacia
(stam 4)
Pseudomonas aeruginosa
Achromobacter dentrificans
Burkholderia cepacia complex Burkholderia cepacia complex
B cenocepacia
(stam 5)
Burkholderia cepacia complex Burkholderia cepacia complex Burkholderia cepacia complex
B stabilis Geen identificatie Burkholderia cepacia complex Burkholderia cepacia complex
B vietnamiensis Acinetobacter baumanii complex Burkholderia cepacia complex Burkholderia cepacia complex
B dolosa Acinetobacter baumanii complex Burkholderia cepacia complex Burkholderia cepacia complex
B pyrrocinia Moraxella spp
Acinetobacter lwoffii
Burkholderia cepacia complex Burkholderia cepacia complex
31 % 85 % 85 %
Critical Appraisal
VRAAG 3:Welke zijn de praktische en financiële implicaties bij eventueel routinematig gebruik van een selectieve bodem voor Burkholderia cepacia complex?
Implicaties voor routine
24/03/2009 35Apr. D. Kieffer
Implementatie in de routine
• prijs Mast BC agar/bodem: 1,39 euro
• bereiding Mast BC agar/bodem: 0,38 euro
• enten en aflezen van Mast BC agar/bodem: 2,65 euro
4,42 euro
• 4,42 euro per respiratoir specimen van mucoviscidose patiënt
• driemaandelijkse staalnamen van ± 250 patiënten
meerkost van 4420 euro/jaar
Conclusies
24/03/2009 37Apr. D. Kieffer
Evidentie uit de literatuur:
• aanbeveling om selectieve bodem voor Bcc te gebruiken– minder overgroei (P. aeruginosa)
– kleuromslag
• BCSA, Mast BC agar of OFPBL
Praktische evaluatie:
• bevestiging semi-selectieve karakter
• geen overgroei (P. aeruginosa)
• snellere detectie en minder uitzuiveringsstappen?
• VITEK® 2 identificatie lijkt accurater vanaf Mast BC agar
To do’s
24/03/2009 38Apr. D. Kieffer
Verdere evaluatie Mast BC agar
Eventueel in combinatie met alternatieve selectieve bodem
Verdere evaluatie VITEK® 2 identificatie
Mast BC agar vs MacConkey agar