H3. Recombinant DNA technologie.

Basis recombinant DNA technologe.- Knippen wordt gedaan door restrictieenzymen. Komen uit bacterin en herkennen en knippen specifieke sequentie. (Genetische palindromen)- Twee enzymen; 1 herkent en methyleert sequentie, andere herkent en knipt sequentie. - Sticky end; 5 overhang, als de meeste aan 3kant zitten. 3 overhang als de meeste aan 5kant zitten. Blunt end. Blunt kan altijd plakken, maar minder efficient. ---> plakken met ligase.- Bacterien hebben plasmiden. Kleine circulaire DNA moleculen die zelfstandig repliceren. Makkelijk isoleerbaar en makkelijk inbrengen.- Op het plasmide liggen eigenschappen; - Origin of replication -> zelfstandig repliceren - MCP (multiple cloning site) -> stukje dna met herkenningssites voor restrictieenzymen. - Selectiemarkers. Niet alle cellen zullen het plasmide opnemen. Dus resistentiegen tegen antbioticum aanwezig. Je selecteert dus cellen die het plasmide hebben opgenomen.- Vector (plasmide) openknippen. - DNA dat je inbrengt = insert.- Inbrengen construct in bacterie = transformatie. Cellen behandelen met calciumchloriden, dus cel wordt permeabel. Andere manier is electrische shock, = electroperforatie. Tijdelijke permeabele celwand.- Altijd weinig opname van plasmiden. Dus antibioticatest. - Opkweken op voedingsbodems met antibioticum.

Blauw-wit-screening;LACz codeert voor een deel van enzym B-galactosidase (wat lactose afbreekt). X-gal lijkt op lactose, als het wordt afgebroken wordt het blauw. LacZ wordt geinactiveerd als door cloneren DNA. Dus wordt een bacterie blauw = lacZ is aanwezig, dus DNA niet opgenomen.Wit = lacZ gen is niet aanwezig, dus DNA wl opgenomen. Voorwaarde; je moet gebruik maken van een E. Coli stam die zelf lacZ mist.

Tot expressie laten komen -> promotor benodigd. Dus als je het gen op de goede plaats induceert, dan komt je dna ook tot expressie dankzij die promotor. Reguleerbare promotor.

Andere vectoren.- Plasmide -> geen grote insert.- Bacteriofagen -> virussen die bacterien infecteren. DNA in een bacteriofaag.- Cosmiden -> Plasmiden met COS-site. Een herkenningssite op faag dna, dat herkent wordt bij maken van faag partikelen. Cosmide kan dus ingepakt worden in eiwitmantel. -> gebruiken om cellen te infecteren. Grotere insert. - Bac's -> plasmiden gebaseerd op de F-factor van E. Coli, hele grote inserts.- YAC's -> genetisch gemodificeerde chromosomen van gist, gekoppeld aan plasmide. Zowel in E. Coli als gist repliceren. Hele grote inserts.

Agarose gel electroferese.- Gel maken, mengsel van agarose en buffer.- Welletjes in gel waarin DNA monster kan.- Gel in buffer, beide kanten electrodes met spanning.- Negatief geladen DNA moleculen migreren door de gel. Van negatief naar positief. - Kleine framenten migreren snel, grote langzaam. Scheiden dus op grootte.- Fluoresceren, (bindt aan dna) dan beschijnen met uv licht.- Marker, DNA fragmenten met bekende grote = vergelijking.

Klonen chymosine gen;- Chymosine; uit de magen van kalfjes (stremsel)- Gen kloneren en tot expressie brengen in een ander organisme- Hoe kom je aan het gen- Library maken. Genomic (chromosomaal) of cDNA bank.

- Genomic; Isoleren chromosomaal DNA. (Welke cel maakt niet uit.) - Knippen DNA in fragmenten- Fragmenten ligeren in vectoren (cosmide of bac)- Vector inbrengen in gastheer (bijv e.coli.)- Verzameling bacterien met construct vector en een willekeurig stuk van chromosomaal DNA van koe

- cDNA bank; Complementairy DNA- Startmateriaal is mRNA uit cellen isoleren- Primer toevoegen die bindt aan poly-A staart van mRNA.- Enzym reverse transciptase (retrovirus). Gebruikt RNA als template voor maken van DNA streng- Kan enkel aanbouwen. Dus poly T primer nodig.- Molecuul 1 streng dna, 1 streng rna. RNA verwijderen door te behandelen met RNA-ase.- 2e streng DNA maken met DNA-polymerase. Moet aanbouwen dus korte random primers toevoegen.- Dan heb je dubbelstrengs DNA.

- Linkers aanzetten om cDNA te kloneren = linkers aanzetten. Kleine dna stukjes met herkenningssite voor restrictieenzym.- Dan kan je knippen en plakken.- Constructen in gastheer = verzameling veel bacteriecellen met een construct met cDNA.

- cDNA bank verzameling van de genen die tot expressie komen in een bepaald weefsel. - Kleiner dan genomische bank.- Startmateriaal is mRNA dus intronen zijn eruit. -> als je tot expressie wilt brengen in prokaryoten.

Hoe vind je nu de bacterie die het cDNA van chymosine bevat? Met colony blotting of een probe.Probe; enkelstrengs DNA molecuul dat complementair is aan het gen dat je wil vinden. Is gelabeld met fluorescerende nucleotiden of radioactiviteit. Maar, je hebt het gen nog niet, hoe maak je dan een probe.

- Kijken naar het gen voor hetzelfde eiwit in een ander organisme (homoloog gen.) Zal niet identiek zijn maar er zijn vast delen die voldoende gelijk zijn zodat hybridisatie ontstaat. Was echter bij chymosine nog niet bekend.

- Dan kan je eventueel ook uitgaan van het eiwit. Gezuiverd eiwit was er, stukje aminozuursequentie bepalen. Dus bedenken welke codons er kunnen coderen voor die aminozuren, door gebruik te maken van genetische code. = Reverse translation. Je weet stukje sequentie. Dus welke mogelijke mRNA's, dus sequentie gen. Niet exact want meer codons voor 1 aminozuur. Codongebruik is soms wel organisme specifiek.

Terug naar de probe; als je 'm hebt kan je colony blotting toepassen.Je groeit de bacterien van de bank op tot kolonies. Elke kolonie bevat hetzelfde construct met hetzelfde cDNA. Kolonies overbrengen op membraan van nitrocellulose of nylon. = Blotten. Kopie van elke agar plaat. Dan cellen op membraan behandelen zodat ze lyseren en het dna denatureert. Dan fixeren van DNA door membraan verhitten (of uv) en dan zit het DNA vast aan het membraan. Dan oplossing toevoegen met probe, die kan basenparen met je chymosine gen. Alles wegwassen -> waar het gen aanwezig is zal de probe blijven zitten. Maak m zichtbaar (xray oid) dan weet je welke kolonie het gen bezit. De originele kolonie opkweken. In nederland weinig gebruikt. Ivm negatieve invloed op verkoop en export.

Blotten; het overbrengen van DNA, RNA, Eiwit op een drager (meestal nitrocellulose of nylon) om het molecuul te fixeren.

Southern blotting; gebruiken om DNA fragment aan te tonen.- Scheiden fragmenten met agarose gel electroferese. Dna wordt geladen in slotjes agarose gel.- Gel runnen, DNA migreert door agarosegel en scheiden op grootte.- Toevoegen denaturatie oplossing (hele hoge pH en zoutoplossing) dna zal denatureren (enkelstrengs worden)- Toevoegen neutrolizer, pH neutraliseren.- Fragmenten overbrengen op membraan. Blotten. Buffer nodig, alles moet nat zijn met buffer.- Buffer zal omhoog trekken, dna meenemen uit gel, dna zal terecht komen op membraan.- Membraan met dna incuberen met buffer, dna wordt gecrosslinkt mbv uvlicht. Dna is gefixeerd.- Prehybridisation buffer toevoegen, ongelabeld dna. Zal binden aan membraan, zodat er geen aspecifieke binding plaatsvindt van de probe.- Dan hybridisation buffer toevoegen met probe.- Probe wegwassen. (3x, niet specifiek gebonden dna moet loslaten, hoge T)- Xray film op, kijken waar probe gebonden heeft.

Northern blotting;- Specifiek RNA molecuul- Ook met DNA probe

Western blotting;- Kijken naar eiwit.- Met antilichaam ipv probe.

FISH; Specifieke sequentie rna of rna aantronen met probe- Karyotype maken, DNA denatueren- Fluorescende probe toevoegen die hybridiseerd met een bepaalde sequentie.- Niet gebonden probe wegwassen- Onder fluor microscoop kijken waar het heeft gebonden. Je ziet of het aanwezig was, maar ook op welk chromosoom en welke plek in chromosoom. Vooral gebruikt voor opsporen genetische afwijkingen.

PCR; Bepaalde DNA sequentie vermenigvuldigen. (Naast het maken van een bank)- Template DNA (dna waarop het dna dat we willen amplificeren ligt)- Twee primers, korte enkelstrengs dna moleculen. 1 bindt voor het gen, 1 bindt na het gen, aan de complementaire streng.- Nucleotiden- Polymerase (meestal tac, uit archea.) optimaal 72 graden.- Mix in pcr machine.- Denaturatie. (94,96 graden) twee DNA strengen gaan uit elkaar.- Annealing (50,60 graden). DNA zal weer renatureren. Primers zijn klein en veel aanwezig, dus die zullen als eerste binden aan je DNA.- Extension; (70, 75). Tac zal de keten verlengen vanaf primers. - Gevolg, 2 nieuwe ketens. Stappen herhalen, zodat je dna fragmenten krijgt die precies zo groot zijn als tussen de 2 primers in. - Cycli herhalen.- Allerlei toepassingen, DNA fragmenten amplificeren, aanwezigheid aantonen, detecteren pathogenen in voedsel en water, diagnostiek (aantonen mutaties), maken DNA profielen, forensisch onderzoek.- Snel, gevoelig, makkelijk. Weinig template DNA nodig om een product te krijgen.- Je moet wel de sequentie weten voor het maken van primers.

PCR kan ook met mRNA. - mRNA met reverse transcriptase omgezet in cDNA.- Dan PCR, reverse transcriptie PCR (rtPCR). - Dan wil je weten of het juiste product is gevormd met het juiste formaat.- Meestal doe je dan agarose gel electroferese.

Real Time PCR; Detecteren fluorescencie. Realtime PCR; omdat we het ontstaan van een product al kunnen volgen tijdens de reactie. (Of quantitatieve pcr, indicatie hoeveelheid template dna in het monster, hoe meer template dna, hoe minder cycli nodig is om fluorescentie te detecteren.)- SYBRgreen- Tacman

SYBRgreen; - Kleurstof die als ie bindt aan dubbelstrengs dna gaat fluoresceren. Dus na elongatiefasie wordt steeds meer fluorescentie gemeten.

Tacman probe- Bindt aan dna dat je wilt amplificeren (tussen 2 primers in.)- Heeft gemodificeerd 3' uiteinde zodat er geen dna aangemaakt kan worden.- Bezit een fluorescerende reporter en een quencher. Zitten deze dicht bij elkaar, dan is er geen fluorescentie. - Tijdens hybridisatie binden primers, en de tacmanprobe. Nog geen fluorescentie.- Tijdens extensie verlengt de tac polymerase de dna vanaf de primers. Tac polymerase kan aanbouwen en afsplitsen als ie een 5'tegen komt. Komt het enzym de tacman probe tegen, gebeurt dat. Dus Q en reporter worden van elkaar gescheiden, en ontstaat fluorescentie. Dus hoe vaker target dna wordt geamplificeerd, hoe vaker dit gebeurt, en hoe meer fluorrescentie er komt.

Q-pcr vaak gecombineerd met reverse transcriptase, om expressie te bekijken. Hoge expressie = veel mRNA, = veel cDNA = veel template voor pcr reactie.

Sanger; sequentie bepalen, volgorde nucleotiden.- Dideoxynucleotiden; groep op 3' is veranderd. Gevolg => daarna kan geen nieuwe nucleotide meer aangebouwd worden. Chain determination method.- DNA waarvan je de sequentie wilt bepalen, 1 primer (naast het stuk dat je wilt sequencen.) 3'kant wijst naar het te sequencen stuk, DNA polymerase, gewone deoxynucleotiden. Kleine hoeveelheid dideoxynucleotiden, waarvan A, T, G, en C elk gelabel fluoresceerd zijn met een andere kleur.- Primer bindt, dna polymerase bouwt aan.- Soms normale nucleotide aangebouwd, in sommige gevallen een dideoxy, waardoor de aanbouw stopt.- Je krijgt dus een verzameling fragmenten met ieder aan het eind een gelabeld dideoxy.- Wordt aantal keer herhaald.- Fragmenten scheiden op grootte met capillaire gel en electroferese.- Laser en detector bepaalt dan fluorescentie van ieder fragment. Je weet dus of ie dan eindigt met een a, t, c of g. - Sorteren op grootte, dus je ontdekt dan de sequentie. ==> mogelijk gemaakt het hele humane genoom te sequencen. (3 mljd dollar en tien jaar.)

Automatisering sanger methode. Afname kosten sinds 2007. Next generation sequencing. -> Verschil met sanger methode ligt in het aantal reacties dat wordt gedaan, massive parallel sequencing.

Genomics; Bestuderen van DNA sequenties van genomen.Transcriptomics; Bestuderen van de expressie van veel genen onder een bepaalde conditie.Proteomics; Bestuderen van heel veel eiwitten onder een bepaalde conditie.

Dna microarray; Geinteresseerd in alle genen. Bijv verschil in gen expressie tussen gewoon weefsel en tumor weefsel.- Isoleren mRNA uit weefsel. (tumor weefsel bijv)- Mbv reverse transcriptase maak je van mRNA's enkelstrengs gelabeld cDNA. - cDNA voeg je toe aan de microarray en laat ze binden.- Op microarry zitten enkelstrengs dna moleculen. Corresponderen met bijvoorbeeld het normale humane genoom. Je wt op wat elke spot zit. - Na het binden goed wassen. Al het ongeboden cDNA gaat weg.- De spots die fluoresceren is het mRNA aan geboden. Ook expressie komt tot uiting in sterkte van fluorescensie.- Als je gewoon DNA gebruikt ipv cDNA kijk je niet naar de expressie van genen maar naar bepaalde sequenties in het dna. Bijv voor het identificeren van mutaties.

Eiwitten- Enzymen, structureel (cytoskelet oid), transport (hemoglobine), signalering afweer, transcriptie regulatie.- In de biologie veel geproduceerd (amylasen, lipasen, proteases) - Therapeutische eiwitten; EPO, insuline, etc.- Structuur; bouwstenen zijn aminozuren. Peptidyl transferase bindt peptiden aan elkaar, tot eiwit. Animoterminus wordt als eerste gemaakt. Carboxy aan de andere kant.- Eigenschappen eiwit worden bepaald door de animozuren waarmee ie is opgebouwd.- Primaire structuur; volgorde aminozuren in een eiwit.- Secundaire structuur; Lokale structuren, alpha helix en beta sheet. Waterstofbruggen tussen atomen in de backbone van de eiwitketen. Voorspelbaar.- Driedimensionale structuur die een eiwit aanneemt als ie volledig gevouwen is. Afhankelijk van ionische binden, hydrofobe interacties, hbruggen, zbruggen, vanderwaalskrachten, etc. Onvoorspelbaar, experimenteel bepalen.- Quaternaire structuur; meerdere polypeptideketens en cofactoren. - Na translatie; vouwen mbv chaperones. Moeten ook op de juiste plek terecht komen in de cel. membraan, export, etc. mbv signaalpeptides.Post translationele modificaties;- Vorming zwavelbruggen- Glycosylering. Suikergroepen worden aan eiwitketens gekoppeld. Vooral in eukaryote cellen.

SDS-page; Scheiding eiwtten op grootte.- Gel gemaakt van acrylamide (compactere matrix. Eiwitten zijn kleiner.)- DNA altijd negatief, eiwitten zowel positief als negatief. - Verschillend gevouwen, snelheid van migratie wordt beinvloed.- SDS gaat om de eiwitten heen zitten, ontvouwt ze, en maken ze negatief. Zodoende enkel scheiden op massa.- Gel electroferese.- Coomassie kleuring.- Met de kleuring zie je ALLE eiwtten die in een monster aanwezig zijn. Andere techniek als je dit niet wilt.

Western Blotting; specifiek eiwit aantonen.- SDS-page- Eiwitten overbrengen op nitrocellulose. Eiwitten worden gefixeerd.- Voeg antilichaam op dat is opgewekt tegen een bepaald eiwit, het eiwit dat we willen vinden.- Antilichaam is opgekweekt in een dier, door het antiserum te isoleren na inbrengen eiwit.- Antilichaam incuberen met blot, niet gebonden antilichaam wegspoelen.- 2e antilichaam toevoegen, een dat gericht is tegen de antilichamen van het proefdier. Aan het 2e antilichaam is een reporterenzym gekoppeld.- Wanneer je het juiste substraat toevoegt, wordt er een kleurreactie gekatalyseerd.- Na toevoegen van subtraat kan je zien of het 2e antilichaam gebonden is. Dan weet je of je eiwit aanwezig is, en in welke mate.

Antilichaam is moeilijker te verkrijgen dan probe, namelijk moet je het eerst zuiveren en injecteren in een dier.

Elisa; aantonen eiwit. - Multiwell plates- In elk welletje kan je een monster analyseren.- In een welletje breng je antilichaam aan tegen het eiwit waarin je geinteresseerd bent.- Voeg monster toe.- Is het eiwit aanwezig zal het binden aan antilichaam.- Wassen, tweede antilichaam aantonen. Tweede antilichaam met enzym aan gekoppeld.- Tweede antlichaam zal ook binden als je eiwit aanwezig is.- Substraat toevoegen om je enzym te detecteren. - Wanneer enkel positief/negatief belangrijk is. :)- Gekleurd? Positief.Kan ook varieren met antilichaam tegen proefdier (dus tweede antilichaamstap opsplitsen in 2 x.)Gaat sneller dan western blotting, want sds-page kan je weglaten. Kan ook goed geautomatiseerd worden.

Eiwit produceren;- Therapeutische eiwitten, meestal humane eiwitten. Bepalen van juiste productiesysteem = upstream processing.- Downstream processing; hoe het eiwit gezuiverd kan worden, getest op functionaliteit en bewaard.

Posttranslationele modificaties;- SNP's- Introns/exons- Glycolysatie

Productiesystemen;- Bacterien; Voordelen; snelle groei, hoge productie, goedkoop medium, makkelijk genetisch veranderen. Nadelen; geen glycosylering, inclusion bodies (aggregaten.)- Schimmels; Voordeel; veel enzymen maken en secreteren, snelle groei, goedkoop Nadelen; Niet altijd juiste posttranslationele modificaties. Mogelijk niet functioneel in mensen.- Cellijnen (insecten, zoogdieren, mens); Voordelen; Grote kans op goede ptm Nadelen; Duur, kans op infecties tijdens producties.- Planten; Voordelen; Eukaryoot, = juiste ptm, goedkoop, grote schaal. Nadelen; Niet altijd juiste ptm, dikke celwand maakt opzuivering moeilijk- Dieren; Grote kans op juiste ptm. Nadeel; niet zo eenvoudig, ethische vraagstukken.

Keuze hangt af van complexiteit van het eiwit.

Downstream processen;

ZuiveringChromatografie;- Glazen buis met kolommateriaal. Mengsel van eiwitten in bepaalde oplossing in de buis. Snelheid van door de buis heen gaan, hangt van van eigenschappen van eiwitten. Je scheidt ze dus van elkaar.- Size exclusion; Heel onregelmatig gevormde korrels. Grote eiwitten gaan snel, de kleine eiwitten zitten vast in het kolommateriaal. Je bepaalt in welke fractie je eiwit zit en je kiest degene waar je geinteresseerd in bent.- Centrifugeren of filtratie ook voor grootte.- Ion exchange chromatografie; kolommateriaal is geladen. Bijv positief geladen. Dan zullen de negatief geladen binden. Spoelen met steeds hoger wordende zoutconcentratie. Dus hoe zouter, hoe meer er los laat. Scheiden op lading.- Affiniteits chromatrografie; bijv antilichamen koppelen aan kolom.- Hydrofobiciteit.

HPLC; high performance liquid chromatrografie;- Scheiding vindt plaats onder zeer hoge druk. Snel en goed. Niet voor grote hoeveelheden. Meer analytisch.

Controleren van je zuivering; in welke fractie zit je eiwit? - Western blot als je antilichaam hebt. Geen antilichaam? Bekijk dan de activiteit van je eiwit.- Of SDS page. Scheiding van eiwit afhankelijk van grootte.

Proteomics; Het bestuderen van veel eiwitten tegelijk. Proteine microarrays, (met antilichamen) maar lastig ivm het ontwikkelen van die antilichamen. We kijken bij proteomics dus vooral naar kleine hoeveelheden eiwitten. Hoe kan het wel makkelijk? 2D electroferese met massaspectronomie.

2D electroferese = 1e keer op lading, 2e keer op grootte.Scheiden op lading; iso electrisch focussing. Eiwitten worden op een matrix gebracht die en pH gradient heeft, waarna spanning op gezet wordt. De eiwitten migreren naar de plaats waar hun lading nul is. Isoelectrisch punt. 1e dimentie.Dan SDS toevoegen, 2e dimentie = gewone sds page. Alle eiwitten zijn dan negatief gemaakt he, remember.

Identificatie eiwit;- N-terminaal sequencing door Edman degradatie; meest N terminale aminozuur gelabeld en afgesplitst. Het volgende aminozuur wordt bekeken en bepaald welke het is. En dan doe je dat steeds opnieuw. Dan krijg je de aminozuur volgorde. Die kan je vergelijken met eiwitten in database.- OF, Massaspectrometrie; Je isoleert eiwit dat je wilt identificeren. Je knipt in fragmenten met specifiek protease. Fragmenten worden geioniseerd en komen in analyser tube. Detector bepaalt hoe lang ze nodig hebben door die tube heen te gaan. Die is afhankelijk van de massa van een fragment. Die vergelijk je weer met de database.

-----------------------------------------------Werkcolleges---------------------------------------------------------------------

Transcriptie; Dna, RNA polymerase, Ribonucleotiden.

Translatie;Ribosoom, translatiefactoren, intiatior tRNA, tRNA's, Aminozuren, Aminoacyl tRNA synthetases, elongatiefactoren, peptidyl transferase, release factoren, ATP en GTP. Anticodon, mRNA, A/P/E bindingsplaatsen, proteine factoren.

Prokaryoten;Constante eiwit synthese, sneller aanpassen aan de omgeving dus onstabiel mRNA.

Eukaryoten;Gebeurt op specifieke momenten, uniek activator/enhancer systeen,/ wel stabiel mRNA.

Translatie- Initiatie; Klein subunit van ribosoom bindt aan mRNA met behulp van intiatiefactoren, intiatior tRNA bindt aan startcodon, waardoor de grote subunit bindt. - Elongatie; tweede tRNA bindt aan A site, peptidyl transferase katalyseert de peptidebinding tussen het aminozuur van het tRNA en de peptideketen. Lege tRNA laat los. tRNA met peptideketen gaat van A naar P site. Dit herhaalt zich en wordt gemedieerd door elongatiefactoren.- Terminatie; Stopcodon wordt bereikt. Releasing factors binden aan stopcodon en zorgen dat translatie stopt en de ribosoom subunits loslaten. Belangrijk; Aminoacyl tRNA synthetases koppelen aminozuren aan tRNA's. Dit kost ATP.GTP is nodig voor de geladen tRNA's en de translocatie.

Prokaryoten Eukaryoten

Maken chromosomale bank; Geinteresseerd in promotor of intronen, of als je niet weet of je gen tot expressie komt.- Isoleer chromosomaal DNA- Knipt chromosomaal DNA met restrictie enzymen- Kloneer de fragmenten in vectoren- Breng vectoren in gastheer

cDNAbank; Wanneer er geen intronen in mogen zitten (dus als je wilt kloneren in prokaryoten). Enkel voor coderend DNA, Bekend in welk weefsel het gen tot expressie komt.- Isoleren mRNA- Maken van cDNA met RT- Afbreken RNA streng- Maken dubbelstrengs DNA met DNA polymerase- Kloneren cDNA's in vectoren- Brengen van vectoren in gastheer.

Gedegenereerde probe; Combinatie van mogelijke DNA sequenties.

Ultrafiltratie; ook wel hoge druk. Precipitatie; Neerslag.

Bepalen tertiaire structuur eiwit; Kristallisatie en X-ray diffractie.

Als je een eiwit uit een extremofiel haalt, het gen voor dat eiwit isoleert en tot expressie brengen in E. coli. De stappen;

Gen inactiveren door RNA interferentie;

Somatic Cell Nuclear Transfer;- Verwijderen kern uit eiel- Somatische cel injecteren in eicel- Door electroshock fuseren zeHelaas; Kloons niet indentiek door omgevingsfactoren. Lage efficientie, vaak defecten, snellere veroudering door kortere telomeren.

Mogelijkheid iemand te herkennen aan de hand van VNTR Isolerenbloedvandeverschillendepersonen IsolerenDNAuitbloedcellen KnippenDNAmetrestrictieenzym Scheidenfragmentenmetagarosegelelectroforese Blottenopnitrocellulose IncuberenmeteenprobetegendeVNTRSouthernblotting

Dot-blot analyse;

Ontwikkeling DNA profiel in tijd;- Techniek;eerstRFLP(Southernblotting),nuPCR-Loci:eerstmultiplelocusVNTR,toen(meerdere)singlelocusVNTRs ennumeerderesinglelocusSTRs.- CodissysteemFBI 13STRmetPCR,kansophetzelfdeprofieliskleinerdan1opeenmiljard

Type DNA- Autosomaal dna; uniek- Y- Chromosmaal dna; Bepaling geslacht, blijft gelijk over generaties via mannelijke lijn- Mitochondriaal dna; aanwezig in heel veel kopien van de cel, erft door via vrouwelijke lijn.

ASO; Waarbij je naar 1 specifieke mutatie kijkt. amplificeermetPCRhetfragmentmetverwachtemutatie BlotopnitrocelluloseHybridiseermetallelspecifiekeprobes,ndieidentiekisaanhetwildtypeenndieidentiekisaanhetmutanteallel

Hybridoma techniek; InjecterengezuiverdCD28inmuizen IsolerenvanantilichaamproducerendeBcellenuitdemilt IedereBcelwordtapartgefuseerdmeteenmyeloma(kankercellen)cel=hybridoma SelecterenvaneenhybridomadieeenmonoclonaalantilichaammaakttegenCD28

HumaniserenvanmonoclonaleantilichamenStap1)kloneerdegenenuitdehybridomadiecoderenvoorhetmonoclonaleantilichaam(PCR)Stap2)Vervangdedelenvanhetmuizengendiecoderenvoordeconstantedelenvanhetantilichaamvoordiezelfdedelenvaneenhumaanantilichaam

Neemonbevruchteeicelenverwijderdekern Neemeencelvandepatinteninjecteerdehelecel(ofalleendekern)indeeicel Groeitotembryoinblastocyststadium Oogstdestamcellen