Exoom sequencing - stofwisselingsziekten · 2014-03-31 · Van paradox naar paradigm: De novo...

AGGCACCTCTGCATGCTGGATATTTGCTTTGCAGTTGGGGACGGTGGACAGACATTCTTTCCCACGGACGCTATAAACGCCAACTCACTGAGCAAGATGTAGAAACCATCTGCAGAACCATCCTGGTGTACTGTCTTAATCATTACAAAGGGGATGAGAATATCAAAAGCTTCATCTGGGATCTGATCACACCCACAGCGGATGGCCAGACTCGAGCCTTGGTCAACCATTCCGGTAGGTCTCCACCATGCTGTTTGTGCTACAGGGTCACAAAGCCACCAGGAACTTTTGTGACACACTGTTGATAAAGAGATGTGACATAAACCCCATATTTCCCTGCCTCGTGCATTAAGCTCTCTGCCATTGACACTATAATTGGAATGTAAAAGGCTTCTATTATTATTATGATGGTGATTCTAGGTTTGTCAGCTCCTGTGCCAAGGGGAAGGAAGGGAAAGAAGGTGAAAGCCCAGAGCACACAGCCGGTGGTGCAGGATGCCGACTGGCTGGCCAGCTGCAA

CCCAGATGCCCTGTTCCAGGAGGACAGCTACAAGAAACACCTGAAGCATCACTGTAACAAGTATGTTATTAGAGGGTGGACCTGGAGAGCTTAATTCCCTTTTTATTCTTTAAAAAATACATGCAGCCGGCCCTTCACGTCTGCAGATGCAGAACTCGCAGATTTGGAGGGTCAACTGAGGGACCTGAGCATCTGCGGATCTTGGTGTCTGAGGGGGGTCCTGGAACCATACTCCCGCGGATATGGAGGGACAGCTCTGTTATTAAGACTTTTAAATGGTATAGTTATTGCCTTTGCACAGCCTTATCATTTTTCTTGAAATGTGGTGTCAAGTTGCAGGAGAGCGTACCTTTAGGTGACTGATTATTTTTTAACATGGTAAGATACACAACACAACGTTTACCATTTTTACCATTTATAAGTGAACAATTCATTGGCATTAATTACACTCACAATGCTGTATACTCACTATCTGTACCTGAAATGTTTCCATCTTCCCAAATATAAACACTGTATCAATTAAACA


Exoom sequencing

Joris Veltman

Afdeling Genetica

UMC St. Radboud

Email: [email protected]




Familie-onderzoek:

Welke genetische

merkers erven over

samen met ziekte?

Associatie-onderzoek: Welke

genetisch merkers verschillen

tussen grote groepen mensen

met en zonder ziekte.

Traditionele genetica: Familie-onderzoek en Associatie-onderzoek

Merker A1 erft over samen met ziekte




Veel hersenaandoeningen komen voor bij kinderen van gezonde ouders en leiden tot vermindere voortplanting

Verstandelijke beperking

Autisme

Schizofrenie

Zeldzame hersen-

aandoeningen




Onderzoek naar oorzaak van verstandelijke handicap

Gezonde ouders krijgen soms een kind met deze ziekte

De ziekte heeft vaak een oorzaak in het DNA

Extra chromosoom 21

Ouders hebben extra

chromosoom niet!

Nieuw foutje

in het DNA?




1953 2001 2008 2011 2020?

De genetica, een jong en supersnel ontwikkelend vakgebied

DNA is Referentie 1ste persoonlijke Genoom Genoom bij

dubbele helix! genoom genoom in kliniek geboorte?

Microscoop Sanger sequencing DNA chips Genoom sequencing Genetica computervak




Ideale start van genetische onderzoek

DNA uit bloed

Genoom sequentie

met alle variatie

Belangrijke eigenschappen: - Accuraat - Snel - Goedkoop




Next generation sequencing: Een technologische revolutie!

Vroeger: 1 DNA fragment per keer lezen

Nu: miljoenen tegelijk!




5500XL

454

Veel bedrijven, veel concurrentie; Snelle ontwikkeling!

1st cluster: Sept 2009 2nd cluster: Aug 2010

HiSeq

Ion Torrent

Pacific biosciences Complete Genomics




DNA sequencing wordt snel goedkoper!

From: Stein Genome Biology 2010 11:207

Moore’s law

http://genomebiology.com/2010/11/5/207/figure/F2




DNA sequencing output neemt enorm toe

E Mardis. Nature 2011




Van sequentie tot genoom:Veel puzzelwerk

Miljoenen korte DNA fragmenten per individu

Totale genoomsequentie 1 individu

Zeer veel computer

Rekenkracht!!!!!!!!




Het genoom




We kunnen het totale genoom van een mens nu lezen




Hoeveel verschilt het genoom van 2 “gezonde” mensen: Hoe verschillend zijn ze nu echt?

3 miljoen

verschillen

5,997 miljard

overeenkomsten




DNA sequencing methode nog niet perfect

• 1 keer lezen van een DNA sequentie:

~1 op 10,000 nucleotiden incorrect

Voor totale genoom: 600.000 fouten!


~1 op 100,000 nucleotiden incorrect

Voor totale genoom: 60.000 fouten!


~1 op 1,000,000 nucleotiden incorrect

Voor totale genoom: 6,000 fouten!

Bedenk: 1 DNA fout/variatie kan al tot ziekte leiden!

Probleem: Meer lezen is duurder en verlaagt throughput!

Van genoom naar exoom sequencing

‘Exoom’ (alle exonen van een genoom) ~1% van het humane genoom

‘Alle’ coderende sequenties van het humane genoom (>180,000 exons), in één experiment gemeten Hypothese: Meeste ziekteveroorzakende mutaties zitten in de genen




Exoom verrijking voorafgaand aan sequencing

DNA fragmenten Biotin-labelled “Baits”

representing all exons of ~18,000 genes

sequencing




seq reads

targets

genes

Resultaat van exoom sequencing experiment

Alle genetische variatie in een lijstje




Variatie in normale populatie Ziekte-veroorzakende variatie

Van groot belang: Inzicht in normale en ziekteveroorzakende genoomvariatie




Hoeveel varieert het exoom, hoe interpreteer je dit?

Aantal coderende varianten:

~ 20,000

Aantal unieke varianten

met effect op eiwit:

~ 150-200

Hoe identificeer je die ene pathogene variant?

Voorbeeld 1: Een zeldzame ziekte

Exomen sequencen!

All variants Filtered variants




Essentieel: Goede klinische verzameling

Our study Literature: 46 cases

Gender 6 f/7 m Neurodevelopmental anomalies Developmental delay 11/11 39/39 Seizures 12/13 32/35 Vision impairment 8/9 11/12 Hearing impairment 8/9 8/11 Craniofacial features Large anterior fontanelle 10/12 Prominent forehead 12/13 43/43 Mid-face retraction 13/13 46/46 Hypertelorism 12/13 Short, upturned nose 13/13 40/42 Low-set ears 12/13 37/39 Structural anomalies Genital 13/13 35/38 Hydronephrosis or vesicoureteral reflux

13/13 42/45

Cardiac defect 7/13 20/35 Characteristic skeletal

malformations 11/11

Choanal stenosis 4/13 12/29

Based on: Lehman, A.M. et al. AJMG A. (2008)

Am J Med Genet. 1978;1(4):361-75.

Schinzel-Giedion Syndroom: zeldzame sporadische ziekte

Ziektegen identificatie: Filter & combineer

Variants Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Mean

Genes with

variants in all

samples

Total called 22,916 22,602 22,152 19,528 21,800 4,735

Exonic + SpliceSites(SS) 12,196 12,255 11,796 10,498 11,686 3,331

Non-synonymous (NS) +

SS 5,556 5,618 5,427 4,802 5,351 1,634

Novel (not in dbSNP130) 405 401 390 387 396 35

Novel (not in in-house db) 299 289 275 288 288 12

...en filter meer!

Variants Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Mean

Genes with

variants in all

samples

Total called 22,916 22,602 22,152 19,528 21,800 4,735

Exonic + SpliceSites(SS) 12,196 12,255 11,796 10,498 11,686 3,331

Non-synonymous (NS) +

SS 5,556 5,618 5,427 4,802 5,351 1,634

Novel (not in dbSNP130) 405 401 390 387 396 35

Novel (not in in-house db) 299 289 275 288 288 12

Novel (not in ~100 exomes) 180 186 154 172 173 1

De novo mutaties in het SETBP1 gen

Patient 1

Patient 2

Patient 3

Patient 4

Ziektegen identificatie in versnelling door exoom sequencing




Onderzoek naar oorzaak van verstandelijke handicap

Aandoening meestal bij kind van gezonde ouders

De ziekte heeft vaak een oorzaak in het DNA

Extra chromosoom 21

Ouders hebben extra

chromosoom niet!

Nieuw foutje

in het DNA?




Nieuwe hypothese: De novo mutaties Van belang bij evolutie maar ook oorzaak ziekte?




Detectie van alle de novo mutaties is nu mogelijk! Exoom sequencing van patiënt-ouder trios

Alle variatie in genen Trio-sequencing om erfelijke variatie te filteren




De novo mutaties ontstaan meestal bij aanleg zaadcel!

Genoom sequencing 78 patient - ouder trios

Gemiddeld 63 de novo mutations/patient

80% mutaties komt van vader

Aantal mutaties neemt toe in

zaad van oudere vaders!

Voorbeeld 2: Veelvoorkomende aandoening

2010

3 oktober 2012

Variants Average of 10

patients

Total called 21,755

After exclusion of nongenic, intronic & synonymous variants

5,640

Private variants 143

After exclusion inherited variants 5

Validation Sanger sequencing 0-2

Prioritizatie van kandidaat de novo varianten




Visualisatie van een de novo mutatie

a

Patient

reads

Mother

reads

Father

reads




De novo mutaties in negen verschillende genen

Gene Mutation (cDNA)

Mutation (protein)

Gene function

DYNC1H1 c.11465A>C p.His3822Pro Retrograde axonal transporter; interacts with PAFAH1B1 (causing Lissencephaly – a neurodevelopmental disorder)

ZNF599 c.532C>T p.Leu187Phe Unknown

RAB39B c.557G>A p.Trp186X Known X-linked mental retardation gene

YY1 c.1138G>T p.Asp380Tyr Ubiquitously expressed transcription factor; Mouse knock down results in growth retardation, neurulation defects and brain abnormalities; interacts with MeCP2, a known MR gene

BPIL3 c.887G>A p.Arg269His Innate immune respons

PGA5 c.1058T>C p.Val353Ala Precursor of pepsin

DEAF1 c.683T>G p.Ile228Ser Transcription factor; Regulator of 5-HT1A receptor in the brain; Mouse knockout causes neural tube defects

CIC c.1474C>T p.Arg492Trp Granule cell development in central nervous system

SYNGAP1 c.998_999del p.Val333AlafsX Known autosomal dominant mental retardation gene




Verdeling de novo mutaties in 10 patiënten

MR trio Link to MR No link to MR

1 DYNC1H1 ZNF599

2 RAB39B

3 YY1 BPIL3

4 PGA5

5 DEAF1

6 CIC

7

8 SYNGAP1

9

10 JARID1C*

* De novo in moeder van een patiënt

3 mutaties in “verstandelijke

handicap” genen

4 ernstige mutaties in goede

kandidaat genen voor

verstandelijke handicap

Een nieuw inzicht in oorzaak van

Verstandelijke handicap!

.

Vissers et al. Nature Genetics 2010




Het gevolg: Exoom sequencing in de diagnostiek!

Uitdagingen: - Schaalvergroting: Van 100 naar 4000 exomen! - Interpretatie: Hoe zeker weten we welke variant de ziekte veroorzaakt? - Ethiek: Vinden we ook andere informatie in exoom? - Kosten: Kan dit voor zonder verhoging kosten?




Is deze aanpak nuttig in de diagnostiek?

• De novo mutatie oorzaak ernstige verstandelijke beperking bij 13% van de patiënten • Daarnaast 3% erfelijke oorzaken gevonden • Mogelijke oorzaak bij nog 19 patiënten gevonden, hierbij zal vervolgonderzoek plaatsvinden • Diagnostische uitslag bij alle 100 patiënten verstuurd




Exoom sequencing bij mitochondriële aandoeningen!

September 2011: Start pilot studie met 500 samples voor

5 genetische aandoeningen:

Aandoening 1st stap 2nd stap

Verstandelijke handicap

Genoomwijde de novo mutaties

(trio-sequencing) -

Mitochondriële aandoeningen

Analyse bekende ziektegenen

Genoomwijde analyse

Blindheid

Doofheid

Bewegingsstoornissen

Eerste stap voor 50 mitochondriële aandoeningen bijna afgerond!




Wat kunnen we met al die genetische kennis?

Inzicht in de onderliggende biologie

Betere diagnose, prognose en counseling

Aangrijppunten voor therapie?




Conclusies

Next generation sequencing revolutie:

Ziektegen identificatie is eenvoudig geworden

Genetische oorzaak zeldzame hersenziekten snel opgelost!

Van paradox naar paradigm:

De novo mutaties zijn een belangrijke oorzaak van hersenziekten zoals verstandelijke beperking en autisme

Van onderzoek naar diagnostiek:

Exoom sequencing kan als generieke test in de diagnostiek

van hersenziekten van groot nut zijn!




Genoomsequencing: Integratie van expertise!

Diagnostiek & onderzoek

Laboratorium & bioinformatica

Mutatie & structurele variatie





Bedankt!

Genoom Diagnostiek Helger Yntema Marcel Nelen Dorien Lugtenberg Rolph Pfundt Kornelia Neveling Hans Scheffer

Klinische genetica Marjolein Willemsen Bregje van Bon Tjitske Kleefstra David Koolen Anneke Vulto-van Silfthout Marlies Kempers Bert de Vries Han Brunner

Genoom Onderzoek Lisenka Vissers Joep de Ligt Alex Hoischen Christian Gilissen Jayne Hehir-Kwa Marisol del Rosario Nienke Wieskamp Rick de Reuver Thessa Kroes Petra de Vries Gaby van de Ven-Schrobbers Michael Kwint Irene Janssen Marloes Steehouwer

Exoom sequencing - stofwisselingsziekten · 2014-03-31 · Van paradox naar paradigm: De novo...

Documents

Transcript of Exoom sequencing - stofwisselingsziekten · 2014-03-31 · Van paradox naar paradigm: De novo...