De biosynthese, regulatie en secretie van cyclische lipopeptiden in...

FaculteitBio-ingenieurswetenschappen

Academiejaar2015–2016

Debiosynthese,regulatieensecretievancyclischelipopeptideninfluorescerendePseudomonaspopulaties

CharlotteDeBruynPromotor:Prof.dr.ir.MonicaHöfteTutor:FeyisaraEyiwumiOlorunleke

Masterproefvoorgedragentothetbehalenvandegraadvan

Masterindebio-ingenieurswetenschappen:cel-engenbiotechnologie

Auteursrecht

i

AuteursrechtDe auteur, de promotoren en de tutor geven de toelating deze masterproef voor consultatiebeschikbaartestellenendelenervantekopiërenvoorpersoonlijkgebruik.Elkandergebruikvaltonderde beperkingen van het auteursrecht, in het bijzondermet de verplichting uitdrukkelijk de bron tevermeldenbijhetaanhalenvanresultatenuitdezemasterproef.Gent,juni2016Deauteur,CharlottedeBruynDepromotorProf.dr.ir.MonicaHöfte

Detutor,FeyisaraEyiwumiOlorunleke

Woordvooraf

ii

WoordvoorafTerugkijkendopditjaarmoetikeerlijkzeggenblijtezijndezewoordenteschrijven.Daarhetweliswaareeneindebetekentmaartevensookeennieuwbegin.Heteindevaneenlangewegmetupsendowns,vaneenfantastischeopleidingenvansamenwerkingenmetgeweldigemensen.Tochookhetbeginvannieuweupsendowns,vaneenspannendenieuwewereldenvannogteontdekkenvriendschappen.Dezethesissluitdedeurvanstudentzijnmaaropentdaarmeeookvelenieuwedeuren.Hiervoorwilikverscheidenemensenbedanken.Allereerstbedank ikmijntutor,FeyiOlorunleke,diemedoordewereldvandefytopathologieheeftgeleid enme zo veel heeft geleerd. Ze heeftme in contact gebrachtmet uitdagingen en heeftmegeholpenmezelfteontdekken.Ookbedankikmijnpromotor,Prof.dr.ir.MonicaHöfte,voordezekansommeteontwikkelen,voordebijsturingenkritischeblik.IkbedankOlumideOmoboyeomaltijdklaartestaanenmetehelpenenbegeleiden.Hijheeftmedoenthuisvoelenin‘hetPseudomonasteam’.OokbedankikEvelienDeWaelevoordehulpbijdevelePCR’s,enIlseDelaereenNadiaLemairevoordepraktischeassistentie.Bedanktaaniedereenopdefytopathologieomsteedsbereidtezijntehelpenenvoordebabbelsenleukemomenten.DankuwelJanomervoormetezijn.Ommeraadtegevenalsikeromvroegenalsikernietomvroeg.Enbedanktaanalmijnvriendenomsamentelachenenpleziertemaken,omtocheenpaarthesisvrijemomentjestecreëren.Tenslottedankaanmijnoudersommetesteunen,nietalleentijdensditthesisjaar,maardoorheenallestudiejaren.Ommetehelpenmijneigenwegtevinden.Mama,bedanktomallestocheensnatelezenookalwashetsomsmoeilijktebegrijpen.Allenbedanktomnieuwedeurenteopenen.

CharlotteDeBruyn

Gent,3juni2015

Samenvatting

iii

SamenvattingOrfamide is een cyclische lipopeptide met biosurfactants activiteit die geproduceerd wordt doorverschillendePseudomonas species. Deze orfamide producerendePseudomonas species zijn onderanderebelangrijkvoordelysevanoömyceetzoösporen,debiocontrolevanRhizoctoniaeninsecticideactiviteittegenbladluizen.Inditonderzoekwordtdebiosynthese,regulatieensecretievanorfamidebestudeerd in een aantal orfamide producerende Pseudomonas isolaten. De orfamidebiosynthesecluster bestaat uit drie biosynthesegenen ofaA, ofaB en ofaC; twee luxR-typeregulatiegenenluxUpenluxDownentweesecretiegenenmacA,macBeninsommigeisolateneenderdesecretiegennodT.P.protegensPf-5enPseudomonassp.CMR12aenCMR5cmakenorfamideaaneninde laatste twee stammen werd bewezen dat de twee luxR-type regulatorgenen instaan voor deregulatie van orfamide aangezien de LuxR-mutanten geen orfamide meer aanmaakten. Via qPCR-analyseisgeblekendatdezeLuxR-geneninPseudomonassp.CMR5cdeexpressievanhetsecretiegenmacB negatief reguleren. Het secretiesysteem van orfamide werd onderzocht in Pseudomonas sp.CMR12aenCMR5cdiehetMacA-MacB-secretiesysteembevattenomorfamidevanhetintracellulairemilieunaarhetperiplasmatebrengen.OmditorfamideverderhetextracellulairemilieuintepompenzijnbuitenstemembraanproteïnennodigzoalsNodTenOprMinPseudomonassp.CMR12aenOprMen Cmec in Pseudomonas sp. CMR5c. Via swarmingtesten met mutanten in deze buitenstemembraanproteïnen werd bewezen dat orfamide gebruik maakt van deze pompen om de cel teverlaten.Onderzoekmetinhibitorenomdewerkingvandezepompentegentegaantoondeaandathet secretiesysteem complexer is dan initieel gedacht. Het bewees dat er meerdere buitenstemembraanproteïnen instaan voorde secretie vanorfamide.Ookbeïnvloedendepompenelkaar enzorgtdecombinatievanafwezigeengeïnhibeerdepompenvoordehoeveelheidorfamidediedecelkan verlaten. Verder werd de bioactiviteit van orfamide tegen de oömyceet Pythium myriotylumnagegaan in vitroen in plantametP. protegensCHA0enPseudomonas sp. CMR5c.Deorfamide inPseudomonassp.CMR5c lijkt invitroeenrol tespelen inde inhibitievanP.myriotylum terwijl inP.protegensCHA0geenverschilwaartenemenwastussenhetwildtypeendeorfamidemutant.Meteeninplantaexperimentuitgevoerdopcocoyammetbeideisolatenlijktorfamidewelgeensignificanterolte spelen in het inhiberen van de groei van de oömyceet. Wel zou het kunnen bijdragen tot debeweegbaarheidvandebacterieindegrondendekolonisatievandeplantwortels.

Abstract

iv

AbstractOrfamide isacyclic lipopeptidewithbiosurfactantsactivity,producedbyanumberofPseudomonasspecies. Orfamides are important for lysis of oomycete zoospores, biocontrol of Rhizoctonia andinsecticidal activity against green peach aphid. In this research the biosynthesis, regulation andsecretion of orfamide is studied in some orfamide producing Pseudomonas isolates. The orfamidebiosyntheticclusterconsistsofthreebiosyntheticgenesofaA,ofaBandofaC;tworegulatorgenesluxUpandluxDownandtwosecretiongenesmacA,macBandinsomeisolatesathirdsecretiongenenodT.P.protegensPf-5andPseudomonassp.CMR12aandCMR5careisolatesthatcanproduceorfamide.Inthisworkweprove that the luxR-typeregulatorgenes inPseudomonassp.CMR12aandCMR5careresponsiblefortheregulationoforfamidebecausetheLuxRmutantsdonotmakeorfamide.WithaqPCR analysis it is shown that the LuxR genes in Pseudomonas sp. CMR5c negatively regulate thesecretiongenemacB.ThesecretionsystemoforfamidewasstudiedinPseudomonassp.CMR12aandCMR5c.TheycontaintheMacA-MacBsecretionsystemtobringorfamidefromtheintracellularspaceinto the periplasm. To pump this orfamide further into the extracellular space, outer membraneproteins are necessary, like NodT and OprM in Pseudomonas sp. CMR12a and OprM and CmeC inPseudomonassp.CMR5c.Swarmingtestswithmutants inthisoutermembraneproteinsprovedthatorfamidemakesuseofthispumpstoleavethecell.Researchwithinhibitorsthatblocktheactivityofthepumps,showedthatthesecretionsystemismorecomplexthaninitiallythought.Thisprovesthattherearemoreoutermembraneproteinsresponsibleforthesecretionoforfamide.Furthermore,thepumpshaveinfluenceoneachotherandacombinationofabsentpumpsandpumpsthatareinhibitedhasinfluenceontheamountoforfamidethatcanleavethecell.Alsothebioactivityoforfamideagainstthe oomycetePythiummyriotylumwas testedwith an in vitroand an in plantaexperimentwithP.protegensCHA0andPseudomonassp.CMR5c.TheorfamideinPseudomonassp.CMR5cseemstoplaya role in vitro in the inhibition of P.myriotylum while in P. protegensCHA0 there is no differencebetween the wild type and the orfamidemutant. The orfamide of both isolates seems to play nosignificantroleinplantaoncocoyamintheinhibitionofthegrowthoftheoomycete.Maybeorfamidecouldcontributetothemotilityofthebacteriainthegroundandthecolonisationoftheplantroots.

Lijstvanafkortingen

v

LijstvanafkortingenAfkorting Betekenis

A-domein Adenylatiedomein

ABC ATP-bindingcassette

AHL N-acyl-homoserinelacton

AZ Aminozuur

C-domein Condensatiedomein

C-domein Cyclisatiedomein

CCC Carbonylcyanide3-chlorophenylhydrazone

cDNA CopyDNA

CFTR Cysticfibrosistransmembranaireregulator

CFU ColonyFormingUnit

CLP Cyclischelipopeptide

CWDE Celwand-afbrekende-enzymen

DAPG 2,4-diacetylphloroglucinol

DNA Desoxyribonucleïnezuur

E-domein Epimerisatiedomein

GLB Glybenclamide

HCN Waterstofcyanide

HPLC-MS High-performanceliquidchromatografy-Massaspectrometry

Hpt Histidinefosfotransfer

HTH Helix-turn-helix

ISR Inducedsystemicresistance

M-domein N-methylatiedomein

MM MasterMix

NOV Natriumorthovanadaat

NRPS Niet-ribosomalepeptidesynthetase

OD Optischedensiteit

ofaA orfamideAgen

ofaB orfamideBgen

ofaC orfamideCgen

ORF Openreadingframe

orf Orfamide

PCP Peptidylcarrierproteïne

PCR Polymerasekettingreactie

PDI Plantziekteindex

PLT Pyoluteorin

PRN Pyrrolnitrin

qPCR KwantitatievePolymerasekettingreactie

Lijstvanafkortingen

vi

Afkorting Betekenis

R-domein Reductasedomein

RNA Ribonucleïnezuur

RND Resistance-nodulation-division

RSD RelatieveStandaardafwijking

RT-PCR RealTimePolymerasekettingreactie

SUR Sulfonylureareceptors

T-domein Thiolatiedomein

TE-domein Thioesterasedomein

TRI Trizol

WT Wildtype

μ Gemiddelde

σ Standaardafwijking

Inhoudsopgave

vii

InhoudsopgaveAuteursrecht.......................................................................................................................i

Woordvooraf.....................................................................................................................ii

Samenvatting....................................................................................................................iii

Abstract............................................................................................................................iv

Lijstvanafkortingen...........................................................................................................v

Inhoudsopgave.................................................................................................................vii

1.Inleiding.........................................................................................................................1

2.Literatuurstudie..............................................................................................................22.1FluorescerendePseudomonads..............................................................................................2

2.1.1Inleiding..................................................................................................................................22.1.2Classificatie.............................................................................................................................22.1.3Biologischerelevantie............................................................................................................2

2.2Biosurfactants........................................................................................................................42.2.1Inleiding..................................................................................................................................42.2.2Cyclischelipopeptiden............................................................................................................4

2.3RegulatievanCLP’s..............................................................................................................102.3.1Inleiding................................................................................................................................102.3.2LuxR-typetranscriptieregulatorgenen.................................................................................112.3.3GacS/GacAtweecomponentensysteem..............................................................................112.3.4Quorumsensing...................................................................................................................122.3.5Heatschokproteïnen...........................................................................................................122.3.6ProteaseClpP.......................................................................................................................132.3.7Andereregulatorischegenen...............................................................................................132.3.8Milieueffecten......................................................................................................................14

2.4SecretievanCLP’s................................................................................................................152.4.1Inleiding................................................................................................................................152.4.2RNDeffluxpompen...............................................................................................................152.4.3TypeIsecretiesystemen......................................................................................................16

2.3HetCLPorfamide.................................................................................................................172.3.1Inleiding................................................................................................................................172.3.2Pseudomonasprotegensstammen......................................................................................172.3.3NauwverwantePseudomonasisolaten...............................................................................192.3.4Regulatievanorfamide........................................................................................................202.3.5Secretievanorfamide..........................................................................................................202.3.6Biologischerelevantievanorfamide....................................................................................22

2.4Cocoyam..............................................................................................................................23

3.Doelstelling..................................................................................................................24

Inhoudsopgave

viii

4.Materiaal&Methoden.................................................................................................254.1Fenotypebepaling...............................................................................................................25

4.1.1Druppelinzaktest..................................................................................................................254.1.2Swarming..............................................................................................................................254.1.3HPLC-MS-analyse..................................................................................................................264.1.4Inhibitoren............................................................................................................................264.1.5RealTimePolymerasekettingreactie(RT-PCR).....................................................................274.1.6KwantitatievePolymerasekettingreactie(qPCR)..................................................................29

4.2Invitroinhibitieexperiment................................................................................................304.3Biocontroleexperimentmetcocoyam.................................................................................31

4.3.1Weefselkweekcocoyam.......................................................................................................314.3.2Inoculatie..............................................................................................................................32

5.Resultaten&Discussie..................................................................................................345.1Biosynthesevanorfamide....................................................................................................34

5.1.1Resultaten............................................................................................................................345.1.2Discussie...............................................................................................................................365.1.3Conclusie..............................................................................................................................37

5.2Regulatievanorfamide........................................................................................................385.2.1Resultaten............................................................................................................................385.2.2Discussie...............................................................................................................................415.2.3Conclusie..............................................................................................................................45

5.3Secretievanorfamide..........................................................................................................455.3.1Resultaten............................................................................................................................455.3.2Discussie...............................................................................................................................545.3.3Conclusie..............................................................................................................................58

5.4Bioactiviteitvanorfamide....................................................................................................595.4.1Resultaten............................................................................................................................595.4.2Discussie...............................................................................................................................625.4.3Conclusie..............................................................................................................................65

6.Algemeneconclusies....................................................................................................66

7.Ideeënvoorverderonderzoek......................................................................................67

8.Bronnen.......................................................................................................................68

9.Bijlage..........................................................................................................................769.1Tabellen...............................................................................................................................769.2Figuren................................................................................................................................83

Inleiding

1

1.InleidingFluorescerendePseudomonasbacteriënkomenvoornamelijkindeaandachtindemedischewereldmethetmenselijk pathogeenPseudomonas aeruginosa ookwel bekend als de ziekenhuisbacterie. Dezebacterie staat bekend om zijn resistentie tegen verscheidene antibiotica. Wanneer antibioticatoegediendwordenendebacteriebinnendringen,kandebacterieviaeeningenieuspompsysteemdeantibioticaterugnaarbuitenpompen.Opdezemanierhebbendeantibioticageeneffectopdebacterieenishetbijzondermoeilijkdebacterieuitteschakelen.Indegeneeskundeligtdeprioriteitdanookinhetblokkerenvanditpompsysteemzodatdeantibioticadebacterienietkunnenverlatenendebacterieuiteindelijksterft.WaaromechterbevatdeP.aeruginosaditpompsysteem indeeersteplaats?Hetpompsysteem is er niet alleen om exogenemoleculen naar buiten te pompenmaar ook om eigenmetabolietenbuitende cel tebrengen.Dezemetabolieten kunnendebacteriehelpen in zijn groei,onderhoud of levenswijze of kunnen een invloed uitoefenen op het extracellulair milieu waar debacteriezichbevindt.BiosurfactantszijnmetabolietenaangemaaktdoortalvanbacteriënwaaronderfluorescerendePseudomonasbacteriën.Sommigevandezebiosurfactantskunnendebeweegbaarheidvandebacterie vergroten, plant-pathogene-activiteit vertonenof juist plant-pathogenenbestrijden.DaarP.aeruginosaeenmenselijkepathogeeniskandezeechternietgebruiktwordenvoorbiologischecontrole op planten. Om die reden is het interessant te onderzoeken of er andere Pseudomonasbacteriën bestaan die biosurfactants aanmaken en die het pompsysteem gebruiken om debiosurfactantsnaarbuitentebrengen.Opdezemanierishetonderzoeknaarhetpompsysteemnietalleen vanbelang voor demedischewereldmaar ook voor de landbouw, daar biologische controleplantenziekteskanbestrijdenenplantopbrengstenkanverhogen. Inditonderzoekwordencyclischelipopeptidenbestudeerd.Dezezijneen typebiosurfactantsdiedoor talvanPseudomonasbacteriënworden geproduceerd. Cyclische lipopeptiden zijn belangrijk voor verscheidene functies zoals debeweegbaarheidvandebacterie,devasthechtingenlosmakingvandebacterieaaneenoppervlak,debiobeschikbaarheid,antimicrobiëleactiviteit,plant-pathogeniteit,resistentietegenpathogenenenzelfsbiologische controle. Orfamide is een recent ontdekte cyclische lipopeptide, reeds bekend om zijnbiocontrole activiteit. Verscheidene fluorescerende Pseudomonas bacteriën over de hele wereldkunnen orfamide aanmaken.Maar hoewordt dit orfamide gevormd?Doorwelke genenwordt hetgereguleerd?Opwelkemanierwordthetbuitendebacteriegebracht?Onderzoeknaarorfamide isnodigominzichtteverwerveninzijnbiologischecontrole.Ditkanleidennaareennieuwmanieromplant-pathogenentebestrijdenenplantenopbrengstenteverghogen.

Literatuurstudie

2

2.Literatuurstudie

2.1FluorescerendePseudomonads

2.1.1InleidingDePseudomonaszijneencomplexegroepbacteriëndiebehorentotdegammaproteobacteriën.HetaantalPseudomonasbacteriënstaatmomenteelop144species(Gomilaetal.,2015).HetzijnaerobeGram-negatieve bacteriën en bevatten derhalve een binnenste en buitenste cytoplasmamembraan(Trögletal.,2012).Doordesamenstellingvanhetbuitenstemembraan,namelijkfosfolipiden,eiwittenen lipopolysachariden, zijn deze bacteriën bijzonder weinig permeabel voor kleine hydrofielemoleculen. Hierdoor zijn de Pseudomonas bacteriën goed bestand tegen het binnendringen vanantimicrobiëleagentia(Nikaido,1989).HetgenusPseudomonasbevattweegrotegroepennamelijkdeP. aeruginosa en de P. fluorescens of ook wel de fluorescerende Pseudomonas bacteriën. Defluorescerende Pseudomonas bacteriën worden zo genoemd omdat ze fluorescerende geelgroenepigmenten kunnen aanmaken op cultuurmedia (Hua and Höfte, 2015). De P. fluorescens wordenopgedeeldinvijfgroepennamelijkP.putida,P.syringae,P.lutea,P.aspleniienP.fluorescens.HierbijisdeP.fluorescensgroephetmeestverschillendvandeanderegroepeneneenzeerdiversegroepdieopgedeeldwordt in negen subgroepen, namelijk:P. fluorescens, P.gessardi, P. fragi, P.mandelii, P.jesseni,P.koreensis,P.corrugata,P.chlororaphisenP.protegens,weergegeveninFiguur1(Garrido-Sanzetal.,2016).Persubgroepkomendanverscheidenespeciesvoor.

2.1.2ClassificatieDeclassificatievandePseudomonasspeciesgebeurtdoorverschillendegenentesequeneren.Zowordthet 16S rRNA gen gebruikt als een universelemarker waardoor verschillende bacteriën vergelekenkunnenworden.Verschillentussendesubgroepenwordenechternietmakkelijkteruggevondendoorhet16SrRNAgenomdathetgengeconserveerdisonderbacteriënvandezelfdesoort.Hierdoorwordenandere 'housekeeping'genenaangeroepenzoalshetgyrB gen,het rpoBgenenhet rpoDgen.DezegenenwordengebruiktvoordefylogenetischekarakterisatievandePseudomonasbacteriën.Hiervoorkanonderanderemulti-locussequenceanalysis(MLSA)gebruiktwordenenkanereenfylogenetischeboomgemaaktworden.Indienmeerdan97%gelijkheidoptreedttussende'housekeeping'genenvandebacteriënbehorenzetotdezelfdesoort(Gomilaetal.,2015;Muletetal.,2010).

2.1.3BiologischerelevantieDoordatdefluorescerendePseudomonasbacteriënzodiverszijnkomenzevoorinverscheidenemilieuszoals water, bodem, planten en sedimenten (Hua and Höfte, 2015). Ze kunnen bijvoorbeeld voorbiodegradatiegebruiktwordendoortoxischeenchemischecomponentenaftebreken.Zezijnechtervoornamelijkinteressantomdatzeinhogeaantallenaanwezigzijnaandeoppervlaktenvanwortelsenbladerenvanplanten.Doorhetaanmakenvanbepaaldestoffenkunnenzedaneeninvloeduitoefenenop de werking van de plant. Deze bacteriën worden aldus vaak bestudeerd om plantengroei en -gezondheidteverbeteren(Botelho&Mendonça-Hagler,2006).Zokunnenzeinvloeduitoefenenopdewerkingvanbepaaldeplant-pathogenenindebodemdoorbijvoorbeeldincompetitietetredenmet

Literatuurstudie

3

hetpathogeen,eenantagonistischeffectuitteoefenen,predatieofdoorhetresistentiemechanismevandeplantteverhogen(Chin-A-Woengetal.,2003;Troxleretal.,1997).Dezebiocontroleactiviteitvande fluorescerendePseudomonadsmaakthundanookeengraagonderzocht studieobject.DezethesiszaleveneensmeerinzichtbrengenindeinteractietussenfluorescerendePseudomonasbacteriënendeplant.

Figuur1.ClassificatievandePseudomonasfluorescensgroepinnegensubgroepen;P.fragiisnietopgenomenindezefiguur(Garrido-Sanzetal.,2016).

P.mandeliisubgroep

P.jesseniisubgroep

P.koreensissubgroep

P.corrugatasubgroep

P.fluorescenssubgroep

P.gessardiisubgroep

P.chlororaphissubgroep

P.protegenssubgroep

Literatuurstudie

4

2.2Biosurfactants

2.2.1InleidingEen bacterie maakt metabolieten aan die instaan voor zijn overleving, groei, ontwikkeling enreproductie.Ookkunnensecundairemetabolietenwordenaangemaaktdiehiernietrechtstreeksbijbetrokken zijn maar wel biologisch werkzaam zijn en voordelen bieden zoals: antibiotica, toxinen,herbicidenensurfactants.Dezesecundairemetabolietenwordenvaakaangemaaktopheteindevandeexponentiëlefaseenstationairefaseaangeziendezenietonmiddellijknodigzijn(Soetaert,2014).Deproductiekaneveneensopgangkomenonderbepaaldeomstandigheden(Ludwig-Müller,2015).Ook de fluorescerende Pseudomonas bacteriënmaken secundaire metabolieten aan, voornamelijkantibioticaenbiosurfactants(Neidigetal.,2011).Surfactantszijnamfipatischeorganischemoleculenwatbetekentdatzezowelhydrofielealshydrofobedelenbevatten.Hierdoorbevindendemoleculenzichvaakaande interfasetussenvloeibare fasenmetverschillendepolariteitenwaterstofbindingen(Rodriguesetal.,2006).Zekunnenoppervlakteeigenschappenzoalsoppervlakte-energieen-spanningveranderen.Indiendezesurfactantsgeproduceerdwordendooreenorganismewordtgesprokenvanbiosurfactants(Sung-Chyr,1996).Deproductieervankomtvaakvoorbijplantgeassocieerdebacteriënzodatzedegezondheidvandeplantoppositieveofnegatievewijzekunnenbeïnvloeden(D’aesetal.,2010). Biosurfactants worden beschouwd als secundairemetabolieten toch kunnen ze in sommigegevalleneenrolspelenindeoverlevingvanhetmicro-organismedoorbijvoorbeeldnutriëntentransporttevergemakkelijken(Rodriguesetal.,2006).Zekunneninvloeduitoefenenopdebeweeglijkheidvanhetmicro-organisme,opdebiofilmformatieendekolonisatie.Ookkunnenzedebiobeschikbaarheidvanexogenecomponentenzoalsnutriëntenveranderenzodatdezeenendogenemetabolietenbeteropgenomenkunnenworden,watresulteert ineenverhoogdebiologischeactiviteit.Quorumsensingactiviteitkaneveneensbeïnvloedwordendoordezebiosurfactants.(D’aesetal.,2010;Rodriguesetal.,2006).Doordatzedoormicro-organismenaangemaaktwordenzijnzeintegenstellingtotsynthetischesurfactantsbeterbiodegradeerbaar,mindertoxisch,resistentertegenextremetemperaturen,pHenzoutgehalteenmeerdivers(Mnif&Ghribi,2015;Rodriguesetal.,2006;Sung-Chyr,1996).Hetisechternietzekerofdewaargenomeneffectenvandebiosurfactantsinvitrodezelfdezijnalsinhunnatuurlijkeomgevingaangeziendeaangemaaktehoeveelhedenverschillenenerrekeningmoetwordengehoudenmetmilieucondities(D’aesetal.,2010).Erzijnverschillendesoortenbiosurfactantsbeschrevenzoalsglycolipiden,fosfolipiden,polysacharideproteïnecomplexen,vetzuren,neutralelipidenenlipopeptiden(Rodriguesetal.,2006).

2.2.2Cyclischelipopeptiden

2.2.2.1InleidingCyclische lipopeptiden (CLP's) zijn een type biosurfactants met een laag moleculair gewicht dievoorkomeninverscheidenevormenendiegeproduceerdwordendoorvelebacteriën,waaronderookdefluorescerendePseudomonasbacteriën(Raaijmakers,deBruijn,&deKock,2006;Ron&Rosenberg,2001).CLP'swordenmetzekerheidgeproduceerddoorvolgendeplantgeassocieerdePseudomonas:P.syringae,P.tolaasii,P.fuscovaginae,P.corrugata,P.fluorescens,P.protegensenP.putida(Nielsenetal.,2002;Raaijmakersetal.,2006).CLP'sbestaanuiteenvetzuurstaartgekoppeldaaneenringvormigeoligopeptidenzodateenlactonringwordtgevormdtussentweeaminozurenuitdepeptideketen(de

Literatuurstudie

5

Bruijnetal.,2007;Finking&Marahiel,2004;Raaijmakersetal.,2006).Structureleverschillenkomenveelvuldig voor door variaties in het aantal, type, positie en configuratie van de aminozuren in depeptidemaarookdoorverschillen inde lengteencompositievandevetzuurstaart (deBruijnetal.,2007; Raaijmakers et al., 2006). Omdat CLP's worden aangemaakt door een verscheidenheid aanbacteriënenomdatzeverschilleninchemischestructuurwordtverwachtdatzemogelijkmeerdereenverschillendebiologischefunctiesbevatten.VelefluorescerendePseudomonasbacteriënkunnenindebodemCLP’sproduceren,watdoetvermoedendatCLP'seenecologischfunctiehebbenindebodemwaarbijbodemtype(pHentextuur)eenrolkanspelen.Zokunnenertalvanvoordelenoptredenvoorde fluorescerende Pseudomonas bacteriën door CLP's te produceren in de rhizosfeer, namelijk, debeweegbaarheid van de bacterie vergroten, zorgen voor adhesie van de bacterie aan de wortels,nutriëntenbeterbeschikbaarmaken,zorgenvooreencompetitievoordeelenaanantagonismedoen(Nielsen et al., 2002). Bij plant-pathogene Pseudomonas bacteriën zijn CLP's belangrijkevirulentiefactoren en kunnen ze poriën induceren met celdood tot gevolg. Bij antagonistischePseudomonas bacteriën kunnen CLP's een rol spelen in antimicrobiële en cytotoxische activiteit,beweegbaarheidenbiofilmformatie.Ookantagonistische interactiesmetandereorganismenkomenfrequentvoorzoalsplanten,schimmels,oömyceten,mycoplasma's,bacteriënenvirussen(deBruijnetal.,2007;Nielsenetal.,2002;Raaijmakersetal.,2006).OpbasisvanhunstructuurwordenCLP'svande Pseudomonas species opgedeeld in negen grote groepen: viscosin, syringomycin, orfamide,amphisin,putisolvin,entolysin,xantholysin, tolaasinensyringopeptin(Gross&Loper,2009;Lietal.,2013;Mnif & Ghribi, 2015; Roongsawang et al., 2011). Tabel 1 geeft de classificatie van de negengroepenweerterwijlFiguur2destructurenweergeeftvanamphisin,syringomycinentolaasin.Tabel 1. Gekende CLP’s geproduceerd door Pseudomonas species opgedeeld in negen klassen met aantalaminozuren(AZ)waaruitzebestaan(Gross&Loper,2009;Lietal.,2013;Mnif&Ghribi,2015;Roongsawangetal.,2011).Groep AantalAZ CLP Groep AantalAZ CLPViscosin 9 Viscosin Putisolvin 12 PutisolvinI Viscosinamide PutisolvinII WLIP Entolysin 14 EntolysinA MassetolideA/B/C Xantholysin 14 XantholysinA/C MassetolideD XantholysinB MassetolideE MA026 MassetolideF Tolaasin 22 TolaasinI MassetolideG/H TolaasinII PseudophominA/B TolaasinA PseudodesminA TolaasinB PseudodesminB TolaasinFSyringomycin 9 SyringomycinSRA SessilinA SyringomycinSRE FuscopeptinA/B SyringostatinA CorpeptinA/B SyringostatinB ChicopeptinA/B PseudomycinA/C Sclerosin CormycinA Syringopeptin 23 SP22Orfamide 10 OrfamideA/C SP25A OrfamideB/D/E Phe-SP25AAmphisin 11 Amphisin Tensin Pholipeptin Lokisin ArthrofactinA/D/C ArthrofactinB

Literatuurstudie

6

2.2.2.2BiosyntheseCLP'sworden gevormd via niet-ribosomale peptide synthetases (NRPS's). Deze zijnmultifunctioneleenzymen om peptiden aan elkaar te binden en bevatten een grote activiteit. Tal van onnatuurlijkeaminozurenenanderemoleculenzoalscarboxyzurenenvetzurenkunnengeïncorporeerdwordendoorNRPS'swaardooreengrotestructurelevariabiliteitinpeptidenontstaat(deBruijnetal.,2007;Finking& Marahiel, 2004; Raaijmakers et al., 2006). NRPS gevormde peptiden verschillen eveneens vanribosomaalgevormdepeptidendoordatdezelaatsteverschillendenakijkmechanismesbevatten.DezezijnvanbelangvooreengoedewerkingvanhetprimairemetabolismewaarhetbijNRPS'sbelangrijkiseenvariëteitaanpeptidentekunnenmaken(Finking&Marahiel,2004).NRPS'swordengecodeerddooreenzeergrootgenclusterenbevatteneenmodulairestructuurwaarbijelkemoduleinstaatvoordestapsgewijzeincorporatieenmodificatievanéénbepaaldaminozuurindeoligopeptide(D’aesetal.,2010;Raaijmakersetal.,2006).Moduleskunnenverderopgedeeldworden in initiatie,elongatieenterminatiemodules.DeNRPS-elongatiemodulebevatdriegeconserveerdedomeinen:hetA-domein,T-domeinenC-domein.Hetadenylatiedomein(A-domein)isverantwoordelijkvoorhetselecterenvanaminozurenenactiveertdezetotamino-acyl-adenylaatwaarATPwordtverbruikt.Hetthiolatiedomein(T-domein)ofookwelpeptidylcarrierproteïne(PCP),zorgtvoordethioesterificatievanhetgeactiveerdaminozuurenstaatinvoorhettransport.Hetcondensatiedomein(C-domein)zorgttenslottevoordepeptidebindingtussenhetaminozuurdatgebondenzitophetPCPvandezelfdemoduleenhetpeptidylgebondenopdevorigemodulewaardooreenpeptideketenwordtopgebouwd.Hetgevormdepeptidebeweegtvandeenemodulenaardeandereenhetaantalendesequentievandeaminozurenindepeptideisgelinktaanhetaantalendevolgordevandemodules(Bertietal.,2007;deBruijnetal.,2007;FinkingandMarahiel,2004;GrossandLoper,2009;Marahieletal.,1997;Raaijmakersetal.,2006).DeNRPS-initiatiemodule zorgt voor de aanbreng van het eerste aminozuur voor de synthese van depeptide.DezemodulebevatgeenC-domein(deBruijnetal.,2007).DeNRPS-terminatiemodulebestaatenkeluithetthioesterasedomein(TE-domein).Wanneerdelineairpeptideaangemaaktis,wordtnogeenlaatsteaminozuurtoegevoegddoorditTE-domein,waarnahetlineairepeptideaanheteindewordt

Figuur2.StructuurvanCLP(a)amphisin,(b)syringomycinen(c)tolaasin(Hamley,2015).

Literatuurstudie

7

'losgeknipt'waardooreenlineairproductvrijkomt.Dooreenintramoleculairereactiekaneveneenseencyclischeofvertaktepeptidegevormdworden(deBruijnetal.,2007;Gross&Loper,2009;Marahieletal.,1997;Raaijmakersetal.,2006).InFiguur3wordteenschematischeweergavegegevenvandeNRPS.VerderzijnernogverschillendedomeinendienodigkunnenzijntijdensNRPS-peptidevorming:hetE-domein,M-domein,Cy-domeinenR-domein.Hetepimerisatiedomein(E-domein)isverantwoordelijkvoordeconversievandeLnaarD-vormvaneenaminozuur.Hetisinsommigegevallenookmogelijkdat eenexterne racemase verantwoordelijk is voorde L naarD conversie, zoals bij de vorming vanarthrofactin(Raaijmakersetal.,2006).HetN-methylatiedomein(M-domein)zorgtvoormodificatievanhetNRPSwaardoordebiologischeactiviteitvergrootwordtendepeptidebindingwordtgestabiliseerd(Marahieletal.,1997).Hetcyclisatiedomein(Cy-domein)staatinvoordevormingvaneenoxazoolringofeenthiazoolringterwijlhetreductasedomein(R-domein)dezeringsystemenverderkanreducerentotoxazolidineenthiazolidineringsystemen(Gross&Loper,2009).

Voornamelijk het A-domein is verantwoordelijke voor de grote variabiliteit in CLP's. Twee dezelfdeaminozuren kunnen namelijk geselecteerd worden door een verschillend A-domein. Het A-domeinbevateveneensde'wobble-like'positiewaardooreenflexibelergebruikinaminozurenplaatsvindt.Opdezemanierkunnenerdus'incorrecte'aminozureningebouwdwordenwaardoordeiso-vormenvansommigeCLP'sverklaartkunnenworden.NietenkelhetA-domeinmaarookC-,E-enTE-domeinenkunneneenrolspelenindeherkenningvanaminozuren(Raaijmakersetal.,2006).SommigebacteriënkunnenookmeerdereNRPSgenclustersbevatten,wateveneenshetontstaanvanverschillendeCLP'sverklaart(D’aesetal.,2010).

2.2.2.3BiologischnutCLP'sgeproduceerddoorfluorescerendePseudomonasbacteriënhebbentalvanbiologischefuncties.In deze sectie zal voornamelijk de CLP-activiteit van plantgeassocieerde Pseudomonas bacteriën

Figuur3.Moduleswordenafgeschrevenuiteengen.Dezemoduleswordenonderverdeeldininitiatie,elongatieenterminatiemodulesdiebestaanuitkatalytischedomeinenvoorsubstraatactivatie(A-domein),transport(T-domein),vormingvanpeptidebinding(C-domein)enloslatenvandepeptideketen(TE-domein).InitiatiemodulesbevattengeenC-domeinenterminatiemodulesbevattenenkelhetTE-domein(Finking&Marahiel,2004).

Literatuurstudie

8

bekekenworden,namelijkdeoppervlakteeigenschappen,antimicrobiëleactiviteit,plant-pathogeniteit,geïnduceerderesistentieenbiologischecontrole.

Oppervlakteeigenschappen

BeweegbaarheidZoals reeds eerder besproken maken fluorescerende Pseudomonas bacteriën voornamelijkbiosurfactantsaanalssecundairemetabolieten.CLP'szijneentypebiosurfactantsenkunnenerdusvoorzorgendatdeoppervlaktespanningverlaagdwordtofzekunnendeviscositeitvanhetoppervlakveranderen.Zokanviscosindeoppervlaktespanningverlagentot27mN/m(Ron&Rosenberg,2001).Sommigeplant-pathogenenenantagonistische fluorescerendePseudomonasbacteriënzijndusvoorhun beweegbaarheid in de fyllo- en rhizosfeer afhankelijk van hunCLP-productie, namelijk door deoppervlaktespanningteverlagenkunnenzezichmakkelijkerbewegennaardewortelsofbladerenvandeplanttoe.DitisbewezenvoorP.fluorescenswaardeproductievanviscosinenamphisinzorgtvooreengroterbeweegbaarheidvandebacterie(D’aesetal.,2010;Raaijmakersetal.,2006).Waarschijnlijkspeeltnietalleendeinvloedvandeoppervlaktespanningeenrolbijdebeweegbaarheidmaarookdefysischeenchemischestructuurvandebiosurfactants(Raaijmakersetal.,2006).Hierdoorkanverklaardwordenwaarom sommige CLP's een hogere beweegbaarheid hebben dan anderen. Het is namelijkbewezendatCLP'suitdeamphisingroepeenhogerebeweegbaarheidvandeP.fluorescensinduceerdedanCLP'suitdeviscosingroep(Nielsenetal.,2002).

VasthechtingenlosmakingDe vasthechting van een bacterie aan het oppervlak van een plantwortel hangt af van zowel dehydrofobe reacties als de hydrofiele reacties van de geproduceerde CLP-molecule. De meestenatuurlijke oppervlakken hebben een negatieve lading, uitzonderlijk een positieve lading, wat vanbelangisbijdevasthechtingvanionischeCLP'swaarookdeionconditiesendepHeeneffecthebben(Neu, 1996). Na deze vasthechting kan dan biofilmformatie plaatsvinden. De rol van de CLP's inbiofilmformatiehangtaf vande fysischeenchemischeeigenschappendie zebevatten (D’aeset al.,2010).CLP'salsviscosinenmassetolidegeproduceerddoorP.fluorescensenarthrofactinenputisolvinIenIIgeproduceerddoorP.putidaenPseudomonasspeciesMIS38,kunnenbiofilmformatieinducerenofveranderen.DitisvoornamelijkvanbelanginderhizosfeerzodatzedefluorescerendePseudomonasbacteriënhelpendeplantenwortelsefficiënter tekoloniseren (D’aesetal.,2010;Raaijmakersetal.,2006). CLP's als surfactin, geproduceerd door Salmonella species en B. subtilis, kunnen dan weerbiofilmformatieinhiberen,watbelangrijkisinhetonderzoekombiofilmentevernietigen(Raaijmakerset al., 2006). Het binden van CLP's aan het celoppervlak van de bacterie kan de hydrofobeeigenschappenvanzijnceloppervlakveranderenwaardoordebacteriezichuiteindelijkloskanmakenvandebiofilm.DemoleculairestructuurvandeCLP-moleculenisdusbelangrijkvoorvasthechtingoflosmakingvanbacteriënaanoppervlakken(Neu,1996).

BiobeschikbaarheidCLP's kunnenandereuitgescheidenmetabolieten zoals fenazines inoplossingbrengenwaardoordebioactiviteitverhoogdwordt.OpdezemanierhebbendeCLP'sendefenazineseensynergistischeffect;insommigegevallenisheteffectechteradditief.EenonderzoektoontaandatCLP'sgeproduceerddoorPseudomonas species CMR12a verantwoordelijk kunnen zijn voor deonderdrukking vanVerticilliummicrosclerotia(D’aesetal.,2010).DitwerdaangetoonddoordatdeCLP-mutantendeaanwezigheidvan

Literatuurstudie

9

demicrosclerotiaveelminderkononderdrukken.DeCLP'skunneneendunnebiofilmvormenaanhetoppervlakvandemicrosclerotiaenerfunctionerenalstransportmoleculenvoorfenazines.Aangezienfenazines redox eigenschappen bevatten, hebben deze ook een functie als extracellulaire elektronshuttlewaar CLP's eveneens helpen om deze rol te vervullen (D’aes et al., 2010). Plant-pathogenePseudomonas bacteriën gebruiken ook CLP's om celwand-afbrekende-enzymen (CWDE) naar hetoppervlakvandeplanttebrengen.ZehelpenmeeindebiobeschikbaarheidvanCWDE(Raaijmakersetal.,2006).DoordeCWDE'sterbeschikkingtestellenwordtdecelwandafgebrokenenkunnentoxischesurfactantshetcelmembraanbinnengaanomdecelmembraanfunctiesteverstoren.ZonderdeCWDE'szouditeffectmindernadrukkelijkvoorkomen(Foglianoetal.,2002).

AntimicrobiëleactiviteitZowelCLP'salsbiologischemembranenbestaanuitamfipatischemoleculenwaardoorzebijzondergoedkunnen interageren met elkaar. CLP's kunnen reageren als breed spectrum agentia met cytolyseactiviteit waardoor biologische membranen afgebroken worden en bacteriën, virussen, schimmels,mycoplasma'senoomycetenmedeafsterven(D’aesetal.,2010;Raaijmakersetal.,2006).SommigeCLP'szijntoxischvoorbepaaldeorganismenterwijlzeminderactiviteitvertonentegenanderen.Dezeverschillen kunnen te wijten zijn aan de structurele verschillen van zowel CLP als membraan. Ookstereochemischeveranderingenenverschillentussenéénaminozuurkunnenverantwoordelijkzijnvoordeverschillendeactiviteiten.ZowasdeantimicrobiëleactiviteitvandegezuiverdeCLP'svanamphisin,lokisinentensinhogerdanvoorviscosinamide(Nielsenetal.,2002).DeCLP'sgeproduceerddoordefluorescerendePseudomonasbacteriënhebbenvaakeentoxischeffecttegenschimmels(D’aesetal.,2010).Viscosinamide,geproduceerddoorP.fluorescensDR54,zouiontunnelskunnencreëreninhetmembraanvandeoömyceetPythiumultimumendeschimmelRhizoctoniasolani,waardoorhungroeiverhinderd wordt (Nielsen et al., 1998). Ook tensin, geproduceerd door P. fluorescens 96.578, kanschimmelgroeivanR.solani inhiberen(Nielsenetal.,2000).Echter, inhetgevalvanP.tolaasiizorgttolaasinervoordatdecelmembraanvaneetbarepaddenstoelenverstoordwordtwaardoordeziekte'brownblotch'floreert,watleidttoteconomischeverliezen(D’aesetal.,2010).DeCLP'smassetolideenviscosingeproduceerddoorP.fluorescensSS101enSBW25kunneneenrolspelenindeverdedigingtegenpredatievanprotozoaNaegleriaamericana(Mazzolaetal.,2009).

Plant-pathogeniteitEen verscheidenheid van plant-pathogene Pseudomonas bacteriën produceren CLP's, namelijk P.syringaepv.syringae,P.syringaepv.atrofaciensenP. fuscovaginae.DezeCLP's zijnfytotoxineswatbetekentdatzedeplantgroeiinhiberenofzelfsgiftigzijnvoordeplant.Fytotoxineszijnnietgastheerspecifiekenkunnennecroseinducereninhetplasmamembraanvanplantencellen(D’aesetal.,2010).Deze fytotoxines worden opgedeeld in twee groepen aan de hand van hun structuur, namelijk detolaasinendesyringomycingroep(Raaijmakersetal.,2006).Inplantweefselwordtnecrosedoorbeidegroepengeïnduceerddoorporiëntevormen.Doordezeopeningeninhetplasmamembraanontstaaner transmembranaire fluxen van H+, Ca2+ en K+ waardoor de pH-gradiënt daalt over hetplasmamembraanendevloeistofbinnenindecelmeerbasischwordt.HierdoorvaltdeceluiteeninmeerderecellulairecomponentenwaardoordebinnendringendebacterieverderkanvermeerderenenCLP-productiekanstijgen,watuiteindelijkleidttotdedoodvandecel.Slechtsenkelenanomoltoxineis voldoende om deze poriën te maken waardoor dit proces erg efficiënt is (D’aes et al., 2010;Raaijmakersetal.,2006).CLP-fytotoxineskunneneveneenseenhemolytischeactiviteitbevattenwat

Literatuurstudie

10

betekentdatzerodebloedcellenkunnenafbreken.HemolysedoortolaasinkangeïnhibeerdwordendoordivalentemetaalionentoetevoegenzoalsZn2+,Ca2+enMg2+.Dezebindenimmersaannegatiefgeladen groepen aan de extracellulaire kant van het plasmamembraan dicht bij de plaats waarporievormingplaatsvindt.DeoppervlakteeigenschappenvanCLP'sspeleneenindirecterolinvirulentiedoorplantweefseltekoloniserenendoorCWDE'stoegangteverlenenaanhetoppervlak(deBruijnetal.,2007;Lindow&Brandl,2003;Raaijmakersetal.,2006).Plant-pathogenePseudomonasbacteriënproducerentegelijktweeCLP's,éénuitdetolaasinenéénuitdesyringomycingroep,terwijlanderePseudomonasbacteriëndoorgaanséénCLPaanmaken.Hierdoorwordtvermoeddatdeaanmaakvande twee CLP's nodig is voor plant-pathogene interacties te verwezenlijken. Het kan ook zijn dat deconcentratie van het geproduceerde fytotoxine de pathogeniteit bepaalt. Uiteindelijk zijn demilieucondities en de natuurlijke omgeving eveneens factoren die de CLP-productie beïnvloeden(Raaijmakers et al., 2006). Structurele verschillen tussen CLP's leiden tot verschillende biologischeactiviteitenendusverschillendeactiviteitenvandefytotoxines(D’aesetal.,2010).

GeïnduceerderesistentieSommigeCLP'skunnenverdedigingssignaleninduceren(ISR)indeplanttegeneenbreedspectrumvanpathogenen.ZokanmassetolideA,geproduceerddoorP.fluorescensSS101resistentieinducerentegendeziekte'tomaatbruinrot',datwordtveroorzaaktdoorPhytophthorainfestans(Tranetal.,2007).Hetis niet duidelijk hoe massetolide A resistentie induceert. Het is mogelijk dat een effect op hetplasmamembraanvandeplantzorgtvooreenverdedigingsresponsindeplant.(D’aesetal.,2010).

BiologischecontroleBiologischecontrolevanplantenziektesbetekenthetbeheersenvandeziekteofhetaantal/effectvanpathogenendoendalendoormiddelvanbiologischemechanismenoforganismen(Campbell,1989).Meerspecifiekkunnenlevendemicro-organismeninhetmilieugebrachtwordenomhetpathogeentebeheersen.Pseudomonasspecieskunnengebruiktwordenvoorbiocontroleomverschillenderedenen.Zo kunnen ze vele exudaat componenten gebruiken als nutriëntenbron, zijn ze vaak overvloedigaanweziginnatuurlijkegronden,voornamelijkderhizosfeer,engroeienzesnel(Chin-A-Woengetal.,2003).BiocontrolemetPseudomonasspeciesstaatcommercieelgeziennognietzoveralsbiocontrolemetBacillusspecies.DitkomtvoornamelijkdoordatBacillusspeciesmakkelijkerzijnommeetewerkenaangezienzesporenkunnenvormen.DesondankshebbenveleCLP’sgeproduceerddoorPseudomonasbacteriën een grote antibiotica activiteit in vitro waardoor ze vaak belangrijke effecten kunnenuitoefenenopplant-pathogenenzoalsreedseerderbesproken.Tochmoetsteedsrekeninggehoudenworden met het feit dat in situ resultaten afhankelijk zijn van meerdere factoren zoals grondkarakteristieken,aanwezigheidvananderemicro-organismen,enzovoortenduskunnenverschillenvaninvitroresultaten(D’aesetal.,2010).VoorgaandeonderzoekenkunnenhelpenomdefluorescerendePseudomonasbacteriënvoorbiologischecontroletegebruiken.

2.3RegulatievanCLP’s

2.3.1InleidingEr is weinig gekend over de genetische regulatie van CLP-productie omdat verscheidene factorenverschillendeeffectenkunnenverwezenlijken.Verschillendesystemenzoudeneenrolkunnenspelenonderanderentranscriptieregulatorgenen,eentweecomponentensysteemenceldensiteitmaarook

Literatuurstudie

11

verscheideneanderefactorenzoudendebiosynthesevanCLP'skunnenbeïnvloeden.Dezewordenallenhieronder besproken waarbij Tabel 2 een samenvatting weergeeft van de reeds in de literatuurbesprokenregulatiesystemen.

2.3.2LuxR-typetranscriptieregulatorgenenDe LuxR-familie bestaat uit transcriptionele regulatorendie eenDNA-bindendhelix-turn-helix (HTH)motiefbevattenindeC-terminaleregio.DezeLuxR-typeregulatorenkunnenopbasisvanhunactivatiemechanismeopgedeeldwordenintweegrotegroepen.Deeerstegroepbestaatuitregulatorendietoteentweecomponentensysteembehorenenwordengeactiveerddoorfosforylatie(zie2.3.3GacS/GacAtweecomponentensysteem).DetweedegroepzijnregulatorendiekunnenwordengeactiveerddoorbindingvaneenautoinducerzoalsAHL(zie2.3.4Quorumsensing).VerscheideneLuxR-typeregulatorenbevattenhetC-terminaleHTH-motiefenbehorentochniettotéénvandetweegroepen.DedagvanvandaagzijnverschillendeLuxR-typeregulatorenbekend(deBruijn&Raaijmakers,2009a).EeneersteisPpuRdieeenAHL-bindenddomeinbevatendustotdetweedegroepLuxR-typeregulatorenbehoort.PpuRspeelteenrolindeproductievanputisolvindoorP.putidaPCL1445(Dubernetal.,2006).AndereLuxR-typeregulatorenzijnSalA,SyrFenSyrGinP.syringaepv.syringaediegeenAHL-bindenddomeinbevattennocheenresponsregulatordomeinendustotgeenvanbeidegroepenLuxR-typeregulatorenbehoort.SalA,SyrFenSyrGbeïnvloedendebiosynthesevansyringomycinensyringopeptin(Kittenetal.,1998;Luetal.,2002a;Wangetal.,2006).OokputisolvinwordtmindergeproduceerddoorP.putidabijeenmutatie inSyrF (Dubernetal.,2008).De regulatievanviscosinbiosynthese inP. fluorescensSBW25kaneveneensgebeurendoortweeLuxR-typeregulatoren,namelijkViscARenViscBCRdieooknietbehorentotéénvandetweegroepen(deBruijn&Raaijmakers,2009a).InPseudomonasspeciesMIS38 wordt de biosynthese van arthrofactin gereguleerd door ORF1 (Roongsawang et al., 2003).Verder zijn er eveneens verscheidenemechanismesdie LuxR-type regulatoren kunnenbeïnvloeden.Dezezullenhieronderbesprokenworden.

2.3.3GacS/GacAtweecomponentensysteemEen twee componentensysteemwordt vaak in bacteriën teruggevonden aangezien het de bacteriehelptomzichaantepassenaanveranderendeconditiesofombepaaldemilieustekoloniseren.Eentweecomponentensysteembestaatuiteensensorkinaseeneencognaatresponsregulator.DesensorkinaseGacSwerdalseerstebeschreveninP.syringaepv.syringaeB728aalsessentiëlefactorvoorlaesiemanifestatieopdebladerenvandeboon.DeresponsregulatorGacAwerdalseerstebeschrevenindeP.protegensCHA0,waarhetdienstdoetalsactivatorvanantibioticaencyanideproductie.Hetbewijsdat GacS en GacA samen deel uit maken van een twee componentensysteem werd als eersteaangetoondinP.syringaepv.syringaeenlatervoorverscheideneanderebacteriën.GacSbehoorttotde klasse van onorthodoxe histidine sensor kinases die een fosforyl zenderdomein bevat, eenontvangersdomeineneenhistidinefosfotransfer(Hpt)uitgangdomein.WanneereenmilieusignaalhetGacS bereikt treedt autofosforylatie op waarbij een fosforylgroep van het zenderdomein wordtovergebrachtnaarhetprimaireontvangersdomeinenvervolgensnaarhetHtpdomein.HetHtpdomeinreageerthiernaalseensecundairzenderdomeindoordefosforylgroepovertebrengennaarderesponsregulator GacA. Het GacA wordt gefosforyleerd en kan vervolgens binden met DNA en er eenregulatorischeffectuitoefenen.Dedag van vandaagwordener reeds20GacSenGacAhomologenbeschreveninenterischebacteriën,fluorescerendePseudomonasbacteriën,VibrioenAzetobacter.In

Literatuurstudie

12

plant-pathogenebacteriënishetGacS/GacAtweecomponentensysteemvaaknodigvoorvirulentie.Inplant-antagonistischebacteriënwordthetsysteemdanweergebruiktvoordeexpressievanbiocontrolefactorenzodatdeplantbeschermdistegenpathogeneschimmels.ZokanhetGacS/GacAsysteemineengroepvanplantgeassocieerdewortel-koloniserendePseudomonasbacteriënexpressievangenenactiverendienodigzijnvoordesynthesevansecundairemetabolietenmetantimicrobiëleactiviteit.Ookkandezegroepbacteriëndeexpressievangenendieinstaanvoorsecreterendeenzymen,positiefreguleren (Heeb & Haas, 2001). In de P. syringae pv. syringae reguleert GacS de biosynthese vansyringomycin(Hrabak&Willis,1992).HetGacSreageertmetGacAwaardoorookGacAinP.syringaepv.syringaeinvloedheeftopderegulatievandebiosynthesevansyringomycin(Richetal.,1994).DeamphisinbiosyntheseinPseudomonasspeciesDSS73wordteveneensgereguleerddoorGacS(Kochetal.,2002).DetolaasinbiosyntheseinP.tolaasiiwordtgereguleerddoorPheNdiefungeertalsGacSineentweecomponentensysteem(Grewaletal.,1995).MutatiesinGacS/GacAzorgdenvooreenverliesinCLP-productiewatresulteerdeineengedaaldevirulentieeneenverliesvanbiocontroleactiviteit(deBruijn&Raaijmakers,2009b;Songetal.,2014).GacSenGacAkunnenookandereregulatorischegenenbeïnvloeden.ZowordthetSalA,eenLuxR-typeregulatorinP.syringaepv.syringaestammenB301DenB728apositiefbeïnvloeddoorGacAenGacS.DnaK(zie2.3.5Heatshockproteïnen)wordteveneenspositiefgereguleerddoorhetGacS/GacAsysteeminP.putida(Raaijmakersetal.,2006).

2.3.4QuorumsensingCeldensiteitkaneveneenseenrolspelenindeglobaleregulatievanCLP-biosynthese.Signaalmoleculenkunnen aangemaakt worden zoals N-acyl homoserine lactonen (AHL's) en wanneer deze AHL-concentratieeenbepaaldegrensoverschrijdtkunnenanderegenengereguleerdwordenzowelpositiefalsnegatief.Ditmechanismewaarceldensiteiteenrolspeeltindeexpressievangenenwordtquorumsensinggenoemd.P.fluorescens5064maaktAHL'saanomdebiosynthesevanviscosintereguleren(Cuietal.,2005;Songetal.,2015).HetPpuR-RsaL-PpuRquorumsensingsysteeminP.putidaPCL1445controleertdebiosynthesevanputisolvinIenII(zieook2.3.2LuxR-typetranscriptieregulatorgenen)(Dubernetal.,2006).DeCLP-biosynthesevananderePseudomonasspecieswordtechternietbeïnvloeddoorAHL's.ZowordtdebiosynthesevanmassetolideAdoorP.fluorescensSS101nietbeïnvloeddoorAHL-gebaseerdquorum sensing.Dit toont aandat de regulatie vanCLP-biosynthese kan verschillentussenspeciesentussenstammenvandezelfdespecies(deBruijn&Raaijmakers,2009b;Songetal.,2014).

2.3.5HeatschokproteïnenDnaKiseenheatshockproteïnediebehoorttotdeHsp70heatshockproteïnefamilie.DezeHsp70iseen moleculaire chaperone die helpt bij de correcte opvouwing van proteïnen in cellen. Hsp70chaperonenhebbenmeerdererollenwaarvanéénisdatzedoorwarmtegeïnduceerdebeschadiginginproteïnenkunnenvoorkomenofherstellen(deBruijn&Raaijmakers,2009a;Schröderetal.,1993).InP.putidaPCL1445wordtDnaKwaarschijnlijkgereguleerddoorσ32.DnaJenGrpEzijnco-chaperonenvanDnaKenkunnensameneenchaperonencomplexvormen(Dubernetal.,2005).DnaKkannuderegulatievandebiosynthesevanverscheideneCLP'sbeïnvloeden.ZozalDnaKinP.putidaPCL1445debiosynthesevanputisolvin Ien II reguleren (Dubernetal.,2005).DedeletievanDnaKofGrpE inP.syringaepv.glycinearesulteertinhetverliesvandelevensvatbaarheidterwijleenmutatieindezelfdegenen bij 28°C geen invloed heeft op groei van P. putida PCL1445. Het verlies van DnaK zou

Literatuurstudie

13

gecompenseerd kunnen worden door andere heat shock proteïnen of DnaK is gewoonweg nietbelangrijk.Bijhogeretemperaturenzoalsbij35°CheeftdemutatieinDnaKenGrpEwelinvloedopdegroeivanP.putidaPCL1445.HetisnietgewetenofDnaKinP.putidaPCL1445directofindirectwordtgereguleerd door GacS/GacA, echter, de heat shock respons blijkt geen deel uit te maken van deGacS/GacAregulatie(Dubernetal.,2005).DnaKkaneveneensmassetolidebiosyntheseregulereninP.fluorescensSS101enhetwordtgesuggereerddathetnietonderdecontrolestaatvanhetGacS/GacAtweecomponentensysteem(Songetal.,2014).

2.3.6ProteaseClpPClpP is een ATP-afhankelijke serine proteasewelke zeer geconserveerd is en verscheidene functiesbevatwaarvanintracellulaireproteolyse.DeATPaseswaarmeeClpPgeassocieerdiskunnenofwelhetproteïnesubstraatherkennenofwelkunnenzemethetsubstraatinteragerenviaadaptorproteïnen.Desubstraten worden dan uit hun opgevouwen structuur gehaald en worden vervolgens naar deproteolytischekamervanhetClpPproteasegebrachtdatleidttotproteïnedegradatieenhetvrijkomenvan proteïne fragmenten (de Bruijn & Raaijmakers, 2009b; Song et al., 2015). De ClpP protease iseveneenseenregulatorindebiosynthesevanCLP’s.MassetolidebiosyntheseinP.fluorescensSS101wordtnamelijkgereguleerddoorClpP.DezeClpPregulatiekangebeurenopverschillendemanieren(Songetal.,2015).ClpPkaninvloedhebbenophettranscriptioneleregulatorgenLuxR(mA)waardoormassetolidebiosynthesegereguleerdwordt.EenanderscenarioisdatClpPdecitroenzuurcyclusenhetaminozuurmetabolismebeïnvloedtwatdeaanmaakvanprolinebeïnvloedtendatheeftopzijnbeurtinvloed op LuxR(mA). De ClpP regulatie van massetolide biosynthese in P. fluorescens SS101 isonafhankelijk van de regulatie door het GacS/GacA twee componentensysteem (de Bruijn &Raaijmakers,2009b;Songetal.,2014;Songetal.,2015).

2.3.7Andereregulatorischegenen

2.3.7.1GidAHetgidAgenisbetrokkenbijdeglobaleregulatievansyringomycinensyringopeptinbiosyntheseinP.syringae. Er wordt eveneens gesuggereerd dat GidA een rol speelt in de regulatie van luxR-typeregulatorsalAinP.syringae.HetgidAgenisbelangrijkbijdetimingencoördinatievanchromosoominitiatieenisnodigvoorefficiëntechromosoomverdubbeling(Kinscherf&Willis,2002).

2.3.7.2SyrASyrAisvoornamelijkbetrokkenbijdebiosynthesevanargininetochheefthetookeenregulatorischefunctieindebiosynthesevansyringomycinindeP.syringaepv.syringae(Luetal.,2003).

2.3.7.3SyrPHetsyrP gencluster inP. syringaepv. syringae isbetrokkenbijde fosfotransferbijde regulatievansyringomycin productie waardoor het gelijkenis vertoont met de histidine kinases van de tweecomponentensystemen.SyrPbevatechternietdedomeinendieinstaanvoorautofosforylatieactiviteitenwordtdaarombeschouwdalseenintermediairtussendesensorproteïneenderesponsregulatorvaneentweecomponentensysteemgenaamdfosforelaysysteem(Zhangetal.,1997).

Literatuurstudie

14

2.3.8MilieueffectenVoorgaandebeschrevengenenenproteïnenwordenvaakgeactiveerdofgedeactiveerddoorbepaaldeomgevingssignalen.Nutritionelefactorenkunnennamelijkeeninvloedhebbenopderegulatievandebiosynthese vanCLP's. Ijzerconcentraties vanaf 2µMhebbeneenpositief regulatorisch effect opdeproductievansyringomycininP.syringaepv.syringaeterwijlanorganischefosfaatconcentratiesvanaf1mMdeproductiekunnenonderdrukken(Benderetal.,1999;Gross,1985).Ookkanhetsoortkoolstofsubstraatinvloedhebbenopderegulatie,zoalsaangetoondinP.fluorescensDR54voordebiosynthesevanviscosinamide.Hierhebben limitatievankoolstof,stikstofenfosforeveneenseen invloedopderegulatie(Nielsenetal.,1999).DeinvloedvanabiotischeconditieszoalspH,temperatuurenzuurstofwerdeneveneensbestudeerd(Raaijmakersetal.,2006).Nietalleennutritionelefactorenofabiotischecondities speleneen rolmaarookplant signaalmoleculenkunneneen invloeduitoefenen.Primairesignalendiedeproductievansyringomycin inP. syringaepv.syringaebeïnvloedenzijnbijvoorbeeldfenolischeglycosides.Dezezijnaanwezigindebladeren,stamenbloemenvanverscheideneplantendieP. syringae pv. syringae bevatten. Arbutin is zo'n fenolische β-glucoside die de biosynthese vansyringomycinkanreguleren(Benderetal.,1999).

CLP Species/Stam Proteïne ReferentieViscosin P.fluorescensSBW25 ViscARenViscBCR(LuxR-type) (de Bruijn & Raaijmakers,

2009a) P.fluorescens5064 AHL(Quorumsensing) (Cuietal.,2005)Massetolide P.fluorescensSS101 DnaK(Heatshockproteïne) (Songetal.,2014) P.fluorescensSS101 ClpP (Songetal.,2014)Amphisin Pseudomonassp.DSS73 GacS (Kochetal.,2002)Arthrofactin Pseudomonassp.MIS38 ORF1(LuxR-type) (Roongsawangetal.,2003)Tolaasin P.tolaasii PheN(GacS) (Grewaletal.,1995)Syringopeptin P.syringaepv.syringaeB728a GidA (Kinscherf&Willis,2002) P.syringaepv.syringaeB301D SalA,SyrG,SyrF(LuxR-type) (Luetal.,2002a)Syringomycin P.syringaepv.syringaeB728a LemA(GacS) (Hrabak&Willis,1992) P.syringaepv.syringaeB728a GacA (Richetal.,1994) P.syringaepv.syringaeB728a GidA (Kinscherf&Willis,2002)Syringomycin P.syringaepv.syringaeB728a SalA(LuxR-type) (Kittenetal.,1998) P.syringaepv.syringaeB301D SalA,SyrG,SyrF(LuxR-type) (Luetal.,2002a) P.syringaepv.syringaeB301D SyrA(argininebiosynthese) (Luetal.,2003) P.syringaepv.syringaeB301D SyrP (Zhangetal.,1997)Putisolvin P.putida SyrF(LuxR-type) (Dubernetal.,2008) P.putidaPCL1445 GacA (Dubernetal.,2005) P.putidaPCL1445 GacS (Dubernetal.,2005) P.putidaPCL1445 DnaK,DnaJ,GrpE (Heat shock

proteïn)(Dubernetal.,2005)

P.putidaPCL1445 PpuR (LuxR-type / Quorumsensing)

(Dubernetal.,2006)

Tabel2.ProteïnenbetrokkenbijderegulatievanCLP’sgeproduceerddoorPseudomonasspecies.

Literatuurstudie

15

2.4SecretievanCLP’s

2.4.1InleidingEr bestaan verscheidene secretiesystemen voor Gram-negatieve bacteriën die kunnen opgedeeldwordenintweegrotegroepen;deenkelvoudige-membraan-overspannendetransportersdieenkelhetbuitenstemembraanoverspannenendedubbele-membraan-overspannende transportersdie zowelhet buitenste als het binnenste membraan overspannen. De dubbele-membraan-overspannendetransporterskunnenopgedeeldwordenintripartitesecretie,typeII,typeIII,typeIVentypeVIsecretiesystemen. Hierbij kan de tripartite secretie opgedeeld worden in RND effluxpompen en type Isecretiesystemen. Beide systemen vormen een tripartiet dubbele-membraan-overspannend kanaalmet een binnenste membraan component, een periplasma adaptorproteïne en een buitenstemembraanproteïnekanaal (Costa et al., 2015). Deze twee systemen worden hieronder uitgebreidbesprokenaangeziendezesystemenvanbelangzijnvoordesecretievanCLP’s.

2.4.2RNDeffluxpompen

2.4.2.1Inleiding‘Resistance-nodulation-division’ (RND) pompen zijn een familie van multidrug effluxpompen. Zepompenkleineexogenemoleculendievaakantibacteriëlecomponentenzijnuitdecelwaardoorzedikwijls een rol spelen in antibiotica resistentiemechanismen. De binnenste membraancomponentmaaktgebruikvaneenprotongradiëntalsenergiebron.Hettransportvandesubstratenwordthierbijgekoppeldaanhettransportvandeprotonen.Hetsubstraatkanzowel inhetperiplasmaalsaandebinnenkantvanhetbinnenstemembraanbindenaandebinnenstemembraancomponent.Vervolgenswordthetsubstraatnaareenholteindeperiplasmaproteïnegebrachtwaarbijhetprotonentransportvoor de nodige energie zorgt. Doordat het substraat bindt wordt het complex, dat bestaat uit hetbinnenste membraancomponent en de periplasma proteïne, verbonden met de buitenstemembraancomponent.Doordezebindingwordtdebuitenstemembraancomponentgeopendenkanhetsubstraatdecelverlaten(Costaetal.,2015;Dauryetal.,2016;Marquez,2005).

2.4.2.2MexAB-OprMTwaalf RND-type effluxpompen worden teruggevonden in P. aeruginosawaaronder de reeds goedbestudeerdeMexAB-OprM(Kourtesietal.,2013).DemexAB-oprMgeneninP.aeruginosavormeneenoperondatcodeertvoorMexA,MexBenOprM.HierbijisMexAdebinnenstemembraanproteïne,MexBde periplasma fusieproteïne enOprM het buitenstemembraankanaalproteïne diemoleculen directbuitendecelkanpompen.HetMexAB-OprMsysteemspeelteenrolinhetnaarbuitenpompenvantalvan antibiotica en chemotherapeutische stoffen zoals fluoroquinolones, β-lactams, tetracyclines,chloramphenicolennorfloxacin.OpdezemanierdraagthetMexAB-OprMsysteembijaanderesistentievanP.aeruginosa(Evans&Poole,1999;Lietal.,1995).

Literatuurstudie

16

2.4.3TypeIsecretiesystemen

2.4.3.1InleidingTypeIsecretiesystemenzorgenvoordesecretievangroteaantallengevarieerdeproteïnesubstraten.HetsysteemisverwantaandeRND-familievanmultidrugeffluxpompen.DetypeIsecretiesystemendie een rol spelen in antibiotica resistentie zijn echter vaak drug specifieke pompen. De binnenstemembraancomponentbehoorttotde‘ATP-bindingcassette’(ABC)-transporterfamilie.DezegebruikendehydrolysevanATPomenergieoptewekenomhetsubstraattetransporteren.Hetsubstraatinhetcytoplasma bindt aan de binnenstemembraancomponent en wordt overgezet naar de holte in deperiplasma fusieproteïnedoorATP tegebruikenalsenergiebron.Doordebindingvanhet substraatwordthetcomplexvanbinnenstemembraancomponentenperiplasmafusieproteïnegebondenaandebuitenstemembraancomponentdievervolgensopentenhetsubstraathetextracellulairmilieuinstuurt.BijtypeIsecretiesystemenisdeperiplasmafusieproteïneverbondenaandeABC-transporterofwordtdeze gerekruteerdwanneer het substraat bindt aan de binnenstemembraanproteïne (Costa et al.,2015;Marquez,2005).

2.4.3.2MacA-MacBMacB is een ABC-type effluxpomp dat gebonden is aan MacA. Hierbij is MacA de periplasmafusieproteïneenMacBdebinnenstemembraanproteïne(Kobayashietal.,2001).Degenendieinstaanvoordeaanmaakvandezeproteïnen,macAenmacB,zijnredelijkgeconserveerdenkomenvoorintalvanPseudomonasspecies.ZobevattendesessilinebiosyntheseclusterinPseudomonassp.CMR12aendeorfamidebiosyntheseclusterinPseudomonasprotegensPf-5demacAenmacBgenen(Olorunlekeetal.,2007).HetmacAenmacBgenvanPseudomonasputidaPCL1445bevattenrespectievelijk85%en88%gelijkheidmetPseudomonasentomophilaL48(Dubernetal.,2008).InPseudomonasspeciesMIS38iseenperiplasmaproteïnegenteruggevondendat87%gelijkheidvertoontmetmacAvanP.protegensPf-5(Limetal.,2009).PseudomonasfluorescensSS101bevattweeopenreadingframes(ORF)die84%en85%gelijkheidvertonenmetrespectievelijkmacAenmacBvanP.protegensPf-5.AldezemacAenmacB genen worden vaak teruggevonden naast de CLP-biosyntheseclusters van verschillendePseudomonasspecies.DezepositieisredelijkgeconserveerdensuggereerteenbelangrijkerolinCLP-biosynthese(deBruijnetal.,2008).HetwerdreedsaangetoonddatdesecretievanhetCLPputisolvinin P. putida PCL1445 afhankelijk is vanmacA enmacB (Dubern et al., 2008). Ook in Pseudomonassyringaepv. syringae is de secretie van fytotoxische CLP’s, namelijk syringomycin en syringopeptin,afhankelijkvaneenPseEenPseFproteïnediegelijkheidvertonenmetMacAenMacBrespectievelijk(Cho&Kang,2012).

2.4.3.3NodTIn een aantal CLP-producerende stammen wordt het luxR-type regulatorgen van de CLP-biosynthesecluster voorafgegaan door een nodT gen dat zorgt voor de aanmaak van eeneffluxtransporter.DezeNodTiseenbuitenstemembraanproteïne.OfdezeNodTeffluxtransporteraldannieteenrolspeeltindesecretievandeCLPisnognietaangetoond(D’aesetal.,2014).Deregionaastdemassetolidegencluster inP. fluorescens SS101heefteveneenseenORFdat75%gelijkheidvertoontmetnodTvanP.fluorescensPf0-1(deBruijnetal.,2008).

Literatuurstudie

17

2.3HetCLPorfamide

2.3.1InleidingOrfamides zijn opgebouwd uit tien aminozuren die een cyclische peptide vormen. Ze wordengekarakteriseerd door een 3-hydroxy laurinezuur of eenmyristinezuur die verbonden is aan de N-terminusvandecyclischepeptide.DoorhunverschillendeaminozuursequentieencyclisatieschemazijnzeverschillendvandeandereCLP's(Grossetal.,2007).ZewordenvoornamelijkgeproduceerddoorPseudomonasprotegensbacteriënendoorenkelenauwverwanteisolaten.

2.3.2Pseudomonasprotegensstammen

2.3.2.1PseudomonasprotegensPf-5Pseudomonas protegens Pf-5 werd voor het eerst geïsoleerd van de wortels van de katoenplant(Gossypium) in Texas, US (Howell & Stipanovic, 1979). In deze soort werd de orfamide genclusterontdektwaarhetdriegroteORF’sbevatnamelijkorfamideA(ofaA),orfamideB(ofaB)enorfamideC(ofaC).DezegenenstaaninvoordeproductievandeCLP’sorfamideA,orfamideBenorfamideCmetm/zwaarden respectievelijk gelijk aan 1295, 1281 en 1267. De structurenwordenweergegeven inFiguur4.

DegenenofaA,ofaBenofaCbestaangezamenlijkuittienmodulesdieelkeenC-domein,A-domeinenT-domeinbevattendiedeelongatiemodulevormt.DetypischeinitiatiemodulediegeenC-domeinbevatwordtnietteruggevondeninofaA.ErwordengeenE-domeinenteruggevondeninofaA,ofaBenofaCmaarzesvandetienC-domeinenbevattengeconserveerdeC/E-sequentiesindeN-terminaleregio.Aande C-terminus van ofaC zijn ook twee TE-domeinen aanwezig. De drie componenten orfamide A,orfamideBenorfamideCwordendoordezelfdegenclusteraangemaakt.DitwerdaangetoonddoordateenmutatieinofaAzorgdevoordeeliminatievandeproductievanalledriedeorfamides.Gerelaxeerdesubstraatspecificiteitisderedenvoorhetontstaanvandeverschillendeorfamides(Grossetal.,2007).DegenclusterendemoduleorganisatieinP.protegensPf-5zijnterugtevindeninFiguur5.DeorfamidegenclustermetflankerendegenenvanP.protegensPf-5enanderestammenwordenweergegeveninFiguur6.

Figuur4.StructuurvanCLP’sorfamideA,BenC(Grossetal.,2007).

Literatuurstudie

18

Figuur5.Orfamidegenclusterbestaanduit3ORF’snamelijkofaA,ofaBenofaCendeNRPS-moduleorganisatieinP. protegens Pf-5. De pijlen representeren de ORF’s die de NRPS’s vormen. Asp, asparaginezuur; Glu,glutaminezuur; Ile, isoleucine; Leu, leucine; Ser, serine; Thr, threonine; Val, valine; C, condensatie domein, A;adenylatiedomein;PCP,thiolatiedomein;Te,thioesterasedomein;M,module(Grossetal.,2007).

Figuur 6. Orfamide biosynthesecluster met flankerende regio’s van orfamide producerende Pseudomonasisolaten.Rood:biosynthesegenen;Groen:regulatorgenen;Blauw:transportergenen;Grijs/zwart:anderegenen.(1a) GCN5-gerelateerde N-acteyltransferase; (1b) RND effluxsysteem, buitenste membraanproteïne; (2) LuxRtranscriptieregulator, luxUp; (ofaA, ofaB, ofaC) Nonribosomale peptidesynthase; (3)Macrolide effluxproteïne,macA; (4) Macrolide effluxproteïne, macB; (5) LuxR transcriptieregulator, luxDown; (6) Flagellair basaallichaamproteïne,flgD;(7)Flagellairehaakproteïne,flgE;(8)Putatievegnatfamilieacetyltransferase;(9)Familie2glycosyl transferase; (10,11) Hypothetische proteïne; (12) Glyoxalase familieproteïne; (13) Heme transporterCemD,radicaleSAMdomeinbevattendeproteïne(Maetal.,2016).

OrfamideA OrfamideB OrfamideC

LeuAsp/GluThrIle/ValLeuSerLeuLeuSerVal

M1M2M3M4M5M6M7M8M9M10

1a89 CMR12a

1b2ofaAofaBofaC3451213 Pf-5

1a671213 CMR5c

1a671213 CMAA1215

1b1213 WayneIR

PH1b 1b111213

Cab57 1b891213

CHA0 1b89101213

---------------

Literatuurstudie

19

2.3.2.2PseudomonasprotegensCHA0Pseudomonas protegens CHA0 werd voor het eerst geïsoleerd van de wortels van de tabaksplant(Nicotianatabacum) inZwitserland(Stutzetal.,1986).Recentwerdaangetoonddatookdezesoortorfamidekanaanmaken,voornamelijkorfamideA(Maetal.,2016).

2.3.2.3PseudomonasprotegensF6PseudomonasprotegensF6werdvoorheteerstgeïsoleerduiteenolievervuildegrondinKorea.Het16SrRNA vertoont 100% gelijkheid met de P. protegens CHA0 en de productie van orfamide A werdaangetoond(Jangetal.,2013).

2.3.2.4PseudomonasprotegensCab57PseudomonasprotegensCab57werdvoorheteerstgeïsoleerduitderhizosfeervanhetherderstasje(Capsellabursa-pastoris)datgroeide ineenveld inHokkaido, Japan.Denucleotidenvandeze soortvertonen98,47%gelijkheidmetdievanP.protegensCHA0en98,22%metP.protegensPf-5waarbijhet16SrRNA100%gelijkheidtoontmetbeideisolaten.DegenclustervoororfamideAvandeP.protegensPf-5iseveneensgeconserveerdindezesoort(Takeuchietal.,2014).

2.3.2.5AnderePseudomonasprotegensstammenRecentwerdaangetoondviaBLASTdatermogelijknogmeerorfamideproducerendePseudomonasisolatenbestaannamelijkP.fluorescensWayne1RgeïsoleerduitderhizosfeervanmaïsensojabooninOhio,USenPseudomonasspeciesPH1bgeïsoleerduitphytotelmavancarnivoreplanteninMaleisië.(Anon,2014;McSpaddenGardeneretal.,2005;Vasconcellosetal.,2013).DeorfamideclustersvanallehierbovenbesprokenPseudomonasstammenwordenweergegeveninFiguur6(Maetal.,2016).

2.3.3NauwverwantePseudomonasisolaten

2.3.3.1PseudomonasspeciesCMR12aPseudomonasspeciesCMR12abehoorttotdefluorescerendePseudomonasbacteriënenbevindtzichtussendeP. protegensenP. chlororaphis subgroepen (D’aeset al., 2014).Hetwerd voorhet eerstgeïsoleerduitderhizosfeervandecocoyam(Xanthosomasagittifolium)inCameroonenookdezesoortmaakt orfamide aan. De orfamide gencluster vertoont hoge gelijkheid met de gencluster van P.protegens Pf-5. De ofaA, ofaB en ofaC genen van Pseudomonas sp. CMR12a vertonen namelijkrespectievelijk79%,82%en82%gelijkheidmetofaA,ofaBenofaCvanP.protegensPf-5.Eenanderverschilisdestructuurvandeorfamidemoleculendiewordenaangemaakt.ZomaaktPseudomonassp.CMR12a de CLP’s orfamide B, orfamide D en orfamide E aanmetm/z waarden 1254, 1280, 1282respectievelijkwaarbijorfamideBhetmeestgeproduceerdwordt.HetaangemaakteCLPorfamideBisidentiekaanorfamideBvanP.protegensPf-5maarorfamideDenorfamideEverschillenvanorfamideAenorfamideCdoordathunisoleucine-residuvervangenisdooreenvaline-residuenzeverschillenvanorfamideBdooreenverschilinvetzuurketen(D’aesetal.,2014).Pseudomonassp.CMR12amaaktnaastorfamidenogeenanderCLPaan,namelijksessiline.

2.3.3.1PseudomonasspeciesCMR5cOokPseudomonasspeciesCMR5cbehoorttotdefluorescerendePseudomonasbacteriënenbevindtzichtussendeP.protegensenP.chlororaphissubgroepen(D’aesetal.,2014;Perneeletal.,2007).Het

Literatuurstudie

20

werdgeïsoleerduitderhizosfeervandecocoyaminCameroonenmaakteveneensorfamideaan.DegenenofaA,ofaB enofaC vanPseudomonas sp. CMR5c vertonen respectievelijk 82%, 84% en 84%gelijkheidmetofaA,ofaBenofaCvanP.protegensPf-5(Perneeletal.,2007).Pseudomonassp.CMR5cmaaktvijfverschillendesoortenorfamideaannamelijkorfamideB,D,E,FenGwaarbijorfamideFenGm/Zwaardenbezittenvanrespectievelijk1307,7en1309,6.OrfamideGverschiltvanorfamideBinzijnvetzuurketenlengteterwijlorfamideGenFverschillenomdatorfamideFeendubbelebindingbevat.De orfamide gencluster van Pseudomonas sp. CMR5c komt overeenmet die van Pseudomonas sp.CMR12a,weergegeveninFiguur6(Maetal.,2016).

2.3.3.1PseudomonasspeciesCMAA1215Via BLAST werd recent nog een orfamide producerende Pseudomonas soort ontdekt namelijk dePseudomonasspeciesCMAA1215diewerdgeïsoleerduitdebodemvanMangrovesinBrazilië(Anon,2014;McSpaddenGardeneretal.,2005;Vasconcellosetal.,2013)

2.3.4RegulatievanorfamideDe orfamide cluster bevat twee luxR-type transcriptieregulatorgenen, namelijk luxUp en luxDown.StroomopwaartsvandeorfamideclusterbevindtzichluxUpenstroomafwaartsbevindtzichluxDown,weergegeven in Figuur 6. Deze genen zijnwaarschijnlijk betrokken bij de regulatie van orfamide inbovengenoemde Pseudomonas isolaten. De luxR-type transcriptieregulatorgenen in anderePseudomonas isolaten zijn namelijk betrokken bij de regulatie van CLP-productie (de Bruijn &Raaijmakers,2009a).InPseudomonassp.CMR12aenCMR5cregelendezetweeregulatorgenenookdebiosynthesevanorfamideaangezieneenmutatieinofwelluxUpofwelluxDownervoorzorgtdatergeenorfamidewordtaangemaakt(Maetal.,2016).

2.3.5SecretievanorfamideNetachterdeorfamideclusterbevindenzichgenendie instaanvoordesecretie,namelijkmacAenmacB,weergegeveninFiguur6.MacAschrijfthetmembraanfusieproteïneafdatzichnestelt inhetperiplasmavanhetplasmamembraan.MacBschrijfthetintegraalmembraanproteïneafdatzichinhetbinnenste plasmamembraan bevindt en ATP gebruikt als energiebron. De orfamide producerendePseudomonas protegens stammen bevatten nog een nodT gen dat zich bevindt voor het luxUpregulatorgen.DitnodTgenzorgtvoordeaanmaakvaneenbuitenstemembraanproteïne.Pseudomonassp. CMR12a, CMR5c en CMAA1215 bevatten dit nodT gen niet in de orfamide biosynthesecluster,duidelijkweergegeveninFiguur6(Maetal.,2016;Olorunlekeetal.,2007).Pseudomonassp.CMR12abevathetnodTgenechterwelindeCLPsessilinebiosyntheseclusterdie71%gelijkheidvertoontmetP.protegensPf-5.DesessilinebiosyntheseclusterbevateveneensdemacAenmacBgenen(D’aesetal.,2014).HetMacA-MacB-NodTmechanismegebruiktATPvoorzijnwerkingenzorgtvoordesecretievansessiline(datanognietgepubliceerd).Ookeenandermechanismeisverantwoordelijkvoordesecretievan sessiline,namelijkhetMexA-MexB-OprMsysteemdatgebruikmaakt vaneenprotonengradiëntvoor zijnwerking (datanogniet gepubliceerd). Sessiline kandusdoor twee systemenbuitende celworden gebracht. Hierbij lijkt de buitenstemembraanproteïneOprM eerder actief te zijn in de loggroeifasevandecelterwijlNodTmeergebruiktwordtineenlaterstadium(datanognietgepubliceerd).DeorfamidediewordtaangemaaktinPseudomonassp.CMR12agebruikteveneenshetMacA-MacB-NodTmechanismeomdeextracellulaire ruimte tebereiken (datanogniet gepubliceerd).Orfamide

Literatuurstudie

21

gebruiktdusdeNodTbuitenstemembraanproteïnediewordtaangemaaktdoorhetnodTgenuiteenandereCLP-biosynthesecluster,namelijkdievansessiline.OokgebruiktorfamidehetOprMbuitenstemembraanproteïneomdecelteverlaten(datanognietgepubliceerd).HetOprMdatnormaalgebruiktwordt bij hetMexA-MexB systeemenhetNodTdat afgeschrevenwordt doornodTaanwezig in desessiline biosynthesecluster, worden beiden gebruikt als buitenste membraanproteïnen die elkafzonderlijksamenwerkenmethetMacA-MacBsysteem.DezesecretiesystemenwordenweergegeveninFiguur7.

OokPseudomonassp.CMR5cbevateenoprMgendat100%gelijkheidvertoontmethetoprMgenvanPseudomonas sp. CMR12a dat waarschijnlijk instaat voor het naar buiten brengen van orfamide.Pseudomonas sp. CMR5c en CMR12a bevatten eveneens een gen, namelijk cmeC, dat homologievertoontmetdegenendiebuitenstemembraanproteïnenafschrijven.Cmecschrijftwaarschijnlijkookeenbuitenstemembraanproteïneafwaarvanhetwerkingsmechanismenognietgekendis(datanognietgepubliceerd).Figuur8geeftdefylogenetischeboomweervaneenaantalPseudomonasisolatenopbasisvanhunbuitenstemembraanproteïnen.

Figuur7.SecretiepompsysteemMacA-MacB-NodTenMacA-MacB-OprMinPseudomonassp.CMR12a.MacBenNodTmakengebruikvanATPvoorhunwerking.OprMbehoorttotdeRND-familiediegebruikmaaktvanprotonenomdecyclischelipopeptideninhetperiplasmaverderdeextracellulaireruimteintepompen.

Buitenstemembraan

Binnenstemembraan

Periplasma

ATP ADP+Pi

CLP

CLP

NodT

MacA

MacB

CLP

OprM

ATP ADP+Pi H

+

Literatuurstudie

22

2.3.6BiologischerelevantievanorfamideDeactiviteitvanorfamidemaakthetgeschiktvoorallerleitoepassingen.P.protegensPf-5maakthetmeestorfamideAaandatzorgtvoorhetimmobielmakenvanzoösporen,watwordtgeobserveerddoordesnellelysevandeoömyceetPhytophthoraramorum. Indezelfdestudiewordtechteraangetoonddatdegroeivanhetmyceliumvaneenschimmelofoömyceetnietwordttegengegaan.HetheeftweleeneffectopdeamphotericinB-resistentestamvanCandidaalbicans(Grossetal.,2007).DeproductievanorfamideBinPseudomonassp.CMR12azorgtvoordegroeionderdrukkingvanhetmyceliumvandeschimmelRhizoctoniasolaniopboonenkool(D’aesetal.,2011;Olorunlekeetal.,2014).OokoefenthetbiocontroleactiviteituitopcocoyamwortelswaarhetPythiummyriotylumonderdrukt(Maetal.,2016;Perneeletal.,2007).Orfamidespeelttevenseenrol inswarmingdatwaarschijnlijkeeneffectheeftopdecapaciteitvandebacterieomzichteverspreideninderhizosfeer.AangezienPseudomonassp.CMR5cgerelateerdisaanPseudomonassp.CMR12a,wordtverwachtdatdeorfamideproductiein

Figuur8.FylogenetischeboomvanaantalPseudomonasisolatengealigneerdmetdebuitenstemembraanproteïnesequenties. De wortel van de boom is buitenste membraanproteïne sequentie van OprJ van P.aeruginosa_PAO1_NP_253287.DegekleurdePseudomonasisolatenwordenonderzochtindezethesisdaarreedsmutantenwerdenaangemaakt.

Literatuurstudie

23

Pseudomonassp.CMR5cdezelfderolzalhebben(Perneeletal.,2007).P.protegensF6maaktorfamideA aan dat insecticide activiteit vertoont tegen de groene perzikluis (Myzus persicae). Orfamide A isdodelijkvoordeperzikluizen inbepaaldedosissenenzougebruiktkunnenwordenom luizenondercontroletehoudenindeorganischeagricultuur(Jangetal.,2013).

2.4CocoyamDe cocoyam, in het Latijns Xanthosoma sagittifolium, behoort tot de Araceae familie en vindt zijnoorsprongintropischAmerika.IndejarennegentigwerdhetingevoerdinWest-Afrikadatnuéénvandegrootsteproducentenis.Deknolvandecocoyamiseetbaarenvoedtongeveer200miljoenmensenin de tropen en subtropen. De plant is dus een belangrijke voedselbron en hoge opbrengsten zijngewenst.Tweevariëteitenwordenvoornamelijkgecultiveerdnamelijkdewittecocoyamenderodecocoyam.Dewittecocoyamishetpopulairstonderdepopulatiemaarisechtergevoeligaanziektes,specifiekaandeoömyceetPythiummyriotylumwat'rootrotdisease'ofwortelrotveroorzaakt.Derodecocoyamishiermindergevoeligvoor.Doorwortelrotkandeopbrengsttotwel90%verminderen.Deoömyceetiszoweleffectiefopdejongerealsoudereplanten.Symptomenvandeziektezijnhetgeelwordenvanbladeren,dwerggroeienernstigeverkleiningvanhetwortelsysteem.Chemischepesticidenkunnen deze oömyceet bestrijden maar deze hebben een negatief effect op het milieu en degezondheidvandemens.Omdieredenishetonderzoeknaarbiocontroleheelbelangrijk(DeMaeyeretal., 2011;Tambongetal., 1999;Tambong&Höfte,2001). Zo’n40Pseudomonas specieswerdengeïsoleerduitderhizosfeervandewitteenrodecocoyam(Perneeletal.,2006).HieruitisPseudomonasaeruginosa een gekende en effectieve biocontrole agent die P. myriotylum reeds effectief koncontroleren.P.aeruginosaisechtereenopportunistischmenselijkpathogeenwaardoorgezochtwerdnaaralternatievePseudomonasisolaten.UitdegeïsoleerdePseudomonasspecieswerdgezochtnaarinvitroantagonismetegenP.myriotylum.Antagonistischestammenkondenenkelwordenteruggevondeninderhizosfeervanderodecocoyam(Höfte&Altier,2010).DeantagonistischestammenPseudomonassp.CMR12aenCMR5cblekenwortelrot60%en53%terugtedringenwaarP.aeruginosawortelrotkonterugdringentot48%(Gardener,2007;Perneeletal.,2007).Derodecocoyamlijktduseenstrategieontworpentehebbenomspecifiekeantagonistischemicro-organismentestimulerenomP.myriotylumteonderdrukken.Dezehypothesewordtgesteundmethetfeitdatderodecocoyaminsterielegrondevengevoeligisalsdewittecocoyam(Höfte&Altier,2010;Perneeletal.,2007).DeonderdrukkingvanP.myriotylumisonderanderenafhankelijkvandeproductievanCLP's.OmdieredenishetinteressantCLP-productiedoorPseudomonasisolatenenhuninvloedenopdecocoyamteonderzoeken.

Doelstelling

24

3.DoelstellingVelefluorescerendePseudomonasbacteriën,behorendetotdeP.putidaenP.fluorescensgroep(zieFiguur1),staanbekendomhunbiocontroleactiviteit(Höfte&Altier,2010b).Dezebiocontroleactiviteitismogelijkdoordeaanmaakvanmetabolietendieeeninvloedkunnenuitoefenenopdebacteriezelfen/ofhetextracellulairmilieu.Onderzoeknaareenklassevandezemetabolieten,namelijkdecyclischelipopeptiden,istoegenomendaardezevaakbiocontroleactiviteitvertonen.Orfamideiszo’ncyclischelipopeptidewaarvanhetmechanismenogniethelemaalisuitgepluisd.Recentonderzoektoondeaandat tal van Pseudomonas protegens stammen en enkele nauw verwante isolaten orfamide kunnenaanmaken. Dit orfamide blijkt een rol te spelen in de beweegbaarheid van de bacterie en kan deoppervlaktespanning verlagen. Ookwerd reeds aangetoond dat orfamide een biocontrole activiteitbezittegenenkeleschimmelsenoömyceten(D’aesetal.,2014;Grossetal.,2007;Jangetal.,2013;Maetal.,2016).Hoeweldebiosyntheseenbioactiviteitreedswerdenonderzochtisderegulatienognietgrondig bestudeerd. Het is reeds bekend dat twee luxR-type regulatorgenen een rol spelen in deregulatie van orfamide (de Bruijn & Raaijmakers, 2009a; Ma et al., 2016). Interessant om teonderzoekenisofdezegeneninallestammendezelfdeinvloeduitoefenen.Hiervoorkanhetfenotypevan mutanten in luxUp en luxDown vergeleken worden met het fenotype van het wild type. Er isvoornamelijk zeer weinig gekend over de secretie van orfamide. Dat de macA en macBtransportergenenwaarschijnlijkeenrolspeleninhetnaarbuitenbrengenvanorfamideisreedsgekend(Maetal.,2016;Olorunlekeetal.,2007).Dematewaarinzeeenrolkunnenspelenisechternognietbestudeerd.Onderzoeknaardezesecretiemechanismenverteltmisschienietsmeeroverhunspecifiekerol in de secretie vanorfamide. In het bijzonder kanhet nut vandebuitenstemembraanproteïnenwordenbestudeerd.Hiervoorkanhetfenotypevandemutantenindezebuitenstemembraanproteïnenvergelekenwordenmethet fenotypevanhetwild type.Verderonderzoeknaardebioactiviteit vanorfamideisookaangeraden.HetverliesinopbrengstenvandecocoyaminAfrikaisnognietverholpen(Höfte and Altier, 2010b). Daarom is belangrijk dat de plant-pathogeen Pythiummyriotylumwordtbestreden.HetnutvanorfamideinderhizosfeervandecocoyamzouweleenseenoplossingkunnenbiedenvoordebestrijdingvanP.myriotylum.De doelstelling van deze thesis is het onderzoeken van de biosynthese, regulatie, secretie enbioactiviteit van orfamide in verschillende fluorescerendePseudomonaspopulaties. Hiervoor zal deregulatie voornamelijk inPseudomonas sp. CMR5c bestudeerdworden daar er reeds een luxUp enluxDownmutantwasaangemaakt.DesecretiezaleveneensvoornamelijkinPseudomonassp.CMR5cwordenbestudeerddaarermutatieswarengemaaktintweebuitenstemembraanproteïnen.Ookhetsecretiesysteem van Pseudomonas sp. CMR12a zal verder worden onderzocht. De bioactiviteit vanorfamide tegendeplant-pathogeneoömyceetP.myriotylumwordtbestudeerd inPseudomonassp.CMR5cenP.protegensCHA0omdaterinbeidestammenreedsorfamidemutantenwerdengemaakt.Op deze manier kon de invloed van orfamide worden bestudeerd. Hierbij bevat Pseudomonas sp.CMR5chettransporternodTgenniet indeorfamidebiosyntheseclusterwaarP.protegensCHA0ditnodTgenwelbevat(Maetal.,2016).

Materiaal&Methoden

25

4.Materiaal&MethodenDe verschillende Pseudomonas isolaten en primers die gebruikt werden tijdens de experimentenwordenweergegeveninTabelB1.DesamenstellingvandeaangemaaktemediawordenweergegeveninTabelB2enB3.

4.1Fenotypebepaling

4.1.1DruppelinzaktestMet een druppelinzaktest kan snel nagegaan worden of een bacterie orfamide uitscheidt. Debiosurfactants eigenschap van orfamide zorgt ervoor dat de oppervlaktespanning van een druppelbacteriecultuurverlaagtendatdedruppelinelkaarzakt.Pseudomonassp.CMR5cenmutantenwerdenopgegroeidop LB-mediumop28°C. Kolonieswerdenopgepikt, overgebracht in5mL LB-vloeistof enovernachtgeïncubeerdindeshakerop28°C.Eendruppelvan50µLvandevloeibarebacteriecultuurwerdopparafilmgebracht.Alsblancostaalwerdeen50µLdruppelwatergebruikt.Dedruppelswerdengekleurdmetbroomthymolblauwwaardoordedruppelblauwkleurdeenhetresultaatbeterzichtbaarwerd.

4.1.2SwarmingSwarming is eveneens een test om te bepalen of orfamide uitgescheiden werd aangezien het debeweegbaarheidvandebacteriestimuleert.Pseudomonassp.CMR12a,CMR5c,P.protegensPf-5enmutantenwerdenopgegroeidopKB-mediumop28°C.Kolonieswerdenopgepikt,overgebrachtin5mLKB-vloeistofenovernachtgeïncubeerdindeshakerop28°C.DeOD620werdbepaaldmetKB-vloeistofalsblancostaal.Hetnodigevolumewerdberekendzodat107CFUaanwezigwarenin1,5mLKB-vloeistof.Hiervoor werden Formule 1 tot en met 3 gebruikt. De OD werd via een reeds bepaalderegressiecoëfficiëntomgezetinCFU/mL.

Omallebacteriënopeenbeginconcentratietezettenvan107CFUpermLKB-vloeistofmoethetvolumewaarinditaantalbacteriënaanwezigiswordenbepaald.

HetvolumeinmLdatzouwordenaangevuldmetKB-vloeistoftoteenvolumevan1mLwordtbereikt,zou dan een concentratie hebben van 107 CFU/mL KB-vloeistof. Er werd echter 1,5mL KB-vloeistofgebruiktinplaatsvan1mL.Omdittecorrigerenwerdvolgendeformulegebruikt.

Formule1:

1𝑂𝐷%&' = 8,2293. 100𝐶𝐹𝑈𝑚𝐿

Formule2:

107𝐶𝐹𝑈𝑚𝐿𝐾𝐵𝑣𝑙𝑜𝑒𝑖𝑠𝑡𝑜𝑓

𝐶𝐹𝑈𝑚𝐿

=𝑚𝐿

𝑚𝐿𝐾𝐵𝑣𝑙𝑜𝑒𝑖𝑠𝑡𝑜𝑓

Formule3:𝑚𝐿

𝑚𝐿𝐾𝐵ABCDEFGCH. 1000

µ𝐿𝑚𝐿

. 1,5𝑚𝐿𝐾𝐵ABCDEFGCH = µ𝐿

Materiaal&Methoden

26

Wanneer dit volume in µL toegevoegd wordt aan 1,5mL KB-vloeistof bevatte de oplossing eenconcentratie van 107 CFU/mL. Deze 1,5mL KB-vloeistofmet berekende hoeveelheid bacteriecultuurwerdineenwelletjevaneenzeswellplaatgebrachtenvervolgensgeïncubeerdop28°Cgedurende24uur.Vandebacteriecultuurwerd1mLovergebrachtnaareen1,5mLeppendorftubedatgecentrifugeerdwerdgedurende2minutenaan13,400g.Decellenwerdentweemaalgewassenmet1mLnormalesalineoplossing door te resuspenderen en te centrifugeren gedurende 2 minuten op 13,400g. De cellenwerdenopgelostin1mLnormalesalineoplossingendeOD620werdbepaald.Een5µLdruppelvandeoplossingwerdinhetmiddenvaneen0,6%agarLB-plaatgebracht.Deplatenwerdengedurende17uurondergebrachtindeincubatorop28°C.

4.1.3HPLC-MS-analysePseudomonassp.CMR12a,CMR5cenmutantenwerdenopgegroeidopLB-mediumop28°C.Kolonieswerdenopgepikt,overgebrachtin5mLLB-vloeistofenovernachtgeïncubeerdindeshakerop28°C.DeOD620werdgemetenmetLB-vloeistofalsblancostaal.Hetvolumenodigzodat107bacteriënaanwezigwarenin2,5mLLB-vloeistofwerdberekendmetFormules1totenmet3waarbijFormule3indiemateaangepastwerddatvermenigvuldigdwerdmet2,5mLinplaatsvan1,5mL.Driewelletjesvaneenzeswellplaatwerdenopgevuldmet2,5mLLB-vloeistofendeberekendehoeveelheidbacteriecultuurvoorelkesoort.Dezewerdenop28°Cgeïncubeerdzonderteshakengedurendezowel17uur,24uurals41uurzodatdrietijdspuntenterbeschikkingwaren.DeOD620werdgemeten,devloeibarebacterieculturenuitdewelletjeswerdenelkin1,5mLeppendorftubesgebrachtenwerdengecentrifugeerdgedurende2minutenaan13400rpm.Hetsupernatanswerdineennieuweeppendorftubegebrachtenvervolgensgefilterdmetbehulpvaneen10mLspuiteneen0,22µmfilter.HetgefilterdesupernatanswerdingepaktvoorHPLC-analyse.

4.1.4Inhibitoren

4.1.4.1ConcentratieOm bepaalde effluxpompsystemen te inhiberen kunnen inhibitoren worden gebruikt. Een eersteinhibitoriscarbonylcyanide3-chlorophenylhydrazone(CCC)diedeprotonafhankelijkesecretiepompendeactiveert.Eentweedeinhibitorisnatriumorthovanadaat(NOV)diereageertalseenATPaseinhibitor.Eenderdeenlaatsteinhibitorisglybenclamide(GLB)dieeveneensverscheideneATP-transporterskaninhiberen.DeconcentratiesvanCCC,NOVenGLBdiegebruiktwerdenzijnrespectievelijk25μM,1mMen10μM.TabelB3geeftweerhoedezeinhibitorenklaargemaaktwerden.

4.1.4.2SwarmingPseudomonassp.CMR12a,CMR5cenmutantenwerdenopgegroeidopLB-mediumop28°C.Kolonieswerdenopgepikt,overgebrachtin5mLKB-vloeistofenovernachtgeïncubeerdindeshakerop28°C.DeOD620werdbepaaldmetLB-vloeistofalsblancostaal.Hetvolumenodigzodat107bacteriënaanwezigwarenin1,5mLLB-vloeistofwerdberekendmetFormules1totenmet3.Erwerdtelkens50μLinhibitortoegevoegdaande1,5mLLB-vloeistofmetbacteriecultuur.Ditwerdgeïncubeerdop28°Cgedurende24 uur. Van de bacteriecultuur werd 1mL overgebracht naar een 1,5mL eppendorftube datgecentrifugeerdwerdgedurende2minutenaan13,400g.Decellenwerdentweemaalgewassenmet1mL normale saline oplossing en opgelost in 1mL normale saline oplossing waarna de OD620 werdbepaald.Een5µLdruppelvandeoplossingwerdinhetmiddenvaneen0,6%agarLB-plaatgebracht.

Materiaal&Methoden

27

Deplatenwerden17uurgeïncubeerdop28°Cwaarnaderesultatenwerdenbekeken.Erwerdookeenswarmingtestuitgevoerdwaar1µLDMSOwerdtoegevoegdinplaatsvaninhibitor.DitomnatekijkenofereeneffectvanDMSOwaarneembaarwas.Heteffectin%tussendebehandelingzonderinhibitoreneenbehandelingmetinhibitorwordtberekendmetFormule4.

%𝐸𝑓𝑓𝑒𝑐𝑡 = 𝐵𝑒ℎ𝑎𝑛𝑑𝑒𝑙𝑖𝑛𝑔𝑚𝑒𝑡𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑡𝑜𝑟 − 𝐵𝑒ℎ𝑎𝑛𝑑𝑒𝑙𝑖𝑛𝑔𝑧𝑜𝑛𝑑𝑒𝑟𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑡𝑜𝑟

𝐵𝑒ℎ𝑎𝑛𝑑𝑒𝑙𝑖𝑛𝑔𝑧𝑜𝑛𝑑𝑒𝑟𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑡𝑜𝑟

Omna tegaanofditeffect significant iswerdopdediameterwaardenstatistiek toegepastmethetprogrammaSPSS.ErwerdgebruikgemaaktvandeMann-WhitneyTestomelkebehandelingmetéénanderebehandeling te vergelijkenmet als nulhypothesedat de tweebehandelingen gelijk zijn. Eensignificantieniveau van 5% werd gebruikt zodat indien de p-waarde groter was dan 0,05 denulhypothesebehoudenwerdenindiendep-waardekleinerwasdan0,05denulhypotheseverworpenwerd.

4.1.5RealTimePolymerasekettingreactie(RT-PCR)

4.1.5.1CellenopgroeienPseudomonassp.CMR5c,P.protegensPf-5enmutantenwerdenopgegroeidopLB-mediumop28°C.Kolonieswerdenopgepikt,overgebrachtin5mLLB-vloeistofenovernachtgeïncubeerdindeshakerop28°C.DeOD620werdgemetenmetLB-vloeistofalsblancostaal.Hetvolumenodigzodat107bacteriënaanwezigwarenin2,5mLLB-vloeistofwerdberekendmetFormules1totenmet3waarbijformule3indiemateaangepastwerddatvermenigvuldigdwerdmet2,5mLinplaatsvan1,5mL.Driewelletjesvaneen zes well plaat werden opgevuld per soort en werden op 28°C geïncubeerd zonder te shakengedurende zowel 17 uur als 24 uur zodat twee tijdspunten ter beschikking waren. De OD620werdgemeten,devloeibarebacterieculturenuitdewelletjeswerdenelkin2mLeppendorftubesgebrachtenwerden gecentrifugeerd gedurende 10 minuten aan 10000rpm op 20°C. Het supernatans werdafgegotenendecelpelletswerdenbevroreninvloeibaarstikstofenbewaardin-80°C.

4.1.5.2RNA-extractieWanneerdecellenuitde-80°Cwerdengehaaldwerdenzeonmiddellijkinvloeibarestikstofbewaard.Inelkeeppendorftubewerdeenbeatgeplaatswaarnadecellen totpoederwerdenvermalen indehomogenisatorgedurende30 secondenop24Hz.Erwerd1mLTrizol (TRIReagent) toegevoegdaan100mgpoederenditwerdonmiddellijkgevortextgedurende1minuut.Destalenwerdengeïncubeerdgedurende5minutenop28°C.Hiernawerd0,2mLchloroformtoegevoegdenwerdergoedgeschudmetdehandgedurende15seconden.Deeppendorftubeswerdengeïncubeerdgedurende3minutenopkamertemperatuur.Vervolgenswerdendestalengecentrifugeerdgedurende15minutenop12000gop 4°C. Hierdoor ontstond bovenaan een waterige fase die werd overgebracht naar een nieuweeppendorftube.Hetwashierbijbelangrijkdatdeinterfasezekernietwerdaangeraakt.Dewaterigefasewerd geprecipiteerd door 0,5mL isopropanol toe te voegen, goed te mengen en 10 minuten opkamertemperatuur te laten incuberen. Vervolgenswerd gecentrifugeerd gedurende 10minuten op12000gop4°C.Hetsupernatanswerdverwijderdendepelletwerdgewassenmet1mL75%ethanol.Dit werd gevortext gedurende 2 tot 3 seconden tot de pellet loskwam. Er werd gecentrifugeerdgedurende5minutenop7000rpmop4°Cwaarnahetsupernatansverwijderdwerd.Vervolgenswerdnogeensgecentrifugeerdgedurende1minuutop7000rpmop4°Comalhetresiduelesupernatanste

Formule4:

Materiaal&Methoden

28

verwijderenmeteenpipet.DestalenmetRNAwerdenaandeluchtgedroogdgedurendeongeveer10minutentotdepelletonzichtbaarwas.HetRNAwerdnuopgelostin40µLRNAsevrijwaterendestalenwerdenbewaardin-80°C.

4.1.5.3DNAsebehandeling,concentratiebepalingHetwaszeerbelangrijkomallesinijstebewarenterwijlergewerktwerd.Aandebevrorenstalenwerd40µL10xTURBODNAseBuffertoegevoegden2µLDNAse.Ditwerdgeïncubeerdgedurende30minutenop37°C.Hiernawerd8µL inactivatieReagenttoegevoegdwaarnagoedgeschudwerden2minutengeïncubeerdwerdopkamertemperatuur.Namengenwerdgecentrifugeerdgedurende1,5minutenop10000g. Het supernatans werd overgebracht naar een verse eppendorftube en met despectrofotometerwerddeconcentratievandestalenbepaald.Hetvolumewerdaangepastzodateenmassavan3000ngRNAbekomenwerd.DitvolumeRNAwerdvervolgensaangevuldmetRNAvrijwatertot10µLzodateenconcentratievan300ngRNA/µLwerdbekomen.

4.1.5.4MakenvancopyDNA(cDNA)OmvanhetRNAcDNAtemakenwerdeenPCRuitgevoerdmetMasterMix(MM)uitTabel3.VandeMMwerd10µLbij10µLvanhetRNA-staalgevoegdinPCReppendorftubes.Opdezemanieriser3000ngRNAin20µLomcDNAaantemaken.HetPCR-programmauitTabel4werdgebruikt.

Materialen Volumeperstaal

10xRTBuffer 2µL

25xdNTPMix(100mM) 0,8µL

10xRTRandomPrimers 2µL

ReverseTranscriptase(multiscribe) 1µL

Rnaseinhibitor 1µL

Water(nucleasefree) 3,2µL

4.1.5.5AanmakenprimersVoordePCR-analysemoestenprimersvoorelkteonderzoekengenwordenaangemaakt.Viadewebsitevan“NCBI”kondenucleotidesequentievanelkgengenoteerdworden(“NCBI,”z.d.).Dewebsitevan“Primer3” gebruikte deze nucleotide sequentie om een aantal forward en reverse primers voor testellen(“Primer3,”z.d.).HierbijwerdrekeninggehoudenmetdatvoorPCR-analysehetafteschrijventranscript ongeveer 500bp langmoet zijn. De forward en reverse primerswerden gekozenwaarbijrekeninggehoudenwerdmetdatdeidealeprimerongeveer20bplangis,50%GC-nucleotidenbevatendatdesmelttemperaturenvandeprimersdichtbijelkaarliggen.Viadewebsitevan“MultiplePrimerAnalyzer”werdnagegaanofdegekozenprimesspecifiekwarenengeendimerenvormdenmetelkaar(“MultiplePrimerAnalyser,”z.d.).Omdeexpressievaneengennategaan,werdvoorelktebestuderengeneenforwardprimeraangemaaktvoorhetbeginstukjevanhetgeneneenreverseprimervoorheteindstukjevanhetgen.Omdeco-expressietussentweegenennategaanwerdeenforwardprimer

Tabel3.MMvoorPCRvoormakenvancDNAuitRNA,berekendvooréénstaal.

Tabel4.PCR-programmavoorhetmakenvancDNAuitRNA.PCRProgramma Tijd

25°C 10min37°C 40min85°C 5min

Materiaal&Methoden

29

aangemaaktvoorheteindstukjevanheteerstegeneneenreverseprimervoorhetbeginstukjevanhetvolgendegen.

4.1.5.6PCRIndientranscriptieplaatsvondindePseudomonasspecieswerdhetRNAaangemaakt.DoorditRNAomtezettennaarcDNAenprimerstegebruikenvoordeteonderzoekengenenkonbepaaldwordenofdePseudomonasspeciesdegenenafschreven.DeteonderzoekengenenwarenluxUp,ofaA,ofaB,ofaC,macA,macB, luxDown en nodT voor sommige Pseudomonas isolaten. Een MasterMix (MM) werdaangemaakt voor deze genenen voor alle co-expressies voor zowelPseudomonas sp. CMR5c alsP.protegensPf-5,weergegeveninTabel5.VandeMMwerd49µLbij1µLvanhetcDNA-staalgebrachtinde PCR-eppendorftubes zodat een volume van 50µL bekomenwerd.Het PCR-programmadatwerdgebruiktwordtweergegeveninTabel6.Vervolgenswerd20µLvanhetPCR-productop1,5%agarosegelgeladenvoorgelelektroforese.

PCRProgramma Tijd

94°C 2min30cyclivan:94°C 30sec59°C 60sec72°C 30sec72°C 10min

4.1.6KwantitatievePolymerasekettingreactie(qPCR)OmtebepalenhoeveelkeerhettranscriptwerdafgeschrevenwerdqPCRgebruikt.ViaRNA-extractiewerdRNAgeëxtraheerduitdeteonderzoekenbacteriePseudomonassp.CMR5cenmutantennazowel17 uur opgroeien als 24 uur opgroeien (zie 4.1.5 RT-PCR). Van dit RNA werd cDNA gemaakt metMasterMixsamenstellinggegeveninTabel3enhetgebruikteprogrammainTabel4.DeconcentratievanhetcDNAwerdbepaaldenwerdzodanigverdundmetRNAsevrijwaterdateenconcentratievan10ng/µL werd bereikt. De te onderzoeken genen waren rpoD,macA,macB en luxDown waarvoorprimers werden aangemaakt op dezelfde manier als voor RT-PCR-analyse (zie 4.1.5.5 Aanmakenprimers).VoorqPCR-analysemoesthetafteschrijventranscriptweltussende150bpen200bplangzijn in plaats van 500bp zoals bij PCR-analyse. Een MasterMix werd aangemaakt voor elk gen,weergegeveninTabel7.AanelkeMasterMixvanééngenstaalwordt2,5µLcDNAtoegevoegd.Opdezemanierbevatteelkgenstaal25ngcDNA.

Tabel5.MasterMixvoorPCRmet1µLstaalMaterialen VolumeGoTaqReactionBuffer 10µL10µMPrimerF 2µL10µMPrimerR 2µL10mMdNTPmix 0.5µLGoTaqDNAPolymerase 0,2µLWater(RNAsevrij) 32,3µL

Tabel6.PCR-programmavoorhetamplificerenvandesequentiesbehorendetotdebiosynthese, regulatieensecretievandeorfamidecluster.

Materiaal&Methoden

30

Drie bacteriestalenwerden onderzocht voorPseudomonas sp. CMR5c gedurende 17 uur en 24 uurnamelijkhetwildtype,deluxUpmutantendeluxDownmutant.Tabel8geeftweerhoedeqPCRwerdopgesteld.

4.2InvitroinhibitieexperimentOmnategaanofdePseudomonasspeciesdegroeivanPythiummyriotylumkaninhiberenwerdeeninhibitietest uitgevoerd. Op een PDA-plaat werd P. myriotylum opgegroeid in de 28°C incubatorgedurendedriedagen.Pseudomonassp.CMR5c,P.protegensCHA0enorfamidemutantenwerdenopgegroeidopKB-mediumop28°Cgedurendetweedagen.Kolonieswerdenopgepikt,overgebrachtin5mLKB-vloeistofenovernachtgeïncubeerd indeshakerop28°C.Vandebacteriecultuurwerd4mLgecentrifugeerdgedurende10minutenaan10000g.Hetsupernatanswerdgefilterdmeteen0,22µmfilternaareennieuweeppendorftube.Deoverige1mLvandebacteriecultuurwerdovergebrachtnaareennieuweeppendorftube.Wanneerdeoömyceetvoldoendeopgegroeidwas,werdmeteenboornummer3kleinecirkeltjeuitgesneden.Metbehulpvanboornummer4werder inhetmiddenvannieuwePDAplateneencirkeluitgeboord.Ronddecirkel,op1cmafstand,werdenvieragarcirkeltjesmetP.myriotylumgeplaatst.Vanhetgefilterdsupernatanswerd100µL inhetcirkelgaatjegebracht,telkensdriereplicaten.Vandebacteriecultuurwerd100µLinhetcirkelgaatjegebracht,eveneensdriereplicaten.Deplatenwerdengeïncubeerdop28°Cgedurendetweedagenwaarnadediametervandeinhibitiezoneopgemetenwerd.OpdezediameterwaardenvanelkebehandelingweergegeveninTabel9werd vervolgens statistiek toegepastmet het programma SPSS. Erwerd gebruik gemaakt van deKruskal-WallisTestmetnulhypothesedatallebehandelingengelijkzijnendeMann-WhitneyTestomelke behandeling met één andere behandeling te vergelijken met als nulhypothese dat de tweebehandelingengelijkzijn.Eensignificantieniveauvan5%werdgebruiktzodatindiendep-waardegroterwas dan 0,05 de nulhypothese behouden werd en indien de p-waarde kleiner was dan 0,05 denulhypotheseverworpenwerd.

Tabel7.MasterMixvoorqPCRvoorééngenstaal.

Materialennodigperstaal Volumepergenstaal

Sybergreen 12,5µL

3µMPrimerF 2,5µL

3µMPrimerR 2,5µL

Water(RNAsevrij) 5µL

Tabel8.QPCR-opstellingvoorPseudomonassp.CMR5cgedurendezowel17uurals24uur.rpoD;housekeepinggen;mA,macA;mB,macB; lD, luxDown.WT,wildtype;LU, luxUpmutant;LD, luxDownmutant;ntc,negatievecontrole. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A rpoD

WTrpoDLU

rpoDLD

rpoDntc

mAWT

mALU

mALD

mAntc

mBWT

mBLU

mBLD

mBntc

B lDWT

lDLU

lDLD

lDntc

Materiaal&Methoden

31

Nummer Behandeling

1 Controle2 PseudomonasprotegensCHA03 PseudomonasprotegensCHA0-Δorf4 PseudomonasprotegensCHA0-cellen5 PseudomonasprotegensCHA0-Δorf-cellen6 PseudomonasspeciesCMR5c7 PseudomonasspeciesCMR5c-Δorf8 PseudomonasspeciesCMR5c-cellen9 PseudomonasspeciesCMR5c-Δorf-cellen

4.3Biocontroleexperimentmetcocoyam

4.3.1Weefselkweekcocoyam

4.3.1.1ProliferatieInpotjeswerd10mLgeautoclaveerdMS+mediumgebrachtengewachttotvoldoendeafgekoeld.Bijproliferatie van reeds opgegroeide cocoyamplantjes was het belangrijk steriel te werken: sterielescalpels, steriele pincetten, steriel oppervlak en handschoenen.Wortels en bladeren van de kleinesteriele cocoyamplantjeswerden afgesneden zodat enkel een klein deeltje van ongeveer een halvecentimeterrondoverbleef.Ditdeelbevattedeapexenhetwitmateriaaldatdeelisvandeknol.Alhetafgestorvenmateriaal(bruin)werdverwijderd.Hetwashierbijbelangrijkdeapexniettebeschadigen.Zes apex stukjeswerden in eenpotjemetMS+mediumgeplaatstwaarbij het jongste deel vanhetafgesnedenstukjeinhetmediumwerdgeplaatst.Depotjeswerdengeïncubeerdop26°Cgedurende16uurlicht/8uurdonkergedurendetweemaanden.Nazeswekenenvoortweemaandenkondezestapherhaaldwordenomplantjesverdertevermenigvuldigen.

4.3.1.2AcclimatisatieOokhierwerdsterielgewerkt(zieproliferatie).Deknollenvandeplantjeswerdenverwijderdzodatzegeen tot weinig voedselvoorraad bevatten. De wortels van de plantjes werden gewassen metkraantjeswaterwaarbijdewortelsendeplantzoweinigmogelijkbeschadigdwerden.Doordeagarteverwijderenwerddekansopcontaminatieverkleind.Deplantjeswerdentweemaalgewassenzodatdeagarzekerverwijderdwasendewortelsproperwaren.Vervolgenswerdeengrotebakgesteriliseerdmet ethanol waarna aarde die tweemaal werd geautoclaveerd met 700mL water in de bak werdgebracht. De plantjes werden in de aarde gepland en de bakwerd bedektmet transparant plasticaangeziendeplantjesveel lichtnodighebbeneneenheelhogerelatievevochtigheid.Nadriedagenkondenereenpaar gaatjes inhetplasticwordengemaakt, na5dagenwerdendezegaatjes grotergemaaktenna7dagenwerdhetplasticverwijderd.Hetwasbelangrijkdatderelatievevochtigheidgradueeldaalde.

Tabel 9. Behandelingen van in vitro inhibitie experiment opP.myriotylum. ‘Δorf ‘zijn de orfamidemutanten,‘cellen’ wijst erop dat de bacteriecultuur met cellen is gebruikt, zonder deze aanwijzing betekent dat hetsupernatanswerdgebruikt.BijdecontrolewerdenkelP.myriotylumgebruiktzonderbacteriecultuur.

Materiaal&Methoden

32

4.3.2Inoculatie

4.3.2.1PseudomonasspeciesPseudomonassp.CMR5c,P.protegensCHA0enorfamidemutantenwerdenopgegroeidopKB-mediumop28°Cengedurendeéénàtweedagengeïncubeerd.Nadatdecellenvoldoendegegroeidwarenwerder aan de platen 25mL normale saline oplossing toegevoegd. Met de driehoeksspatel werden allebacteriën opgelost in de normale saline oplossing. Deze oplossing werd overgegoten in een kleineerlenmeyervan100mL.Deplatenwerdennagespoeldmet25mLnormalesalineoplossingeneveneensovergegoten indeerlenmeyerwaarnaaangevuldwerdmetnormalesalineoplossing tot100mL.DeOD620werdbepaaldenhetvolumewerdbepaaldwaar3.106bacteriënaanwezigzijnpergramgrond.Formule1werdgebruiktomdeODomtezettennaarCFU/mL.VervolgenswerdFormule5gebruiktomhet volume te bepalen dat nodig is zodat alle experimenten een beginconcentratie hebben van3.106CFUbacteriënpergramgrond.

DitgeefthetvolumeinmLdatzouwordengebruiktin1ggrondzodatdebeginconcentratiebacteriënzoubestaanuit3.106CFU/ggrond.Erwerdechter385ggrondgebruiktaangezienelkepot77ggrondbevatteenervijfherhalingenwaren.OmdittecorrigerenwerdFormule6gebruikt.

WanneerditvolumeinmLtoegevoegdwordtaan385ggrondwordteenconcentratievan3.106CFU/gbereikt.Ditvolumewerdovergebrachtineenfalcontube.

4.3.2.2P.myriotylumP.myriotylumwerd opgegroeid op PDA-mediumop 28°C gedurendeongeveer vijf dagen.Wanneervoldoende opgegroeid werden er ringetjes uit gesnedenmet boor nummer 3. Per te onderzoekenPseudomonas soort werden er 6 ringetjes uitgesneden. Er werden 30 ringetjes in een falcontubegebrachtwaar25mLgeautoclaveerdbidestwateraantoegevoegdwerd.Meteenhomogenisatorwerdditgehomogeniseerdgedurende15à20seconden.Geautoclaveerdbidestwaterwerdtoegevoegdtoteenvolumevan50mLwerdbereikt.

4.3.2.3ExperimentDriedelenpotgrondtypeIwerdgemengdmetééndeelzand.AanhetberekendevolumePseudomonasinoculumwerd50mLbidestwatertoegevoegdenditwerdvervolgens2minutenlanggoedgemengdmetde385ggrond.Degrondwerdgedurendetweedagenbewaardinsterielezakjesaan28°C.Tweedagen later werd de gehomogeniseerdeP.myriotylum aan de grond toegevoegd. Hiervoorwerd 2minutenlanggoedgemengd.DegemengdegrondmetPseudomonasenP.myriotylumwerdverdeeldover vijf potten zodat elke pot 77g grond bevatte. De cocoyamwortels werden in nieuw berekendPseudomonas inoculumgediptomoverdevijfpottenverspreidteworden.Erwerdooktelkenseenpositieve controle en negatieve controle uitgevoerd. De positieve controle was grond zonder

Formule5:

3.106𝐶𝐹𝑈𝑔𝑔𝑟𝑜𝑛𝑑𝐶𝐹𝑈𝑚𝐿

=𝑚𝐿

𝑔𝑔𝑟𝑜𝑛𝑑

Formule6:m𝐿

ggrond. 77𝑔. 5 = m𝐿

Materiaal&Methoden

33

Pseudomonasenmettweedelenwater.DenegatievecontrolewasgrondzonderPseudomonasmaarmetP.myriotylum.

4.3.2.4ZiekteevaluatieenkwantificatiebacteriënNaongeveer zevendagenwerd al danniet een gele verkleuringwaargenomenopdebladeren.Debladerenwerdengescoordopverkleuring.Een‘0’werdtoegekendaandebladerendiegeenverkleuringtoonde;een‘1’wanneerminderdan50%vanhetbladgeelkleurde;een‘2’wanneermeerdan50%vanhetbladgeelkleurde;een‘3’wanneerheelhetbladgeelkleurdeeneen‘4’wanneerhetbladdoodwas.Formule7geeftdedeplantziekteindex(PDI)weerdiewerdbepaaldmetbehulpvandezescores.

Op deze PDI-waarden van elke behandeling weergegeven in Tabel 10 werd vervolgens statistiektoegepast met het programma SPSS. Er werd gebruik gemaakt van de Kruskal-Wallis Test metnulhypothesedatallebehandelingengelijkzijnendeMann-WhitneyTestomelkebehandelingmetéénanderebehandeling te vergelijkenmet als nulhypothesedat de tweebehandelingen gelijk zijn. Eensignificantieniveau van 5% werd gebruikt zodat indien de p-waarde groter was dan 0,05 denulhypothesebehoudenwerdenindiendep-waardekleinerwasdan0,05denulhypotheseverworpenwerd.

Nummer Behandeling1 Positievecontrole2 Negatievecontrole3 PseudomonasprotegensCHA04 PseudomonasprotegensCHA0-Δorf5 PseudomonasspeciesCMR5c6 PseudomonasspeciesCMR5c-Δorf

Nadatdebladerengescoordwarenwerdendeovergeblevenwortelsgewassenmetwateromdeaardeteverwijderen.Dewortelswerdengedroogdenonmiddellijkgewogen.Vervolgenswerdenzeelkapartinvijzelsgebrachtdiegeautoclaveerdwerden.Erwerdzandtoegevoegd,5mLnormalesalineoplossingen de wortels werden gedurende twee minuten lang gecrushed. Een verdunningsreeks werdaangemaaktmetnormalesalineoplossingtot10-4.Vanelkeverdunningwerd10μLtweemaaluitgeplaatopKB-mediumengeïncubeerdop28°Cgedurende30uur.VervolgenswerdendeCFU'sgeteld.

Formule7:

𝑃𝐷𝐼 = 𝐴𝑎𝑛𝑡𝑎𝑙𝑏𝑙𝑎𝑑𝑒𝑟𝑒𝑛 ∗ 𝐶𝑜𝑟𝑟𝑒𝑠𝑝𝑜𝑛𝑑𝑒𝑟𝑒𝑛𝑑𝑒𝑠𝑐𝑜𝑟𝑒𝑏𝑙𝑎𝑑

𝑇𝑜𝑡𝑎𝑎𝑙𝑎𝑎𝑛𝑡𝑎𝑙𝑏𝑙𝑎𝑑𝑒𝑟𝑒𝑛 ∗ 𝑀𝑎𝑥𝑖𝑚𝑎𝑙𝑒𝑠𝑐𝑜𝑟𝑒

Tabel10.BehandelingenvaninvitroinhibitieexperimentopP.myriotylum.‘Δorf‘zijndeorfamidemutanten.

Resultaten&Discussie

34

5.Resultaten&Discussie

5.1Biosynthesevanorfamide

5.1.1Resultaten

Swarmingtest

DebiosynthesevanorfamideinPseudomonasspeciesCMR12a,CMR5cenPseudomonasprotegensPf-5werdallereerstnagegaanmeteenswarmingtest.Figuur9geeftdeswarmingtestresultatenweervandedrieisolatendieduidelijkeenswarmingpatroongeven.

HPLC-MS-analyse

High-performance liquidchromatografy (HPLC) -Massaspectrometry (MS)-analysevanPseudomonassp.CMR5cwerduitgevoerdomspecifiektebepalenwelkemoleculenwerdenaangemaakt.Doordathetsupernatanswerdbestudeerdennietdecellenkonwordenbepaaldwelkeaangemaaktemoleculenbuiten de celwerden gebracht. Aangezien dem/zwaarden van orfamide reeds bekendwaren konmakkelijkdeaanmaakvanorfamideteruggevondenworden.Figuur10geefthetchromatogramweervoorPseudomonassp.CMR5cna24uuropgroeien.Driegroterepiekenenéénkleinerepiekwerdenzichtbaarbijhetwildtype,namelijkdepiekenvoororfamideD,E,BenG.OrfamideBwerdhierbijhetmeesteaangemaakt.

Figuur 10. HPLC-MS-analyse vanPseudomonas sp. CMR5c. De stalen van de bacteriënwerden bereid uit hetsupernatansvan24uurgegroeideLB-vloeistofculturen.

Figuur9.SwarmingtestmetPseudomonassp.CMR12a,CMR5cenP.protegensPf-5na24uuropgroeienopLB-mediummet0,6%agar.

CMR12a Pf-5CMR5c

E3.36B3.46

G3.78D3.06

151123 5C - 20

Time0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

Relatie

ve

abun

dantie(%

)

Tijd(s)

Pseudomonassp.CMR5c


35

RT-PCR-analyse

Een Real Time Polymerasekettingreactie (RT-PCR) werd uitgevoerd om te bepalen welke orfamideclustergenen werden afgeschreven door Pseudomonas sp. CMR5c en P. protegens Pf-5. RNA werdgeëxtraheerduitcellendie17uuren24uurwarengegroeidinLB-vloeistofop28°C.DeconcentratievanhetRNAwordtweergegeveninTabelB4.Dezetabeltoonthogeconcentratiewaardenengoedezuiverheden van het geëxtraheerde RNA. Uit dit RNA werd vervolgens cDNA gemaakt waaruit konwordenonderzochtwelkegenenvandeorfamideclusterexpressievertoonden.InFiguur11wordtdetranscriptionele analyse van de orfamide biosynthesecluster van Pseudomonas sp. CMR5c en P.protegensPf-5na17uuren24uurweergegeven.Hierbijwerdookdeco-expressietussendegenennagekeken.Na17uuren24uurwerdenerbijPseudomonassp.CMR5cdezelfdetranscriptengevormdnamelijkeenkorttranscriptvanluxUpeneenlangtranscriptdatofaABC-macAB-luxDownomspant.BijP.protegensPf-5na17uuropgroeienwerdendrietranscriptenaangemaaktnamelijkeentjedatluxUpomspant,éénvoormacAenéénvoorluxDown.TranscriptenmetdeeltjesvanluxUp-ofaA,ofaA-ofaB,ofaB-ofaC,ofaC-macA,macA-macBenmacB-luxDownwerdeneveneenswaargenomenzonderdatdegeneneffectiefwerdenafgeschreven.Na24uurwerdééngroot transcript gevormddat alle genenomspande,nodT-luxUp-ofaABC-macAB-luxDown.ErmoetopgemerktwordendatbijP.protegensPf-5na zowel 17 uur als 24 uur opgroeien er twee transcripten getekend zijn diemacB en luxDownomspannen.Ditomdatderichtingvanafschrijvingvandezeco-expressienietgekendisendusbeidekantenzoukunnenuitgaan.

Figuur 11. Transcriptionele analyse van de orfamide biosynthesecluster van Pseudomonas sp. CMR5c en P.protegensPf-5na17uuren24uuropgroeieninLB-vloeistofop28°C.

nodTLUofaAofaBofaCmacAmacBLD

17u24u

17u&24u

LUofaAofaBofaCmacAmacBLD

Pseudomonassp.CMR5c

P.protegensPf-5


36

5.1.2DiscussieOrfamidewordtgeproduceerddoortalvanplantgeassocieerdePseudomonasspecies(Maetal.,2016)zoals onder anderen Pseudomonas protegens Pf-5 geïsoleerd van de katoenplant (Howell andStipanovic,1979),PseudomonasprotegensCHA0geïsoleerdvandewortelsvandetabaksplant(Stutzetal.,1986)enPseudomonasspeciesCMR12aenCMR5cbeidengeïsoleerduitderhizosfeervandecocoyam (Perneeletal., 2007).Deorfamidebiosynthese staatonder controle vandrieNRPSgenennamelijkofaA,ofaBenofaC (D’aesetal.,2014).DezegenenkunnenverschillendesoortenorfamideaanmakennamelijkorfamideAtotenmetGdoorgerelaxeerdesubstraatspecificiteit(Grossetal.,2007;Maetal.,2016).

Swarmingtest

DeaanmaakvanorfamideinPseudomonassp.CMR12a,CMR5cenP.protegensPf-5werdaangetoondmet een swarmingtest waarbij swarmingbeweegbaarheid voorkwam (Figuur 9). Deswarmingbeweegbaarheid toonde aan dat orfamide aangemaakt werd aangezien orfamide deoppervlaktespanning kan verlagen zodat bacteriën kunnen bewegen doorheen het medium. DatPseudomonas sp. CMR12a zo weinig beweegt doorheen het medium is te verklaren doordat ooksessilineaangemaaktwordt.Sessiline inPseudomonassp.CMR12a isbelangrijkvoorbiofilmformatiewaarorfamidevoornamelijkvanbelangisvoordeswarmingbeweegbaarheid.Dezesessilineblokkeertechterhetvrijkomenvanorfamide,waardoordeswarmingbeweegbaarheidonderdruktwordt(D’aesetal.,2014).Pseudomonassp.CMR5cmaaktenkelorfamideaanengeensessiline,waardoororfamidevrijspelheeftendeswarmingbeweegbaarheidgroterisdanbijPseudomonassp.CMR12a.NublijktP.protegensPf-5hetmeestdoorheenhetmediumtekunnenbewegen.Allereerstmaaktdezesoortgeensessilineaan,zodathetvrijkomenvandeorfamidenietonderdruktwordt.Eenredenvoordegroterebeweegbaarheid zou kunnen zijn dat de promotors voor de biosynthesegenen inP. protegensPf-5actieverzijndandievanPseudomonassp.CMR12aenCMR5c(LiandZhang,2014).Hierdoorkandegenexpressie hoger zijn waardoormeer orfamidewordt aangemaakt, wat resulteert in een hogerebeweegbaarheid.

HPLC-MS-analyse

Met HPLC-MS op Pseudomonas sp. CMR5c kon onderzocht worden welke specifieke orfamidemoleculenwerdenaangemaakt.VierduidelijkepiekenverschenennamelijkdievanorfamideB,D,EenGmetm/zwaardenrespectievelijkgelijkaan1254,1280,1282en1309.NormaalwordtechternogeenvijfdeorfamidemoleculenaangemaaktdoorPseudomonas sp.CMR5cnamelijkorfamideFmetm/zwaarde1307(Maetal.,2016).DezepiekindeHPLC-MS-analysewasechtertekleinomopgemerktteworden.

RT-PCR-analyse

MetRT-PCR-analysekandanbepaaldwordenwelkegenenexactwerdenafgeschreven,zowelna17uuralsna24uuropgroeienvandebacteriën.IneenvorigonderzoekmetRT-PCR-analysewerdhetwildtypevanPseudomonassp.CMR12aonderzocht,weergegeveninFiguur12.Na17uurontstaanertweetranscripten,namelijkeenkorttranscriptvoorhetluxUpgeneneenlangtranscriptdatofaABC,macABenluxDownomspant.Na24uurontstaanerechterviertranscriptennamelijkdriekortevoorhetluxUp,


37

ofaAenofaBgeneneenlangertranscriptdathetofaC,macABenluxDowngenomspant(datanognietgepubliceerd). Het is meteen duidelijk dat de expressie van de orfamide biosynthesegenentijdsafhankelijkisdaarverschillendetranscriptenwerdengevormdna17uuren24uur.EenopmerkingmoetgemaaktwordenoverhettranscriptdatmacBenluxDownomspantna17uuren24uuropgroeienvandebacterie.Deze tweegenenworden inde tegenovergestelde richtingafgeschrevenwaardoorverwachtwordtdatgeenco-expressietussenmacBenluxDownvoorkomt.Doordattochco-expressiewordtwaargenomenisonzeker inwelkerichtinghettranscriptwordtafgeschreven.Hetkanzijndateen promotor rechts van het macB gen de afschrijving start en het DNA verder afschrijft integenovergestelde richting van luxDown. Of een promotor links van het luxDown gen start deafschrijvingenhetDNAvanmacBwordtindetegenovergestelderichtingafgeschreven.DezestukjesRNAdieindeandererichtingwordenafgeschrevenwordenantisenseRNA’s(asRNA’s)genoemd.DezeasRNA’s kunnen optreden als sleutel regulators van genexpressie. Ze kunnen de expressie van eenoperon onderdrukken terwijl ze alsmRNA functioneren voor een ander operon. Hierdoor staan zebekendalsverfijnderegulatorswitcheninbacteriën(Sestoetal.,2012).VerderonderzoekisvereistomtebepalenwatdefunctieisvandezeasRNA’sinPseudomonassp.CMR12a.

InPseudomonassp.CMR5clijktdeexpressieniettijdsafhankelijktezijndaardetranscriptenvoorbeidetijdspunten dezelfde bleven (Figuur 11). Hetzelfde lange transcript werd aangemaakt als bijPseudomonas sp. CMR12a na 17 uur opgroeien. De expressie in P. protegens Pf-5 blijkt terugtijdsafhankelijktezijnmaarblijktjuistna24uurhetlangetranscripttevormeninplaatsvanna17uurzoalsinPseudomonassp.CMR12a.Detijdsafhankelijkheidvanhetlangetranscriptkanalweertewijtenzijn aan de activiteit van de promotor voor dit transcript dat meer (P. protegens Pf-5) of minder(Pseudomonassp.CMR12a)actiefwordtnaverloopvantijd(LiandZhang,2014).OokinP.protegensPf-5 worden asRNA’s teruggevonden net als in Pseudomonas sp. CMR12a. Verder onderzoek iseveneensvereistomdefunctievandezeasRNA’stebepalen.

5.1.3ConclusieOrfamide wordt aangemaakt door Pseudomonas sp. CMR12a, CMR5c en P. protegens Pf-5. Deafschrijvingvandebiosynthesegenen isechter tijdsafhankelijk voorPseudomonassp.CMR12aenP.protegensPf-5.Waarschijnlijkisdittewijtenaandepromotoractiviteitdieverandertinfunctievandetijd. De promotors voor de biosynthesegenen van orfamide in Pseudomonas sp. CMR5c lijken niet

Figuur12.(Vorigonderzoek)TranscriptioneleanalysevandeorfamidebiosyntheseclustervanPseudomonassp.CMR12ana17uuren24uuropgroeien(datanognietgepubliceerd).


17h24h

Pseudomonassp.CMR12a


38

afhankelijkvandetijd.Pseudomonassp.CMR12aenP.protegensPf-5makenooknogasRNA’saandieeenrolzoudenkunnenspeleninderegulatievanbepaaldegenen.DezeasRNA’szijnnietaanweziginPseudomonassp.CMR5c.HetisduidelijkdatdeexpressievandebiosynthesegenenverschiltindedriePseudomonas isolaten. Dit doet vermoeden dat orfamide productie in de orfamide producerendePseudomonasspecieselkopeenanderemanierwordtgereguleerdenbeïnvloed.

5.2Regulatievanorfamide

5.2.1ResultatenDe regulatie van orfamide werd enkel onderzocht in Pseudomonas species CMR5c aangezien deregulatie inPseudomonassp.CMR12areedsgoedwerdbestudeerd.Erwerdenverschillendetestenuitgevoerd, namelijk de druppelinzaktest, de swarmingtest, HPLC-analyse, RT-PCR-analyse en qPCR-analyse.DeregulatieinPseudomonasprotegensPf-5konnietwordenonderzochtdaargeenluxUpenluxDownmutantenwarenaangemaakt.

Druppelinzaktest&Swarmingtest

OmdeinvloedvandeluxUpenluxDownregulatorgenenvanPseudomonassp.CMR5czelfaantetonenwerdeensnelledruppelinzaktestuitgevoerd.DeresultatenhiervanwordenweergegeveninFiguur13entonenaandatdedruppelbacteriecultuurvanluxUpenluxDownmutantennietinzakten.Vervolgenswerd een swarmingtest uitgevoerdwaarvan de resultatenwordenweergegeven in Figuur 14. Dezebevestigden de resultaten van de druppelinzaktest. Het wild type bewoog doorheen het mediumdoordat deze orfamide aanmaakte terwijl de luxUp en luxDown mutanten geenswarmingbeweegbaarheidvertoonden.

Figuur13.DruppelinzaktestvanPseudomonassp.CMR5cendemutantenvoorluxUpenluxDown.Voorhetblancostaalwerdwatergebruikt.

Figuur14.SwarmingtestvoorPseudomonassp.CMR5cenluxUpenluxDownmutantenna17uuropgroeienvanbacteriënopLB-mediummet0,6%agaraan28°C.

BlancoCMR5cΔluxUpΔluxDown

CMR5cΔluxUpΔluxDown


39

HPLC-MS-analyse

HPLC-MS-analyse werd uitgevoerd om specifiek te bepalen welke moleculen werden aangemaakt.Figuur15geefthetchromatogramweervoorPseudomonassp.CMR5cenluxUpenluxDownmutantenna24uuropgroeien.DefiguurgeeftduidelijkweerdatdeluxUpenluxDownmutantengeenorfamideaanmakenwanterwerdengeenpiekenwaargenomen.Figuur16geeftdeoptischedensiteit(OD)weerna17uur,24uuren48uuropgroeieninLB-vloeistof.TabelB5geeftdegetabelleerdewaardenweer.Decellenwerdenbijdestartzodanigverdunddatzeallemaaldezelfdecelconcentratiebevattenamelijk107cellen/mL.Na17uurwarendeluxUpenluxDownmutantensnelleraangegroeiddandeanderen.Dezetrendwerdookteruggevondenna24uur.Na48uurechterwasde luxUpmutantaangegroeidterwijldehoeveelheidluxDownmutantdaalde.HetwildtypevertoondeeveneenseenstijgingdochlagdecelconcentratielagerdanbijdeluxUpenluxDownmutanten.

Figuur15.HPLC-MS-analysevanPseudomonassp.CMR5cenmutanten.Destalenvandebacteriënwerdenbereiduithetsupernatansvan24uurgegroeideLB-vloeistofculturen.

Figuur16.OptischedensiteitvanPseudomonassp.CMR5cenluxUpenluxDownmutanten.Culturenwerden17uur,24uuren48uuropgegroeidinvloeibareLBendeODwerdbepaald.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

17u 24u 48u

OD

Tijdstip

ODanalyse

CMR5cWT

ΔluxUp

ΔluxDown

151123 5C - 20

Time0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

151123 5C - 20

Time0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

Relatie

veabu

ndantie

(%)

CMR5c-luxUp

CMR5c-luxDown

Tijd(s)

E3.36B3.46

G3.78D3.06

Pseudomonassp.CMR5c


40

RT-PCR-analyse

RT-PCR-analysewerduitgevoerdopde luxUp en luxDownmutantenom tebepalenwelkeorfamideclustergenenwerdenafgeschreven.TabelB4geeftdeRNA-concentratiesweerdieeengoedezuiverheidblijkentevertonen.DeRT-PCR-resultatenwordenweergegeveninFiguur17.DeluxUpmutantmaaktevier transcripten aan. Er werd een kort transcript teruggevonden dat deeltjes van ofaA en ofaBomspandezonderdatdeeffectievegenenwerdenafgeschreven.HetzelfdewasterugtevindenvoorofaCenmacA.EentranscriptvanmacBwerdteruggevondenwaareendeeltjemacAvasthingeneentranscriptvanluxDownwerdgedetecteerd.DeluxDownmutantmaaktedezelfdetranscriptenaanmaarindeplaatsvanhet luxDowntranscriptwerdhet luxUptranscriptteruggevonden.Na24uurwerdennog steeds dezelfde transcripten gevormd als na 17 uur voor zowel het wild type als de luxUp enluxDownmutanten.

qPCR-analyse

EenqPCRwerdeveneensuitgevoerdopPseudomonassp.CMR5comhetaantalkeerdatdetranscriptenwerdenafgeschreventebepalen.DeconcentratievanhetcDNAwordtweergegeveninTabelB6.Vooralle genen waren de primers in orde aangezien de dissociatiecurves goed waren. Deze wordenweergegeveninFiguurB1.Figuren18en19gevendeqPCR-waarderespectievelijkvoor17uuren24uurrespectievelijk.HiervoorwerdendeCt-waardenvanhethousekeepinggenrpoDafgetrokkenvandeCt-waardevanhetstaal.VervolgenswerdgekalibreerdtenopzichtevanhetwildtypezodatdeqPCR-waarde van het wild type telkens naar één werd herleid. De getabelleerde waarden wordenweergegeveninTabelB7.Hetvaltopdatna17uurde luxUpenvoornamelijkde luxDownmutanteneenverhoogdeexpressievertoondenvanmacB.Destijgingvanexpressieverdweendanweerna24uurwaardeexpressievanzowelmacA,macBalsluxDownindeluxUpenluxDownmutantendaalde.

Figuur17.TranscriptioneleanalysevandeorfamidebiosyntheseclustervanPseudomonassp.CMR5cenluxUpenluxDownmutantenna17uuren24uuropgroeieninLB-vloeistofop28°C.Deexpressiewashetzelfdena17uuren24uurenwordenindefiguuralséénweergegeven.

Wildtype

ΔluxUp

ΔluxDown


Pseudomonassp.CMR5c


41

5.2.2DiscussieIn plant-pathogene Pseudomonas species zijn enkele regulatiemechanismen bekend die CLP-biosynthesereguleren.HetGacS/GacAtweecomponentensysteemiszo’neersteregulatiemechanismeaangezieneenmutatieinéénvandetweegenenresulteertinhetverliesvanCLP-productie(deBruijnetal.,2007;deBruijnetal.,2008;Dubernetal.,2005;Kittenetal.,1998;Luetal.,2002b).Quorum

Figuur18.2-ΔΔCtwaardenvanqPCR-analysevanPseudomonassp.CMR5cna17uuropgroeiengekalibreerdtenopzichtevanwildtype.

Figuur19.2-ΔΔCtwaardenvanqPCR-analysevanPseudomonassp.CMR5cna24uuropgroeiengekalibreerdtenopzichtevanwildtype.

0

3

6

9

12

15

18

21

24

MacA MacB LuxDown

Relatie

veexpressie(2

-ΔΔC

t )

q-PCRPseudomonas sp.CMR5c17uur

CMR5c CMR5c-ΔluxUp CMR5c-ΔluxDown

0

3

6

9

12

15

18

21

24

MacA MacB LuxDown

Relatie

veexpressie(2

-ΔΔC

t )

q-PCRPseudomonas sp.CMR5c24uur

CMR5c CMR5c-ΔluxUp CMR5c-ΔluxDown


42

sensingiseentweedemechanismedatdebiosynthesevaneenaantalCLP’skanreguleren(Cuietal.,2005;Dubernetal.,2006).EenderdemechanismezijndeluxR-typetranscriptieregulatorgenen.EenmutatieindezegenenzorgteveneensvoorhetverliesvanCLP-productie(Bertietal.,2007;deBruijnandRaaijmakers,2009a;Dubernetal.,2005;Dubernetal.,2008;Maetal.,2016;Vallet-Gelyetal.,2010; Wang et al., 2006). De luxR-type regulatorgenen behoren ofwel tot het GacS/GacA tweecomponentensysteemofwelwordenzegeactiveerdviaquorumsensing.Insommigegevallenbehorenzetotgeenvanbeidegroepen(deBruijnandRaaijmakers,2009a).OokbestaaneranderemechanismendiedeluxR-typeregulatorgenenkunnenbeïnvloeden.ZokannamelijkdeClpPproteasedeluxR-typeregulatorgeneninP.fluorescensSS01voormassetolideproductiebeïnvloeden(Songetal.,2015).OokhetGidAgenspeeltwaarschijnlijkeenrolinderegulatievanluxR-typeregulatorgensalAinP.syringae(KinscherfandWillis,2002).De orfamide biosynthesecluster, van alle orfamide producerende Pseudomonas species, bevateveneens twee luxR-type regulatoren, namelijk het luxUp gen dat zich voor de orfamidebiosynthesegenenbevindtenhetluxDowngendatzichachterdeorfamidebiosynthesegenenbevindt(D’aesetal.,2014;Maetal.,2016).Deregulatorischerolvan luxUpen luxDown inPseudomonassp.CMR12awerdreedsaangetoond(datanognietgepubliceerd).MutanteninluxUpofluxDownverliezennamelijkdeaanmaakvanorfamide.

Druppelinzaktest,Swarmingtest&HPLC-MS-analyse

OmderolvandetweeLuxRregulatoreninPseudomonassp.CMR5ctebekijkenwerdenverschillendetesten uitgevoerd. Een druppelinzaktest (Figuur 13), swarmingtest (Figuur 14) en HPLC-MS-analyse(Figuur15)toondenaandatorfamidenietmeergeproduceerdwordtdoordeluxUpenluxDownmutant.LuxUp en luxDown in Pseudomonas sp. CMR5c blijken dus orfamide te reguleren net zoals inPseudomonassp.CMR12a.Uitdeoptischedensiteitanalyse(Figuur16)wordtvastgestelddatdeluxUpenluxDownmutantensnellergroeiendanhetwildtype.DitkomtwaarschijnlijkdoordatdeluxUpenluxDownmutantenhunenergienietmoetenstekeninhetaanmakenvanorfamidewaardoorzehunenergie kunnen gebruiken om te groeien en te reproduceren. Deze metabolische belasting is welaanwezigbijhetwildtypeenzorgtdanvooreentrageregroeiinvergelijkingmetdemutanten(VanDenBroeketal.,2005;DeLeijetal.,1998).

RT-PCR-analyse

Via een RT-PCR-analyse kon bepaald worden welke genen werden afgeschreven door de luxUp enluxDownmutanten. IneenvorigonderzoekmetRT-PCR-analysewerdhetwild typeende luxUpenluxDownmutantenvanPseudomonassp.CMR12aonderzocht.DezeresultatenwordenweergegeveninFiguur20.HetblijktdatdeluxUpmutantna17uurtweetranscriptenvormt,ééndatmacB-luxDownomspantmeteenstukjevanmacAenééndatofaBomspant.Na24uurwordendezelfdetranscriptengedetecteerdmeteenextratranscriptvoorhetofaAgen.Pseudomonassp.CMR12ameteenmutatieinluxDowngeeftna17uureentranscriptvanofaBeneentranscriptdatmacAB-luxDownomspant.Ookkomtdeco-expressievan luxUp-ofaAgenenvoor.Na24uur isereentranscriptdatmacABvolledigomspanteneenstukjevanluxDownmaarookeenlangertranscriptdatluxUp-ofaABomspant.DeRT-PCR-analysetoondeaandateenmutatieinofwelluxUpofwelluxDownzorgtvoorhetverliesvanhetlangeenkelvoudige transcript. Tochblijkende luxUp en luxDown genendeexpressievandemacAB


43

genen niet te verstoren wat aantoont dat de regulatiegenen enkel een invloed uitoefenen op debiosynthesegenenennietophetsecretiesysteem.BijPseudomonassp.CMR5cverliezendeluxUpenluxDown mutanten na 17 uur en 24 uur groeien eveneens het lange transcript dat ofaABC-macABomspant(Figuur17).Ditblijktdusderedentezijnvoorhetverliesvanorfamideproductiewatmetdedruppelinzaktest,swarmingtestenHPLC-MS-analysewordtaangetoond.DoordatdeexpressievandemacABgenennietverstoordwordtinéénvanbeidemutantenlijkt luxUpen luxDowngeenpositieveregulatorischeinvloeduitoefenenophetsecretiesysteemnetzoalsbijPseudomonassp.CMR12a.

ReedseerderwerddeaanwezigheidvanantisenseRNA’s(asRNA’s)besproken.DezekomenookvoorbijPseudomonassp.CMR12avoornamelijkbijdemacBen luxDowngenen(Figuur20).Hetaanwezigzijn van co-expressie tussen deze genen bewijst het bestaan van asRNA’s. Er werden nog anderetranscriptengevondenindeluxUpen luxDownmutanten,namelijktranscriptendieofaBomspandenna17uurenofaAenofaBna24uur.De luxDownmutantbevatteookeentranscriptdat luxUp-ofaAomspandenazowel17uurals24uur.DeresultatenvandeHPLC-MS-analysegavennochtansaandatergeenorfamidewerdgevormdentochwerdenkortetranscriptenvandeorfamidegenenaangemaakt.DitsuggereerteveneensdaterasRNA’swerdenafgeschreven.DezeasRNA’sregulerendetranscriptievanhetcomplementairemRNAdoortranscriptieinterferentieoftranscriptieattenuatie(Sestoetal.,2012).Waarschijnlijkwordttranscriptieattenuatiegebruiktwaarbijdetranscriptievroegtijdiggestoptwordt.Dekortetranscriptenzijndanookallichtverantwoordelijkvoordezwakkebandjeszichtbaarinde RT-PCR-analyse aangezien normaal sterke bandjes worden waargenomen indien een gen totexpressiekomt. Inhetwild typevanPseudomonassp.CMR12awerdendezekortetranscriptenniet

Figuur20.(Vorigonderzoek)TranscriptioneleanalysevandeorfamidebiosyntheseclustervanPseudomonassp.CMR12aenluxUpenluxDownmutantenna17uuren24uuropgroeien(datanognietgepubliceerd).


Pseudomonassp.CMR12a

17u24u


Wildtype

ΔluxUp

ΔluxDown

Wildtype

ΔluxUp

ΔluxDown


44

waargenomen.Dochwordtvermoeddatzewelaanwezigwarenmaargemaskeerdwerdendoordereeds aanwezige transcripten. RT-PCR-analyse van Pseudomonas sp. CMR5c toonde aan dat erwaarschijnlijkookasRNA’svoorkomentijdensdetranscriptievandeorfamidebiosyntheseclustervandeluxUpenluxDownmutanten(Figuur17).Immers,erwerdenofaA-ofaBtranscriptenenofaC-macAtranscriptengevormd.OokhierzorgdetranscriptieattenuatiewaarschijnlijkvoordekortetranscriptenendusdezwakkerebandenzichtbaarindeRT-PCR-analyse.

qPCR-analyse

DekwantificatievandeexpressievandemacA,macBenluxDowngeneninPseudomonassp.CMR5cenluxUpenluxDownmutantenkanbekekenwordenmetdeqPCR-analyse(Figuren18en19).Na17uurblijkendemutanteneenhogereexpressievanmacBteregulerenvoornamelijkbijdeluxDownmutant.LuxUpenluxDownblijkendeexpressievanmacBdanwelnietpositiefteregulerenmaarwelnegatief.AangeziendemacBexpressiestijgtwanneerhetluxUpofluxDowngennietaanwezigisonderdruktdeLuxUpofLuxDownbijaanwezigheiddezeverhoogdeexpressie.DeluxR-typeregulatorgenentredendusop als transcriptionele repressors van macB. luxR-type regulatorgenen die als transcriptionelerepressors dienen in plaats van transcriptionele activatorsworden slechts teruggevonden in enkelebeschrevensystemen.ZofunctioneerteenluxR-typeregulatorgeninrecombinanteEscherichiacolialsN-Acylhomoserinelactone(AHL)-afhankelijkrepressorvandelacZpromotor(EglandandGreenberg,2000). AHL’s zijn signaalmoleculen die voorkomen in tal vanGram-negatieve bacteriën die quorumsensing kunnen induceren (FuquaandGreenberg, 1998).De repressor inE. coli blijkt dusonderdecontrole te staanvanquorumsensing. InBrucellaabortus 2308 isdeLuxR-type regulatorBabReenrepressorvanhetvirBgendatcodeertvoorhettypeIVsecretiesysteem(Caswelletal.,2012).HetLuxRhomoloogEsaRinPantoeastewartiisubspeciesstewartiiiseveneenseenrepressorvandeproductievanextracellulairepolysacharidestewartan(vonBodmanetal.,1998).Zoalseerdervermeldstaatderegulatievandesecretiegenen inPseudomonassp.CMR5cwaarschijnlijknietondercontrolevandeluxR-typeregulatorgenen.MacAenmacBwordenvermoedelijkdooranderegenengereguleerd.TochishetmogelijkdatdeexpressievanhetmacBgeninhetwildtypewordtonderdruktdoordatdeluxR-type regulatorgenen repressor proteïnen aanmaken die binden op de promotor vanmacB. DezerepressorproteïnenbindendanwaarschijnlijknietaandepromotorvanmacAaangeziengeenverschilinexpressiewordtwaargenomeninde luxUpof luxDownmutanttenopzichtevanhetwildtype.DePseudomonassp.CMR5cluxUpenluxDownmutantzoudendanmindertotgeenrepressorproteïnenmeeraanmaken,zodathetmechanismedatdesecretiegenenregulerenvolledigecontrolekrijgt.Na24uurwordtmacBterugmindertotexpressiegebrachtindeluxUpenluxDownmutanten.Ditkantewijtenzijnaandepromotordieminderactiefwordtzodaterminderregulatieoptreedt(LiandZhang,2014).EenandereredenkanzijndatandererepressorproteïnenwordenaangemaaktdiedeafschrijvingvanmacBinhibeert.HetvaltopvoorbeidetijdspunteninPseudomonassp.CMR5cdatluxDownnogsteedstotexpressiewordtgebrachtindeluxDownmutant.OokwordtluxUpafgeschrevenindeluxUpmutantna 24 uur opgroeien. Dit zou niet mogelijk mogen zijn aangezien de luxDown en luxUp genenrespectievelijk niet aanwezigwaren.Waarschijnlijkwerdeen ander stukjeDNAgeamplificeerddoorcontaminatie vandeMasterMixofdoor aspecifiekeprimers.Deze transcripten zijn slechts in kleinemateaanwezigenkunnenbijgevolgwordenverwaarloosd.


45

5.2.3ConclusieDeluxR-typeregulatorenluxUpenluxDownstaaninvoorderegulatievanorfamideinPseudomonassp.CMR5c.Mutanten in één van deze genenmaken namelijk geen orfamidemeer aan. Doordat dezemutantenhunenergienietmoetengebruikenvoordeaanmaakvanorfamide,kunnenzehunenergiegebruiken om te groeien en reproduceren. Orfamide biosynthesegenen worden niet langerafgeschrevenmaardesecretiegenenlijkennogsteedstotexpressietekomenindeafwezigheidvanderegulatiegenen. Een qPCR-analyse toonde echter aan dat de regulatiegenen toch een invloed uitoefenenophetsecretiegenmacB.DitgenwordtwaarschijnlijknegatiefgereguleerddoorLuxUpen/ofLuxDowndoordatdezealstranscriptionalerepressorsoptreden.InPseudomonassp.CMR12amakenzowel hetwild type als luxUpen luxDownmutantenasRNA’s aan.Hetwordt verwachtdat ermeerasRNA’saangemaaktwordeninhetwildtypedanaangegeven.DezezijnwaarschijnlijkgemaskeerddoordereedsaanwezigetranscriptenwaardoorzenietgeobserveerdkunnenwordenmetRT-PCR-analyse.OokPseudomonassp.CMR5cblijkenasRNA’saantemakendieinhetwildtypewaarschijnlijkeveneensgemaskeerdwordendoordereedsaangemaaktetranscripten.

5.3Secretievanorfamide

5.3.1ResultatenDesecretievanorfamidewerdonderzochtinPseudomonasspeciesCMR12a,CMR5cenPseudomonasprotegens Pf-5. In Pseudomonas sp. CMR12a werd het wild type en de nodT en oprMmutantenonderzocht en in Pseudomonas sp. CMR5c werd het wild type en de oprM en cmeC mutantenonderzocht,daardezemutantenreedswarenaangemaakt. InP.protegensPf-5werdenkelhetwildtype bestudeerd daar geenmutantenwaren aangemaakt. Verschillende testenwerden uitgevoerd,namelijkdedruppelinzaktest,swarming,HPLC-analyseenheteffectvaninhibitorenwerdbestudeerd.

5.3.1.1PseudomonasspeciesCMR12a

Swarmingtest

OmdeinvloedvandebuitenstemebraanproteïnenNodTenOprMvanPseudomonassp.CMR12atebestuderenwerdeensnelleswarmingtestuitgevoerd.DeresultatenhiervanwordenweergegeveninFiguur21.HetverwijderenvanhetoprMgenzorgdeervoordatdebeweegbaarheidvandebacterietoenam.

Figuur 21. Swarmingtest voor Pseudomonas sp. CMR12a en nodT, oprM en nodT-oprM mutanten na 24 uuropgroeienvanbacteriënopLB-mediummet0,6%agaraan28°C.

CMR12aΔnodTΔoprMΔnodT-oprM


46

Swarmingtestmetinhibitoren

Om het secretiesysteem verder te bestuderen werd gebruik gemaakt van inhibitoren diesecretiepompenkondeninhiberen.Tabel11geeftnogeenseenkortoverzichtweervandegebruikteinhibitorenenhunactiviteit.

Met swarmingtesten konbekekenworden inwelkemate de inhibitoren effect haddenop het naarbuitenbrengenvanorfamide.DeinhibitorenwerdentoegevoegdvoorhetopgroeieninvloeibareLB-culturen.Decellengroeiden24uuropenwerdenwerdengebruiktvoordeswarmingtest.Na17uurwerdenderesultatenbekeken.Defoto’svandeswarmingplatenwordenweergegeveninFiguur22.Dediameterwaarden van de swarmingzones werden opgemeten en de gemiddelde waarden wordenweergegeven in Tabel 12. Allereerst werden swarmingtesten uitgevoerd waar 1µL DMSO werdtoegevoegdinplaatsvaninhibitoromnategaanofDMSOeentoxischeffecthadopdecellen.Erwerdechter geen verschil waargenomen tussen de swarmingresultatenmet en zonder DMSO (data nietweergegeven).De resultatenmakenduidelijkdatPseudomonassp.CMR12aniet veeldoorheenhetmedium beweegt. OprM mutant en nodT-oprM dubbelmutant vertoonden wel een groterebeweegbaarheid.WanneerCCCwerdtoegevoegdwerdendeH+-pompengeïnhibeerdwataanleidinggaftoteenhogerebeweegbaarheidinhetwildtypeendenodT-oprMmutantaangezieneensignificantpositiefeffectwerdwaargenomen.DeNOV-inhibitorzorgdevooreen lagerebeweegbaarheid inhetwildtypeendeoprMmutantdaareensignificantnegatiefeffectwerdwaargenomen.DetoevoegingvandeGLB-inhibitorbijhetwildtypeendenodTmutanthadeensignificantnegatiefeffectterwijlhetbij deoprM ennodT-oprMmutanten zorgde vooreen significantpositief effect enduseengroterebeweegbaarheid.TabelB8geeftweerwatdeinvloedvandemutantenisbijelkebehandeling.InhetexperimentzonderinhibitorendedriebehandelingenmetinhibitorzorgenzoweldenodTmutantalsde oprM mutant als de nodT-oprM dubbelmutant voor een significante stijging van deswarmingbeweegbaarheid. Enkel bij de behandeling met CCC verliest de nodT mutantswarmingbeweegbaarheidtenopzichtevanhetwildtype.

Tabel11. Inhibitorengebruikt tijdens swarmingtestdiebepaalde soortenpompen inhiberen. ‘*’,NOVenGLBinhiberenelkandereATP-pompen.Inhibitor Inhibitie

Carbonylcyanide3-chlorophenylhydrazone(CCC) H+-pomp

Natriumorthovanadaat(NOV) ATP-pomp*

Glybenclamide(GLB) ATP-pomp*


47

Figuur 22. Swarmingtest resultaten van Pseudomonas sp. CMR12a en mutanten en met drie verschillendeinhibitoren: Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCC), natriumorthovanadaat (NOV) en glybenclamide(GLB).Inhibitorenwerdentoegevoegdaaneenconcentratievan25μM,1mMen10μMrespectievelijkwaarnadevloeibarebacteriecultuuropgroeidevoor24uur.‘ɸ’,gemiddeldediameterwaarde.

CMR12a+CCC+NOV+GLB

CMR12a-nodT+CCC+NOV+GLB

CMR12a-oprM+CCC+NOV+GLB

+CCC+NOV+GLB CMR12a-nodT-oprM

ɸ1,25ɸ3,30ɸ1,10ɸ1,05

ɸ1,45ɸ1,65ɸ1,25ɸ1,20

ɸ3,35ɸ3,38ɸ1,68ɸ4,20

ɸ1,70ɸ4,55ɸ1,40ɸ4,35


48

5.3.1.2PseudomonasspeciesCMR5c


DedruppelinzaktestwerdeveneensuitgevoerdbijdeoprMencmeCmutantenvanPseudomonassp.CMR5c.HetresultaatwordtweergegeveninFiguur23entoontaandatdedruppelsbacteriecultuurvanhet wild type, oprM mutant, cmeC mutant en oprM-cmeC dubbelmutant hun oppervlaktespanningverloreneninelkaarzakten.Deswarmingtest,weergegeveninFiguur24,bevestigtderesultatenvande druppelinzaktest. Het wild type en de mutanten bewogen doorheen het medium doordat zeorfamideaanmaakten.

Tabel12.SwarmingtestresultatenvanPseudomonassp.CMR12aenmutantenmetdrieverschillendeinhibitoren:Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCC), natriumorthovanadaat (NOV) en glybenclamide (GLB). μ,gemiddelde;σ,standaardafwijking;%RSD,relatievestandaardafwijking;p-waardevandeMann-WhitneyTestmetsignificantieniveau5%metalsnulhypothesedatdebehandelingmetinhibitor(CCC,NOVofGLB)gelijkisaandebehandelingzonderinhibitor;%Effect,stijgend(+)ofdalend(-)effectvandeinhibitortenopzichtevandebacteriezonderinhibitor.Devetgedruktewaardenin%Effect-kolomzijnsignificantophet5%significantieniveau.Behandeling μ(cm) σ(cm) %RSD p-waarde %Effect

CMR12a 1,25 0,05 4% CMR12a+CCC 3,30 0,30 9% 0,029 164%CMR12a+NOV 1,10 0,00 0% 0,029 -12%CMR12a+GLB 1,05 0,05 5% 0,029 -16%

CMR12a-nodT 1,45 0,05 3% CMR12a-nodT+CCC 1,65 0,11 7% 0,057 14%CMR12a-nodT+NOV 1,25 0,09 7% 0,057 -14%CMR12a-nodT+GLB 1,20 0,00 0% 0,029 -17%

CMR12a-oprM 3,35 0,46 14% CMR12a-oprM+CCC 3,38 0,23 7% 1,00 1%CMR12a-oprM+NOV 1,68 0,28 17% 0,029 -50%CMR12a-oprM+GLB 4,20 0,17 4% 0,029 25%CMR12a-nodT-oprM 1,70 0,90 53% CMR12a-nodT-oprM+CCC 4,55 0,85 19% 0,029 168%CMR12a-nodT-oprM+NOV 1,40 0,00 0% 1,00 -18%CMR12a-nodT-oprM+GLB 4,35 0,36 8% 0,029 156%

Figuur23.DruppelinzaktestvanPseudomonassp.CMR5cendemutantenvoornodT,oprMennodT-oprM.Voorhetblancostaalwerdwatergebruikt.

BlancoCMR5cΔoprMΔcmeCΔoprM-cmeC


49

HPLC-MS-analyse

HPLC-MS-analyse werd uitgevoerd om te bepalen welke moleculen werden aangemaakt en of demutaties een invloed hadden in de aanmaak ervan. Figuur 25 geeft het chromatogram weer voorPseudomonassp.CMR5cenmutantenna24uuropgroeien.DriegroterepiekenenéénkleinerepiekwerdenzichtbaarbijallemutantennamelijkdepiekenvoororfamideD,E,BenG.OrfamideBwerdsteedshetmeeste aangemaakt.De figuur geeft duidelijkweer dat de cmeCmutantmeer orfamideaanmaakte.Figuur26geeftdeoptischedensiteit(OD)weerna17uur,24uuren48uuropgroeieninLB-vloeistofenTabelB5geeftdegetabelleerdewaardeweer.Na48uurwarenhetwildtype,oprM,cmeCenoprM-cmeCmutantenevenveelaangegroeid.InFiguur27wordtaangetoondhoeveelorfamidewordtaangemaaktonafhankelijkvanhetaantalcellenaanwezigdoordepiekoppervlaktetedelendoorde OD. Tabel B9 geeft de getabelleerde waarden weer. Hiervoor werd de piekoppervlakte bij dechromatogramuitdeHPLC-MS-analysegedeelddoordeoptischedensiteit.Na17uurwerderdoorallebacteriën,zowelwildtypealsmutanten,ongeveerevenveelorfamideaangemaakt.Eenstijgendetrendwaswaartenemenindeaanmaakvanorfamidemetdetijd.Na24uurmaaktedecmeCmutantmeerorfamideaandandeanderen.Na48uurwasereenduidelijketrendzichtbaarwaardecmeCmutanthetmeesteorfamideaanmaaktevervolgensdeoprM-cmeCdubbelmutantendandeoprMmutant.

Figuur24.SwarmingtestvoorPseudomonassp.CMR5cennodT,oprM,nodT-oprM,luxUpenluxDownmutantenna17uuropgroeienvanbacteriënopLBplatenaan28°C.

CMR5cΔoprMΔcmeCΔoprM-cmeC


50

Figuur25.HPLC-MS-analysevanPseudomonassp.CMR5cenmutanten.Destalenvandebacteriënwerdenbereiduithetsupernatansvan24uurgegroeideLB-vloeistofculturen.

Figuur26.OptischedensiteitvanPseudomonassp.CMR5Cenmutanten.Culturenwerden17uur,24uuren48uuropgegroeidinvloeibareLBendeODwerdbepaald.

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

17u 24u 48u

OD

Tijdstip

ODanalyse

CMR5cWT

ΔoprM

ΔCmec

ΔoprM-Cmec

151123 5C - 20

Time0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

151123 5C - 20

Time0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

151123 5C - 20

Time0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40%

0

100

151123 5C - 20

Time0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40

%

0

100

Pseudomonassp.CMR5c

CMR5c-oprM

CMR5c-oprM-cmeC

CMR5c-cmeC

Relatie

veabu

ndantie

(%)

Tijd(s)

E3.36B3.46

G3.78D3.06

E3.30B3.40

G3.74D3.00

E3.34B3.44

G3.78

D3.04

E3.32B3.44

D3.04

G3.80


51


Ook in Pseudomonas sp. CMR5c werden de inhibitors gebruikt om het secretiesysteem verder tebestuderen.Figuur28geeftdefoto’svandeswarmingplatenweerenTabel13geeftdegetabelleerderesultaten.DeresultatentonenaandatbijPseudomonassp.CMR5cdeinhibitorCCCenkelzorgdevooreensignificantegroterebeweegbaarheidindeoprM-cmeCmutant.DeinhibitorNOVzorgdevooreensignificantegroterebeweegbaarheidbehalvebijdeoprM-cmeCdubbelmutantwaarheteensignificantekleinerebeweegbaarheidvertoonde.InhibitorGLBzorgdeenkelvooreensignificantdalendeffectindeoprM-cmeCmutantdaar er eeneffect van -163%werdwaargenomen. TabelB8 geeftweerwatdeinvloedvandemutantenisbijelkebehandeling.Hetexperimentzonderinhibitorgeeftgeensignificanteinvloedvandemutanten.BijdebehandelingmetCCCzorgdedeoprM-cmeCdubbelmutantvooreenstijging vande swarmingbeweegbaarheid tenopzichte vanhetwild type.DebehandelingmetNOVtoondeeensignificanteffectbijzoweldeoprMmutant(12%)alsdecmeCmutant(22%)alsdeoprM-cmeCdubbelmutant(-59%).BehandelingmetGLBzorgdebijdeoprM-cmeCdubbelmutantvooreendalinginswarmingbeweegbaarheid(-60%).

Figuur27.HPLC-MS-analysevanPseudomonassp.CMR5cenmutanten.Depiekoppervlaktenwerdenopgeteldengedeelddoordeoptischedensiteitvandebacteriën.

0E+00

1E+07

2E+07

3E+07

4E+07

5E+07

6E+07

17u 24u 48u

piek/OD

Tijdstip

Piek/ODanalyse

CMR5cWT

ΔoprM

ΔCmec

ΔoprM-Cmec


52

Figuur 28. Swarmingtest resultaten van Pseudomonas sp. CMR5c en mutanten en met drie verschillendeinhibitoren: Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCC), natriumorthovanadaat (NOV) en glybenclamide(GLB).Inhibitorenwerdentoegevoegdaaneenconcentratievan25μM,1mMen10μMrespectievelijkwaarnadevloeibarebacteriecultuuropgroeidevoor24uur.

CMR5c+CCC+NOV+GLB

CMR5c-cmeC+CCC+NOV+GLB

CMR5c-oprM+CCC+NOV+GLB

+CCC+NOV+GLB

ɸ3,88ɸ3,70ɸ2,05ɸ1,48

ɸ4,33ɸ5,00ɸ6,15ɸ3,65

ɸ4,00ɸ4,63ɸ5,65ɸ3,60

ɸ3,95ɸ4,25ɸ5,03ɸ3,70

CMR5c-oprM-cmeC


53

5.3.1.3PseudomonasprotegensPf-5


Figuur29geeftdefoto’svandeswarmingplatenweermetinhibitorenvoorP.protegensPf-5enTabel14geeftdegetabelleerdewaardenweer.HierbijwerdenkelmethetwildtypegewerktdaarergeenmutanteninP.protegensPf-5voorhandenwaren.UitderesultatenblijktdatP.protegensPf-5eengrotebeweegbaarheid had in vergelijking met Pseudomonas sp. CMR12a en CMR5c. De CCC- en GLB-inhibitoren zorgden voor een lagere beweegbaarheid maar deze dalingen zijn niet significant. HetgebruikvandeNOV-inhibitorbrachteengroterebeweegbaarheidmetzichmeediewelsignificantwas.

Figuur 29. Swarming resultaten vanP. protegensPf-5met drie verschillende inhibitoren: Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCC), natriumorthovanadaat (NOV) en glybenclamide (GLB). Inhibitoren werdentoegevoegdaaneenconcentratievan25μM,1mMen10μMrespectievelijkwaarnadevloeibarebacteriecultuuropgroeidevoor24uur.

Tabel13.SwarmingtestresultatenvanPseudomonassp.CMR5cenmutantenmetdrieverschillendeinhibitoren:Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCC), natriumorthovanadaat (NOV) en glybenclamide (GLB). μ,gemiddelde;σ,standaardafwijking;%RSD,relatievestandaardafwijking;p-waardevandeMann-WhitneyTestmetsignificantieniveau5%metalsnulhypothesedatdebehandelingmetinhibitor(CCC,NOVofGLB)gelijkisaandebehandelingzonderinhibitor;%Effect,stijgend(+)ofdalend(-)effectvandeinhibitortenopzichtevandebacteriezonderinhibitor.Devetgedruktewaardenin%Effect-kolomzijnsignificantophet5%significantieniveau.Behandeling μ(cm) σ(cm) %RSD p-waarde %Effect

CMR5c 3,95 0,61 15% CMR5c+CCC 4,25 0,36 9% 0,486 8%CMR5c+NOV 5,03 0,18 4% 0,029 27%CMR5c+GLB 3,70 0,52 14% 0,486 -6%CMR5c-oprM 4,00 1,16 29% CMR5c-oprM+CCC 4,63 0,18 4% 0,114 16%CMR5c-oprM+NOV 5,65 0,11 2% 0,029 41%CMR5c-oprM+GLB 3,60 0,10 3% 0,343 -10%CMR5c-cmeC 4,33 0,58 13% CMR5c-cmeC+CCC 5,00 0,24 5% 1,00 16%CMR5c-cmeC+NOV 6,15 0,35 6% 0,029 42%CMR5c-cmeC+GLB 3,65 0,35 10% 1,00 -16%CMR5c-oprM-cmeC 3,88 0,59 15% CMR5c-oprM-cmeC+CCC 5,23 0,48 9% 0,029 35%CMR5c-oprM-cmeC+NOV 2,05 0,15 7% 0,029 -47%CMR5c-oprM-cmeC+GLB 1,48 0,28 19% 0,029 -62%

Pf-5+CCC+NOV+GLB

ɸ4,65ɸ3,70ɸ5,83ɸ4,30


54

Behandeling μ(cm) σ(cm) %RSD p-waarde %Effect

Pf-5 4,65 0,85 18%

Pf-5+CCC 3,70 0,10 3% 0,114 -20%

Pf-5+NOV 5,83 0,18 3% 0,029 25%

Pf-5+GLB 4,30 0,10 2% 1,000 -8%

5.3.2DiscussiePseudomonasspecieskunnenverschillendesecretiesystemenbevatten.ZobevatP.aeruginosaRND-type-effluxpompenwaaronderhetMexAB-OprMsysteem(Kourtesietal.,2013).DitwelbeschrevensysteemisverantwoordelijkvoorhetnaarbuitenpompenvanantibioticazodatP.aeruginosahiertegeneen hoge resistentie bevat (Li et al., 1995). Type I secretiesystemen komen ook veel voor inPseudomonas species. Deze bestaan net als de RND-effluxpompen uit een binnenstemembraancomponent,eenperiplasmaadaptorproteïneeneenbuitenstemembraankanaal(Costaetal.,2015).HetMacABsecretiesysteemiseenvoorbeeldvaneentypeIsecretiesysteemenkomtvoorintalvanPseudomonasspecies(deBruijnetal.,2008;ChoandKang,2012;Dubernetal.,2008;Limetal.,2009; Olorunleke et al., 2007). Hierbij isMacB een ABC-type effluxpomp dat zich in het binnenstemembraanbevindtenMacA isdeperiplasmaproteïnediegebonden isaanMacB (Kobayashietal.,2001). Wanneer een buitenste membraanproteïne bindt aan het MacAB-systeem vormt deze eenfunctioneeltypeIsecretiesysteem(Costaetal.,2015).IndeorfamidebiosyntheseclusterbijdeorfamideproducerendePseudomonasspeciesbevindendezesecretiegenen zich net achter deorfamide cluster en juist voor de LuxR-Down regulator (Maet al.,2016).DemeesteorfamideproducerendePseudomonasspeciesbevattenookeennodTgendatzichvoor de orfamide biosynthesecluster bevindt. Dit gen schrijft een buitenste membraanproteïne af.Pseudomonas sp.CMR12a,CMR5cenCMAA1215bevattenditnodT genechterniet indeorfamidebiosynthesecluster(Maetal.,2016;Olorunlekeetal.,2007).Pseudomonassp.CMR12abevatweleenhomoloogvannodTinhetgenoomnamelijkindesessilinebiosynthesecluster(D’aesetal.,2014).EentweedebuitenstemembraanproteïneOprMwordtnormaal samenmethetMexAB secretiesysteemgebruikt(Lietal.,1995).ZowelhetNodTproteïnealshetOprMproteïnekunnensamenwerkenmetMacABomeenfunctioneelsecretiesysteemtevormen,zodatorfamideuitdecelkanwordengepompt(data nog niet gepubliceerd). Pseudomonas sp. CMR12a en CMR5c bevatten een cmeC gen dathomologievertoontmetdebuitenstemembraanproteïnen.Hetzouverantwoordelijkkunnenzijnvoorde aanmaak van een andere buitenstemembraanproteïne CmeC dat eveneens helptmet het naarbuitenpompenvanorfamide(datanognietgepubliceerd).

Tabel14.SwarmingtestresultatenvanP.protegensPf-5metdrieverschillendeinhibitoren:Carbonylcyanide3-chlorophenylhydrazone (CCC), natriumorthovanadaat (NOV) en glybenclamide (GLB). μ, gemiddelde; σ,standaardafwijking; %RSD, relatieve standaardafwijking; p-waarde van de Mann-Whitney Test metsignificantieniveau5%metalsnulhypothesedatdebehandelingmetinhibitor(CCC,NOVofGLB)gelijkisaandebehandelingzonderinhibitor;%Effect,stijgend(+)ofdalend(-)effectvandeinhibitortenopzichtevandebacteriezonderinhibitor.Devetgedruktewaardenin%Effect-kolomzijnsignificantophet5%significantieniveau.


55

5.3.2.1PseudomonasspeciesCMR12a

HPLC-MS-analyse

IneenvoorgaandeHPLC-MS-analysemetPseudomonassp.CMR12awerdduidelijkdateenmutatieinoprMervoorzorgtdateengroterehoeveelheidorfamidebuitendecelwordtgebracht.Eendubbelemutatie inzowelnodTalsoprM zorgtvooreennoggroterehoeveelheidorfamidedatbuitendecelwordtgebracht.Deze resultatenzijn zichtbaarna41uuropgroeienvandebacteriën (datanognietgepubliceerd).DeswarmingtestvoorPseudomonassp.CMR12a(Figuur21)bevestigtdezeresultaten.De oprM mutant zorgt voor een grotere hoeveelheid orfamide die naar buiten wordt gebracht invergelijkingmethetwildtype.OokdedubbelemutantnodT-oprMbrengtmeerorfamidebuitendeceldanhetwildtype.Teneerstemoetgemeldwordendatindedubbelemutantgeensessilinemeerwordtgeproduceerd(datanognietgepubliceerd).SessilinegebruikthetMexAB-OprMsysteemenhetMacAB-NodTsysteemomdecelteverlaten.BijuitschakelenvannodTenoprMwordtgeensessilinemeernaarbuiten gebracht. Hierdoor is het zichtbare swarmingpatroon in de nodT-oprM mutant helemaal tewijten aan de aanmaak van orfamide. Ten tweede toont dit aan dat er andere buitenstemembraanproteïnenzijndieorfamidebuitendecelkunnenbrengenaangezienindedubbelemutantzowelnodTalsoprMzijnuitgeschakeldenertocheengrotehoeveelheidorfamidebuitendecelwordtgebracht. Ten derdemoet opgemerkt worden dat ermeer orfamide buiten de cel wordt gebrachtwanneeréénofbeidebuitenstemembraanproteïnenafwezigzijnenvoornamelijkbijdeafwezigheidvanOprM.EenverklaringhiervoorzoukunnenzijndateenanderepompwordtgeactiveerddieactieverisdanNodTofOprM(Daugelaviciusetal.,2010).


Om de pompsystemen dieper te bestuderen werd een swarmingtest uitgevoerd waarbij gebruikgemaakt werd van inhibitoren namelijk carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCC),natriumorthovanadaat(NOV)englybenclamide(GLB)(Tabel12).CCCkaninP.aeruginosadeprotonenvandeRND-pompenontkoppelenwaardoorhetmembraanproteïnegeenenergiemeerheeftomtewerken(Pagèsetal.,2005).BijgevolgstaatCCCbekendvoorhetinhiberenvanH+-pompen.DeABC-transporterfamiliedieATPgebruiktomenergieoptewekkenkanopgedeeldwordeninverschillendeklassenwaaronderdesulfonylureareceptoren(SUR),cysticfibrosistransmembranaireregulator(CFTR)endeP-glycoproteïnen(Golsteinetal.,1999).HetisbekenddatNOVkanbindenopP-glycoproteïnenzodathettransportvanmoleculenwordttegengegaan(Horioetal.,1988;Urbatschetal.,1995).GLBkanreagerenmetSURenCFTRzodatdewerkingvandepompeneveneensgeïnhibeerdworden.OokkanGLBsommigeP-glycoproteïneninhiberen(Golsteinetal.,1999).NOVenGLBkunnenmetanderewoorden elk andere ATP-pompen inhiberen. De swarmingresultaten met inhibitoren kunnenweergevenwelkepompenhetmeestvanbelangzijninhetnaarbuitenpompenvanorfamide.Hetwildtype Pseudomonas sp. CMR12a maakt buiten orfamide ook sessiline aan wat de kleineswarmingbeweegbaarheidverklaart.Sessilineblokkeertimmersdeactiviteitvanorfamide(D’aesetal.,2014).DezesessilinegebruiktzowelhetMexAB-OprMsysteemalshetMacAB-NodTsysteemomdecelte verlaten (data nog niet gepubliceerd). Toevoeging van CCC aan het wild type Pseudomonas sp.CMR12abrachteenenormestijgingvanswarmingbeweegbaarheidmetzichmee.HieruitblijktdatdeH+-pompOprMhetmeest verantwoordelijk is voorhetnaarbuitenbrengenvan sessiline.Wanneersessiline grotendeels wordt geblokkeerd heeft orfamide immers meer vrij spel en activeert het


56

swarmingbeweegbaarheid. Wanneer NOV of GLB wordt toegevoegd en ATP-pompen wordengeblokkeerd treedt een significante daling op van de beweegbaarheid wat doet vermoeden datorfamideminderuitdecelgeraakt.DePseudomonassp.CMR12anodTmutantvertoonteenhogereswarmingbeweegbaarheid ten opzichte van het wild type. Dit heeft eveneens te maken met hetblokkerenvansessilinewaardoororfamidezijnactiviteitkanuitvoeren.EnkelhettoevoegenvanGLBaandenodTmutantvertoonteensignificantedalingwateroplijktdatorfamidebepaaldeATP-pompengebruikt omde cel te verlaten.Demutatie vanoprM zorgt voor eenhogebeweegbaarheidwatdevoorgaandehypothesebevestigtdatsessilinevoornamelijkdeH+-pompOprMgebruiktomdecel teverlaten.IndienOprMgeblokkeerdis,doortoevoegenvanCCC,ofnietaanwezigis,indeoprMmutant,wordtnamelijkmeerorfamidebuitendecelgebracht.ToevoegenvanNOVenGLBaandeoprMmutantgevenverschillenderesultaten.NOVzorgtvooreensignificantedaling(-50%)terwijlGLBzorgtvooreensignificante stijging (25%) wat doet vermoeden dat NodT een ATP-pomp is die door GLB wordtgeïnhibeerdmaarnietdoorNOV.OrfamidegebruiktduswaarschijnlijksommigeATP-pompenomdecelteverlatenenandereniet.DenodT-oprMmutantmaaktgeensessilinemeeraanwaardoorenkelnaardesecretievanorfamidekanwordengekeken.Deverhoogdeswarmingbeweegbaarheidmethetwild type isdan teverklarendoordatgeensessilinewordtgevormdenorfamidevrij spelheeft.Hetblokkeren van alle H+-pompen of bepaalde ATP-pompen zorgt echter voor een significante stijging(168%doorCCCen156%doorGLBrespectievelijk)inswarmingbeweegbaarheid.Hetkanzijndathetblokkeren vanbepaaldepompen zorgt voorde activatie van anderenpompen (Daugelavicius et al.,2010).Ook kanhet gebruik vande inhibitor ervoor zorgendateenpompnietwordt gedeactiveerd(Broounetal.,1999;Sunetal.,2014).Hetkannamelijkzijndaterrepressorproteïnenbestaandieeenpompdeactiveren.DoorgebruiktemakenvantoxischecomponentenzoalsCCCkunnendezebindenaan de repressorproteïnen waardoor de pomp niet wordt gedeactiveerd. De swarmingresultatenkunnenookopeenanderemanierbekekenwordennamelijkdoordebehandelingensamentezettenen de invloed van de mutanten op het wild type te bekijken in elke behandeling (Tabel B8). Eensignificante stijging van swarmingbeweegbaarheid in de mutanten wordt waargenomen in elkebehandelingtenopzichtevanhetwildtypebehalvebijdeCCCbehandelingwaardenodTmutanteendalingvertoonttenopzichtevanhetwildtype.Dooropdezemaniernaarderesultatentekijkenwordtopnieuwvastgestelddathetafwezigzijnvanéénofbeidebuitenstemembraanproteïnenzorgtvoormeersecretievanorfamide.WanneerH+-pompenwordengeïnhibeerdheefthetafwezigzijnvandeNodTbuitenstemembraanproteïnenochtanseendalendeffectinswarmingbeweegbaarheid.Ditkanzijn doordat NodT een grote functie vervult in het naar buiten pompen van orfamide. Een anderevaststelling is dat het inhiberen van sommige pompen een invloed heeft op de mate waarin demutanten orfamide secreteren. Namelijk wanneer de H+-pompenworden geïnhibeerd zal de oprMmutant niet veel meer orfamide naar buiten brengen dan het wild type. Wanneer bepaalde ATP-pompenwordengeblokkeerdzaldeoprMmutantechterveelmeerorfamidebuitendecelbrengendanhetwildtype.Combinatievangeblokkeerdeenafwezigepompengevenandereeffectenwaardoorhetsecretiesysteemcomplexerisdaneerstverwacht.Verderonderzoekisnodigomditsecretiesysteeminzijn geheel te ontrafelen. Een bijkomende opmerkingmoet gemaaktworden over de variatie in deswarmingtestenwaardooreenverschilnietalssignificantkanwordenbeschouwd.Dezevariatiekantewijtenzijnaandesamenstellingvanhetmediumen/ofaeratietijdenshetopgroeienvandebacteriën.DepompactiviteitbijP.aeruginosaisnamelijkafhankelijkvandezetweefactoren(Daugelaviciusetal.,2010).HetzoudaarominPseudomonassp.CMR12aeveneensmogelijkgeweestzijndathetmediumen/ofaeratieeenrol spelen indepompactiviteit.Deconditiesvandeexperimentenwarendanwel


57

dezelfde toch zouden kleine verschillen een groot effect kunnenhebbenopdepompactiviteit.Ookwordendebacteriënnacentrifugatieopgelostinnormalesalineoplossingomeenisotoneomgevingtebehouden. Deze normale saline oplossing zou echter zoutstress teweeg kunnen brengenwaardooreveneensvariatieinswarmingbeweegbaarheidkanoptreden(LoNostroetal.,2005).

5.3.2.2PseudomonasspeciesCMR5c


OmhetsecretiesysteeminPseudomonassp.CMR5cnadertebezienwerdentalvantestenuitgevoerdmet hetwild type enoprM, cmeC enoprM-cmeCmutanten.Hetwerkingsmechanisme van cmeC ishierbij nog niet bekend. Een eerste test is de druppelinzaktest (Figuur 23) die aantoont dat debacterieculturen van alle mutanten inzakken en dus orfamide blijven produceren. Deze resultatenworden bevestigd met de swarmingtest (Figuur 24) waarbij alle mutanten eenswarmingbeweegbaarheidvertonen.Orfamidewordtdusnogsteedsgeproduceerddoorbacteriënmetmutaties indebuitenstemembraanproteïnen.Eenverschil tussendemutanten isechternietop temerken.Eenswarmingtestgeeftdebacteriënechtermaar17uuromoptegroeienwatonvoldoendekanzijnomeenverschilwaartenemeninswarmingbeweegbaarheidtussendemutanten.

HPLC-MS-analyse

Om de orfamide secretie op verschillende tijdspunten te bekijken werd een HPLC-MS-analyseuitgevoerdvoor17uur,24uuren48uur.DezebevestigtdatallemutantenorfamideaanmakendaarzetelkensdevierpiekenvanhetwildtypebevattennamelijkpiekenvoororfamideB,D,EenG(Figuur25).DepiekvoororfamideFistelkenstekleinomwaartenemen.Deoptischedensiteitanalyse(Figuur26)toontaandatdecmeCmutanthetsnelstgroeitna17uurmaardatna48uurallemutantenenhetwildtypeeenongeveerevengroteceldensiteitbevatten.ErwordtvermoeddathetaanmakenvandebuitenstemembraanproteïneCmecmeerenergie vergt inhetbegin vandegroei. IndienCmecniethoeftaangemaakttewordenkandezeenergiegebruiktwordenindegroei,ontwikkelingenreproductievandecellen(VanDenBroeketal.,2005;DeLeijetal.,1998).Depiek/OD-analysevanPseudomonassp.CMR5c(Figuur27)toontna17uurgroeiengeenverschilwatooktezienismetdeswarmingtest.Na24uurwordtnochtanseenverschilwaargenomendaardecmeCmutantmeerorfamidenaarbuitenbrengt.Na48uurishetverschilnogduidelijkerenbrengtdeoprMmutantmeerorfamidebuitendeceldanhetwildtype.DeoprM-cmeCdubbelmutantbrengtnogmeerorfamideinhetextracellulairmilieuen de cmeC mutant brengt het meeste orfamide naar buiten. Wanneer één of beide buitenstemembraanproteïnenafwezigzijnwordtdusmeerorfamidebuitendecelgebrachttenopzichtevanhetwildtype.ZoalseerderbesprokenbijPseudomonassp.CMR12azouookhierderedenkunnenzijndatin de afwezigheid van bepaalde pompen andere pompenworden geactiveerd (Daugelavicius et al.,2010).


OmhetpompsysteemietsdieperteonderzoekenwordenookinswarmingtestenvanPseudomonassp.CMR5cinhibitorsgebruikt(Tabel13).HierbijlijktenkelNOVsteedseensignificanteinvloedtehebbenopdeswarmingbeweegbaarheidvanzowelhetwildtypealsdemutanten.NOVzorgterinhetwildtype,de oprM mutant en de cmeC mutant namelijk voor dat de swarmingbeweegbaarheid stijgt. Het


58

blokkerenvanbepaaldeATP-pompenzorgterdusvoordatanderepompenactiefworden;ditkunnenzowelH+-pompenzijnalsandereATP-pompen.WanneerdeH+-pompenindedubbelemutantwordengeïnhibeerdtreedteensignificantestijgingopvanswarmingbeweegbaarheid(35%).HettoevoegenvanNOVenGLBzorgtechtervooreensignificantedalingvanrespectievelijk-47%en-62%respectievelijk.Het uitschakelen van bepaalde ATP-pompen in de afwezigheid van de OprM en Cmec buitenstemembraanproteïnenzorgtvooreenverliesinpompactiviteit.HieruitblijktdatofweloprMofwelcmeCnodig is om andere pompen te activeren. Ook hier is het mogelijk dat het gebruik van toxischecomponentenervoorzorgtdatbepaaldepompennietwordengedeactiveerd(Broounetal.,1999;Sunetal.,2014).Deswarmingresultatenkunnenookhieropeenanderemanierbekekenwordennamelijkdoordebehandelingensamentezettenendeinvloedvandemutantenophetwildtypetebekijkeninelkebehandeling(TabelB8).Bijdebehandelingwaargeeninhibitorwerdgebruiktisergeeneffectwaartenemenvandemutanten.BijdebehandelingmetCCCzorgtdeoprM-cmeCdubbelmutantvooreenstijging van de swarmingbeweegbaarheid ten opzichte van het wild type. Opnieuw zorgen deafwezigheidvanoprMencmeCvoordeactivatievananderepompen.DebehandelingmetNOVtoonteensignificantestijgingbijzoweldeoprMmutantalsdecmeCmutanteneensignificantedalingbijdeoprM-cmeCdubbelmutant.BehandelingmetGLBzorgtbijdeoprM-cmeCdubbelmutanteveneensvooreen daling in swarmingbeweegbaarheid. Dit wijst erop dat de afwezigheid van oprM en cmeC incombinatie met geblokkeerde ATP-pompen ervoor zorgt dat orfamide minder naar buiten wordtgebracht.DeafwezigheidvanoprMencmeCincombinatiemetdeactivatievanH+-pompenzorgtervoordatmeerorfamidenaarbuitenwordtgebracht.DecombinatievanafwezigeengedeactiveerdepompenzorgtdusookvoorverschillendeeffectennetalsinPseudomonassp.CMR12a.Hetsecretiesysteemlijktdaaromonderinvloedvanmeerderefactorenenismeercomplexdangedacht.Variatiestewijtenaansamenstelling van hetmedium, aeratie en/of zoutstressmoeten ook in het achterhoofd gehoudenworden.DeresultatenvanPseudomonassp.CMR5cvergelijkenmetderesultatenvanPseudomonassp. CMR12a is niet vanzelfsprekend aangezien deze laatste sessiline aanmaakt die dezelfdepompsystemengebruikt.

5.3.1.3PseudomonasprotegensPf-5


DeswarmingtestmetinhibitorenwordteveneensuitgevoerdopP.protegensPf-5waarbijenkelnaarhetwildtypegekekenwordtdaargeenmutantenbeschikbaarwaren(Tabel14).EnkelhettoevoegenvanNOVheefteensignificanteinvloed(25%)opdeswarmingbeweegbaarheid.WanneerbepaaldeATP-pompenwordengeblokkeerdblijktditanderepompenteactiveren (Daugelaviciusetal.,2010).Hetgebruik vanNOV zelf kanookhier ervoor zorgendat bepaaldepompennietworden gedeactiveerd(Broounetal.,1999;Sunetal.,2014).Pseudomonassp.CMR5cenP.protegensPf-5makenbeideenkeldeCLPorfamideaan.Beidewildtypesondergaaneenstijgendeffectinswarmingbeweegbaarheidbijhet toevoegen vanNOV.Het kan zijn dat bepaaldepompsystemen in de twee isolatenopdezelfdemanierwerkenenopdezelfdemanierbeïnvloedworden.Verderonderzoekhieromtrentisnodig.

5.3.3ConclusieDebuitenstemembraanproteïnenNodTenOprMinPseudomonassp.CMR12ahelpenhetorfamidebuitendeceltebrengen.DeafwezigheidvanhetnodTgenblijktnietmeteeneeninvloedtehebbenop


59

dehoeveelheidorfamidediedecelkanverlaten.DitiswaarschijnlijkdoordatsessilinevoornamelijkdeOprMpompgebruiktomdecelteverlaten.Ditsessilineblokkeertvervolgensdeactiviteitvanorfamide.EenmutatieinoprMzorgtdanweerwelvooreenstijgingvanorfamidesecretie.GedeeltelijkdoordateenmutatieinOprMdesessilinesecretiedoetdalen.DeafwezigheidvanzowelnodTalsoprMzorgteveneens voormeer orfamide secretie. Dit sugereert dat de afwezigheid van een bepaalde pomp,anderepompenkanactiveren.NodTenOprMzijnechternietdeenigebuitenstemembraanproteïendie door orfamide gebruikt worden om de cel te verlaten. Het wordt vermoed dat orfamidevoornamelijk bepaalde ATP-pompen gebruikt om de cel te verlaten. Het gebruik van toxischecomponentenzoalsdeinhibitorenkanerookvoorzorgendatpompennietwordengedeactiveerd.Decombinatievangeïnhibeerdeenafwezigepompenkanverschillendeeffectengevenopdehoeveelheidorfamidedie de cel kan verlaten.Pseudomonas sp. CMR5cbevat de buitenstemembraanproteïnenOprMenCmeCdieorfamidehelpennaarbuitenpompen.DeafwezigheidvanhetoprMgenlijkteenkleineroltespelenindehoeveelheidorfamidedatbuitendecelwordtgebracht.NamelijkwanneerOprMafwezigiswordtermeerorfamidenaarbuitengepompt.DemutatieincmeCzorgterduidelijkvoordatmeerorfamidedecelkanverlaten.HetblokkerenvanbepaaldeATP-pompenzorgtervoordatmeerorfamidedecelkanverlatenmaarwanneerhierbovenopOprMofCmeCafwezigiswordtminderorfamideuitdecelgebracht.Ookhierisdecombinatievangeïnactiveerdeenafwezigepompencruciaalvoordehoeveelheidorfamidediedecel kanverlaten.ZowelOprMalsCmec lijkeneengrote rol tespelen inorfamidesecretie.Tochzijnookanderepompenaanwezigdieorfamidedeceluitkunnenpompen.P.protegensPf-5heefteveneenspompendiemeerorfamidenaarbuitenkunnenbrengendananderepompen.HetinhiberenvanbepaaldeATP-pompenzorgtervoordatmeerorfamidedecelkan verlaten. Deze resultaten van drie verschillende Pseudomonas isolaten geven aan dat hetsecretiesysteemzeercomplexisenafhankelijkvanhetisolaat.

5.4Bioactiviteitvanorfamide

5.4.1ResultatenEen invitro inhibitieexperimentwerduitgevoerdomtebepalenofPseudomonasspeciesCMR5cenPseudomonas protegens CHA0 Pythium myriotylum konden inhiberen. Deze twee Pseudomonasisolatenhadden immers reedsaangemaaktorfamidemutanten.HierbijbezitP.protegensCHA0hetnodTgenindeorfamidebiosyntheseclusterterwijlPseudomonassp.CMR5cditnodTgennietbevat.VervolgenswerdeenplantexperimentuitgevoerdmetbeideisolatentegenPythiummyriotylumopdecocoyamplant.

Invitroinhibitieexperiment

Defoto’svanhetinvitroinhibitieexperimentmetP.protegensCHA0enPseudomonassp.CMR5ctegenPythiummyriotylumwordenweergegeveninFiguurB2.DezonewaarP.myriotylumnietgroeidewasdezonewaarinhibitieoptrad.DediametervandezezonewerdopgemetenenwordtweergegeveninTabel15.AllebehandelingenblekenP.myriotylum tekunnen inhiberendaareensignificantverschilwerdwaargenomentenopzichtevandecontrolemeteenp-waardevan0,002voorallebehandelingen,weergegeveninTabelB10enB11.ErlijkteenkleinverschilininhibitiewaartenementussenhetwildtypevanP.protegensCHA0endeorfamidemutantmaarditverschilisechternietsignificantophet5%significantieniveauberekendmetdeMann-WhitneyTest.Erwerdweleensignificantverschilininhibitie


60

waargenomentussenhetwildtypevanPseudomonassp.CMR5Cendeorfamidemutant.OmuittezoekenofereenverschilwasininhibitievanP.myriotylumtussendecellenenhetsupernatanswerdendezeapartonderzocht.DeresultatenwordenweergegeveninTabelB12waaruitgeconcludeerdkanwordendatdecellenvanhetwild typevanP.protegensCHA0significantminder inhiberendanhetsupernatansvanhetwildtype.Tussendecellenenhetsupernatansvandeorfamidemutantisechtergeensignificantverschilwaartenemen.BijhetgebruikvansupernatansvanPseudomonassp.CMR5ctradsignificantmeerinhibitieopdanwanneerdecellenwerdengebruiktzowelvoorhetwildtypealsvoordeorfamidemutant.

Behandeling μ(cm) σ(cm) %RSD p-waarde %Effect

Control 0,00 0,00 0% CHA0 1,90 0,10 5% CHA0-Δorf 1,80 0,13 7% 0,24 -5%CHA0cel 1,72 0,12 7% CHA0-Δorfcel 1,68 0,11 6% 0,669 -2%CMR5c 2,32 0,11 5% CMR5c-Δorf 1,90 0,08 4% 0,002 -18%CMR5ccel 2,07 0,09 5% CMR5c-Δorfcel 1,73 0,07 4% 0,002 -16%

Inplantainhibitieexperiment

EenplantexperimentmetP.protegensCHA0enPseudomonassp.CMR5cwerduitgevoerdtegenP.myriotylum.DepositievecontroleplantenblevengezondterwijldenegatievecontroleplantenwerdenaangetastdoordeP.myriotylum daar alleblaadjes geelwerdenener geenwortelsoverbleven.Debladerenwerdengescoordopverkleuring.Een‘0’werdtoegekendaandebladerendiegeenverkleuringtoonde;een‘1’wanneerminderdan50%vanhetbladgeelkleurde;een‘2’wanneermeerdan50%vanhetbladgeelkleurde;een‘3’wanneerheelhetbladgeelkleurdeeneen‘4’wanneerhetbladdoodwas. De scores van de planten worden weergegeven in een gestapeld diagram in Figuur 30. Deplantziekteindex(PDI)werdvervolgensbepaaldmetFormule7.OpdezePDI-waardenwerdstatistiektoegepastmethetprogrammaSPSS.ErwerdgebruikgemaaktvandeKruskal-WallistestendeMann-Whitney-U-test. De p-waarde van de Kruskall-Wallis Test bedroeg 0,005waardoor de nulhypotheseverworpenwerd.Debehandelingenzijndusnietallemaalgelijk.Dep-waardenvandeMann-WhitneyTestentussenallebehandelingenwordenweergegeveninTabelB13.HierbijzijnP.protegensCHA0enorfamidemutant beiden significant verschillend van de negatieve controlemet p=0,008 op het 5%significantieniveau. Het wild type van Pseudomonas sp. CMR5c is significant verschillend van denegatieve controle op het 5% significantieniveau aangezien de p-waarde eveneens 0,008 bedraagt.Pseudomonas sp. CMR5c orfamide mutant is echter net niet significant verschillend opsignificantieniveau5%aangezienp-waarde0,056bedraagt.ZowelhetwildtypealsdemutantenvanP.

Tabel15.DegemiddeldediametermetstandaardafwijkingvaninvitroinhibitieexperimentmetP.protegensCHA0enPseudomonassp.CMR5cenorfamidemutanten.‘Cel’wijsteropdatdebacteriecultuurmetcellenisgebruikt,zonderdezeaanwijzingbetekentdathetsupernatanswerdgebruikt.μ,gemiddelde;σ,standaardafwijking;%RSD,relatieve standaardafwijking; p-waarde van de Mann-Whitney Test met significantieniveau 5% met alsnulhypothesedathetwild typegelijk isaandeorfamidemutant;%Effectgeeftaanwatheteffect is vanhetuitschakelenvandeorfamidebiosyntheseclusteropdeinhibitievanPythiummyriotylum.Devetgedruktewaardenin%Effect-kolomzijnsignificantophet5%significantieniveau.


61

protegensCHA0enPseudomonassp.CMR5czijnnietsignificantverschillendvandepositievecontroleDePDI-waardenwordengrafischweergegeveninFiguur31.

Figuur 30. Ziekte evaluatiemet stapeldiagramvandebladscores vanP. protegens CHA0enPseudomonas sp.CMR5cenorfamidemutanten.

Figuur 31. Plantziekte index (PDI) diagram van P. protegens CHA0 en Pseudomonas sp. CMR5c en orfamidemutanten.Behandelingmetdezelfdeletterzijnnietsignificantverschillendophet5%significantieniveauvolgensdeMann-WhitneyTest.

0%

20%

40%

60%

80%

100%

Positievecontrole

Negatievecontrole

CMR5c CMR5c-Δorf CHA0 CHA0-Δorf

%blade

reninelkeklasse

Ziekteevaluatie

0 1 2 3 4

b

a

b

b

b b

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Positievecontrole

Negatievecontrole

CMR5c CMR5c-Δorf CHA0 CHA0-Δorf

PDI

Plantziekteindex


62

Vervolgenswerdeenkwantificatieuitgevoerdvandebacteriënopdewortelsvandecocoyamplant.Demeeste wortels waren echter weggerot door de aantasting van P. myriotylumwaardoor ook geenstatistiek kon worden toegepast. Van de weinige wortels die overbleven worden de resultatenweergegeveninTabel16.Dezetabelgeefthetgewichtvandeovergeblevenwortelsendegemiddeldelog10waardevanhetaantalCFUopdewortels.ZowelbijP.protegensCHA0alsbijPseudomonassp.CMR5cisdelog10vanhetaantalCFUopdewortelsredelijkhoogenisernietveelverschiltussenhetwild type en de orfamidemutant. De standaardafwijkingen bij de log10 van de CFU zijn wel hoog,waardoordezelog10waardedusminderbetrouwbaarzijn.Tabel16.KwantificatievanP.protegensCHA0enPseudomonassp.CMR5copdewortelsvandecocoyamplant.Hetplantennummervandeplantwaarvandewortelsnognietwarenweggerotwordtmeegegevensamenmethetgewichtvandewortelsendelog10vanhetaantalbacteriënaanwezigopdewortels.μlog10,gemiddeldelog10vandetweeplaten;σlog10,standaardafwijking;%RSD,relatievestandaardafwijking.Behandeling Plantnr. Gewichtwortels(g) μlog10(CFU/g) σlog10(CFU/g) %RSD

CHA0 2 0,02 9,81 0,00 0,000

CHA0-Δorf 4 0,078,89 0,62 0,069

CHA0-Δorf 5 0,04

CMR5c 2 0,01 9,97 0,24 0,023

CMR5c-Δorf 4 0,04 9,49 0,02 0,002

5.4.2DiscussieDeactiviteitvanorfamidewerdreedseerderbestudeerdenblijktgeschiktvoortalvantoepassingen.Orfamidekannamelijkzoösporenimmobielmaken;zorgtvoorgroeionderdrukkingvanhetmyceliumvan de schimmel Rhizoctonia solani op boon en kool; kan biocontrole activiteit uitoefenen opcocoyamwortelsdoorPythiummyriotylumteonderdrukkenenvertoontinsecticideactiviteittegendegroeneperzikluis(D’aesetal.,2011;Grossetal.,2007;Jangetal.,2013;Maetal.,2016;Olorunlekeetal.,2014;Perneeletal.,2007).

Invitroinhibitieexperiment

Omnategaanoforfamide,aangemaaktdoorP.protegensCHA0enPseudomonassp.CMR5c,degroeivanPythiummyriotylumkan inhiberen,wordteersteen invitroexperimentuitgevoerdomsneleeneerstebeeld te krijgen.Hierbij bevatP. protegensCHA0hetnodT gen in debiosynthesecluster vanorfamideterwijlPseudomonassp.CMR5cditgennietbevat(Maetal.,2016).HetisreedsbekenddatP. protegens CHA0 een breed spectrum van bioactieve metabolieten aanmaakt waaronder 2,4-diacetylphloroglucinol(DAPG),pyrrolnitrin(PRN),waterstofcyanide(HCN),pyoluteorin(PLT),indool-3-azijnzuur,salicylzuurenpyochelin.Dezestamheeftdanookeengrotepotentiëlebiocontroleactiviteit.ZoonderdruktP.protegensCHA0onderanderezwartewortelrotopdetabaksplantveroorzaaktdoorThielaviopsisbasicoladoordeaanmaakvanDAPGenHCN(Keeletal.,1992;Stutzetal.,1986;Voisardet al., 1994).Ookwortelrot opde tomaatplant veroorzaakt doorFusariumoxysporum f. sp. radicis-lycopersiciwordtonderdruktdoordeaanmaakvanDAPG(DuffyandDéfago,1997).KiemplantziekteopdekomkommerveroorzaaktdoorPythiumultimumwordtdanweeronderdruktdoordeaanmaakvanPLT (Maurhofer et al., 1992). Tarwehalmdoder ziekte op tarwe veroorzaakt doorGaeumannomycesgraminisvariatietriticiwordtvoornamelijkonderdruktdoordeproductievanDAPG(Keeletal.,1992).Pseudomonas sp. CMR5c kaneveneens verschillendebioactievemetabolieten aanmaken zoals PRN,


63

HCN,PLT,phenazine-1-carboxylaatenphenazine-1-carboxamide.Dezemetabolietenkunnenziektenveroorzaakt door Pythium species onderdrukken (Anjaiah et al., 1998; Maurhofer et al., 1992;ThomashowandWeller,1988).Beidestammenmakendusbuitenorfamidenogeen talvananderebioactievemetabolietenaan.HetisdanooknietverbazenddatresultatenvaneeninvitroinhibitietestmetP. protegensCHA0 enPseudomonas sp. CMR5c aantonendatP.myriotylumwordt onderdrukt(Tabel 15). Deze resultaten voor Pseudomonas sp. CMR5c werden reeds gesuggereerd aangezienPseudomonas sp. CMR12a eveneens biocontrole activiteit bevat tegen P. myriotylum opcocoyamwortels(Perneeletal.,2007).WatechterinteressantisomwaartenemenisdatinP.protegensCHA0wanneerorfamidenietwordtgeproduceerdnogsteedsinhibitievanP.myriotylumoptreedt.Eriszelfsgeensignificantverschiloptemerkenininhibitietussenhetwildtypeendeorfamidemutant.DitisteverklarendoordegrotehoeveelheidbioactievemetabolietendieP.protegensCHA0aanmaakt.Deze metabolieten zijn waarschijnlijk mede verantwoordelijk voor de biocontrole activiteit van P.myriotylumterwijlorfamidehierineennietaltegroterolblijkttespelen.Andereresultatenwordenwaargenomen bij Pseudomonas sp. CMR5c waar de orfamide mutant de P. myriotylum significantminderkanonderdrukken.DitkomtwaarschijnlijkdoordatPseudomonassp.CMR5cminderbioactievemetabolietenaanmaaktdanP.protegensCHA0waardoororfamideéénvandegroterespelersisinhetinhiberenvanP.myriotylum.Dezeresultatenzijnterugtevindenvoorzowelhetexperimentwaarenkeldecellenwerdengebruiktalshetexperimentwaarenkelhetsupernatanswerdgebruikt.Wanneerdeintacte cellen werden gebruikt kunnen deze reproduceren en secundaire metabolieten aanmaken.Wanneer het supernatans werd gebruikt bevat dit enkel de reeds aangemaakte en gesecreteerdemetabolieten.OmtezienofereenverschilwasininhibitievanP.myriotylumtussendemetabolietenindecelendereedsgesecreteerdemetabolietenwerdenbeideexperimentenmetelkaarvergeleken(TabelB12).HierbijvertoondehetwildtypevanP.protegensCHA0eensignificantverschilterwijldeorfamide mutant geen verschil toonde. De metabolieten in de cellen inhiberen dus minder de P.myriotylumdandereedsgesecreteerdemetabolieten.BijPseudomonassp.CMR5ctoondenzowelhetwildtypealsdeorfamidemutanteensignificantverschiltussendecellenenhetsupernatans.Ookhierinhiberen de metabolieten in de cellen de P. myriotylum minder dan de reeds gesecreteerdemetabolieten.

Inplantainhibitieexperiment

IneencocoyamplantexperimentmetP.protegensCHA0enPseudomonassp.CMR5ctradsignificantinhibitieopvanP.myriotyluminvergelijkingmetdenegatievecontrolediegeenbacteriebehandelingkreeg(Figuren30en31).ErwerdgeensignificantverschilwaargenomentussenhetwildtypeendeorfamidemutantinzowelP.protegensCHA0alsPseudomonassp.CMR5c.DoordatbeidestammenvelebioactievemetabolietenaanmakenkunnenzeP.myriotylumgoedonderdrukkenmaarisdeinvloedvanorfamideopdezeinhibitieminiem.HetvaltwelopdatP.protegensCHA0deP.myriotylummeerkaninhiberendanPseudomonassp.CMR5cookalishetverschilnietsignificant.Pseudomonassp.CMR5cmaaktminderbioactievemetabolietenaanwaardoorhogereinhibitieverklaardzoukunnenworden.Doordebacteriëntekwantificerendiezichopdewortelsbevindenkoneenlog10CFU/gwortelbepaaldworden(Tabel16).DoordatdemeestewortelsweggerotwarenkondenmaareenpaarwortelsgebruiktwordenvoordeCFU/gwortelbepalingenzijndelog10waardennietrepresentatief.Tochgeeftheteenideedoordatdelog10waardenzohoogzijn.VoorP.protegensCHA0ligtdelog10namelijktussen8en10CFU/gwortel.Dezewaardenzijnveelhogerdandereedsbeschrevenlog10waardenindeliteratuur.Wanneer fluorescente Pseudomonas die DAPG aanmaken op boon (Phaseolus vulgaris) worden


64

gebruikt,wordteenlog10van7,4bekomen.Oplinze(Lensculinaris), lupine(Lupinus)enerwt(Pisumsativum)wordenrespectievelijkelog10waardenbekomenvan5,8;6,9en6,4CFU/gwortel(DeLaFuenteetal.,2006).Dezewaardenzijnlagerdandelog10waardenvanP.protegensCHA0opdecocoyam.HetlijktdatwortelkolonisatieafhankelijkisvanhetgewaswatookreedseerderwerdaangetoondmetdefluorescentePseudomonasopverschillendegewassen(DeLaFuenteetal.,2006).Delog10waardevandeorfamidemutant is lager dandie vanhetwild type.Door het kleine aantal populaties kon geenstatistiektoegepastwordenendusgeensignificantverschilopgemerktworden.Doordebiosurfactantsactiviteitvanorfamidezoutochverwachtwordendatkolonisatievandewortelsvlottergebeurtinhetwildtypedatorfamidebevatdanindeorfamidemutant(D’aesetal.,2010;Raaijmakersetal.,2006).Dit kon echter niet bevestigd wordenmet dit experiment. De log10 waarden van Pseudomonas sp.CMR5cvoorzowelhetwildtypealsorfamidemutantlagentussende9en10CFU/gwortel.DezestammaaktgeenDAPGaanmaarkoloniseertdesondanksgoeddewortel.DAPGlijktdusweinigroltespelenin de kolonisatie van de bacteriën. Het kleine verschil waar te nemen tussen het wild type en deorfamidemutantzouookhiertewijtenkunnenzijnaandeafwezigheidvanhetbiosurfactantsorfamide(D’aesetal.,2010;Raaijmakersetal.,2006).Pseudomonas sp.CMR12aheefteveneensbiocontroleactiviteittegenP.myriotylum.DezestammaaktnamelijkfenazinesencyclischelipopeptidenaandochgeenpyrrolnitrinenpyoluteorinzoalsPseudomonassp.CMR5c.TochlijktPseudomonassp.CMR5cgeengroterebioactiviteit te bevatten tegenP.myriotylumdanPseudomonas sp. CMR12a.Omdie redenwordt gesuggereerd dat fenazine en cyclische lipopeptiden de voornaamste oorzaak zijn vanbiocontroleactiviteitennietpyrrolnitrinenpyoluteorin(Perneeletal.,2007).OokzoudendeCLP’senfenazines een synergistisch of additief effect kunnen hebben. De samenwerking tussen deze tweemoleculen zou dan misschien de bioactiviteit kunnen vergroten (D’aes et al., 2010). Voorgaandonderzoek op Pseudomonas sp. CMR12a toonde eveneens aan dat wortelkolonisatie waarschijnlijkafhankelijkisvanhetgewas.Pseudomonassp.CMR12aopcocoyamhadimmerseenlog10rond9CFU/gwortelterwijldezelfdestamopbooneenlog10van5CFU/gwortelhad(datanognietgepubliceerd).Decocoyammaaktmisschienexudatenaandiehelpenbijdekolonisatievandebacteriënopdewortels.Eenlaatsteopmerkingmoetgemaaktwordeninverbandmetdep-waardenvandestatistischetesten.Aangeziendegemiddeldenvanmeerderebehandelingenmeervoudigmetelkaarwerdenvergelekenisde kans groter dat twee waarden significant verschillend zijn van elkaar. Hiervoor wordt best eencorrectietoegepastzoalsdeBonferronicorrectiezodatdekansopsignificantieverlaagd.DeBonferronicorrectiedeelthetbestaandesignificantieniveau0,05doorhetaantaltestendiewerdenuitgevoerd.Inhet geval van de in vitro inhibitie test zou 0,05 gedeeldmoetenworden door achtwat een nieuwsignificantieniveaugeeftvan0,00625.Enkeldep-waardenkleineralsdezewaardezoudenalssignificantmogenbeschouwdworden.Metditnieuwesignificantieniveaublijvendebehandelingenmetbacteriënsignificant verschillend van de controle. Ook is wild type Pseudomonas sp. CMR5c significantverschillendvandeorfamidemutant,zowelindienhetsupernatanswerdgebruiktalswanneerdecellenwerdengebruikt. IndiendeBonferroni correctiewordt toegepastophet cocoyamplant experiment,moet0,05gedeeldwordendoor13wateennieuwsignificantieniveauvan0,00385geeft.Hiermeeblijktgeenenkelebehandelingmeersignificantverschillendtezijn.ErkanechteropgemerktwordendatdeBonferronicorrectiealsdestrengstmogelijkecorrectiemethodewordtgezienwaardoordezevaaknietgebruiktwordt.Hetbekijkenvanderesultatenenhetinterpreterenvanverschillendemogelijkhedenzougoedgenoegmoetenzijnomeenredelijkeverklaringtevindenenconclusiestetrekken(Perneger,1998).EenBonferronicorrectieisindezegevallendusnietnodig.


65

5.4.3ConclusieZowelP.protegensCHA0alsPseudomonassp.CMR5ckunnenP.myriotyluminhiberenineeninvitroexperiment.Deorfamide vanP.protegensCHA0heeft echter geen invloedophet inhiberenvanP.myriotylumdoordatdit isolaatverscheideneanderebioactievemetabolietenaanmaakt.DeorfamidevanPseudomonassp.CMR5cheeftweleensiginificanteffectinhetinhiberenvanP.myriotylum.HetmaakteveneensanderebioactievemetabolietenaanmaarminderverschillendealsP.protegensCHA0.Ineen inplantaexperimentopcocoyamhebbenzowelhetwildtypealsdeorfamidemutantvanP.protegensCHA0enPseudomonassp.CMR5ceensignificanteffectopdeinhibitievanP.myriotylum.Deze inhibitie is echter eveneens onafhankelijk van de aanmaak van orfamide doordat anderebioactievemetabolieteneengrotererolspelenindeinhibitievanP.myriotylum.Deorfamidelijktweleen rol te spelen inwortelkolonisatie. Dit is tevens ook afhankelijk van het soort gewas aangeziencocoyamwortelseenhogeraantalCFUbevatten.Decocoyamzouexudatenkunnenaanmakendiedebacteriënhelpendewortelstekoloniseren.

Conclusie

66

6.AlgemeneconclusiesCyclischelipopeptidenzijneentypebiosurfactantsdiedoortalvanplantgeassocieerdePseudomonasspecies worden aangemaakt. Dit onderzoek focust zich op de biosynthese, regulatie, secretie enbioactiviteitvanhetCLPorfamidedooreenaantalPseudomonasprotegensstammenenenkelenauwverwantestammen.De aanmaak van orfamide in P. protegens Pf-5, Pseudomonas sp. CMR12a en CMR5c werd in ditonderzoekbevestigd. InPseudomonassp.CMR5ckonenkeldeaanmaakvanorfamideB,D,EenGwordenaangetoondennietdeaanmaakvanorfamideFdaardepiekinHPLC-MS-analysetekleinwas.NublijktdatdetranscriptievandebiosynthesegenentijdsafhankelijkisinPseudomonassp.CMR12aenP.protegensPf-5endatdeorfamidebiosynthesetranscriptenverschillenvanstamtotstam.Beidenhebbenwaarschijnlijktemakenmetdeactiviteitvandepromotors.Ditwijsteropdatelkestamzijneigensysteemheeftvoordeaanmaakvanorfamideendatbepaaldefactorendeenestammeerkunnenbeïnvloedendanandere.Welkefactorendezeprecieszijnisnognietgeweten.De luxUpen luxDown regulatorgenenspelen inPseudomonassp.CMR12aenCMR5ceenrol inhetregulerenvandeorfamidedaarluxUpenluxDownmutantendeproductievanorfamideverliezen.Doordevermindering inmetabolischebelastingkunnendezemutantensnellergroeienen reproduceren.Deze regulatiegenen dienen tevens in Pseudomonas sp. CMR5c waarschijnlijk als transcriptionelerepressors vanmacB ook al wordenmacA enmacB door andere genen gereguleerd. Ook wordenaanwijzingenteruggevondenvandeaanwezigheidvanantisenseRNA’sdieeveneenseenrolkunnenspeleninderegulatievangenexpressie.Doortebegrijpenopwelkemanierenorfamidegereguleerdwordt kan de aanmaak ervan verhinderdworden indien gewenst. Deze bestudeerde PseudomonasspeciesmetmutanteninluxUpofluxDowngroeiennamelijksnellerenmakengeenorfamidemeeraan.Indien orfamide wordt aangemaakt verlaat het de cel via secretiesystemen. De afwezigheid vanbuitenstemembraanproteïnen NodT en OprM in Pseudomonas sp. CMR12a, en OprM en CmeC inPseudomonassp.CMR5chebbenaangetoonddatorfamidenoganderebuitenstemembraanproteïnengebruikenomdecelteverlaten.Hetinactiverenofafwezigzijnvanbepaaldepompenzorgtookvoordeactivatievananderepompen.Decombinatievanactieveengeïnactiveerdepompenbeïnvloedtdandehoeveelheidorfamidedatdecelkanverlaten.Dithelesecretiesysteemismetanderewoordenveelcomplexerdaninitieelgedacht.Hetbegrijpenvanhetsecretiesysteemkanbijdragentothetstimulerenvandesecretievanorfamideindiengewenst.Aangezienorfamidebiosurfactantsactiviteitbevatkanhetdeoppervlaktespanningverlagenwatkanhelpenbijdebeweegbaarheidvandebacterieenbijhetkoloniserenvandewortelsvaneenplantwelkegewensteeffectenkunnenzijn.Ookbevatorfamidebiocontroleactiviteit,watvanbelangisvoordelandbouw.P.protegensCHA0enPseudomonassp.CMR5ckondenbeidenP.myriotyluminhiberenzowelinvitroalsinderhizosfeervandecocoyamplant.Defunctievanorfamidehierinisechterteverwaarlozendaarbeidestammentalvananderebioactievemetabolietenaanmaken zoalsPRN,HCN,PLT…Orfamideblijktdusniet al te veeleffect te hebben in biocontrole op de cocoyammaar eerder in het koloniseren van dewortels. Defunctievanorfamideblijktteliggeninhethelpenvananderemetabolietenomdeplanttebereiken.

Ideeënvoorverderonderzoek

67

7.IdeeënvoorverderonderzoekPseudomonasspecieszijnreedswelbestudeerdebacteriënmaarzijndoorhundiversiteitnoglangnietvoldoendeuitgepluisd.Deorfamideproducerendebacteriënwordennogmaarrecentonderzochtnaarhunaanmaakvanorfamideendeinvloedervanalsbiocontroleagentia.DatluxUpenluxDownzorgenvoorhetverliesvanorfamideproductieisinditonderzoekbevestigd.Hetzouechter interessant zijneendubbelemutant in luxUp en luxDown temaken inPseudomonassp.CMR12aenCMR5comdeinvloedvanderegulatiegenenopdesecretiegenenverdertebestuderenviaqPCR-analyse. Ook interessant zou zijn te weten welke genen instaan voor de regulatie van desecretiegenenzelf.Omnategaanofdezeonderinvloedstaanvanquorumsensing(QS)zoudendeQS-signaalmoleculengeblokkeerdkunnenworden.AnderesystemenzoudenookeenrolkunnenspelenzoalshetGacS/GacAtweecomponentensysteemofheatshockproteïnen.InP.protegensPf-5wordenbestdeluxUpenluxDownmutantaangemaaktalsookmeteendedubbelmutant.Viaswarmingtestenkan snel nagegaan worden of de aanmaak van orfamide in P. protegens Pf-5 eveneens onder deregulatiestaatvandezegenen.EenqPCR-analysekandeinvloedvandezegenenopdesecretiegenenbestuderen.Ookkunnendestammenonderlingvergelekenworden.Het meeste onderzoek is nodig in verband met het secretiesysteem aangezien dit systeem veelcomplexerinelkaarzitdaninitieelgedacht.AllereerstkunnengeneninPseudomonassp.CMR12aenCMR5cviabio-informaticawordengevondendiehomologievertonenmetdegeneninP.aeruginosadie instaan voor secretie. Niet alleen binnenste membraanproteïnen maar ook buitenste enperiplasmaproteïnen.Doormutantentemakenindezehomologegenenenhiermeeswarmingtestenuittevoerenkantewetengekomenwordenoforfamidenogsteedsdecelkanverlatenenwelkegenenhiervoor precies verantwoordelijk zijn. Hiervoor zullen ookmeerderemutatiesmoeten aangemaaktwordeninéénbacterie.OokmutanteninmacAenmacBzoudenmoetenwordenaangemaaktomnate gaan of andere systemen orfamide voorbij het binnenste celmembraan kan brengen. Het isvoornamelijk interessant dit onderzoek te starten inPseudomonas sp. CMR5c aangezien deze geensessilineaanmaaktwatwelhetgevalisinPseudomonassp.CMR12a.VerderkanhetsecretiesysteeminP.protegensPf-5onderzochtwordenomverschillenindedrieisolatenwaartekunnennemen.Deactiviteitvanorfamidelijktminiembijtedragenaanbiocontrolemaarisdanmisschienwelbelangrijkvoor andere factoren zoals beweegbaarheid in de bodem en wortelkolonisatie. Om dit na te gaanzoudenorfamidemutantenmoetenwordenaangemaakt inbovengenoemde isolatenenonderzochtwordenonderdemicroscoopindenabijheidvanplantwortelszoalscocoyam.Hetisinditopzichtookinteressant andere plantwortels te gebruiken aangezien cocoyamwortels misschien wel exudatenaanmaken die beweegbaarheid en wortelkolonisatie stimuleren. Om die reden zou best ook eensgescreendwordenopmogelijkexudatenzodat,indienaanwezig,huninvloedbestudeerdkanworden.IndiendezeonderzoekenniettetijdrovendzijnennuttigeinformatiebijdragenzouhetookinteressantzijndetestenuittevoerenopalleandereorfamideproducerendePseudomonasspeciesomnategaanwelkeverschillenoptredentussendeisolatenenwelkefactorenwaarvanbelangzijn.

Bronnen

68

8.BronnenAnjaiah V, Koedam N, Nowak-thompson B, Loper JE, Höfte M, Tambong JT, Cornelis P. 1998.

InvolvementofphenazinesandanthranilateintheantagonismofPseudomonasaeruginosaPNA1andTn5derivativestowardFusariumspp.andPythiumspp.Am.Phytopathol.Soc.11:847–854.

PseudomonasGenomeDatabase.2014..http://www.pseudomonas.com/strain/show?id=2466.

BenderCL,Alarcón-Chaidez F,GrossDC. 1999.Pseudomonas syringae phytotoxins:modeof action,regulation, and biosynthesis by peptide and polyketide synthetases.Microbiol.Mol. Biol. Rev.63:266–292.

BertiAD,GreveNJ,ChristensenQH,ThomasMG.2007.IdentificationofabiosyntheticgeneclusterandthesixassociatedlipopeptidesinvolvedinswarmingmotilityofPseudomonassyringaepv.tomatoDC3000.J.Bacteriol.189:6312–6323.http://jb.asm.org/cgi/doi/10.1128/JB.00725-07.

vonBodmanSB,MajerczakDR,CoplinDL.1998.Anegativeregulatormediatesquorum-sensingcontrolofexopolysaccharideproductioninPantoeastewartiisubsp.stewartii.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:7687–7692.

BotelhoGR,Mendonça-HaglerLC.2006.FluorescentPseudomonadsassociatedwiththerhizosphereofcrops-Anoverview.BrazilianJ.Microbiol.37:401–416.

VanDenBroekD,BloembergGV.,LugtenbergB.2005.TheroleofphenotypicvariationinrhizospherePseudomonasbacteria.Environ.Microbiol.7:1686–1697.

BroounA,TomashekJJ,LewisK.1999.PurificationandligandbindingofEmrR,aregulatorofamultidrugtransporter.J.Bacteriol.181:5131–5133.

deBruijnI,deKockMJD,deWaardP,vanBeekTa.,RaaijmakersJM.2008.MassetolideAbiosynthesisinPseudomonasfluorescens.J.Bacteriol.190:2777–2789.

de Bruijn I, Raaijmakers JM. 2009a. Diversity and functional analysis of LuxR-type transcriptionalregulatorsofcycliclipopeptidebiosynthesisinPseudomonasfluorescens.Appl.Environ.Microbiol.75:4753–4761.

de Bruijn I, Raaijmakers JM. 2009b. Regulation of cyclic lipopeptide biosynthesis in PseudomonasfluorescensbytheClpPProtease.J.Bacteriol.191:1910–1923.

deBruijnI,deKockMJD,YangM,deWaardP,vanBeekTa.,RaaijmakersJM.2007.Genome-baseddiscovery, structure prediction and functional analysis of cyclic lipopeptide antibiotics inPseudomonasspecies.Mol.Microbiol.63:417–428.

CampbellR.1989.Biologicalcontrolofmicrobialplantpathogens.CambridgeUniversityPress218p.

CaswellCC,GainesJM,RoopRM.2012.TheRNAchaperoneHfqindependentlycoordinatesexpressionoftheVirBtypeIVsecretionsystemandtheLuxR-typeregulatorBabRinBrucellaabortus2308.J.Bacteriol.194:3–14.

Chin-A-WoengTFC,BloembergGV.,LugtenbergBJJ.2003.PhenazinesandtheirroleinbiocontrolbyPseudomonasbacteria.NewPhytol.157:503–523.

ChoH,KangH.2012.ThePseEFeffluxsystemisavirulencefactorofPseudomonassyringaepv.syringae.

Bronnen

69

J.Microbiol.50:79–90.

Costa TRD, Felisberto-Rodrigues C, Meir A, Prevost MS, Redzej A, Trokter M, Waksman G. 2015.Secretion systems in Gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nat. Rev.Microbiol.13:343–359.http://dx.doi.org/10.1038/nrmicro3456.

CuiX,HarlingR,MutchP,DarlingD.2005.IdentificationofN-3-hydroxyoctanoyl-homoserinelactoneproduction in Pseudomonas fluorescens 5064, pathogenic to broccoli, and controllingbiosurfactantproductionbyquorumsensing.Eur.J.PlantPathol.111:297–308.

D’aesJ,HuaHoangKG,DeMaeyerK,PannecoucqueJ,ForrezI,OngenaM,DietrichLEP,ThomashowLS,MavrodiDV.,HöfteM.2011.BiologicalcontrolofRhizoctoniarootrotonbeanbyphenazine-andcycliclipopeptide-producingPseudomonasCMR12a.Am.Phytopathol.Soc.101:996–1004.

D’aesJ,KieuNP,LéclèreV,TokarskiC,OlorunlekeFE,DeMaeyerK,JacquesP,HöfteM,OngenaM.2014. To settle or to move? The interplay between two classes of cyclic lipopeptides in thebiocontrolstrainPseudomonasCMR12a.Environ.Microbiol.16:2282–2300.

D’aesJ,DeMaeyerK,PauwelynE,HöfteM.2010.Biosurfactants inplant-Pseudomonas interactionsandtheirimportancetobiocontrol.Environ.Microbiol.Rep.2:359–372.

Daugelavicius R, Buivydas A, Sencilo A, Bamford DH. 2010. Assessment of the activity of RND-typemultidrugeffluxpumps inPseudomonasaeruginosausing tetraphenylphosphonium ions. Int. J.Antimicrob.Agents36:234–238.

DauryL,OrangeF,TaveauJ,VerchèreA.2016.TripartiteassemblyofRNDmultidrugeffluxpumps.Nat.Commun.7:1–30.

DubernJF,CoppoolseER,StiekemaWJ,BloembergGV.2008.GeneticandfunctionalcharacterizationofthegeneclusterdirectingthebiosynthesisofputisolvinIandIIinPseudomonasputidastrainPCL1445.Microbiology154:2070–2083.

DubernJF,LugtenbergBJJ,BloembergGV.2006.TheppuI-rsaL-ppuRquorum-sensingsystemregulatesbiofilm formation of Pseudomonas putida PCL1445 by controlling biosynthesis of the cycliclipopeptidesputisolvinsIandII.J.Bacteriol.188:2898–2906.

DubernJ-F,LagendijkEL,LugtenbergBJJ,BloembergGV.2005.TheheatshockgenesdnaK,dnaJ,andgrpE are involved in regulation of putisolvin biosynthesis in Pseudomonas putida PCL1445. J.Bacteriol.187:5967–5976.

Duffy BK, Défago G. 1997. Zinc improves biocontrol of Fusarium crown and root rot of tomato byPseudomonas fluorescens and represses theproductionof pathogenmetabolites inhibitory tobacterialantibioticbiosynthesis.Phytopathology87:1250–1257.

EglandKA,GreenbergEP.2000.ConversionoftheVibriofischeritranscriptionalactivator,LuxR,toarepressor.J.Bacteriol.182:805–811.

EvansK,PooleK.1999.TheMexA-MexB-OprMmultidrugeffluxsystemofPseudomonasaeruginosaisgrowth-phaseregulated.FEMSMicrobiol.Lett.173:35–39.

FinkingR,MarahielMa.2004.BiosynthesisofNonribosomalPeptides.Annu.Rev.Microbiol.58:453–488.

FoglianoV,BallioA,GalloM,WooS,ScalaF,LoritoM.2002.Pseudomonaslipodepsipeptidesandfungal

Bronnen

70

cellwall-degradingenzymesactsynergisticallyinbiologicalcontrol.Mol.plant-microbeInteract.15:323–333.

FuquaC,GreenbergEP.1998.Selfperceptioninbacteria:quorumsensingwithacylatedhomoserinelactones.Curr.Opin.Microbiol.1:183–189.

GardenerBBM.2007.DiversityandecologyofbiocontrolPseudomonasspp. inagriculturalsystems.Am.Phytopathol.Soc.97:221–226.

Garrido-SanzD,Meier-KolthoffJP,GökerM,MartínM,RivillaR,Redondo-NietoM.2016.GenomicandgeneticdiversitywithinthePseudomonasfluorescenscomplex.PLoSOne11:1–30.

GolsteinPE,BoomA,VanGeffelJ,JacobsP,MasereelB,BeauwensR.1999.P-glycoproteininhibitionbyglibenclamideandrelatedcompounds.PflugersArch.Eur.J.Physiol.437:652–660.

Gomila M, Pena A, Mulet M, Lalucat J, Garcia-Valdes E. 2015. Phylogenomics and systematics inPseudomonas.Front.Microbiol.6:1–13.

Grewal SI, Han B, Johnstone K. 1995. Identification and characterization of a locuswhich regulatesmultiple functions in Pseudomonas tolaasii, the cause of brown blotch disease of Agaricusbisporus.J.Bacteriol.177:4658–68.

GrossDC.1985.RegulationofsyringomycinsynthesisinPseudomonassyringaepv.syringaeanddefinedconditionsforitsproduction.J.Appl.Bacteriol.58:167–74.

GrossH,LoperJE.2009.GenomicsofsecondarymetaboliteproductionbyPseudomonasspp.Nat.Prod.Rep.26:1408–1446.

Gross H, Stockwell VO, Henkels MD, Nowak-Thompson B, Loper JE, Gerwick WH. 2007. Thegenomisotopicapproach:asystematicmethodto isolateproductsoforphanbiosyntheticgeneclusters.Chem.Biol.14:53–63.

HamleyIW.2015.Lipopeptides:fromself-assemblytobioactivity.Chem.Commun.51:8574–8583.

HeebS,HaasD.2001.RegulatoryrolesoftheGacS/GacAtwo-componentsysteminplant-associatedandothergram-negativebacteria.Mol.Plant-MicrobeInteract.14:1351–1363.

HöfteM,AltierN.2010.Fluorescentpseudomonadsasbiocontrolagentsforsustainableagriculturalsystems.Res.Microbiol.161:464–471.

HorioM, GottesmanMM, Pastan I. 1988. ATP-dependent transport of vinblastine in vesicles fromhumanmultidrug-resistantcells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:3580–3584.

HowellCR,StipanovicRD.1979.ControlofRhizoctoniasolanioncottonseedlingswithPseudomonasfluorescensandwithanantibioticproducedbythebacterium.Phytopathology69:480–482.

HrabakEM,WillisDK.1992.The lemAgenerequiredforpathogenicityofPseudomonassyringaepv.syringaeonbeanisamemberofafamilyoftwo-componentregulators.J.Bacteriol.174:3011–3020.

HuaGKH,HöfteM.2015.TheinvolvementofphenazinesandcycliclipopeptidesessilininbiocontrolofRhizoctoniarootrotonbean(Phaseolusvulgaris)byPseudomonassp.CMR12aisinfluencedbysubstratecomposition.PlantSoil388:243–253.

Jang JY,YangSY,KimYC, LeeCW,ParkMS,Kim JC,Kim IS.2013. IdentificationoforfamideAasan

Bronnen

71

insecticidalmetaboliteproducedbyPseudomonasprotegensF6.J.Agric.FoodChem.61:6786–6791.

KeelC,SchniderU,MaurhoferM,VoisardC,LavilleJ,BurgerU,WirthnerP,HaasD,DefagoG.1992.Suppression of root disease by Pseudomonas fluorescens CHA0: importance of the bacterialsecondary metabolite 2,4-diacetylphloroglucinol. Mol. Plant-Microbe Interact. <Go toISI>://A1992GZ72200001.

Kinscherf TG, Willis DK. 2002. Global regulation by gidA in Pseudomonas syringae. J. Bacteriol.184:2281–6.http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=134964&tool=pmcentrez&rendertype=abstract.

KittenT,KinscherfTG,McEvoyJL,WillisDK.1998.AnewlyidentifiedregulatorisrequiredforvirulenceandtoxinproductioninPseudomonassyringae.Mol.Microbiol.28:917–929.

Kobayashi N, Nishino K, Yamaguchi A. 2001. Novelmacrolide-specific ABC-type effux transporter inEscherichiacoli.J.Bacteriol.183:5639–5644.

KochB,NielsenTH,SorensenD,AndersenJB,ChristophersenC,MolinS,GivskovM,SorensenJ,NybroeO.2002.LipopeptideproductioninPseudomonassp.strainDSS73isregulatedbycomponentsofsugarbeetseedexudateviatheGactwo-componentregulatorysystem.Appl.Environ.Microbiol.68:4509–4516.

KourtesiC,BallAR,HuangY,JachakSM,VeraDMa,KhondkarP,GibbonsS,HamblinMR,TegosGP.2013.Microbialeffluxsystemsandinhibitors:approachestodrugdiscoveryandthechallengeofclinicalimplementation.OpenMicrobiol.J.7:34–52.

De La Fuente L, Landa BB, Weller DM. 2006. Host crop affects rhizosphere colonization andcompetitiveness of 2,4-Diacetylphloroglucinol-producing Pseudomonas fluorescens.Phytopathology96:751–62.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18943149.

DeLeijFAAM,ThomasCE,BaileyMJ,WhippsJM,LynchJM.1998.EffectofinsertionsiteandmetabolicloadontheenvironmentalfitnessofageneticallymodifiedPseudomonasfluorescensisolate.Appl.Environ.Microbiol.64:2634–2638.

LiJ,ZhangY.2014.Relationshipbetweenpromotersequenceanditsstrengthingeneexpression.Eur.Phys.J.E37:1–6.

LiW,Rokni-ZadehH,DeVleeschouwerM,GhequireMGK,SinnaeveD,XieG-L,RozenskiJ,MadderA,Martins JC, DeMot R. 2013. The antimicrobial compound xantholysin defines a new group ofPseudomonascycliclipopeptides.PLoSOne8:1–16.

Li XZ, Nikaido H, Poole K. 1995. Role of mexA-mexB-oprM in antibiotic efflux in Pseudomonasaeruginosa.Antimicrob.AgentsChemother.39:1948–1953.

LimSP,RoongsawangN,WashioK,MorikawaM.2009.FlexibleexportationmechanismsofarthrofactininPseudomonassp.MIS38.J.Appl.Microbiol.107:157–166.

LindowSE,BrandlMT.2003.Microbiologyofthephyllosphere.Appl.Environ.Microbiol.69:1875–1883.

LuS-E,DouleJD,GrossD.2003.CharacterizationoftheargAgenerequiredforargininebiosynthesisand syringomycin production by Pseudomonas syringae pv. syringae.Appl. Environ.Microbiol.

Bronnen

72

69:7272–7280.

LuS-E,Scholz-SchroederBK,GrossDC.2002a.CharacterizationofthesalA,syrF,andsyrGregulatorygeneslocatedattherightborderofthesyringomycingeneclusterofPseudomonassyringaepv.syringae.Mol.Plant.Microbe.Interact.15:43–53.

LuS-E,Scholz-SchroederBK,GrossDC.2002b.CharacterizationofthesalA,syrF,andsyrGregulatorygeneslocatedattherightborderofthesyringomycingeneclusterofPseudomonassyringaepv.syringae.Mol.Plant.Microbe.Interact.15:43–53.

Ludwig-Müller J. 2015. Plants and endophytes: equal partners in secondarymetabolite production?Biotechnol.Lett.27:1325–1334.

MaZ,GeudensN,KieuNP,SinnaeveD,OngenaM,HöfteM.2016.Biosynthesis,chemicalstructureandstructure-activityrelationshipoforfamidelipopeptidesproducedbyPseudomonasprotegensandrelatedspecies.Front.Microbiol.:1–24.

DeMaeyerK,D’aesJ,HuaGKH,PerneelM,VanhaeckeL,NoppeH,HofteM.2011.N-Acylhomoserinelactone quorum-sensing signalling in antagonistic phenazine-producing Pseudomonas isolatesfromtheredcocoyamrhizosphere.Microbiology157:459–472.

MarahielMa,StachelhausT,MootzHD.1997.Modularpeptidesynthetasesinvolvedinnonribosomalpeptidesynthesis.Chem.Rev.97:2651–2674.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11851476.

MarquezB.2005.Bacterialeffluxsystemsandeffluxpumpsinhibitors.Biochimie87:1137–1147.

MaurhoferM,KeelC,SchniderU,VoisardC,HaasD,DefagoG.1992.Influenceofenhancedantibioticproduction in Pseudomonas fluorescens strain CHA0 on its disease suppressive capacity.Phytopathology.

Mazzola M, de Bruijn I, Cohen MF, Raaijmakers JM. 2009. Protozoan-induced regulation of cycliclipopeptide biosynthesis is an effective predation defense mechanism for Pseudomonasfluorescens.Appl.Environ.Microbiol.75:6804–6811.

McSpaddenGardenerBB,GutierrezLJ,JoshiR,EdemaR,LuttonE.2005.DistributionandbiocontrolpotentialofphlD+PseudomonadsinCornandSoybeanfields.Phytopathology95:715–724.

Mnif I, Ghribi D. 2015. Lipopeptides biosurfactants: mean classes and new insights for industrial,biomedical,andenvironmentalapplications.Biopolymers104:129–147.

MuletM,LalucatJ,García-ValdésE.2010.DNAsequence-basedanalysisofthePseudomonasspecies.Environ.Microbiol.12:1513–1530.

“Multiple Primer Analyser.” Multiple Primer Analyzer.https://www.thermofisher.com/be/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/multiple-primer-analyzer.html.

“NCBI.”NationalCenterforBiotechnologyInformation.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.

NeidigN,PaulRJ,ScheuS,JoussetA.2011.SecondarymetabolitesofPseudomonasfluorescensCHA0drivecomplexnon-trophicinteractionswithbacterivorousnematodes.Microb.Ecol.61:853–859.

Neu TR. 1996. Significance of bacterial surface-active compounds in interaction of bacteria withinterfaces.Microbiol.Rev.60:151–166.

Bronnen

73

Nielsen MN, Sørensen J, Fels J, Pedersen HC. 1998. Secondary metabolite- and endochitinase-dependentantagonismtowardplant-pathogenicmicrofungiofPseudomonasfluorescensisolatesfromsugarbeetrhizosphere.Appl.Environ.Microbiol.64:3563–3569.

Nielsen TH, Thrane C, Christophersen C, Anthoni U, Sørensen J. 2000. Structure, productioncharacteristics and fungal antagonism of tensin - a new antifungal cyclic lipopeptide fromPseudomonasfluorescensstrain96.578.J.Appl.Microbiol.89:992–1001.

NielsenTH,ChristophersenC,AnthoniU,SørensenJ.1999.Viscosinamide,anewcyclicdepsipeptidewithsurfactantandantifungalpropertiesproducedbyPseudomonas fluorescensDR54. J.Appl.Microbiol.86:80–90.

Nielsen TH, Sørensen D, Tobiasen C, Andersen JB, Christophersen C, GivskovM, Sørensen J. 2002.Antibiotic and biosurfactant properties of cyclic lipopeptides produced by fluorescentPseudomonasspp.fromthesugarbeetrhizosphere.Appl.Environ.Microbiol.68:3416–3423.

Nikaido H. 1989. Outermembrane barrier as amechanism of antimicrobial resistance.Antimicrob.AgentsChemother.33:1831–1836.

LoNostroP,NinhamBW,LoNostroA,PesaventoG,FratoniL,BaglioniP.2005.SpecificioneffectsonthegrowthratesofStaphylococcusaureusandPseudomonasaeruginosa.Phys.Biol.2:1–7.

OlorunlekeFE,KieuNP,HöfteM.2014.RecentadvancesinPseudomonasbiocontrol1-27p.

OlorunlekeF,HuaH,KieuP,MaZ,HöfteM.2007.Interplaybetweenorfamides,sessilinsandphenazinesinthecontrolofRhizoctoniadiseasesbyPseudomonassp.CMR12a.Environ.Microbiol.Environ.Microbiol.Reports:1–25.

PagèsJM,MasiM,BarbeJ.2005.InhibitorsofeffluxpumpsinGram-negativebacteria.TrendsMol.Med.11:382–389.

Perneel M, Heyrman J, Adiobo A, De Maeyer K, Raaijmakers JM, De Vos P, Höfte M. 2007.Characterization of CMR5c and CMR12a, novel fluorescent Pseudomonas strains from thecocoyamrhizospherewithbiocontrolactivity.J.Appl.Microbiol.:1–14.

Perneel M, Tambong JT, Adiobo A, Floren C, Saborio F, Levesque A, Höfte M. 2006. Intraspecificvariability of Pythium myriotylum isolated from cocoyam and other host crops.Mycol. Res.110:583–593.

PernegerTV.1998.What’swrongwithBonferroniadjustments.Educ.debate316:1236–1238.

“Primer3.” Primer3. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/. Bron geraadpleegd op 03/11/2015 &22/02/2016.

Raaijmakers JM, de Bruijn I, de KockMJD. 2006. Cyclic lipopeptide production by plant-associatedPseudomonasspp.:diversity,activity,biosynthesis,andregulation.Mol.Plant.Microbe.Interact.19:699–710.

RichJJ,KinscherfTG,KittenT,WillisDK.1994.GeneticevidencethatthegacAgeneencodesthecognateresponseregulatorforthelemAsensorinPseudomonassyringae.J.Bacteriol.176:7468–7475.

RodriguesL,BanatIM,TeixeiraJ,OliveiraR.2006.Biosurfactants:potentialapplicationsinmedicine.J.Antimicrob.Chemother.57:609–618.

RonEZ,RosenbergE.2001.Naturalrolesofbiosurfactants.Environ.Microbiol.3:229–236.

Bronnen

74

Roongsawang N, Hase K, Haruki M, Imanaka T, Morikawa M, Kanaya S. 2003. Cloning andcharacterization of the gene cluster encoding arthrofactin synthetase from Pseudomonas sp.MIS38.Chem.Biol.10:869–980.

RoongsawangN,WashioK,MorikawaM.2011.Diversityofnonribosomalpeptidesynthetasesinvolvedinthebiosynthesisoflipopeptidebiosurfactants.Int.J.Mol.Sci.12:141–172.

Schröder H, Langer T, Hartl FU, Bukau B. 1993. DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperonemachinerycapableofrepairingheat-inducedproteindamage.EMBOJ.12:4137–4144.

SestoN,WurtzelO,ArchambaudC,SorekR,CossartP.2012.Theexcludon:anewconceptinbacterialantisenseRNA-mediatedgeneregulation.Nat.Rev.Microbiol.11:75–82.

SoetaertW.2014.CursusIndustriëlebiotechnologieUGent.In:.Ind.Biotechnol.,pp.1–100.

Song C, Aundy K, van de Mortel J, Raaijmakers JM. 2014. Discovery of new regulatory genes oflipopeptidebiosynthesisinPseudomonasfluorescens.FEMSMicrobiol.Lett.356:166–75.

SongC,SundqvistG,MalmE,deBruijnI,KumarA,vandeMortelJ,BuloneV,RaaijmakersJM.2015.LipopeptidebiosynthesisinPseudomonasfluorescensisregulatedbytheproteasecomplexClpAP.BMCMicrobiol.15:367.

Stutz EW, Défago G, Kern H. 1986. Naturally occurring fluorescent Pseudomonads involved insuppressionofblackrootrotofTobacco.Phytopathology76:181.

Sun J, Deng Z, Yan A. 2014. Bacterial multidrug efflux pumps: mechanisms, physiology andpharmacologicalexploitations.Biochem.Biophys.Res.Commun.453:254–267.

Sung-ChyrL.1996.Biosurfactants:recentadvances.J.Chem.Tech.Biotechnol.66:109–120.

Takeuchi K, Noda N, Someya N. 2014. Complete genome sequence of the biocontrol strainPseudomonasprotegensCab57discoveredinJapanrevealsstrain-specificdiversityofthisspecies.PLoSOne9:1–13.

TambongJT,HöfteM.2001.PhenazinesareinvolvedinbiocontrolofPythiummyriotylumoncocoyambyPseudomonasaeruginosaPNA1.Eur.J.PlantPathol.107:511–521.

Tambong JT, Poppe J, HöfteM. 1999. Pathogenicity, electrophoretic characterisation and in plantadetectionof thecocoyamroot rotdiseasepathogen,Pythiummyriotylum.Eur. J.PlantPathol.105:597–607.

Thomashow LS,Weller DM. 1988. Role of a phenazine antibiotic fromPseudomonas fluorescens inbiologicalcontrolofGaeumannomycesgraminisvar.tritici.J.Bacteriol.170:3499–3508.

TranH,KruijtM,RaaijmakersJM.2007.Diversityandactivityofbiosurfactant-producingPseudomonasintherhizosphereofblackpepperinVietnam.J.Appl.Microbiol.104:839–851.

Trögl J,ChauhanA,RippS, LaytonAC,KuncováG,SaylerGS.2012.Pseudomonas fluorescensHK44:lessons learned fromamodelwhole-cell bioreporterwith a broad application history.Sensors12:1544–1571.

Troxler J, ZalaM,NatschA,Moënne-Loccoz Y, DéfagoG. 1997. Autecology of the biocontrol strainPseudomonas fluorescens CHA0 in the rhizosphere and inside roots at later stages of plantdevelopment.FEMSMicrobiol.Ecol.23:119–130.

Bronnen

75

Urbatsch IL, Sankaran B,Weber J, Senior AE. 1995. P-glycoprotein is stably inhibited by vanadate-inducedtrappingofnucleotideatasinglecatalyticsite.J.Biol.Chem.

Vallet-Gely I, Novikov A, Augusto L, Liehl P, Bolbach G, Péchy-TarrM, Cosson P, Keel C, CaroffM,LemaitreB.2010.AssociationofhemolyticactivityofPseudomonasentomophila,aversatilesoilbacterium,withcycliclipopeptideproduction.Appl.Environ.Microbiol.76:910–921.

Vasconcellos RLF, Mendes R, Taketani RG, Zucchi TD, Melo IS. 2013. Draft genome sequence ofPseudomonas sp . strain CMAA1215 , a plant growth-promoting bacterium isolated from aBrazilianMangrove.GenomeAnnounc.1:2164.

VoisardC,BullCT,KeelC,LavilleJ,MaurhoferM,SchniderU,DéfagoG,HaasD.1994.Molecularecologyof rhizosphere microorganisms. Chapter 6: Biocontrol of root diseases by PseudomonasfluorescensCHA0:currentconceptsandexperimentalapproaches.Ed.F.O’Gara,D.N.Dowling,B.Boesten.Weinheim,Germany:Wiley-VCHVerlagGmbH67-89p.

WangN,LuS-E,RecordsAR,GrossDC.2006.CharacterizationofthetranscriptionalAactivatorsSalAand SyrF,which are required for syringomycin and syringopeptin production byPseudomonassyringaepv.syringae.J.Bacteriol.188:3290–8.

ZhangJH,QuigleyNB,GrossDC.1997.AnalysisofthesyrPgene,whichregulatessyringomycinsynthesisbyPseudomonassyringaepv.syringae.Appl.Environ.Microbiol.63:2771–2778.

Bijlage

76

9.Bijlage

9.1TabellenTabelB1.VerschillendePseudomonasspeciesenbepaaldemutanten.Pseudomonassoort Karakteristiek BronCMR12a Wildtype (Perneeletal.,2007)CMR12a-ΔnodT MutantmetdeletieinnodT NietgepubliceerdCMR12a-ΔoprM MutantmetdeletieinoprM NietgepubliceerdCMR12a-ΔnodT-oprM DubbelmutantmetdeletieinnodTenoprM NietgepubliceerdCMR12a-Clp1 MutantmetinsertieinsesA (D’aesetal.,2011)CMR12a-ΔGI Mutantmetdeletievansessilinecluster NietgepubliceerdCMR5c Wildtype (Perneeletal.,2007)CMR5c-ΔnodT MutantmetdeletieinnodT NietgepubliceerdCMR5c-ΔoprM MutantmetdeletieinoprM NietgepubliceerdCMR5c-ΔnodT-oprM DubbelmutantmetdeletieinnodTenoprM NietgepubliceerdCMR5c-ΔLuxUp MutantmetdeletieinluxUp (Maetal.,2016)CMR5c-ΔLuxDown MutantmetdeletieinluxDown (Maetal.,2016)CMR5c-Δofa Mutantmetdeletieinorfamidecluster NietgepubliceerdP.protegensPf-5 Wildtype (Howell&Stipanovic,1979)P.protegensCHA0 Wildtype (Stutzetal.,1986)P.protegensCHA0-Δofa Mutantmetdeletieinorfamidecluster NietgepubliceerdPrimers(5'→3') PCR-CMR5c-luxUp F:GGTAGGTCTCGATGGAGCTG

R:GAAATGGATGATTCGCTGCTDezestudie

PCR-CMR5c-ofaA F:GATCTGGACCAGGACAGCATR:GTTGACCAGGTGATGGAAGC

Dezestudie

PCR-CMR5c-ofaB F:TGAACATGTACGGCATCACCR:CGATCACATAGGCCACCAG

Dezestudie

PCR-CMR5c-ofaC F:ATCCTCGGTTACCTGCTGTGR:AGCAGGTAGTTCAGGCGTTC

Dezestudie

PCR-CMR5c-macA F:CAGGAAGGCCAGACTGTGATR:GCACCTTGACGTTGTTGTTG

Dezestudie

PCR-CMR5c-macB F:AGCATCAGCGTGAAGATCAAR:CCCATGGAGAACACCATCTC

Dezestudie

PCR-CMR5c-luxDown F:CGCTGATGTGCTTTTCCACR:ACAAGCACTGTTCCCCCATA

Dezestudie

PCR-CMR5c-luxUp-ofaA F:AATTCGGTGTTTCCAGGTTGR:GATGTTGTACAAGGGCGAGTC

Dezestudie

PCR-CMR5c-ofaA-ofaB F:CAGTTGCAACAGGTGGACATR:CTTGTGCTCGACCAGACTGT

Dezestudie

PCR-CMR5c-ofaB-ofaC F:SEQGACCCGTTCAGTGATCAACCR:TGGACGTCCTTTTCCTTCAG

Dezestudie

PCR-CMR5c-ofaC-macA F:CAACCACTTCAGCCTGCTCR:ACTTCAATTGCCCGGAGAC

Dezestudie

PCR-CMR5c-macA-macB F:CTACAACGCGCTGTTCGATR:AACCGAGGATGTTCATCAGG

Dezestudie

PCR-CMR5c-macB-luxDown F:CTCGATCATTACTGCGTTCGR:CATGGTGGAAAAGCACATCA

Dezestudie

PCR–Pf-5-nodT F:AGGAACACCAGGTTGCTGTCR:GACATTCTCCAGGCCGAGTA

Dezestudie

Bijlage

77

PCR–Pf-5-luxUp F:GACAGTTCGGACAGGGAAAAR:GAACTGGGGCAGTTGATTTC

Dezestudie

PCR-Pf-5-ofaA F:GGCTGGACAAGTACCAGAGCR:CAATTCGTAGGACAGCGACA

Dezestudie

PCR-Pf-5-ofaB F:TCGATCACTACACCCTGCTGR:AATTTCTCGGCGTTGAGTTC

Dezestudie

PCR-Pf-5-ofaC F:GCCTACTACACCACCGTTGCR:GTAGATCAGGTTGGCCGGTA

Dezestudie

PCR-Pf-5-macA F:AAAATCGGTATGGGGCTGTTR:CTCGTAATCCTGCTGGGAAA

Dezestudie

PCR-Pf-5-macB F:GCATTTCCTTCAGCGAGAACR:GATGTTCATCACCCCGATTC

Dezestudie

PCR-Pf-5-luxDown F:CGGTATTGACCTTGAGCTTGAR:CAACACCCTGATGCAGACC

Dezestudie

PCR-Pf-5-nodT-luxUp F:CAGGGTCAGTGGGGAGTTACR:TTTTCCCTGTCCGAACTGTC

Dezestudie

PCR-Pf-5-luxUp-ofaA F:TCGCAATACTGCTGGTCAGAR:TCAGTTGGTCGAGCCAGATA

Dezestudie

PCR-Pf-5-ofaA-ofaB F:CCGAGGTACTGCAAGTGGAR:TCAATTCGCTGAACTGCATC

Dezestudie

PCR-Pf-5-ofaB-ofaC F:AACGAATGGAGATCGTCCTGR:GCACTGACGTGGTGGTAGAG

Dezestudie

PCR-Pf-5-ofaC-macA F:CAGGGGGAGGTCATGTCATAR:CCTTGACCTTGAGCGACTTC

Dezestudie

PCR-Pf-5-macA-macB F:CGCAGAACTTTCTCGAAACCR:ATGCTCAGGTCGATGTGCTT

Dezestudie

PCR-Pf-5-macB-luxDown F:GATATCCGCCAGCAGTTCCTR:AGCAGCTCAAGCTCAAGGTC

Dezestudie

qPCR-CMR12a&CMR5c-rpoD F:GAAGGCATCCGTGAAGTGATR:GTGTCGACAGGTGGAGGAAT

Dezestudie

qPCR-CMR12a-macA F:AGGAAACCAAGGCCACCTACR:ATCTGGATCTGCGCACTCTT

Dezestudie

qPCR-CMR12a-macB F:GCACCAAGGACTTCTTCACCR:GGTAACCGACACCAACATGA

Dezestudie

qPCR-CMR12a-luxDown F:GCCGACACAGACTTCCATTTR:GGTGGAGAAGCACATCAGTG

Dezestudie

qPCR-CMR12a–macB-luxDown F:GTGGTCTTCGGCTTCGTCR:GATGTACTCGCCCCAGGAG

Dezestudie

qPCR-CMR5c-macA F:GATCTCCAAGCAGGACTTCGR:GATCACAGTCTGGCCTTCCT

Dezestudie

qPCR-CMR5c-macB F:AGGAGCACGTCAAGAAGCTCR:GATGTTCATCACCCCGATG

Dezestudie

qPCR-CMR5c-luxDown F:GCGTTTCTCAAGCTGTTGGTR:GAACGGCCTATCAAGGATGA

Dezestudie

qPCR-CMR5c-macB-luxDown F:GTGGTCTTCGGGTTCGTCR:GGGCGTCTCTGGTCTTTCTC

Dezestudie

Bijlage

78

TabelB2.Preparatiesvanmediadiegebruiktwerdentijdensdeexperimenten.‘*’,mediadateerstmoetwordenopgelost door op te warmen in microgolf, ‘**’, media dat geautoclaveerd werden na samenstelling voor 25minutenop121°C,‘***’,pHaanpassentot5,7doorKOHtoetevoegen.Media Hoeveelheid Nodigestof

Agarosegel1%* 1g Agarose 100mL Bidestwater LB-vloeistof** 10g Tryptone(Bacto) 5g YeastExtract(Bacto) 10g NaCl 1L Bidestwater LB-medium** 10g Tryptone(Bacto) 5g YeastExtract(Bacto) 10g NaCl 15g Agar 1L Bidestwater LB0,6%medium** 10g Tryptone(Bacto) 5g YeastExtract(Bacto) 10g NaCl 6g Agar 1L Bidestwater KB-vloeistof** 20g Proteosepeptonnr.3(Difco) 1,5g K2HPO4 1,5g MgSO4 10mL Glycerol 1L Bidestwater KB-medium** 20g Proteosepeptonnr.3(Difco) 1,5g K2HPO4 1,5g MgSO4 10mL Glycerol 15g Agar 1L Bidestwater PDAmedium*,** 39g PotatoDextroseAgar(Difco) 1L Bidestwater MSmedium***,** 4,33g Murashige&Skoogmedium 7g PlantAgar 1L Bidestwater Normalesalineoplossing g NaCl 1L Bidestwater

TabelB3.Preparatiesvaninhibitorenwaarbijhetmoleculairgewichtwordtweergegeven,detebereidenoplossingom aan de concentratie in kolom 4 te geraken en de uiteindelijke concentratie die gebruikt wordt voor deexperimentenaangepastdoorbidestwatertoetevoegen.

Bijlage

79

Inhibitor Moleculairgewicht

Oplossing Concentratie Gebruikteconcentratie

Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone(CCC)

204,62g/mol 5,1155mgin1mLDMSO 25mM 25μM

Natriumorthovanadaat(NOV) 183,91g/mol 1,8391mg in 10mL bidest

water1mM 1mM

Glybenclamide(GLB) 494g/mol 2,47mg in 1mL DMSO +

4mLbidestwater1mM 10μM

Staal Pseudomonas Concentratie(ng/µL) 260/280zuiverheid

1 CMR5c-17u 988,23 1,72

2 CMR5c-17u 1135,87 1,63

3 CMR5c-17u 527,65 1,93

4 CMR5c-24u 707,61 1,93

5 CMR5c-24u 920,93 1,77

6 CMR5c-24u 1062,40 1,74

7 CMR5c-LuxUp-17u 2173,30 1,81

8 CMR5c-LuxUp-17u 2947,87 2,01

9 CMR5c-LuxUp-17u 1916,37 1,97

10 CMR5c-LuxUp-24u 1468,03 1,89

11 CMR5c-LuxUp-24u 1375,88 1,94

12 CMR5c-LuxUp-24u 1621,19 1,84

13 CMR5c-LuxDown-17u 1344,43 1,93

14 CMR5c-LuxDown-17u 2422,68 1,93

15 CMR5c-LuxDown-17u 1504,96 1,93

16 CMR5c-LuxDown-24u 1471,20 1,90

17 CMR5c-LuxDown-24u 1043,49 1,86

18 CMR5c-LuxDown-24u 1318,86 1,84

19 Pf5-17u 2543,34 1,90

20 Pf5-17u 2016,49 1,84

21 Pf5-17u 2251,71 2,00

22 Pf5-17u 2447,56 1,72

23 Pf5-17u 2136,82 1,63

24 Pf5-17u 1999,44 1,93

OD-analysevanCMR5cenmutanten

Pseudomonassp. OD17uur OD24uur OD48uur

TabelB4.DeconcentratievanhetgeëxtraheerdeRNAendezuiverheid260/280vanPseudomonassp.CMR5cenmutantenenP.protegensPf5.

TabelB5.AnalysevandeoptischedensiteitvoordePseudomonassp.CMR5cenzijnmutantenopdetijdstippen17uur,24uuren48uur.

Bijlage

80

CMR5c 1,44 1,62 1,64

CMR5c-nodT 1,79 1,67 1,69

CMR5c-oprM 1,2635 1,31 1,63

CMR5c-nodT-oprM 1,31 1,34 1,62

CMR5c-LuxUp 2,33 2,38 2,91

CMR5c-LuxDown 2,57 2,50 2,35

Pseudomonassp. Concentratie(ng/µL)

CMR5c–17u 527,65

CMR5c–24u 707,61

CMR5c-ΔluxUp–17u 1916,37

CMR5c-ΔluxUp–24u 1375,80

CMR5c-ΔluxDown–17u 1504,96

CMR5c-ΔluxDown–24u 1471,20

Gen PseudomonasspeciesCMR5c

17uur CMR5c CMR5c-LuxUp CMR5c-luxDown

rpoD 26,830 26,350 26,740

macA 34,370 34,010 33,980

macB 35,320 33,045 30,670

luxDown 32,905 33,100 34,635

macB-luxDown GeenCt GeenCt GeenCt

24uur CMR5c CMR5c-LuxUp CMR5c-luxDown

rpoD 30,050 27,845 27,530

macA 32,655 32,780 32,740

macB 34,645 33,690 33,855

luxDown 34,050 32,815 32,800

macB-luxDown GeenCt GeenCt GeenCt

TabelB6.ConcentratievancDNAinng/μLvanPseudomonassp.CMR5cna17uuren24uuropgroeiennodigvoorqPCR-analyse.

TabelB7.Ct-waardenvanqPCR-analysevanPseudomonassp.CMR5cna17uuren24uuropgroeieninLB-vloeistofop28°C.

Bijlage

81

TabelB8.SwarmingtestresultatenvanPseudomonassp.CMR12a,CMR5c,P.protegensPf-5enmutantenmetdrieverschillende inhibitoren: Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCC), natriumorthovanadaat (NOV) englybenclamide(GLB).μ,gemiddelde;σ,standaardafwijking;%RSD,relatievestandaardafwijking;p-waardevandeMann-WhitneyTestmetsignificantieniveau5%metalsnulhypothesedathetwildtypemetenzonderbehandelinggelijkisaandedemutantenmetenzonderbehandeling;%Effect,stijgend(+)ofdalend(-)effectvandemutatietenopzichtevanhetwildtype.Devetgedruktewaardenin%Effect-kolomzijnsignificant.Behandeling μ σ %RSD p-waarde %Effect

CMR12a 1,25 0,05 4% CMR12a-nodT 1,45 0,05 3% 0,014 16%CMR12a-oprM 3,35 0,46 14% 0,014 168%CMR12a-nodT-oprM 1,70 0,90 53% 0,029 36%

CMR12a+CCC 3,30 0,30 9% CMR12a-nodT+CCC 1,65 0,11 7% 0,014 -50%CMR12a-oprM+CCC 3,38 0,23 7% 0,043 2%CMR12a-nodT-oprM+CCC 4,55 0,85 19% 0,014 38%

CMR12a+NOV 1,10 0,00 0% CMR12a-nodT+NOV 1,25 0,09 7% 0,014 14%CMR12a-oprM+NOV 1,68 0,28 17% 0,014 53%CMR12a-nodT-oprM+NOV 1,40 0,00 0% 0,014 27%CMR12a+GLB 1,05 0,05 5% CMR12a-nodT+GLB 1,20 0,00 0% 0,014 14%

CMR12a-oprM+GLB 4,20 0,17 4% 0,014 300%CMR12a-nodT-oprM+GLB 4,35 0,36 8% 0,014 314%

CMR5c 3,95 0,61 15% CMR5c-oprM 4 1,16 29% 1 1%CMR5c-cmeC 4,33 0,58 13% 0,343 10%CMR5c-oprM-cmeC 3,88 0,59 15% 0,886 -2%CMR5c+CCC 4,25 0,36 9% CMR5c-oprM+CCC 4,63 0,18 4% 0,343 9%CMR5c-cmeC+CCC 5 0,24 5% 0,057 18%CMR5c-oprM-cmeC+CCC 5,23 0,48 9% 0,029 23%

CMR5c+NOV 5,03 0,18 4% CMR5c-oprM+NOV 5,65 0,11 2% 0,029 12%CMR5c-cmeC+NOV 6,15 0,35 6% 0,029 22%CMR5c-oprM-cmeC+NOV 2,05 0,15 7% 0,029 -59%

CMR5c+GLB 3,7 0,52 14% CMR5c-oprM+GLB 3,6 0,1 3% 1 -3%CMR5c-cmeC+GLB 3,65 0,35 10% 0,886 -1%CMR5c-oprM-cmeC+GLB 1,48 0,28 19% 0,029 -60%

TabelB9.AnalysevanhetpiekoppervlakvanorfamidegedeelddoordeoptischedensiteitvoorPseudomonassp.CMR5cenzijnmutantenopdetijdstippen17uur,24uuren48uur.DemutantenLuxUpenLuxDownwordennietweergegevendoordatzijgeenorfamideproduceren.Pseudomonassp. Piekoppervlak17uur Piekoppervlak24uur Piekoppervlak48uur

CMR5c 3364739,57 19928485,99 32388381,11

CMR5c-nodT 4951556,64 32054106,39 53566484,34

CMR5c-oprM 4696705,59 17504900,45 40536131,99

CMR5c-nodT-oprM 4944455,13 16853539,52 47263262,48

Bijlage

82

TabelB10.P-waardenvandeMann-WhitneyTest inmatrixvormvande invitro inhibitie testvanP.protegensCHA0.Vetgedruktewaardenzijnsignificantophet5%significantieniveau.p-waarden Controle CHA0 CHA0-Δorf CHA0cel CHA0-Δorfcel

Controle 0,002 0,002 0,002 0,002

CHA0 0,240 0,026

CHA0-Δorf 0,180

CHA0cel 0,699

CHA0-Δorfcel

TabelB11.P-waardenvandeMann-WhitneyTestinmatrixvormvandeinvitroinhibitietestvanPseudomonassp.CMR5c.Vetgedruktewaardenzijnsignificantophet5%significantieniveau.p-waarden Controle CMR5c CMR5c-Δorf CMR5ccel CMR5c-Δorfcel

Controle 0,002 0,002 0,002 0,002

CMR5c 0,002 0,009

CMR5c-Δorf 0,015

CMR5ccel 0,002

CMR5c-Δorfcel

TabelB12.Degemiddeldediametermetstandaardafwijkingvan invitro inhibitieexperimentmetP.protegensCHA0enPseudomonassp.CMR5cenorfamidemutanten. ‘Cel’wijsteropdatdebacteriecultuurmetcellen isgebruikt, zonder deze aanwijzing betekent dat het supernatans werd gebruikt. μ, gemiddelde; σ,standaardafwijking; %RSD, relatieve standaardafwijking; p-waarde van de Mann-Whitney Test metsignificantieniveau 5%met als nulhypothese dat de behandelingmet cellen gelijk is aan de behandelingmetsupernatans;%Effectgeeftaanwatheteffectisvanhetgebruikenvandecelleninvergelijkingmetsupernatansop de inhibitie van Pythiummyriotylum.De vetgedruktewaarden in%Effect-kolom zijn significant op het 5%significantieniveau.Behandeling μ σ %RSD p-waarde %Effect

CHA0 1,90 0,10 5% CHA0cel 1,72 0,12 7% 0,026 -9%CHA0-Δorf 1,80 0,13 7% CHA0-Δorfcel 1,68 0,11 6% 0,18 -7%CMR5c 2,32 0,11 5% CMR5ccel 2,07 0,09 5% 0,009 -11%CMR5c-Δorf 1,90 0,08 4% CMR5c-Δorfcel 1,73 0,07 4% 0,015 -9%

Bijlage

83

9.2Figuren

Tabel B13. P-waarden van de Mann-Whitney Test in matrixvorm van het cocoyamplant experiment van P.protegensCHA0enPseudomonassp.CMR5c.Vetgedruktewaardenzijnsignificantophet5%significantieniveau.p-waarden Positieve

controleNegatievecontrole

CHA0 CHA0-Δorf CMR5c CMR5c-Δorf

Positievecontrole

0,008 0,151 0,151 0,310 0,690

Negatievecontrole

0,008 0,056 0,008 0,008

CHA0 0,690 0,548

CHA0-Δorf 0,310

CMR5c 0,841

CMR5c-Δorf

FiguurB1.DissociatiecurvesvanPseudomonassp.CMR5cvoordegenenrpoD,macA,macBenluxDownbijqPCR-analyse.

Bijlage

84

FiguurB2.InvitroexperimentmetPythiummyriotylumenbacteriënP.protegensCHA0enzijnorfamidemutantenPseudomonassp.CMR5cenzijnorfamidemutant.ControlebevatvieragarblokjesP.myriotylummaargeenbacteriën.

CMR5c-cellsCMR5c-Δorf-cells

CMR5cCMR5c-Δorf

Controle

CHA0-cellsCHA0-Δorf-cells

CHA0CHA0-Δorf

De biosynthese, regulatie en secretie van cyclische lipopeptiden in...

Documents

Transcript of De biosynthese, regulatie en secretie van cyclische lipopeptiden in...