Eiwitzuivering 3Eiwitzuivering 3

Kolom chromatografie:- Gelfiltratie- ionchromatografie- affiniteitschromatografie

Sigrid Beiboer en Ivo HornTBEMH-P05IDB HC7

Kolom Kolom chromatografiechromatografie Verschillende soortenVerschillende soorten

Een systeemEen systeem

Een systeemEen systeem

ChromatogramChromatogram

Een kolomEen kolom

biochemistry.wur.nl/Hb/Gelfiltratie.html

Stationaire fase

Mobiele fase

Scheiding op een kolomScheiding op een kolom

Gedrag van moleculen in een Gedrag van moleculen in een kolomkolom

adsorptie: meer neiging tot binding aan stationaire fase

desorptie: minder neiging tot binding aan stationaire fase

CS

CM

desorptie

adsorptie

Ideaal: verdeling lineair

Cs= concentratie is stationaire faseCm= concentratie in mobiele fase

Isothermen en piekvormIsothermen en piekvorm

Cs

Cm

Cs

Cm

Cs

Cm

toenemende hoeveelheid massa piekpatroon in chromatogram

desorptie

adsorptie

een juist evenwicht tussen stationaire fase en mobiele fase geeft een scherpe piek.

KK

K is de verdelingscoëfficiënt: waar bevindt zich een molecuul in de kolom, in CS of in CM

geeft de mate van verdeling over matrix en mobiele fase weer

Wet van Nernst: K = Cs/Cm

CS

CM

K = CS/CM

De De ““zonezone””; de piek; de piekDe zone is het oppervlak van de piekDe zone is rechtevenredig met de

concentratie

Kolom Kolom chromatografiechromatografie Verschillende soortenVerschillende soorten

GelfiltratieGelfiltratie

Kleine moleculen hebben meer tijd nodig

Gelpermeatie of uitsluitingschromatografie (size exclusion chromatography)

De matrix voor gelfiltratieDe matrix voor gelfiltratie

Goede elutie eigenschappenHydrofiel karakterGeen geladen groepenChemische resistentieBiologische resistentie

Bijv. polymeren van:- acrylamide (Biogel P)- dextraan (Sephadex)- combinatie acrylamide en dextraan (Sephacryl)- agarose (Sepharose, Biogel A)

De volumina in een kolomDe volumina in een kolom

Vc = kolom volumeV0 = void volume (buitenvolume)Vi = intern volume (binnenvolume)Vm= matrix volumeVe= elutie volumeVm

Vc = V0 + Vi + Vm

groot eiwit: Ve=V0

klein eiwit: Ve=V0+Vi

Berekeningen met Berekeningen met gelfiltratiegelfiltratieVc = V0 + Vi + Vm = kolomvolume = π r2 h, hieruit de

benodigde hoogte

Kd of K0 = (Ve - V0) / Vi ; (Cs/CM), verdeling over kolom

K0: hoe groter de K0, hoe kleiner de molmassa (Mw): K0 nadert 0: groot molecuul. K nadert 1: kleinste moleculen (volledige distributie over Vi en V0)

Toepassingen gelfiltratieToepassingen gelfiltratieIsolatie en zuivering biomoleculen

(H05PBM)Molecuulmassa bepalingOntzoutenBufferverwisseling

VraagjeVraagjeWelke van onderstaande

methoden kun je gebruiken om zout te verwijderen?

GelfiltratieUltrafiltratieDialyseHomogeniserenCentrifugeren

• Meet OD280 en geeft dit door aan recorder

• Verschuift buizen in rek met bepaalde snelheid en

geeft buiswisseling ook door aan recorder

FractieverzamelaarFractieverzamelaar

Zuivering mbv gelfiltratieZuivering mbv gelfiltratie

Zuivering mbv gelfiltratieZuivering mbv gelfiltratie

Ionenwisselaars

R-Na2 + Ca2+ R-Ca + 2Na+

Zeolieten: - natuurlijke ionenwisselaars- aluminiumsilicaten

IonchromatografieIonchromatografie

Principe scheidingPrincipe scheiding

Matrix: - onoplosbaar- chemische resistent- biologische resistent- inert- capaciteit

Spacer arm vaak voor biochemische toepassingentegengaan sterische hindering

Matrix Spacer arm Ligand Biomolecuul

Matrix en spacer armsMatrix en spacer arms

• Kationenwisselaar:- bevat negatief geladen / zure groepen

(bv. Dowex-50, CM cellulose, Chelex-100)- uitwisseling positieve kationen

• Anionenwisselaar:- bevat positief geladen / basische groepen (bv. Dowex-1, DEAE)- uitwisseling negatieve anionen

Ionogene groepenIonogene groepen

• Ontharding van water:kalk, Ca2+ Na+

• Demineralisering van water:- verwijdering kat- en anionen- 2 ionenwisselaars (indien gemengd: mixed bed)- kationen worden vervangen door protonen- anionen worden vervangen door OH--ionen

Op lab: - demiwater, gedemineraliseerd water mbv hars kolom,

vergelijkbaar met enkelvoudig gedestilleerd water- mQ of milliQ water, gedemineraliseerd water mbv

Millipore kolom, soort “bidest”

Toepassingen voor waterToepassingen voor water

Eiwitlading pH hoog pH laag pH neutraal

Neutrale a.z. 0 0 0Basische a.z. 0 + n+Zure a.z. - 0 m-

Netto lading - + n-m

Isoëlektrisch punt (IEP):- pH waarbij de nettolading van het eiwit nul is- kan bepaald worden met isoëlektrische focussering

Toepassingen voor Toepassingen voor eiwitteneiwitten

pH boven IEP, eiwit is negatief anionenwisselaar

pH beneden IEP, eiwit is positief kationenwisselaar

pH en ionsterkte bepalen affiniteit eiwit voor kolom

Grotere afwijking pH van IEP grotere affiniteit

Hoe werkt ionchromatografie bij Hoe werkt ionchromatografie bij eiwitzuivering?eiwitzuivering?

pH wijzigen of ionsterkte verhogen

Buffer en pH blijven gelijk in zoutgradiënt, alleen zoutconcentratie stijgt!

[NaCl]=0

[NaCl]=1 M

ElutieElutie

Ionchromatografie van Ionchromatografie van aminozurenaminozuren

Zuivering mbv ionchromatografieZuivering mbv ionchromatografie

AffiniteitschromatografAffiniteitschromatografieie

Zuivering gebaseerd op biologische functie of individuele structuur

ScheidingsprocedureScheidingsprocedure

AffiniteitAffiniteit

De mate van aantrekking van moleculenreversibel, dus niet covalent!

Mobielefase

Stationairefase

Schoneuitloop

AffiniteitschromatografieAffiniteitschromatografie

Schema Schema affiniteitschromatografieaffiniteitschromatografie

Matrix Spacer arm Ligand Biomolecuul

• Inert• Open structuur toegankelijk voor eiwitten om

aan ligand aan matrix te kunnen binden• Groot aantal chemische groepen, waaraan ligand

covalent gekoppeld kan worden• Goede elutie eigenschappen• Chemische stabiliteit

MatrixMatrix

• Agarosekorrels• Polyacrylamide korrels• Poreuze glazen korrels• Grote bolvormige korrels:

geven interkorrel ruimtes, die geschikt

zijn voor AC van grote biomoleculen

zoals ribosomen, membraanfracties

en zelfs intacte cellen!

Voorbeelden matrixVoorbeelden matrix

• Specifieke, reversibele affiniteit voor biomolecuul• Bezit minstens één reactieve groep voor binding aan matrix

mag niet betrokken zijn bij biologische herkenning!• Oplosbaar in vloeistoffen betrokken bij koppelingsproces

en bestand tegen koppelingsreacties• Bindingsaffiniteit voor biomolecuul:

- niet te sterk

- niet te zwak

- aanwezig na koppeling aan matrix

LigandLigand

• Tegen sterische hindering• Fysisch-chemische eigenschappen van spacer arms

beïnvloeden karakter matrix en affiniteit van

biomolecuul voor ligand

Hydrofobe spacer arms: toename aspecifieke binding

Tegengaan door klein beetje organisch

oplosmiddel in eluens of hydrofiele spacer arm

Matrix Spacer arm Ligand Biomolecuul

Spacer armsSpacer arms

Voorbeelden spacer armsVoorbeelden spacer arms

Verandering van:• pH• Ionsterkte

Pas op voor denaturatie biomolecuul!!

Niet selectieve elutieNiet selectieve elutie

AC voor IgG-antilichamenAC voor IgG-antilichamen

IgG antilichamen zuiveren met Protein-A, -G of -L affiniteitschromatografie

BiotineBiotine

Eiwitten zijn makkelijk te biotinyleren

Hoge affiniteit voor streptavidine en avidine

Biotine Biotine gebruikt om gebruikt om het ligand aan het ligand aan de matrix te de matrix te koppelenkoppelen

Zuivering biotine-

bindende eiwitten

Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC)

Zuivering van recombinant histidine gemerkte (His-tagged) eiwitten

Histidine:• pK is 6,5• heeft imidazole ring

Interactie tussen twee naburige His-aminozuren in de 6xHis-tag en de Ni-NTA-matrix.

IMAC

Zuiveringsprocedure op Ni-NTA-Spin kolommetjes.

Rode staartjes = His-tag6 histidine aminozuren

IMAC

Zuivering van GST-fusie eiwittenGlutathione-S-Transferase