De binaire interactiestudie van het TPLATE complex

De binaire interactiestudie van het TPLATE

complex

Leentje DE PUYSSELEYR

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van

Master in de Biochemie en de Biotechnologie

Major Plantenbiotechnologie

Academiejaar 2009-2010

Promotor(en): Dr. Jenny Russinova en Dr. Daniël Van Damme

Wetenschappelijk begeleider: Dr. Daniel Van Damme

Vakgroep Plantenbiotechnologie en Genetica

VIB - Departement Planten Systeembiologie

Confidentialiteitsclausule

Dit document en de informatie die het omvat, worden voorgesteld in confidentialiteit, met als

enig doel de evaluatie van de Masterproef van Leentje De Puysseleyr , en mogen niet onthuld

worden aan een derde partij of voor andere doeleinden gebruikt worden zonder uitdrukkelijke

geschreven toestemming van dr. Jenny Russinova.

DANKWOORD

Dit werk kwam enkel tot stand dankzij de hulp van velen. In het bijzonder wil ik mijn

promotor dr. Jenny Russinova en copromotor dr. Daniël Van Damme bedanken. Hun

begeleiding bij het verrichten van wetenschappelijk onderzoek heeft me ontzettend veel

bijgeleerd. Bedankt: voor de aangeboden kans, het vertrouwen, de kritische opmerkingen en

het geduld.

Uiteraard wens ik ook mijn medestudenten bijzonder te bedanken, voor de dagelijkse steun en

praktische hulp.

Ook mijn ouders verdienen een bijzonder woord van dank voor alle kansen die me zijn

geboden. Hun dagelijkse steun bleek echt onmisbaar. Mijn zussen Annemieke en Veronic wil

ik bedanken voor de steun en de praktische hulp.

Als laatste verdient mijn tweelingzus een speciale vermelding. Dankjewel! Voor alle

aanmoedingen, de vrolijke noten, maar vooral omdat je er onvoorwaardelijk bent.

Leentje, juni 2010

1

INHOUD

Dankwoord ................................................................................................................................. 4

Lijst met afkortingen .................................................................................................................. 2

Samenvatting .............................................................................................................................. 4

Summary .................................................................................................................................... 6

Hoofdstuk 1: Inleiding ............................................................................................................... 8

1. Cytokinese in planten ...................................................................................................... 8

2. Endocytose in planten ................................................................................................... 15

3. Endocytose tijdens Cytokinese ...................................................................................... 21

4. TPLATE en het TPLATE-complex .............................................................................. 24

Hoofdstuk 2: Doel .................................................................................................................... 29

Hoofdstuk 3: Resultaten ........................................................................................................... 30

1. Binaire gist-twee-hybride interacties................................................................................ 30

2. BiFC in Nicotiana benthamiana ...................................................................................... 47

3. BiFC in Arabidopsis thaliana ........................................................................................... 65

4. interactie via Ectopische mislokalizatie in BY-2 ............................................................. 72

Hoofdstuk 4: Discussie ............................................................................................................. 75

Hoofdstuk 5: Materiaal en methode ......................................................................................... 85

Referenties ................................................................................................................................ 92

Addendum: Protocols ............................................................................................................... 98

2

LIJST MET AFKORTINGEN

AF actinefilamenten

ADZ actin-depleted zone of actine vrije zone

AP adaptor complex

AP180 assembly protein 180

AtTAN: Arabidopsis Tangled

BFA Brefeldine A

CCV clathrin coated vesicles

CDZ cortical delingszone

CLC clathrin light chain

CHC clathrin heavy chain

CME clathrin mediated endocytosis

COP coat protein

DRPs Dynamine related proteïnen

EH Eps15 homologie

ER endoplasmatisch reticulum

GSL8 Glucan Synthase Like 8

KDZ KCA1 depleted zone

KRP kinesin related motor protein

KN KNOLLE

MAP microtubule associated protein

MT: microtubuli

PD plasmodesmata

PM: plasma membraan

3

PPB Preprofaseband

PRD proline-rich domain

RSH ROOT/SHOOT/HYPOCOTYL-DEFECTIVE of

SH3 Scr homology 3

SNARE oplosbare N-ethyl-maleimide gevoelige factor aanhechtings protein

receptoren

TGN Trans-Golgi-Netwerk

TN tubulair netwerk protein 2

TVN Trans vesiculair netwerk

WT wild type

4

SAMENVATTING

TPLATE uit Arabidopsis is een plant-specifiek eiwit essentieel voor de vorming van

levensvatbare pollenkorrels en voor de laatste fasen van cytokinese in somatische cellen. De

tplate insertie mutant is mannelijk steriel. Constitutieve RNAi in BY-2 cellen leidt tot

defecten in de celplaatverankering met het parentale plasmamembraan. Bovendien lokaliseert

het ter hoogte van de celplaat en in een nauwe regio van het plasmamembraan rond de

celplaat insertiesite in BY-2 cellen en Arabidopsis. Dit zijn sterke aanwijzingen voor een rol

voor TPLATE in de vesikel fusie events tijdens de laatste fasen van de cytokinese. TPLATE

vertoont daarnaast gelijkenissen met adaptormoleculen betrokken in clathrine afhankelijke en

onafhankelijke vesikelvorming. Bovendien kan dit eiwit interageren met de Arabidopsis

clathrin light chain 1 in epidermale cellen van Nicotiana benthamiana. Deze observaties

kunnen wijzen op een link met clathrine gemedieerde endocytose.

Om meer informatie te verkrijgen over de functie van TPLATE werden interactors van

TPLATE opgespoord via TAP experimenten. Op deze manier werden 12 interactors

geïdentificeerd, waarvan zeven eiwitten in onafhankelijke TAP experimenten bevestigd

werden. Samen vormen zij het TPLATE complex. Verschillende van deze eiwitten zijn zelf

ook gelinkt met clathrine gemedieerde endocytose via homologie van hun structuur.

Deze masterthesis onderzocht de interacties tussen de leden van dit TPLATE complex in een

binaire interactiestudie. Daartoe werden drie strategiëen gebruikt.

Ten eerste werden de geconfirmeerde leden van het complex gebruikt voor een Y2H screen.

Ook twee clathrin light chain en twee clathrin heavy chain eiwitten van Arabidopsis werden

ingesloten om interactie van de leden van het complex met clathrine te onderzoeken.

Daarnaast werd een beperkt aantal interacties, waaronder die tussen TPLATE en de clathrine

moleculen, geëvalueerd via bimoleculaire fluorescentie complementatie in Nicotiana

benthamiana en Arabidopsis. Ten slotte werd geprobeerd om de interactie tussen TPLATE en

CLC1 te bevestigen door ectopische lokalisatie van TPLATE in BY-2 cellen.

De Y2H screen onthulde de directe interactie tussen het SH3-like eiwit met twee andere leden

van het complex, sigma-like en TPLATE. Verder werd ook interactie tussen CLC en CHC

eiwitten aangetoond. Via bimoleculaire fluorescentie complementatie kon de interactie tussen

TPLATE en clathrin light chain 1 bevestigd worden en werd aangetoond dat TPLATE kan

dimeriseren. Daarnaast werd ook interactie tussen TPLATE en clathrin heavy chain 1

5

gedemonstreerd. Dit laatste versterkt de link tussen TPLATE en clathrine gemedieerde

endocytose. Evaluatie van BiFC gebruikmakend van stabiele transformanten in Arabidopsis

alsook interactie gebruikmakend van ectopische lokalisatie in BY-2 was tot dusver niet

succesvol. De volgende stap in dit onderzoek zal dan ook omvatten dat de gedetecteerde

interacties in Nicotiana in stabiele Arabidopsis transformanten aangetoond om in situ

informatie te verkrijgen van de vorming van het TPLATE complex in de juiste context van

plantontwikkeling en cytokinese.

6

SUMMARY

Several observations suggest the involvement of the TPLATE Arabidopsis plant-specific

protein in both the genesis of viable pollen and the final phases of cytokinesis in somatic cells.

The TPLATE insertion mutant is male sterile. Constitutive RNAi in BY-2 cells shows defects

in the cell plate anchoring in the parental plasma membrane. Moreover, the TPLATE protein

is located on the cell plate and in a limited region of the plasma membrane around the cell

plate insertion site in BY-2 cells and Arabidopsis. These observations indicate a role of the

TPLATE protein in the vesicle fusion events during the final phases of cytokinesis. The

TPLATE protein also resembles some adaptor molecules involved in clathrin dependent and

independent vesicle genesis. Furthermore, it interacts with Arabidopsis clathrin light chain 1

in epidermal cells of Nicotiana benthamiana. This might suggest a relation with clathrin

mediated endocytosis.

Determination of TPLATE’s interactors by means of TAP experiments provided more insight

into its function. Twelve such interactors were identified, whereof seven were confirmed in

independent TAP experiments. These twelve proteins constitute the TPLATE complex.

Several of them are themselves related to clathrin mediated endocytosis through structure

homology.

This master thesis investigated the interaction between the TPLATE complex proteins in a

binary interaction study. For this purpose, three different strategies have been used.

At first the confirmed proteins of the complex were subjected to a Y2H screen. In order to

investigate the interaction between the complex proteins and clathrin, two clathrin light chain

and two clathrin heavy chain proteins of Arabidopsis are included. Secondly a limited amount

of interactions, including those between TPLATE and the clathrin molecules, were evaluated

by means of bimolecular fluorescence complementation in Nicotiana benthamiana and

Arabidopsis. Finally it was attempted to confirm the interaction between TPLATE and CLC1

through ectopic localisation of TPLATE in BY-2 cells.

The Y2H screen revealed direct interaction between SH3-like and two other proteins of the

complex, sigma-like and TPLATE. Furthermore, interaction between CLC and CHC proteins

was demonstrated. Interaction between TPLATE and clathrine light chain 1 was confirmed

through bimolecular fluorescence complementation experiments, and dimerisation of

7

TPLATE was identified. Besides, interaction between TPLATE and clathrine heavy chain

was detected. The latter further reinforces the link between TPLATE and clathrine mediated

endocytosis. Evaluation of bimolecular fluorescence complementation based on stable

Arabisopsis transformants as well as testing interaction through ectopic lokalisation in BY-2

cells was not successful. The following step is the demonstration of the detected interactions

in Nicotiana in stable Arabidopsis transformants. In such a way, we can acquire in situ

information on the assembly of the TPLATE complex in the proper context of plant

development and cytokinesis.

8

HOOFDSTUK 1: INLEIDING

1. CYTOKINESE IN PLANTEN

DELING DOOR FUSIE

Cytokinese is het proces waarbij na de deling van de kern, ook het cytoplasma in twee wordt

gedeeld. Dit gebeurt in hogere planten door vorming van een nieuwe celwand tussen de twee

dochterkernen. Cytokinese is een essentieel deel van de celcyclus in alle eukaryote cellen. In

tegenstelling tot andere aspecten van de celdeling is cytokinese onafhankelijk geëvolueerd

tussen hogere planten en niet-plant organismen (Oliferenko et al, 2009).

In dieren en gisten wordt een actomyosinering gevormd, waarbij door insnoering van het

plasmamembraan een klievingsgroef ontstaat. Het cytokineseproces start dus aan de periferie

van de cel. De nieuwe wand tussen de dochtercellen wordt gevormd door afzetting van

membraanvesikels ter hoogte van de ingroeiende groef (Balasubramanian et al, 2004).

In cellen van hogere planten daarentegen start cytokinese in het centrum van de cel (figuur 1).

Door fusie van vesikels wordt er een transiënt membraancompartiment gevormd, de celplaat.

Deze groeit verder centrifugaal uit en versmelt uiteindelijk met het plasmamembraan in de

periferie van de cel. Planten hebben hiervoor gespecialiseerde cytoskeletstructuren

ontwikkeld: de preprofaseband (PPB) en fragmoplast (Jurgens et al., 2005).

INITIELE VESIKEL FUSIE

De preprofaseband (PPB) is een dense band van micortubuli (MT) en actine microfilamenten

(AF) en ontstaat uit de corticale micortubule MT array in de cortex van interfase cellen tijdens

de voorbereiding op cytokinese. De PPB merkt de delingszone in de cortex van de cel. Ter

hoogte van de positie waar de PPB wordt gevormd, zal de groeiende celplaat versmelten met

het parentaal plasmamembraan. De PPB, die bestaat uit gealigneerde bundels van MT en

actinefilamenten (AF), wordt gevormd voor de profase en verdwijnt weer bij de afbraak van

het nucleaire membraan tijdens de prometafase (Jurgens, 2005a).

9

figuur 1 Cytokinese van somatische plantencellen. Tijdens de profase wordt de preprofaseband gevormd in de

cortex van de cel. Dit is een transiënte structuur die bestaat uit MT en AF en die het delingsvlak bepaalt. Tijdens

de anafase wordt uit MT van de spoelfiguur de fragmoplast gevormd in het midden tussen de dochternuclei.

Tijdens de telofase wordt de celplaat gevormd door fusie van vesikels. Deze initiatie en verder expansie van de

celplaat wordt gemedieerd door de fragmoplast. Tijdens de cytokinese versmelt de celplaat met het parentale PM

(Jurgens, 2005a).

De fragmoplast bevat zowel MT als AF, die beiden georganiseerd zijn in 2 bundels met hun

plus-eind naar het delingsvlak georiënteerd (Segui-Simarro et al, 2004). De MT van de

fragmoplast ontstaan uit de overblijvende kinetochoor MT tijdens de anafase, groeien in

aantal en combineren tot 2 korte bundels, tussen de 2 dochterkernen. Hoe de transitie van

kinetochoor MT naar fragmoplast MT precies gebeurt, is niet gekend. Voor vorming van deze

structuur is de afbraak van cycline B1 tijdens metafase-anafase transitie vereist (Weingartner et

al, 2004). Eens de fragmoplast MT gevormd zijn, blijft hun organisatie behouden door MT-

geassocieërde eiwitten (MT associated proteins of MAP) en kinesine verwante motoreiwitten

(‘kinesin related proteins’ of KRP). MAP65-1 bijvoorbeeld, associeert met alle MT tijdens de

cytokinese (Lloyd & Hussey, 2001).

De fragmoplast heeft twee belangrijke functies: hij medieert transport van membraanvesikels

naar het celdelingsvlak en is essentieel voor laterale expansie van de celplaat naar de

delingssite in de cortex van de cel. In interfase cellen wordt het transport van vesikels naar

het PM hoofdzakelijk gemedieerd door AF (Geldner et al, 2001). De celplaat kan als een

immatuur PM gezien worden. In delende cellen verzorgen de MT van de fragmoplast het

10

transport van vesikels naar de groeiende celplaat (Otegui et al, 2001; Segui-Simarro et al, 2004). Het

motoreiwit verantwoordelijk voor dit transport is nog niet gekend. Een mogelijke kandidaat is

AtPAKRP2, dat naast colokalisatie met KNOLLE (zie verder) ter hoogte van de celplaat ook

voorkomt in de fragmoplast (Lee et al, 2001).

Vesikels worden aangevoerd via de MT van de fragmoplast. Nadat de vesikels aangekomen

zijn in het delingsvlak versmelten ze met elkaar. Door deze initiële versmelting ontstaan

dunne buisjes van ongeveer 20 nm die het tubulo-vesiculaire netwerk vormen (TVN)

(Samuels et al., 1995).

De vesikels waaruit de celplaat ontstaat zijn van diverse oorsprong. Zowel de secretorische

als de endocytische pathways dragen substantieel bij tot celplaatvorming (Van Damme et al,

2008). Via hoge resolutie elektron tomografie worden twee types vesikels geobserveerd rond

de zicht ontwikkelende celplaat: kleine donkere vesikels en grotere lichtere vesikels (Segui-

Simarro et al, 2004). De kleinere vesikels worden beschouwd als bouwstenen van de celplaat en

geven door fusie aanleiding tot de grotere, lichtere vesikels. De kleinere vesikels bevinden

zich rondom de Golgi stapels en zijn waarschijnlijk hiervan afgeleid. Tijdens de mitose

accumuleren de Golgi stapels in een ring rond de plaats van celplaatvorming. De nabijheid

van de Golgi stapels zou de aanvoer van Golgi-afgeleide vesikels naar het delingsvlak kunnen

vergemakkelijken (Segui-Simarro et al, 2004).

Er zijn veel aanwijzingen dat ook endocytose bijdraagt aan celplaatvorming (zie verder) Er

blijft veel discussie over de precieze oorsprong van de vesikels. Dit kan mogelijk verklaard

worden door de sterke associatie tussen het trans-Golgi netwerk (TGN) en het Golgi apparaat.

Het TGN functioneert ook als vroeg endosomaal compartiment (Robinson et al, 2008). De

secretorische en endocytische pathways convergeren dus in het TGN. Samen met polarisatie

van vesikeltransport tijdens cytokinese kan dit de aanwezigheid van eiwitten van het PM en

de secretorische pathway in de celplaat verklaren (Van Damme et al, 2008). Daarnaast zijn er ook

aanwijzingen voor het bestaan van een alternatieve secretorische route. Zo vindt er tijdens

wortelhaar expansie AtRAB4 gemedieerde secretie plaats tussen Golgi en een endosomaal

compartiment verschillend van het TGN. AtRAB4 is een Rab GTPase (zie verder) betrokken

in membraanfusie (Preuss et al, 2004)

Eens de vesikels aangekomen zijn in het delingsvlak, versmelten ze met elkaar. In eukaryoten

wordt deze membraanfusie gemedieerd door Rab GTPasen en hun effectoren enerzijds, en

‘Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor adaptor protein receptor’ (SNARE) complexen

11

anderzijds (Jahn et al, 2003). Rab GTPasen en hun effectoren zijn betrokken in het ‘docken’

van de vesikels aan het doelmembraan. Er zijn nog geen van deze eiwitten geïdentificeerd met

een rol bij de vorming van de celplaat. SNARE complexen worden gevormd door interactie

tussen SNARE eiwitten aanwezig op het vesikel- en targetmembraan(v- en t-SNARE). Door

interactie vormen de eiwitten bundels met 4 helices, het trans-complex. Vorming van trans-

complexen brengt de membranen dicht bij elkaar en induceert fusie. SNAREs behoren tot de

meest bestudeerde moleculaire componenten betrokken in vesikelfusie tijdens cytokinese.

SNARE eiwitten kunnen worden onderverdeeld in Qa (syntaxines), Qb, Qc en R-SNAREs op

basis van de aanwezigheid van verschillende SNARE motieven (Jahn et al, 2003).

Het syntaxine KNOLLE (KN), een Qa-SNARE, is oorspronkelijk geïdentificeerd in een

cytokinese-defectieve mutant waarbij vesikels accumuleren in het celdelingsvlak (Lukowitz et

al, 1996). Dit membraan geassocieerd eiwit komt enkel tot expressie tijdens de M-fase van de

celcyclus, en lokaliseert ter hoogte van de Golgi stapels en de celplaat. KN is specifiek

betrokken in vesikelfusie tijdens cytokinese (Lauber et al, 1997).

KEULE is een Sec1/Munc18 (SM) eiwit dat interageert met KNOLLE, en deze interactie

bevordert vesikelfusie. SM eiwitten interageren met syntaxines of geassembleerde SNARE

complexen. Deze interactie zou de specificiteit van de SNARE activiteit verhogen. KEULE

werd geïdentificeerd in een mutant defectief in vesikelfusie tijdens cytokinese. De lokalisatie

van KN in deze mutant is onveranderd (Jahn et al, 2003).

EXPANSIE VAN DE CELPLAAT

De expansie van de celplaat naar de cortex is een complex proces waarbij zowel MT als AF

betrokken zijn. De MT zijn vooral belangrijk voor de aanvoer van vesikels. In tegenstelling

tot de corticale MT blijven na het verdwijnen van de PPB AF aanwezig in de cortex van de

cel buiten de delingszone (Hoshino et al, 2003). De functie van de AF in de cytokinese is minder

uitgesproken dan die van de fragmoplast MT. De AF werken voornamelijk stabiliserend en

verbinden de celplaat met de cortex tijdens de expansie (Valster et al, 1997). Vermoedelijk zijn

het niet zozeer de AF maar eerder de MT die instaan voor de geleiding van de celplaat naar de

corticale delingszone (CDZ) (Van Damme et al, 2007).

De dynamiek van het microtubuline speelt een zeer belangrijke rol bij de celplaatvorming.

Tijdens de ontwikkeling van de celplaat in het centrum van het delingsvlak, beginnen de

geassocieerde fragmoplast MT te depolymeriseren, behalve deze aan de rand van de celplaat.

Nieuwe MT polymeriseren naast de overgeblevenen, waardoor transport van vesikels

12

specifiek naar de rand van de groeiende celplaat plaatsvindt. De binnenste MT

depolymeriseren telkens, en nieuwe MT worden toegevoegd aan de buitenkant van de

bestaande. Deze cyclus wordt herhaald tot de celplaat de delingszone in de cortex heeft

bereikt. Het kinesine HINKEL (HIK) in Arabidopsis en zijn homologen NACK1 en 2 in BY-2

cellen spelen een belangrijke rol in deze MT dynamiek tijdens de cytokinese (Nishihama et al,

2002). NACK1 activeert het MAP kinase kinase kinase (MAP3K) NPK1 en target het zo naar

het plus-eind van fragmoplast MT (Soyano et al, 2003). Zowel NPK1 als zijn target NQK1

(MAPKK) worden geïnactiveerd door MT depolymerisatie. De NPK1 signalisatie wordt dus

waarschijnlijk gecontroleerd door een negatieve feedback loop, die leidt tot depolymerisatie

en uiteindelijk NPK1 inactivatie. De NPK1-gemedieerde MT depolymerisatie gebeurt niet in

de ‘celplaat assemblage matrix’ aan de rand van de groeiende celplaat maar enkel ter hoogte

van de MT in het centrum. Hierdoor worden de vesikels enkel naar de rand van de groeiende

celplaat getransporteerd.

Door afzetting van celwand polysacchariden en callose in het lumen van het TVN wordt

hieruit dan het tubulair netwerk (TN) gevormd (Samuels et al, 1995). Om hierbij uitstulping van

het membraan te voorkomen, wordt overtollige membraan verwijderd door de activiteit van

‘dynamin-related proteins’ (DRPs), vroeger ook ‘Arabidopsis dynamin-like proteins’ (ADLs)

genoemd (Kang et al, 2003). Dynamine GTPases zijn mechano-enzymes die ringstructuren

kunnen vormen rond membranen waardoor deze afgesnoerd kunnen worden (Praefcke &

McMahon, 2004). Hierdoor kan membraan dat uitstulpt van de groeiende celplaat verwijderd

worden. Daarnaast zijn ze ook betrokken in de afsnoering van clathrine gecoate vesikels (zie

verder). Deze clathrine gecoate vesikels komen ook voor in de buurt van de groeiende celplaat

(Segui-Simarro et al, 2004). Dit suggereert dat overtollig membraan verwijderd wordt van de

celplaat door een endocytose-gerelateerd proces, waarbij DRPs betrokken zijn (zie verder).

De eiwitten die behoren tot de DRP1 familie in Arabidopsis zijn geassocieerd met de celplaat.

DRP1a interageert met callose synthase, naast zijn rol in membraanafsnoering (Hong et

al.,2001). Op deze manier kan het callose afzetting in het lumen van de celplaat bevorderen.

Naast een hogere callose inhoud heeft het TN ook een lager densiteit van MT en clathrine

‘buds’, en een vlakkere morfologie dan het TVN. Door verdere afzetting van

celwandcomponenten in het lumen, wordt het TN uiteindelijk omgevormd tot een bijna

continu vlak met enkele openingen, de fenestrae. Deze structuur wordt het ‘fenestrated

sheet’ stadium genoemd (zie fig. 2) (Samuels et al., 1995).

13

figuur 2 Model voor celplaatverankering in hogere planten. A-B Secretorische en endocytische vesikels worden via de

MT van de fragmoplast naar de equatoriale zone getransporteerd en versmelten waardoor het tubulo-vesiculaire netwerk

(TVN) wordt gevormd. C Uit het TVN ontstaat het tubulaire netwerk (TN) door afzetting van callose in het lumen. Tijdens

deze fase is de celplaat vlakker en de MT densiteit lager. D Terwijl in het lumen verder celwand componenten worden

afgezet. Zo wordt een bijna continu vlak gevormd, met hier en daar een opening. Dit zijn de fenestrae, en dit stadium wordt

het ‘fenestrated sheet’stadium genoemd. De plaat versmelt met het parentale PM via vingervormige uitstulpingen op de

positie eerder gemerkt door de PPB. E Na versmelting wordt uiteindelijk ook cellulose afgezet in het lumen van de nieuwe

celwand (Samuels et al., 1995).

FUSIE VAN DE CELPLAAT MET HET PARENTALE PLASMAMEMBRAAN EN MATURATIE

De celplaat versmelt uiteindelijk met de oorspronkelijke celwand door fusie met honderden

uitstulpingen die gevormd worden aan de rand van de celplaat (Samuels et al, 1995). De

versmelting is een trigger voor verdere maturatie (Mineyuki, 1999). De fusie gebeurt meestal

niet symmetrisch over de omtrek van de cel (Cutler & Ehrhardt, 2002). Hoe dit proces precies

verloopt is nog niet gekend, net zoals de oorsprong van de vesikels hierbij betrokken. In

mutanten die defectief zijn in vesikel transport tijdens de vroege celplaat ontwikkeling komen

vaak onvolledige celwanden en uitstulpingen voor. Een voorbeeld hiervan is de knolle mutant

die ongefuseerde vesikels accumuleert over het volledige delingsvlak. De uitstulpingen zijn

ook aanwezig als het transport van ER naar Golgi wordt verstoord en KN in het ER gevangen

zit. Dit kan verwezenlijkt worden door BFA behandeling van bijvoorbeeld de GNOM –

LIKE1 mutanten. GNOM (GN) en GNOM-LIKE1 (GNL1) zijn ARF-GEFs in Arabidopsis.

Deze eiwitten zijn betrokken in rekrutering van manteleiwitten naar het membraan tijdens de

vorming van vesikels ter hoogte van het ER (Spang, 2008) (zie verder). BFA of brefeldine A is

een fungaal toxine dat BFA gevoelige ARF-GEFs, zoals GNOM, inhibeert (Renault et al, 2002).

GNL1 is echter niet gevoelig voor BFA, waardoor transport van ER naar Golgi en dus

14

secretie enkel stilgelegd kan worden door BFA behandeling van een gnl1 mutant. Aangezien

de uitstulpingen ook aanwezig zijn in kn mutanten en bij blokkering van KN in het ER,

gebeurt de vorming van de uitstulpingen onafhankelijk van KN en onafhankelijk van vesikel

transport vanaf het TGN (Reichardt et al, 2007). Volgens deze redenering is voor vorming van de

vesikels die de fusie tussen de celplaat en het plasmamembraan bewerkstelligen, synthese van

eiwitten en Golgi transport dus niet essentieel. De vesikels die aanleiding geven tot het

ontstaan van de uitstulpingen zouden dus van endosomale oorsprong en/of rechtstreeks

afkomstig van het plasmamembraan kunnen zijn (Van Damme et al, 2008)

Hoewel het exacte mechanisme van fusie nog niet gekend is, zijn er wel al een aantal eiwitten

geïdentificeerd die hierbij mogelijk een belangrijke rol spelen. Tijdens de verankering van de

celplaat in het parentaal plasmamembraan accumuleert TPLATE (TPL), een eiwit

geassocieerd met de celplaat, in een nauwe regio rond de insertiesite. TPLATE vertoont

similariteit met coat en adaptor eiwitten, en zou dus een functie kunnen hebben in vesikel

transport. Een T-DNA insetiemutant in TPLATE vertoont mannelijke steriliteit door een

veranderde vesikelsamenstelling en een verhoogde afzetting van callose waardoor het pollen

tijdens de maturatie verschrompelt. Dit fenotype is heel gelijkaardig aan dat van de drp1c

mutant, die vermoedelijk een rol speelt in plasmamembraantransport (Kang et al, 2003).

Neerregulatie van TPL in Arabidopsis en Nicotiana tabacum Bright Yellow-2 (BY-2)

suspensieculturen resulteert in een falen van de celplaat in de fusie met het parentale PM.

TPLATE is dus waarschijnlijk betrokken in vesikelfusie tijdens heterotypische fusie van de

celplaat en het plasmamembraan (van Damme et al, 2006).

Root-shoot-hypocotyl defective (RSH) is een hydroxyl Proline-rijk glycoprotein dat

lokaliseert ter hoogte van de celwand. De HRGP-familie van geglycosyleerde eiwitten speelt

een rol in het versterken van de celwand, en zijn dus waarschijnlijk belangrijk in het bepalen

van de celvorm en plantmorfologie. RSH is daarnaast ook betrokken in de positionering van

de celplaat. Het eiwit accumuleert ter hoogte van de site van celplaat-celwand contact.

Verstoring van het RSH eiwit is embryo-lethaal en veroorzaakt misplaatste celplaten,

waardoor de celvorm en grootte verandert (Lam et al, 2001).

Mutaties in Glucan sythase like 8 (GSL8 of MASSUE), een callose synthase, veroorzaakt

verschillende defecten in cytokinese zoals celwand uitstulpingen of twee nuclei in één cel

door afwezigheid van een celplaat (Thiele et al, 2009). De mutant vertoont een reductie in callose

afzetting in de celplaat en/of nieuwe celwand. Daarnaast komen frequent openingen voor in

15

de overgang van de dwarswand naar het parentale PM. De afzetting van callose is dus ook

belangrijk voor de vervollediging van cytokinese. Naast deze cytokinese defecten vertoont de

mutant ook overproliferatie van cellen in bv epidermis, en verstoring van stomatale

patterning. De hypothese hieromtrent is dat plasmodesmata niet dichtgemaakt worden met

callose en hierdoor identiteitsfactoren kunnen migreren naar naburige cellen (Gusemann et al.,

2010).

De afzetting van callose helpt de vroege membraannetwerken van de vormende celplaat te

stabiliseren, en vormt een drijvende kracht voor de afvlakking van de tubules tot een plaat-

achtige structuur De calloseafzetting start tijdens de tubulo-vesikulaire fase van de celplaat, en

neemt sterk toe tijdens de conversie van het tubulair netwerk naar de ‘fenestrated sheet’ fase

(fig. 2) Callose afzetting gebeurt door enzymes geassocieerd met het PM van de vormende

celplaat, zoals het eerder vernoemde GSL8. De laatste stap is de maturatie van de celplaat,

waarbij de fenestrae worden gesloten en cellulose wordt afgezet in het lumen van de nieuwe

celwand. Dit zorgt voor afvlakking en versteviging van de celplaat. De cellulose inhoud van

de nieuwe celwand is pas na de fusie met het parentale membraan vergelijkbaar met die van

de oudercelwand. (Samuels et al., 1995). Tijdens de maturatiefase wordt ook de identiteit van de

celplaat vastgelegd als PM en de polariteit van de cel hersteld. Hierbij is de

sterolsamenstelling van het membraan cruciaal en speelt endocytose een belangrijke rol (zie

verder) (Boutte et al, 2006).

2. ENDOCYTOSE IN PLANTEN

Endocytose kan gedefinieerd worden als het proces waarbij membraangebonden componenten

zoals receptoren opgenomen worden in de cel door internalisatie van plasmamembraan.

Hierbij worden de endosomen gevormd via de fusie van de endocytotische vesikels. Op deze

manier kunnen cellen onder andere receptor-ligand complexen verwijderen van het PM. Dit

wordt ook receptor gemedieerde endocytose genoemd. Er zijn twee types van endocytose in

dieren: clathrine afhankelijke en clathrine onafhankelijke endocytose. Endocytose

onafhankelijk van clathrine omvat pinocytose, de opname van vloeistof, of macro-

pinocytosis,waarbij grote volumes worden opgenomen en ook actine is betrokken (Norbury,

2006). Ook de opname van extracellulair materiaal via fagocytose, voor opname van

extracellulaire partikels, en de vorming van calveolae, flesvormige invaginaties van het PM,

behoren tot deze categorie (Anderson, 1998). Deze processen zijn goed gekarakteriseerd in

dierlijke cellen, maar amper gekend in planten. Eerst volgt een bespreking over de

16

moleculaire componenten betrokken in vesikel transport en endocytose in dieren, later komen

gekende planthomologen aan bod. De nadruk wordt gelegd op clathrine gemedieerde

endocytose.

Clathrine is een manteleiwit dat voorkomt op het oppervlak van transport vesikels in de cel.

Naast clathrine zijn er nog twee andere types manteleiwitten: COPI (coat protein complex I)

en COPII (coat protein complex II). De vesikels worden onderverdeeld op basis van de mantel

van eiwitten die ze dragen. Ze worden afgesnoerd van een donor membraan of organel en

verplaatsen doorheen de cel naar een targetmembraan waarna ze hiermee versmelten. Op deze

manier staan ze in voor het verplaatsen van eiwitten en lipiden verplaatsen in de eukaryote cel

(fig. 3). De mantel heeft verschillende functies tijdens het vesikeltransport: buigen van

membranen, rekrutering van het cargo, afsnoering van de vesikel en rekrutering van factoren

voor het verwijderen van de mantel. COPI vesikels zijn betrokken in transport van het Golgi

naar het ER. COPII vesikels transporteren in de omgekeerde richting: van ER naar Golgi figuur

. Clathrine gecoate vesikels ontstaan ter hoogte van het PM, het TGN en endosomen. Ze

transporteren tussen PM en vroege endosomen, en van het TGN naar de endosomen (McMahon

& Mills, 2004).

figuur 3 Belangrijkste membraan transport pathways via COPI, COPII en clathrine gecoate vesikels in eukaryote

cellen. In de biosynthese pathway worden nieuw aangemaakt moleculen getransporteerd van het ER naar het Golgi en binnen

het Golgi tussen de verschillende cisternen tot ze bij het TGN aankomen. Vandaar worden ze gesorteerd direct naar het PM

17

of naar de endosomen. In de endocytose pathway worden macromoleculen opgenomen in de cel ter hoogte van het PM, en

naar de vroege endosomen gebracht. Vandaar kunnen ze ofwel terug naar het PM worden gerecycleerd, ofwel naar late

endosomen en lysosomen voor afbraak (Kirchhausen, 2000).

De vorming van vesikels omvat verschillende stappen. Tijdens de initiatiestap worden

manteleiwitten gerekruteerd naar het donormembraan. Deze stap is energieafhankelijk (zie

verder). Tegelijk worden ook de eiwitten voor endocytose gesorteerd. Hierbij zal het

membraan instulpen, en wordt een ‘coated pit’ gevormd. Additionele mantelcomponenten

worden gerekruteerd en het donormembraan invagineert. Hierna zal de vesikel afgesnoerd

worden. Ten slotte worden de manteleiwitten weer vrijgesteld van de vesikel, die pas dan kan

versmelten met het targetmembraan (Kirchhausen, 2000).

Clathrine vormt een polymere structuur op het oppervlak van vesikels, de clathrine mantel.

Deze mantel is opgebouwd uit triskelia. Een triskelion bestaat uit drie ‘clathrin heavy chain’

(CHC) molecules, en drie ‘clathrin light chain’ (CLC) molecules, en wordt als een hexameer

gerekruteerd van het cytosol naar het donormembraan (fig. 4). Er zijn 3 CLC (Scheele &

Holstein, 2002) en 2 CHC genen in Arabidopsis (Blackbourn & Jackson, 1996). De clathrinemantel is

verbonden met het donormembraan via adaptormolecules en additionele eiwitten met een

regulerende functie.

Een CHC molecule bevat verschillende domeinen (fig. 4). Meest N-terminaal ligt het

terminaal domein (TD) met een β-propeller structuur. Hiermee bindt clathrine aan de

adaptors. C-terminaal ligt het trimerisatie domein, waarmee de drie CHCs elkaar binden om

een triskelion te vormen. Drie CLCs interageren met de CHCs van het triskelion ter hoogte

van het proximale domein en het trimerisatie domein (Edeling et al, 2006).

figuur 4 Structuur clathrine Schematische voorstelling van een triskelion met drie CLCs en drie CHCs (links) en

assemblage tot een clathrine mantel (rechts) (Schmid & McMahon, 2007).

18

Adaptors (AP) vormen de link tussen clathrine en de inhoud van de transportvesikel (fig. 5).

De APs herkennen en binden sorteringssignalen in de cytosolische staarten van vele

membraaneiwitten. Ze rekurteren clathrine naar het membraan en interageren met een groot

aantal accessorische eiwitten die vesikel vorming reguleren. In zoogdieren bestaan ten minste

vier verschillende adaptorcomplexen voor clathrine gemedieerde endocytose: AP-1 tot 4.

Deze worden ook wel de klassieke adaptors genoemd. Vesikels die gevormd worden ter

hoogte van TGN bevatten heterotertramerische AP-1 adaptor eiwit complexen. Vesikels die

gevormd worden ter hoogte van het PM bevatten de verwante AP-2 complexen. AP-3 is

betrokken in de selectie van cargo bestemd voor de lysosomen. De fysiologische rol van het

vierde klassieke adaptorcomplex AP-4 is nog niet gekend. De klassieke adaptors zijn

heterotetrameren met twee grotere subeenheden (β en γ), een middelmatige subeenheid μ en

een kleine subeenheid σ. De verschillende subeenheden hebben verschillende functies. Zo

dragen β, γ en α bij tot binding met clathrine, en zijn β en μ betrokken in cargo selectie

(Kirchhausen, 2000; Robinson & Bonifacino, 2001).

Figuur 4: a: Het belangrijkste protein adaptor complex in CCVs is het AP2 complex. Dit complex is samengesteld uit 4

subeenheden ( , 2, 2, 2). De membraan cargo interageert voornamelijk met de -subeenheid de ‘oren’(in de figuur

aangeduid als α- en β- ‘appendage’ domeinen), zijn verantwoordelijk voor binding aan de accessorische eiwitten (vier

verschillende peptide interacties zijn met stippellijnen aangeduid). Het rechtse paneel toont een voorbeeld van een cargo

bevattend stukje van de PM dat geassocieerd is met AP2 complexen. Zo wordt een dens proteïne interactie oppervlak

gecreëerd. AP2s worden gestabiliseerd door molecules zoals Eps15. (Schmid & McMahon, 2007).

Voor de klassieke adaptors AP-1 en 2 bestaan isovormen van de gekende subeenheden, die

assembleren tot varianten van de AP-1 en 2 complexen. Daarnaast kunnen ook alternatieve

adaptors, zoals GGAs functioneren in clathrine gemedieerde vesikelvorming. ‘Golgi-

lokalised, γ-ear containing, ADP-ribosylation factor binding proteins (GGAs) zijn

geassocieerd met clathrine mantels op het TGN en binden clathrine, membraan, cargo en

additionele eiwitten. Ook arrestines, hepatocyt growth factor receptor tyrosine kinase (Hrs),

19

epsines (zie verder) en disabled-2 binden met zowel cargo en membranen als met de clathrine

mantel. Arrestine rekruteert G-eiwit gekoppelde receptoren in het PM in clathrine gecoate

vesikels. Deze eiwitten kunne beschouwd worden als alternatieve adaptors en worden ook de

monomerische adaptors genoemd. De alternatieve adaptors kunnen onafhankelijk van of naast

de klassieke adaptors functioneren. In individuele ‘coated pits’ zijn soms meerdere adaptors

aanwezig. Hierdoor is het niet vereist dat alle adaptors kunnen binden met clathrine (McMahon

& Mills, 2004). Er is weinig informatie over monomerische adaptor moleculen, zoals GGAs en

epsines in planten. (Robinson et al, 2008).

De rekrutering van clathrine en adaptorcomplexen naar het juiste membraan is nucleotide

afhankelijk. Activiteit van specifieke GTPasen is vereist. GTPasen wisselen af tussen de

GTP-gebonden, actieve toestand en de GDP-gebonden inactieve toestand. Deze cyclus wordt

gereguleerd door twee eiwitten: guanine nucleotide exchange factor (GEF) en ‘GTPase-

activating protein’ (GAP).(Sato & Nakano, 2007). ADP-ribosylation factor 1(ARF1) is een

GTPase betrokken in de rekrutering van clathrine. In zijn GTP gebonden, actieve toestand

bindt het met het membraan. Voor targeting naar het juiste membraan is ARF1 afhankelijk

van binding met de geschikte GEF. ARF1 is betrokken in de rekrutering van AP-1 complexen

naar Golgi membranen. Welke factor instaat voor rekrutering van AP-2 is niet bekend, maar

synaptotagmine, een Ca2+

-sensor, vervult mogelijk deze functie. Het eiwit bindt zowel AP-2

complexen als fosfoinositiden in het PM en kan hierdoor functioneren als AP-2 docking eiwit

(Haucke & De Camilli, 1999; Takei & Haucke, 2001).

Ter hoogte van de clathrine mantel kunnen heel wat accessorische eiwitten terug gevonden

worden. Deze eiwitten kunnen vaak binden met AP adaptors, lipiden en andere eiwitten zoals.

Voorbeelden zijn: amphiphysine, epsine, synaptojanine en EGF receptor pathway substrate

clone 15 (Eps15). Amphiphysine heeft 3 domeinen: BAR, ‘clathrin and adaptor binding

domain’ (CLAP) en Scr homology 3 (SH3) aan de C-terminus. Het N-terminale BAR domein

staat in voor interactie met lipiden, dimerisatie en inductie van membraan curvatuur. Via het

SH3 domein kan amphiphysine binden met het ‘proline-rich domain’ (PRD) van dynamines,

GTPase die betrokken zijn in het afsnoeren van vesikels. Amphiphysine is betrokken in

clathrine gemedieerde endocytose via zijn interactie met dynamine, synaptojanine, clathrine

en het AP-2 adaptorcomplex (Wigge et al, 1997). Epsines zijn membraaneiwitten, die buiging in

het membraan kunnen induceren. Met hun N-terminaal ENTH-domein binden ze cargo

molecules en phophatidyinositol-(4,5)-bisfosfaat, een membraanlipide. Met hun C-terminus

kunnen ze clathrine en AP-2 adaptors binden. Synaptojanine verwijdert de 5-fosfaatgroep van

20

fosfatidylinositol-(4,5)-bisfosfaat, en kan hierdoor de rekrutering van fosfoinositide bindende

eiwitten, zoals AP-2, arrestine en dynamine moduleren (Haffner et al, 1997). Eps15 bevat in zijn

N-terminaal domein drie Eps15 homology (EH) domeinen, en kan ook als alternatieve adaptor

beschouwd worden. Met zijn EH domeinen interageert Eps15 met andere accessorische

eiwitten zoals epsines en synaptojanine (Chen et al 1998). Daarnaast interageert het zowel met

AP-1 als AP-2, waardoor het dus zowel ter hoogte van het TGN als het PM voorkomt (Tebar et

al, 1996).

Na de afsnoering van het vesikel gemedieerd door dynamines wordt de clathrine mantel

verwijderd. Dit is een ATP afhankelijke reactie en vereist de activiteit van het ATPase heat

shock protein 70 (Hsc70) dat wordt gerekruteerd door auxiline (Kirchhausen et al., 2000).

Clathrine gemedieerde receptor-ligand opname is het best bestudeerd in dieren. Lange tijd

werd verondersteld dat endocytose bij planten niet mogelijk was wegens de hoge turgordruk.

Het heeft geduurd tot 2007 vooraleer clathrine gemedieerde endocytose aangetoond werd in

planten. Het is de belangrijkste pathway voor internalisatie van vele PM eiwitten waaronder

ook de PIN auxin efflux carriers (Dhonukshe et al, 2007). De 4 klassieke adaptor complexen

kunnen ook teruggevonden worden in het genoom van planten waarover sequentie-informatie

beschikbaar is. Het Arabidopsis genoom bevat homologen voor alle adaptines van deze

adaptor complexen. Deze APs zijn echter nog niet gekarakteriseerd op eiwitniveau en hun

fysiologische rol is nog niet gekend. Daarnaast bevat het Arabidopsis genoom ook een groot

aantal ENTH-domein bevattende eiwitten, zoals Epsin R1 en 2. EpsinR1 is en homoloog van

EpsinR in dieren en functioneert als adaptorcomplex in lysosomaal transport. Het interageert

met clathrine en AP-1. EpsinR2 interageert met de δ-subeenheid van AP-3, clathrine en

fosfatidylinositolfosfaat . EpsinR2 is betrokken in anterograad transport van het TGN (Hwang

& Robinson, 2009).

De ARFs komen ook voor in planten, met meerdere isovormen in het genoom van

Arabidopsis. Ook voor de ARF GEF en GAP eiwitten zijn er meerder isovormen in

Arabidopsis. GNOM (GN) bijvoorbeeld is het eerste ARF GEF geïdentificeerd in planten en

hoofdzakelijk betrokken in PIN1 recycling (Geldner et al., 2003).

In planten zijn drie dynamine-verwante eiwit subfamilies beschreven. Hiervan bevat enkel de

Arabidopsis dynamin-like protein ADL3 een PH domein, waarmee dynamines kunnen binden

met het SH3-domein van accessorische eiwitten. Ondanks de afwezigheid van deze PH-

domeinen zouden ze wel nog hun functie kunnen uitoefenen in vesikelfusie (Chen et al, 2001).

21

Voor de laatst stap, het verwijderen van de clathrinemantel, zijn ook homologen van Hsc70 en

auxilin gevonden in planten. (Holstein, 2002).

3. ENDOCYTOSE TIJDENS CYTOKINESE

Endocytose speelt een belangrijke rol gedurende de gehele mitose, ook tijdens de vorming

van de PPB. De PPB ontstaat als een brede band van MTs in de cel cortex, die vernauwt tot

een smalle band en uiteindelijk verdwijnt tijdens de profase. De celplaat zal versmelten met

het PM exact op de positie waar eerder de PPB werd gevormd (Jurgens, 2005b). De PPB laat dus

signalen achter die de positie van het delingsvlak bepalen. Later, net voor de fusie van de

groeiende celplaat met het PM, accumuleert TPLATE op de positie gemerkt door de PPB (van

Damme et al, 2006). Hoe deze signalen worden achtergelaten is nog niet geweten, maar een

hypothese is dat er een geheugen gevormd wordt door lokale veranderingen in het PM

(Karahara et al, 2009). Zo is er geen actine aanwezig in de PPB zone. Dit wordt ‘actine depleted

zone’ of ADZ genoemd (Liu & Palevitz, 1992). Actine bindt met het PM via eiwitten zoals het

formine AtFH6, die instaan voor nucleatie van actine filamenten, en komt voor over het

volledige PM (Favery et al, 2004). Ook het kinesine KCA1 wordt verwijderd uit de PPB zone,

met vorming van de KCA depleted zone of KDZ Deze lokalisatie blijft bewaard als een soort

negatief geheugen, ook na het verdwijnen van de PPB. Daarnaast lokaliseert TANGLED ter

hoogte van de PPB zone, en blijft het ook aanwezig na het verdwijnen van de PPB als een

soort positief geheugen (Smith et al, 1996). De kwantitatieve karakterisatie van de verdeling van

secretorische structuren en clathrine gecoate vesikels toont aan dat endocytische vesikels

accumuleren in het cytoplasma in de PPB zone, in epidermale cellen van de ui zaailingen

(Karahara et al, 2009). De secretorische activiteiten zijn daarentegen binnen en buiten de PPB

gelijkaardig. Endocytose zou dus kunnen helpen in het creëren van de identiteit van de

corticale delingszone, bv door verwijdering van KCA1 of actine ankereiwitten.

Endocytose draagt ook substantieel bij tot celplaat initiatie en expansie. FM4-64, een tracer

voor endocytose, en andere fluid phase merkers zoals Alexa 633 en Lucifer Yellow worden

geïnternaliseerd van het PM en getransporteerd naar de celplaat. Het transport van deze

merkers naar de celplaat verloopt niet via het Golgi, wel via het TGN (Grebe et al., 2003).

Bovendien lokaliseren PM eiwitten zoals PIN1 ter hoogte van de celplaat, en dit zowel tijdens

initiatie als expansie van de celplaat (Geldner et al, 2001). Lang geleden werd al aangetoond dat

het verloop van mitose na de metafase onafhankelijk is van synthese van nieuwe eiwitten

(Garcia-Herdugo et al., 1974). Dit suggereert dat bestaand materiaal gebruikt wordt voor

22

celplaatvorming, en daarvoor is endocytose nodig. Eerder werd al aangetoond dat PM

eiwitten circuleren tussen het PM en intracellulaire compartimenten via endocytose. Deze

constitutieve circulering zou kunnen zorgen voor continue translocatie van materiaal van het

celoppervlak naar de groeiende celplaat (Dhonukshe et al, 2006).

Tijdens expansie en maturatie wordt teveel aan membraan van de plaat verwijderd via

clathrine gemedieërde endocytose. Het aantal clathrine gecoate vesikels en MVBs dat zich in

de buurt van de nieuwe celplaat bevindt, neemt dan ook toe tijdens de laatste fasen van de

cytokinese. Endosomaal transport versterkt dus gedurende de vorming van de celplaat. Zoals

eerder vermeld zijn hierbij dynamines betrokken voor het afsnoeren van vesikels. Planten

hebben zes verschillende dynamine verwante eiwit (DRP) families DRP1-6. De leden van de

plant specifieke dynamine familie, DRP1, blijven aanwezig ter hoogte van de celplaat tijdens

de maturatiefase. DRP1A en C colokaliseren met clathrine ter hoogte van de celcortex

(Konopka and Bednarek., 2008). Ze zijn betrokken in clathrine gemedieerde membraan

trafficking ter hoogte van het PM en of Golgi. Ze zouden dus ook kunnen functioneren in

membraan recycling aan de celplaat tijdens cytokinese. Bovendien zijn ze geassocieerd met

de groeiende rand van de celplaat waar vesikels versmelten. Hun exactie functie blijft echter

onbekend (Bednarek et al., 2010).

Een andere kandidaat voor endocytose tijdens de maturatie fase is DRP2a. Dit eiwit is

betrokken in trafficking van het TGN naar de vacuole. Het dynamine lokaliseert op de

celplaat tijdens cytokinese, en Golgi stapels en het PM in interfase cellen (Hong et al, 2003).

Recent werd aangetoond dat ook DRP5a betrokken is in cytokinese. Het eiwit verschijnt

tijdens de profase als heldere spots rond de nucleus die tijdens de cytokinese lokaliseren ter

hoogte van het delingsvlak. De drp5a mutant nulmutant vertoont bovendien defecten in

celplaatmaturatie in de wortel, maar enkel bij verhoogde temperaturen (Bednarek et al., 2010).

Het syntaxine KN wordt verwijderd van celplaat via endocytose, en het accumuleert in de

MVBs (Tse et al., 2004). De lokalisatie van KN in het celdelingsvlak wordt in stand gehouden

door sterol-afhankelijke, clathrine en dynamine-gemedieerde endocytose. Dit proces

verhindert diffusie van KN naar laterale membranen, zoals wordt geobserveerd in de cpi1-1

mutant, een sterolbiosynthese mutant (zie verder). Dit is vooral vereist tijdens de fusie van de

celplaat met het parentale membraan, omdat KN hier een belangijke rol speelt. Net zoals KN

veroorzaakt gereduceerde expressie van TPLATE cytokinese defecten. TPLATE vertoont

similariteit met vesikel manteleiwitten en lokaliseert in de celplaat en een nauw PM gebied

23

rond de insertiesite. Dit suggereert betrokkenheid in endocytose en een rol in celplaat insertie.

Gezien de lokalisatie van TPLATE en zijn mogelijke functie in endocytose zou dit eiwit een

belangrijke factor kunnen zijn in de endocytose-gemedieerde lokalisatie van KN (Boutte et

al).

Naast clathrine medieerde endocytose, wordt membraan ook verwijderd via COPI machinerie.

ER membraan accumuleert in de buurt van celplaat tijdens late fasen ven celplaatvorming.

Aanwezigheid van COPI vesikels ter hoogte van de celplaat kan wijzen op rechtstreekse

trafficking tussen celplaat en ER tijdens laatste fasen van cytokinese (Couchy et al, 2003; Segui-

Simarro et al, 2004).

Tijdens de vorming van de celplaat moet één derde van het celoppervlak gevormd worden

binnen een beperkte tijdspanne van een aantal minuten. Er zijn dus aanvoer mechanismen

nodig met grote capaciteit. Bij meting van de endocytosesnelheid blijkt deze sterk

opgereguleerd te worden tijdens de vorming van de celplaat. Als endocytose geïnhibeerd

wordt door bijvoorbeeld koudebehandeling wordt celplaatvorming sterk vertraagd en soms

teniet gedaan. Endocytose heeft dus een snelheidsbepalend effect op celplaatvorming

(Dhonukshe et al., 2006). Endocytose van membraan van het centrum van de celplaat zou

gerecycleerd kunnen worden naar de periferie om zo de expansie van de celplaat te

versnellen.

Ook aan het eind van de cytokinese speelt endocytose nog een belangrijke rol. Vele PM

eiwitten zijn via endosomen terecht gekomen in het membraan van de celplaat, en dit aan

beide zijden. Voor sommige van die eiwitten moet hun polaire lokalisatie hersteld worden. De

sterolsamenstelling kan hierin een belangrijke rol spelen, zoals bv. bij PIN2. De

cyclopropylsterol isomerase1-1 (cpi1-1) sterolbiosynthese mutant heeft een veranderde

sterolsamenstelling. Daarnaast vertoont deze mutant ook veranderde PIN2 endocytose. Aan

het eind van de cytokinese lokaliseert PIN2 aan beide zijden van de nieuwe celplaat, maar

wordt verwijderd aan één van de twee. In de cpi1-1 mutant blijft PIN2 aan beide zijden in het

membraan gelokaliseerd. Endocytose is dus ook afhankelijk van de sterolsamenstelling van

membranen. De cpi1-1 mutant vertoont ook cytokinese defecten (Men et al, 2008).

De bijdrage van endocytose aan de aanvoer van bouwmateriaal voor celplaat is niet alleen

zeer efficiënt om op korte termijn de celplaat te vormen. Het kan ook bijdragen aan het

definiëren van het membraan van de celplaat als toekomstig PM doordat in de endosomen

veel PM componenten al aanwezig zijn. Hierdoor zouden secretorische Golgi-afgeleide

24

vesikels al tijdens vroege fasen van celplaatvorming het membraan herkennen als target

(Dhonukshe et al., 2006).

De celplaat kan dus beschouwd worden als een soort gespecialiseerd endosomaal

compartiment dat zowel materiaal van het Golgi als van het PM krijgt door sorterende en

recyclerende endosomen (Dhonukshe et al, 2006).

4. TPLATE EN HET TPLATE-COMPLEX

TPLATE

TPLATE is oorspronkelijk geïdentificeerd in een GFP-gebaseerde screen voor de identificatie

van moleculaire componenten betrokken in cytokinese in Arabidopsis. Bij expressie van

TPLATE-GFP in BY-2 cellen, lokaliseerde dit eiwit ter hoogte van de celplaat. Tijdens de

laatste fasen van celplaatexpansie accumuleert TPLATE in een nauwe regio van het PM rond

de plaats van insertie in het parentale PM. De tplate T-DNA insertiemutant vertoont

mannelijke steriliteit. Neerregulatie van TPLATE resulteert in defecten in de verankering van

de celplaat in het parentale PM. TPLATE is dus een plant-specifiek eiwit dat essentieel is

voor de vorming van leefbare pollenkorrels en voor de laatste fasen van cytokinese in

somatische cellen.

figuur 5 Lokalisatie van TPLATE in BY-2 cellen tijdens cytokinese. (GFP in het groen)

TPLATE vertoont similariteit met de adaptor eiwitten. Het N-terminale gedeelte van

TPLATE is structureel homoloog met het Adaptin_N domein. Dit domein is aanwezig in het

N-terminale gedeelte van de grote subeenheden van AP-1, AP-2, AP-3 en AP-4 adaptor

complexen en in de β-COP, γ1-COP en γ2-COP subeenheden van het COPI eiwit complex.

Deze complexen zijn betrokken in clathrine afhankelijk en onafhankelijke vesikelvorming.

Daarnaast bevat TPLATE ook een β-COP specifiek element, sterk geconserveerd in β-

coatomeer eiwitten. TPLATE is dus verwant aan manteleiwitten en mogelijk gelinkt met

25

vesikelvorming. Omwille van de similariteit met de adaptor eiwitten zou het deel kunnen

uitmaken van een plant-specifiek adaptor complex.

TPLATE COMPLEX

In TAP experimenten uitgevoerd door Astrid Gadeyne zijn een aantal interactors van

TPLATE in Arabidopsis geïdentificeerd (ongepubliceerde data, zie fig. 5 en tab. 1). Samen

vormen zij het TPLATE complex. De subeenheden van het complex zijn geconfirmeerd in

meerdere TAP experimenten, met verschillende leden van het complex als bait-eiwit (Astrid

Gadeyne, ongepubliceerd). Dit complex is dus zeer robuust. Dit wordt ook bevestigd door de

individuele lokalisatie van de leden van het complex (fig. 7).

figuur 6 TPLATE complex. Interactors van TPLATE werden geïdentificeerd in TAP experimenten uitgaande van eiwitten

gekend uit de literatuur (blauw). De groene eiwitten zijn geconfirmeerd in meerdere, onafhankelijke experimenten. De gele

eiwitten zijn slecht één keer teruggevonden.(figuur van Astrid Gadeyne).

De leden van het TPLATE complex zijn nog niet gekarakteriseerd. Voor een aantal

subeenheden van het TPLATE complex bestaat echter wel een link met clathrine gemedieerde

endocytose (zie figuur van Astrid) op basis van sequentiehomologie met gekende eiwitten of

de aanwezigheid van gekende eiwitdomeinen (fig. 7).

26

figuur 7 TPLATE en zijn interagerende eiwitten vertonen sturcturele homologie met mantel adaptor eiwitten.

tabel 1 Overzicht leden van het TPLATE complex. Deze eiwitten zijn vormen een complex met TPLATE. Ze zijn

geïdentificeerd via TAP (Astrid Gadeyne, ongepubliceerd). De eiwitten in het vet werden gebruikt voor de Y2H test.

Componenten van het TPLATE-

complex

Afkorting gebruikt in

dit werk AGI code

hypothetical protein β’COP-like (β’) At5g24710

Transducin family protein WD40-like (WD40) At3g50590

Protein binding/protein transport Mu-like (Mu) At5g57460

Similar to unnamed protein Sigma-like (Sigma) At1g15370

Calcium binding EF-hand AtEHD1 At1g20760

SH3 domain containing protein SH3-like (SH3) At2g07360

Calcium binding EF-hand AtEHD2 At1g21630

27

figuur 7 Lokalisatie TPLATE en interactors in BY-2 cellen. De verschillende leden van het TPLATE complex tonen

eenzelfde lokalisatie als TPLATE. Ze accumuleren ter hoogte van celplaat en het PM in de delingszone tijdens cytokinese,

behalve op de plaats van insertie van de celplaat in het parentale PM. Dit is een extra indicatie dat zij deel zijn van hetzelfde

complex. (figuur Astrid Gadeyne)

At5g24710 of β’-like vertoont op sequentieniveau homologie met de α en β’ eiwitten van het

COPI complex. COPI vesikels dragen een mantel van zeven eiwitten: α-COP, β-COP, β’-

COP, δ-COP, ε-COP, γ-COP, en δ-COP. Ze zijn verantwoordelijk voor bidirectioneel

transport tussen ER en Golgi, en tussen de Golgi cisternen (Couchy et al, 2003).

De structuur van At5g57460 of Mu-like is gelijkaardig aan de structuur van de Mu-

subeenheid van het AP-2 complex. CoIP experimenten wijzen aan dat TPLATE en Mu direct

met elkaar interageren (Astrid Gadeyne, ongepubliceerde data ).

At1g15370 of Sigma-like heeft dezelfde structuur als de sigma-subeenheid van AP-2 en de

zeta-subeenheid van het COPI complex. Sigma-like bevat een longin domein, dat ook

aanwezig is in de mu en sigma subeenheden van clathrine adaptor complexen. Daarnaast

komt het ook voor in Arabidopsis VAMP7, een R-SNARE betrokken in vesikel fusie. Het

longin domein is essentieel voor een correcte subcellulaire targeting van VAMP7 (Uemura et al,

2005).

28

Het SH-3 domein of Src homology domain zoals aanwezig in het SH3-like van het complex,

komt voor in accessorische eiwitten betrokken in regulatie van clathrine gemedieerde

endocytose, zoals bv. amphiphysine (Wigge et al, 1997).

AtEHD1 en 2 zijn Eps15 homology (EH)-domein bevattende eiwitten. Dit domein is eerst

geïdentificeerd in Eps15, een alternatief adaptor eiwit betrokken in clathrine gemedieerde

endocytose. EH-domein bevattende eiwitten zijn in Arabidopsis ook betrokken in endocytose

(Bar et al., 2008). De link tussen de subeenheden en clathrine gemedieerde endocytose

ondersteunt de hypothese dat het TPLATE complex fungeert als een plant-specifiek

adaptorcomplex in endocytose.

29

HOOFDSTUK 2: DOEL

De leden van het TPLATE complex werden herhaaldelijk gevonden in TAP experimenten. De

TAP data geeft ons echter geen informatie over de onderlinge interacties die plaatsvinden

tussen de leden van dit complex. In deze masterthesis werden de binaire interacties tussen de

leden van het TPLATE complex bestudeerd. De homologie van TPLATE met adaptor

eiwitten, de vergelijkbare lokalizatie van TPLATE en CLC1 tijdens cytokinese en de

interactie die eerder gevonden werd tussen TPLATE en CLC1 via BiFC (Daniel Van Damme,

manuscript in voorbereiding) duiden op een rol voor TPLATE in clathrine gemedieerde

endocytose. Om deze link te versterken werd additioneel bewijs gezocht voor een directe link

tussen TPLATE en clathrine.

In totaal werden drie strategieën gebruikt. Ten eerste werden zeven leden van het complex

waaronder TPLATE gebruikt voor een yeast-two-hybrid interactiestudie. Hierin werd ook

interactie getest met 2 CLCs en 2 CHCs van Arabidopsis. Interactie tussen TPLATE en

CLC1 werd eerder aangetoond in Y2H en BiFC experimenten (Daniel Van Damme,

ongepubliceerde data). Daarom werden ook CLC1 (At2g40060) en CLC2 (At2g20760) en

CHC1 (At3g08530) en CHC2 (At3g11130) van Arabidopsis meegenomen in de Y2H

analyses.

Daarnaast werden ook BiFC experimenten uitgevoerd zowel transiënt in Nicotiana

benthamiana als stabiel in Arabidopsis thaliana. In Nicotiana werd interactie getest tussen

TPLATE enerzijds en CLC1 en CHC1 anderzijds. Omdat TPLATE en Mu-like directe

interactors zijn, werd getracht deze interactie te confirmeren via BiFC experimenten in

Arabidopsis omdat dit experiment in situ informatie zou opleveren over deze interactie in de

juiste context van plantontwikkeling en cytokinese.

Ten slotte werd geprobeerd om de interactie tussen TPLATE en CLC1 te bevestigen door

ectopische lokalisatie van TPLATE in BY-2 cellen, gebruikmakend van de observatie dat de

destructie-box van cycline B1;1 de capaciteit bezit om te binden aan de gecondenseerde

metafasechromosomen.

30

HOOFDSTUK 3: RESULTATEN

1. BINAIRE GIST-TWEE-HYBRIDE INTERACTIES

1.1 BASIS VAN HET TWEE HYBRIDE SYSTEEM IN GIST

Het gist twee hybride systeem (Yeast-two-Hybrid, Y2H) laat toe binaire interacties te

onderzoeken in bakkersgist (Sacharomyces cerevisiae) en is gebaseerd op de reconstructie

van een actieve GAL4 transcriptiefactor. Een eerste eiwit X wordt tot expressie gebracht in

gist als fusie-eiwit met het DNA bindend domein (DB) van de GAL4 transcriptiefactor (TF).

Een tweede eiwit Y wordt tot expressie gebracht als fusie-eiwit met het activatiedomein (AD).

Indien eiwitten X en Y met elkaar kunnen binden, worden het activatie- en DNA bindend

domein van de transcriptiefactor weer bij elkaar gebracht. Zo ontstaat een functionele hybride

transcriptiefactor.

De fusie-eiwitten X en Y worden tot expressie gebracht in gistcellen met een reportergen

waarvan de promotor geactiveerd kan worden door de transcriptiefactor. Bij vorming van een

functionele TF bindt deze op de bindingselementen van de promotor en komt het reportergen

tot expressie.

Een mogelijk reportergen is een selectiemerker zoals het HIS3 gen. HIS3 codeert voor het

imidazol glycerol fosfaat dehydratase, een enzym dat functioneert in de biosynthese van het

aminozuur histidine. Bij interactie tussen eiwitten X en Y zijn de gistcellen bijgevolg in staat

zelf histidine aan te maken. De groei van gistcellen op een medium zonder histidine vormt

dan een mogelijke read-out voor interactie.

1.2 KLONERING

De genen uit tabel 1(in de inleiding) werden met behulp van Gateway cloning gekloneerd in

de pDEST32 en pDEST22 destinatievectoren. De genen van interesse worden zo

respectievelijk gekloneerd als fusie-eiwit met het DNA-bindend domein en het

activatiedomein van de GAL4 transcriptiefactor,. De fusies met de TF domeinen zijn N-

terminaal. De vectoren bevatten ook een LEU2 (pDEST32) en TRP1 (pDEST22) gen voor

selectie in gisten op medium zonder leucine en tryptofaan respectievelijk.

31

1.3 TRANSFORMATIE

Na de klonering werden de bekomen vectoren getransformeerd naar Saccharomyces

cerevisiae stam PJ694a (voor alle pDEST22 vectoren) en PJ694α (voor alle pDEST32

vectoren) met behulp van een hitteshock protocol (zie addendum). De gegenereerde pDEST22

en pDEST32 vectoren werden getranformeerd naar gistcellen met verschillend mating type (a

en α). Het mating type van haploide cellen wordt bepaald door het MAT locus, en haploide

cellen worden enkel gevormd in stresscondities zoals een tekort aan nutriënten. Cellen met

tegengesteld mating type kunnen met elkaar versmelten of maten. In plaats van dubbele

transformatie werd mating gebruikt voor de autoactivatie- en interactietesten.

1.4 REPORTERGENEN

Als read-out voor interactie zijn twee reportergenen gebruikt: HIS3 en lacZ. Elk reportergen

heeft een eigen promotorregio met GAL4 bindingselementen, waardoor ze onafhankelijk van

elkaar zijn. Bij activatie van HIS3 kunnen de gisten groeien op medium zonder histidine.

Inductie van lacZ kan opgespoord worden door toevoeging van een buffer met X-gal (5-

bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) aan de gistcellen. De activatie van lacZ

leidt tot omzetting van het X-gal tot een blauw precipitaat.

1.5 VALS POSITIEVEN

Vals positieve resultaten zijn het gevolg van eiwitten die niet echt interageren of waarvan de

interactie biologisch niet relevant is, bijvoorbeeld doordat ze niet in hetzelfde

celcompartiment voorkomen. Dit kan verschillende oorzaken hebben: eiwitten die

oppervlakken hebben met affiniteit voor heel veel eiwitten (sticky proteins); eiwitten die

normaal interageren met een groot aantal eiwitten; eiwitten met regio’s die kunnen

functioneren als activatiedomein; eiwitten die de chromatinestructuur beïnvloeden; eiwitten

met niet-specifieke affiniteiten voor de promotorregio die de expressie van de reporter drijft.

Het aantal vals positieven wordt beperkt door aanpassingen aan het systeem. Om hoge

expressieniveaus en toxiciteit te vermijden worden de onderzochte eiwitten bijvoorbeeld

gekloneerd in vectoren met een laag kopij aantal. Bovendien worden twee reportergenen met

onafhankelijke promotoren en een uitgebreide set van gist controlestammen gebruikt (tabel 1).

32

1.6 AUTOACTIVATIETEST

De bekomen enkelvoudige transformanten zijn eerst ter controle gegroeid op vast medium

zonder leucine en tryptofaan. Onder deze condities kunnen de transformanten normaal niet

groeien, omdat telkens maar 1 van de destinatievectoren aanwezig is. Er werd ook geen groei

waargenomen (data niet getoond).

Autoactiviteit treedt op wanneer één van beide eiwitten, gekoppeld aan één van de twee TF

domeinen, één of beide reportergenen kan activeren zonder interactie met een tweede eiwit,

gekoppeld aan het andere TF domein. Het autoactiverend eiwit leidt zo tot vals positieven in

de interactietest.

Voor alle genen in beide vectoren moet dus de mogelijkheid tot autoactivatie onderzocht

worden. De kans op autoactivatie is het grootst bij fusie met het DNA bindend domein, dus

bij klonering in pDEST32. Omdat autoactivatie ook kan optreden als gevolg van de vorming

van het DB-X/AD complex, (waarbij bv binding optreedt tussen eiwit X en het AD van

GAL4) brachten we beide vectoren samen in de gistcellen voor de autoactivatietest.

De vectoren worden niet samengebracht in gistcellen via dubbele transformatie, maar via

mating. Elk gen in één van de destinatievectoren wordt gecombineerd met de lege andere

vector via mating van de overeenkomstige giststammen. Voor elk eiwit wordt dus de gist die

de pDEST32 met het gen bevat, gecombineerd met een gist met de lege pDEST22. Ook de

omgekeerde combinatie werd gecheckt voor autoactivatie: de genen gekloneerd in pDEST22

met de lege pDEST32. Als de bekomen gisten kunnen groeien op medium zonder histidine, is

er sprake van autoactivatie.

Om HIS3 activiteit te regelen, werd 3-amino-1,2,4-triazol (3AT) toegevoegd. Deze

component inhibeert het genproduct van het HIS3 gen, en verhindert dus expressie vanaf een

bepaalde concentratie. Deze concentratie is afhankelijk van hoe sterk de reporter tot expressie

komt. Als 3AT in deze concentratie wordt toegevoegd aan het medium, kan de

autoactiverende combinatie (gen+vector) toch gebruikt worden voor de interactietest. De

gisten werden uitgeplaat op medium zonder leucine en tryptofaan als positieve controle van

de ‘mating’, en medium zonder Leu, Trp en His met 0mM, 10mM, 20mM, 30mM en 50mM

3AT voor de autoactivatietest.

Op elke plaat werden ook controlestammen gegroeid. Deze stammen bevatten interagerende

eiwitten, met een verschil in de sterkte van interactie (tabel 2). Door de bekomen spots

hiermee te vergelijken krijgen we een idee over de sterkte van de interactie of autoactivatie.

33

tabel 2 Standaard controlestammen voor Y2H experiment. De controlestammen bevatten gekende, al dan niet

interagerende eiwitten met variatie in de sterkte van interactie. Deze giststammen worden op elke plaat gegroeid en de

resultaten worden hiermee vergeleken. Zo kan krijgen we een idee over de sterkte van interactie.

Controle

stam Interagerende eiwitten Sterkte van interactie -Leu-Trp

-Leu-Trp-His + 3AT

0 mM 10 mM 20 mM 30 mM 50 mM

A geen insert Geen

B Human RB+human E2F1 Zwak

C

Drosophila DP + Drosophila

E2F Matig

D Rat cFos + Mouse cJun Sterk

E GAL4 Zeer sterk

De resultaten van de autoactivatietest zijn weergegeven in figuur 9 en 10. De test werd voor

elk gen in pDEST32 en pDEST22 in acht replicaten uitgevoerd, vertrekkend van acht

verschillende kolonies van de enkelvoudige transformanten. In onderstaande figuren wordt

telkens één representatieve replica weergegeven. Alle acht geteste kolonies waren

vergelijkbaar, tenzij anders vermeld.

Bij de autoactivatietest zagen we dat AtEHD1(At1g20760) gekloneerd in pDEST32

autoactiveert bij elke concentratie 3AT die we hebben toegevoegd. Deze combinatie werd dan

ook weggelaten bij de interactietesten. Daarnaast autoactiveren ook CLC1, CHC1 en CHC2

bij klonering in de pDEST32 vector, maar niet bij hogere concentraties van 3AT. Voor CHC1

was er autoactivatie in vier van de acht replicaten. Dit kan te wijten zijn aan een verschil in

‘copy number’ van de pDEST32 vector in de verschillende enkelvoudige transformanten.

Geen enkel van de genen gekloneerd in pDEST22 vertoonden autoactivatie. Deze vectoren

werden dan ook allemaal gebruikt voor de interactietest.

34

pDEST32 ζ μ AtEHD1 β' TPL SH3 WD40 CLC1 CLC2 CHC1 CHC2

-L-W

-L-W-

H

0 mM

3AT

10 mM

3AT

20 mM

3AT

30 mM

3AT

50 mM

3AT

figuur 8 Resultaat autoactivatietest voor klonering in pDEST32. De genen in de bovenste rij werden na klonering in de

pDEST32 vector gecombineerd met de lege pDEST22 vector in gistcellen via mating. Deze gisten werden uitgeplaat op

verschillende media in de eerste kolom. Groei op medium zonder histidine reflecteert autoactivatie. 3AT kan worden

toegevoegd om expressie van de HIS3 reporter te inhiberen.

pDEST22 ζ μ AtEHD1 β' TPL SH3 WD40 CLC1 CLC2 CHC1 CHC2

-L-W

-L-W-H

0 mM

3AT

10 mM

3AT

20mM

3AT

30 mM

3AT

50 mM

3AT

Figuur 9 Resultaat autoactivatietest voor klonering in pDEST22. De genen in de bovenste rij werden na klonering in de

pDEST22 vector gecombineerd met de lege pDEST32 vector in gistcellen via mating. Deze gisten werden uitgeplaat op

verschillende media in de eerste kolom. Groei op medium zonder histidine reflecteert autoactivatie. 3AT kan worden

toegevoegd om expressie van de HIS3 reporter te inhiberen.

35

1.7 INTERACTIETEST

Om interactie te testen werd elk gen in de pDEST22 vector gecombineerd met elk gen in de

pDEST32 vector via ‘mating’ van de overeenkomstige enkelvoudige transformanten.

AtEHD1 in pDEST32 werd weggelaten wegens autoactivatie op elke concentratie van 3AT.

Op deze manier werden 11x10, dus 110 interacties getest. Elk paar eiwitten X en Y werd

bijgevolg tweemaal getest voor interactie: DB-X+AD-Y en AD-X+DB-Y. Dit worden verder

de twee richtingen genoemd. Na ‘mating’ en selectie werden de gistculturen eerst verdund

naar gelijke densiteit en dan gespot op platen met vast medium zonder leucine en tryptofaan,

en medium zonder leucine, tryptofaan en histidine met 0, 10, 20, 30 en 50 mM 3AT. Na het

spotten werd de lacZ test uitgevoerd op de overige gistcellen. Op dag drie werd een beeld

genomen van de platen en werd de groei geëvalueerd.

De interactietest werd drie maal herhaald. Voor elke interactietest werd de mating van de

gisten opnieuw uitgevoerd met andere kolonies van de enkelvoudige transformanten. Uit de

autoactivatietest bleek dat er verspreid over de platen veel kleine gistkolonies groeien

afkomstig van de controlestammen. Om deze contaminatie te vermijden werden deze

controles vervangen door een herhaling van de autoactivatietest. Het is immers belangrijker te

weten welke eiwitten van het complex met elkaar interageren dan wel hoe sterk die interacties

zijn. De resultaten van de interactietest zijn weergegeven in figuren 11-12.

De gisten werden gespot in een 12 x 11 rooster. De spots van dezelfde rij bevatten hetzelfde

gen in pDEST32, de spots van dezelfde kolom bevatten hetzelfde gen in pDEST22. De

autoactivatiecontroles bevinden zich in de laatste rij (combinatie met de lege pDEST32) en de

laatste kolom (combinatie met de lege pDEST22).

Op de plaat met vast medium zonder leucine, tryptofaan en histidine is interactie te zien

tussen SIGMA en SH3, en dit in beide richtingen (fig. 11, spots met volle rand). Ook CLC2

enerzijds, en CHC1 en CHC2 anderzijds interageren, in één richting (spots met gestippelde

rand fig. 11). Door autoactivatie van CLC1, CHC1 en CHC2 in pDEST32, kan niets gezegd

worden over de interacties met deze clones bij deze omstandigheden.

Bij toevoeging van 10 mM 3AT vermindert de groei door autoactivatie. De autoactivatie van

CLC1 in pDEST32 is minder sterk in combinatie met AtEHD1 ten opzichte van de

combinatie met de andere genen in pDEST22 (rode spot fig. 12). CLC1 kan autoactiveren

door interactie met het AD, of doordat het zelf het RNA polymerase kan rekruteren. Het

AtEHD1 eiwit vermindert deze autoactivatie. Dit is mogelijk door verstoring van de interactie

tussen CLC1 en het AD, of door hindering van de rekrutering van het RNA-polymerase.

36

Daarnaast groeien de combinaties van CLC1 met de CHCs in pDEST22 sterker dan de

autoactivatiecontrole in de laatste kolom (groene spots fig. 12). Dit wijst op interactie tussen

CLC1 en de CHCs in deze oriëntatie.

-L-W-H

+

0mM 3AT

pDEST22

ζ μ AtEHD

1 β' TPL SH3 WD40 CLC1 CLC2 CHC1 CHC2 p22

pDEST

32

ζ

μ

β'

TPL

SH3

WD40

CLC1

CLC2

CHC1

CHC2

p32

figuur 10 Resultaat interactietest op medium zonder leucine, tryptofaan en histidine. De genen de eerste kolom werden

na klonering pDEST22 gecombineerd met de genen in pDEST32 in de eerst kolom via mating in gistcellen. Groei van de

resulterende gistcellen op medium zonder histidine duidt op interactie. Interacties die hieruit af te leiden zijn: SIGMA en

SH3, CLC2 en CHC1 en 2. p22 = pDEST22; p32 = pDEST32

Interactie tussen de CHCs en de CLCs wordt ook aangetoond in de omgekeerde richting. Bij

vergelijking van de spots van CHC1 en CHC2 in pDEST32 met de autoactivatiecontrole in de

laatste kolom, is interactie met de CLCs duidelijk (blauwe spots fig. 12). Verder is er ook

37

interactie tussen CHC1 en CHC2, maar slechts in één richting duidelijk (paarse spot, fig. 12).

Ten slotte toont de interactietest dimerisatie van CHC1 (oranje spot fig. 12).

In enkele combinaties, zoals bij SH3 in pDEST32 met de lege pDEST22, groeien individuele

gistkolonies. Deze zijn waarschijnlijk ontstaan door contaminatie en worden als negatief

beschouwd. Onderstaande figuren illustreren de spots van alle groeicondities voor de

gevonden interacties.

-L-W-H

+ 10 mM 3AT

pDEST22

ζ μ AtEHD

1 β' TPL SH3 WD40 CLC1 CLC2 CHC1 CHC2 p22

ζ

μ

β'

pDEST32

TPL

SH3

WD40

CLC1

CLC2

CHC1

CHC2

p32

figuur 11 Resultaat interactietest op medium zonder leucine, tryptofaan en histidine met 10 mM 3AT. De genen in de

eerst rij werden na klonering in pDEST22 gecombineerd met de genen in de eerste kolom in pDEST32 via mating in

gistcellen. Groei op medium zonder histidine duidt op interactie. Interacties die hieruit af te leiden zijn: SIGMA en SH3,

beide CLCs met beide CHCs, , CHC1 met CHC1, CHC1met CHC2. P22= pDEST22; p32= pDEST32.

38

SIGMA en SH3

De spots die interactie aanwijzen tussen SIGMA en SH3 zijn weergegeven voor elke

groeiconditie in figuur 13, samen met het resultaat van de lacZ test. De eerste combinatie,

SIGMA in pDEST22 met SH3 in pDEST32 werkt beter in Y2H dan die in de andere richting.

De gistcellen kunnen nog groeien bij hogere concentraties van 3AT en de lacZ test kleurt

donkerder. De aanwezigheid van SIGMA en SH3 in de gistspots van beide richtingen werd

geconfirmeerd via PCR (fig.14).

Medium -Leu-Trp

-Leu-Trp-His + 3AT

LacZ test

0 mM 10 mM 20 mM 30 mM 50 mM

ζ in pDEST22

+

SH3 in pDEST32

ζ in pDEST22

+

pDEST32

SH3 in pDEST32

+

pDEST22

ζ in pDEST32

+

SH3 in pDEST22

ζ in pDEST32

+

pDEST22

SH3 in pDEST22

+

pDEST32

figuur 12 Overzicht interactietest in gist voor SIGMA en SH3. De gisten werden na mating volgens bovenstaand schema

en verdunning gespot op medium zonder leucine en tryptofaan, en medium zonder leucine, tryptofaan en histidine met 0, 10,

20, 30 en 50 mM 3AT. De eerste combinatie werkt beter dan de tweede. De lacZ test demonstreert interactie voor SIGMA in

pDEST22 en SH3 in pDEST32, maar niet voor de andere richting.

39

De PCR toonde aan dat in beide richtingen de genen voor SH3 en SIGMA aanwezig zijn in de

gistcellen die interactie vertonen (fig. 14).

figuur 13 PCR ter controle van geïdentificeerde interactie tussen SIGMA en SH3. De PCR werd uitgevoerd op gistcellen

en vectoren ter controle van de aanwezigheid van SH3 en SIGMA, en dit met specifieke primers voor SIGMA (boven, 444

bp) en SH3 (onder, 3591 bp).

CLC-CHC

De spots voor de interacties tussen de CHCs en CLCs zijn per groeiconditie weergegeven in

onderstaande figuren (fig. 15-21). De gisten werden na ‘mating’ en verdunning gegroeid op

medium zonder leucine en tryptofaan als positieve controle van de mating procedure (fig.15).

De cellen in elke spot groeien dus overal is zowel pDEST22 als pDEST32 aanwezig.

-Leu-Trp pDEST22

CLC1 CLC2 CHC1 CHC2 p22

pDEST32

CLC1

CLC2

CHC1

CHC2

p32

figuur 14 Overzicht van de spots van interactietest in gist voor CLCs en CHCs. De gisten werden na mating

(volgens bovenstaand schema) en verdunning uitgeplaat op medium zonder leucine en tryptofaan. Dit is een

positieve controle voor de 'mating' procedure. Alle combinaties groeien, dus zowel pDEST22 als pDEST32 zijn

aanwezig. p22= pDEST22; p32= pDEST32

40

Voor het testen van interactie werd de groei geëvalueerd op medium zonder leucine,

tryptofaan en histidine met 0, 10, 20, 30 en 50 mM 3AT. Bij toevoegen van 0 en 10 mM 3AT

autoactiveert CLC1 en CHC2 (fig.16 en 17).CHC1 autoactiveert enkel bij 0mM 3AT (fig. 16).

Bij 0mM 3AT duiden enkel de spots voor combinatie van CLC2 in pDEST32 en CHC1 en

CHC2 in pDEST22 op interactie (rode spots fig.16).

Bij toevoeging van 10 mM 3AT wordt interactie tussen beide CHCs in pDEST32 en beide

CLCs in pDEST22 gedemonstreerd (blauwe spots, fig. 17). Daarnaast kan CHC1 met zichzelf

interageren, en dus dimeriseren (oranje spot, fig. 17) Bovendien kan CHC2 in pDEST32

binden met CHC1 in pDEST22 (paarse spot, fig. 17). Bij 20 mM 3AT onderscheiden ook de

spots met CLC1 in pDEST32 en beide CHCs in pDEST22 zich van de autoactivatiecontrole

in de laatste kolom (groene spots, fig. 18).

-Leu-Trp-His pDEST22


pDEST32

CLC1

CLC2

CHC1

CHC2

p32

figuur 15 Overzicht van de spots van de interactietest in gist voor de CLCs en CHCs. Gisten werden na mating

(volgens bovenstaand schema) en verdunning uitgeplaat op medium zonder leucine , tryptofaan en histidine. De spots

met CLC1, CHC1 en CHC2 in pDEST32 tonen autoactivatie. CLC2 in pDEST32 kan interageren met CHC1 en

CHC2 in pDEST22. p22= pDEST22; p32= pDEST32.

41

-Leu-Trp-His

+ 10 mM 3AT

pDEST22


pDEST32

CLC1

CLC2

CHC1

CHC2

p32

figuur 16 Overzicht van de spots van interactietest in gist voor de CLCs en CHCs. De gisten werden na mating

(volgens bovenstaand schema) en verdunning uitgeplaat op medium zonder leucine, tryptofaan en histidine met 10

mM 3AT. Deze figuur toont interactie tussen CLC1 en 2 enerzijds en CHC1 en 2 anderzijds in één richting (blauwe

spots); dimerisatie van CHC1 (ornaje spot) en interactie tussen CHC1 en CHC2 in één richting (paarse spot).

-Leu-Trp-His

+ 20 mM 3AT

pDEST22


pDEST32

CLC1

CLC2

CHC1

CHC2

p32

figuur 17 Overzicht van de spots van interactietest in gist voor de CLCs en CHCs. De gisten werden na mating

(volgens bovenstaand schema) en verdunning uitgeplaat op medium zonder leucine, tryptofaan en histidine met 20

mM 3AT. Bij deze condities wordt ook interactie tussen CLC1 in pDEST32 en CHC1 en 2 in pDEST22 duidelijk.

p22 = pDEST22; p32= pDEST32

42

-Leu-Trp-His +

30 mM 3AT

pDEST22


pDEST32

CLC1

CLC2

CHC1

CHC2

p32

Bij toevoeging van 30 of 50 mM 3AT aan het medium treedt er voor geen van CLCs of CHCs

nog autoactivatie op (fig. 19 en 20). Op basis van hoe sterk de gisten groeien op deze hoge

concentraties van 3AT, kunnen de geïdentificeerde interacties geordend worden volgens

sterkte. De dimerisatie van CHC1 is de zwakste interactie. In deze spot groeien bij 30 mM

3AT geen cellen meer (oranje spot, fig. 19). Op dezelfde manier kan afgeleid worden dat de

interactie tussen CHC2 en CHC1 (paarse spot fig. 19) zwakker is dan die tussen de CLCs en

de CHCs. Toevoeging van 50 mM 3AT laat dus onderscheid in sterkte toe van de interacties

tussen de CLCs enerzijds en de CHCs anderzijds. De sterkte van interactie wordt aanzienlijk

beïnvloed door de richting in de Y2H test. Bij de CLCs in pDEST32 en de CHCs in

pDEST22, is de interactie tussen CLC1 en CHC2 (gele spot fig. 20) de sterkste, gevolgd door

CLC1 met CHC1 (rode spot fig. 20). Tussen de interacties van CLC2 met CHC1 en 2 kan

geen onderscheid gemaakt worden in sterkte (zwarte spots fig. 20). In de andere richting

interageert CHC2 sterker met beide CLCs dan CHC1 (donkergroene ten .opzichte.van.

lichtgroene spots, fig. 20). Verder kan geen onderscheid gemaakt worden in deze richting.

Het resultaat van de lacZ test is weergegeven in figuur 21. Hoe donkerder blauw de test, hoe

sterker het lacZ tot expressie komt. De evaluatie van interactie is minder duidelijk dan bij de

HIS3 reporter: het verschil tussen groei en geen groei is duidelijker dan een verschil in de

sterkte van de blauwe kleuring. Enkel voor interactie tussen CHC1 in pDEST32 en CLC1 en

2 in pDEST22 zijn de spots duidelijk donkerder dan de corresponderende

figuur 18 Overzicht van de spots van de interactietest in gist voor de CLCs en CHCs. De gisten werden na

mating (volgens bovenstaand schema) en verdunning uitgeplaat op medium zonder leucine, tryptofaan en histidine

met 30 mM 3AT. Op basis van hoe sterk de gisten groeien op deze hoge concentratie van 3AT, kunnen de

geïdentificeerde interacties geordend worden volgens sterkte De cellen in de oranje spot groeien niet langer, deze

interactie is dus de zwakste, gevolgd door de paarse spot. Voor verder onderscheid in sterkte zie figuur 5.

43

autoactivatieconstroles in de laatste rij en laatste kolom (fig. 21). CLC1 in pDEST32 werd

weggelaten omwille van autoactivatie.

-Leu-Trp-His + 50 mM

3AT

pDEST22


pDEST32

CLC1

CLC2

CHC1

CHC2

p32

LacZ test pDEST22


pDEST32

CLC2

CHC1

CHC2

p32

figuur 19 Overzicht van de spots van de interactietest in gist voor de CLCs en CHCs. De gisten werden na mating

(volgens bovenstaand schema) en verdunning uitgeplaat op medium zonder leucine, tryptofaan en histidine met 30 mM

3AT. Op basis van hoe sterk de gisten groeien op deze hoge concentratie van 3AT, kunnen de geïdentificeerde interacties

geordend worden volgens sterkte. De sterkte van de interacties wordt beïnvloed door de richting in de Y2H test. Voor de

interacties tussen de CLCs in pDEST32 en de CHCs in pDEST22 is de interactie tussen CLC1 en CHC2 de sterkste,

gevolgd door CLC1 met CHC1. Tussen interacties van CLC2 met de CHCs kan geen onderscheid gemaakt worden. In de

andere richting is interageert CHC2 sterker met de CLCs dan CHC1. Verder onderscheid kan niet gemaakt worden.

44

TPLATE en de CLCs

Interactie tussen TPLATE en CLC1 werd al eerder aangetoond in BiFC experimenten in

Nicotiana benthamiana (Daniel Van Damme, manuscript in voorbeiding). Hierdoor werd

verwacht deze interactie ook terug te vinden met behulp van Y2H. Uit de uitgevoerde testen

bleek deze interactie niet aantoonbaar via Y2H. Dit zou te wijten kunnen zijn aan verschillen

tussen de individuele kolonies van de enkelvoudige transformanten. Om toch interactie te

vinden werd een extra experiment opgezet. Hiertoe werden acht kolonies van de enkelvoudige

transformanten van TPLATE gecombineerd met 8 kolonies voor CLC1 en CLC2, en dit in

beide richtingen. In geen van de vernoemde combinaties kon interactie gedetecteerd worden

(data niet getoond). Interactie tussen TPLATE en CLC1 kan dus niet aangetoond worden in

Y2H.

SH3 en TPLATE

De gisten in deze spots groeiden zeer traag. Interactie werd pas gedetecteerd 1 week na het

spotten van de gistculturen op het medium zonder leucine, tryptofaan en histidine. Omdat in

de twee vorige interactietesten alle interacties geïdentificeerd konden worden bij 0 of 10 mM

3AT, werden de gisten niet meer gespot bij 20, 30 en 50 mM 3AT. Als geen 3AT werd

toegevoegd, was er na 1 week zwakke groei in alle spots, waaronder de autoactivatiecontroles

voor TPLATE en SH3 in pDEST32. Enkel in de autoactivatiecontroles voor pDEST22 kon

geen groei gedetecteerd worden. Deze spots zijn de enige die geen insert in hun pDEST32

vector bevatten. De groei wordt dus veroorzaakt door de aanwezigheid van om het even welk

eiwit gekoppeld aan het DB domein. Bovendien was deze groei zeer zwak ten opzichte van

echte interacties of autoactivatie, en werd het niet gedetecteerd bij 10 mM 3AT. De algemene

activatie is dus waarschijnlijk het gevolg van aspecifieke rekrutering van het RNA

polymerase door om het even welk eiwit gekoppeld aan het DB domein. De spots voor

interactie tussen TPLATE en SH3 in beide richtingen vertonen een sterkere groei (fig. 22).

Uit de lacZ test kan echter geen interactie afgeleid worden (fig. 22).

figuur 20 Overzicht resultaat LacZ test. Na mating (volgens bovenstaand schema) en verdunning werd

het medium van de gisten verwijderd, en lacZ buffer met X-gal toegevoegd. Door activatie van de LacZ

reporter ontstaat dan een blauw precipitaat. Hoe blauwer de spots, hoe sterker de interactie. Enkel voor

interactie tussen CHC1 in pDEST32 en CLC1 en 2 in pDEST22 zijn de spots duidelijk donkerder dan de

corresponderende autoactivatieconstroles in de laatste rij en laatste kolom. Omwille van autoactivatie werd

CLC1 in pDEST32 weggelaten. P22= pDEST22; p32=pDEST32.

45

De aanwezigheid van de genen voor SH3 en TPLATE in de gisten werd gecontroleerd via

PCR (zie figuur 23). Voor amplificatie van TPLATE en SH3 werden specifieke primers

gebruikt. Beide genen konden in beide spots geamplificeerd worden (fig. 23).

-L-W -L-W-H -L-W-H + 10

mM 3AT lacZ

SH3 in pDEST22 +

TPLATE in pDEST32

SH3 in pDEST22 + pDEST32

TPLATE in pDEST32 +

pDEST22

SH3 in pDEST32 + TPLATE in pDEST22

SH3 in pDEST32 +

pDEST22

TPLATE in pDEST22 +

pDEST32

figuur 21 Overzicht interactietest voor SH3 en TPLATE. De gisten werden na mating (volgens bovenstaand

schema) en verdunning uitgeplaat op medium zonder leucine en tryptofaan, en medium zonder leucine, tryptofaan

en histidine met 0 en 10 mM 3AT. Voor de lacZ test werd het medium van de culturen vervangen door lacZ buffer

met X-gal, dat bij activatie van de lacZ reporter omgezet wordt tot een blauw precipitaat. De spots van de

verschillende groeicondities (enkel 0 en 10 mM 3AT) en het resultaat van de lacZ test zijn weergegeven. SH3 en

TPLATE interageren bij 0 en 10 mM 3AT in beide richtingen, uit de lacZ test kan geen interactie afgeleid worden.

46

figuur 22 PCR ter controle van geïdentificeerde interactie tussen TPLATE en SH3. De PCR werd uitgevoerd

op gistcellen en vectoren ter controle van de aanwezigheid van de genen voor SH3 en TPLATE, en dit met

specifieke primers. In beide gistspots zijn SH3 (boven, 3591 bp) en TPLATE (onder, 4229 bp) aanwezig.

De interacties die geïdentificeerd werden in de Y2H binaire interactiestudie zijn tenslotte

schematisch weergegeven in tabel 3.

tabel 3 Overzicht geïdentificeerde interacties in de Y2H test.

σ μ AtEHD1 β’ TPL SH3 WD40 CLC1 CLC2 CHC1 CHC2

σ x

Μ

AtEHD1

β’

TPLATE x

SH3 x x

WD40

CLC1 x x

CLC2 x x

CHC1 x x x

CHC2 x x x

47


2. BIFC IN NICOTIANA BENTHAMIANA

2.1 PRINCIPE BIMOLECULAIRE FLUORESCENTIE COMPLEMENTATIE

Bimoleculaire fluorescentie complementatie (BiFC) is een directe methode voor het

visualiseren van eiwit-eiwit interacties in levende cellen. De analyse is gebaseerd op de

vorming van een fluorescent complex. GFP wordt opgedeeld in twee polypeptiden die apart

niet fluoresceren: een N-terminaal deel, headGFP (hGFP aminozuur 1 tot 155) en een C-

terminaal deel, tailGFP (tGFP aminozuur 156 tot 239). Met deze fragmenten worden fusie-

eiwitten gemaakt voor interactiestudies. Wanneer twee eiwitten met elkaar binden, worden de

twee delen van GFP weer samengebracht. Bij interactie ontstaat dus een weer natieve GFP

molecule, die fluoresceert bij excitatie met blauw licht. De fluorescentie wordt gevisualiseerd

via confocale microscopie.

Voor elk eiwit zijn er vier mogelijke constructen: hGFP en tGFP N- en C-terminaal. Voor elk

paar eiwitten kunnen dus acht mogelijke combinaties getest worden. De tGFP-ORF fusies

bleken echter niet correct te zijn. Over de combinaties met deze constructen zijn er dus geen

data gegenereerd.

Fusie met hGFP of tGFP kan de interactie tussen twee eiwitten verstoren door sterische

hindering. Als er fluorescentie, autofluorescentie van chloroplasten en stomata niet in acht

genomen, gedetecteerd wordt is dit een aanwijzing dat de twee eiwitten interageren. Indien

geen fluorescentie gedetecteerd wordt, is het echter niet uitgesloten dat de twee eiwitten niet

kunnen interageren. Omwille van sterische hindering door fusie met een fragment van GFP

kan interactie verstoord worden, ook al worden voor elk eiwit vier verschillende oriëntaties

getest.

De constructen voor de fusie eiwitten kunnen transiënt of stabiel tot expressie gebracht

worden. In beide gevallen gebeurt transformatie van de cellen via Agrobacterium. Voor

transiënte expressie in Nicotiana benthamiana worden de Agrobacterium culturen met de

constructen geïnfiltreerd in de epidermis aan de onderkant van de bladeren. Na infiltratie en

T-DNA transfer komen de constructen ectopisch tot expressie in de epidermale cellen. Deze

48

expressie stopt echter na 2 tot 3 dagen door post-transcriptionele gene silencing (PTGS).

Daarom wordt samen met de constructen een viraal afgeleid gen tot expressie gebracht, dat

codeert voor het p19 eiwit van het tomato bushy stunt virus (TBSV) en PTGS onderdrukt. De

expressie van transgenen kan tot 50 keer hoger zijn in aanwezigheid van dit virale eiwit

(Voinnet et al., 2003). Deze transiënte expressie kan tot 1000x hoger zijn dan stabiele

expressie, waardoor de lokalisatie van de eiwitten in de tabakscellen niet altijd de endogene

lokalisatie weerspiegelt.

In de puzzelvormige epidermiscellen van het blad zijn grote vacuolen aanwezig die het

cytoplasma tegen de celwand drukken. Bij een sectie doorheen het midden van de cel is

fluorescentie aanwezig in het cytoplasma daarom te herkennen als een fluorescente,

puzzelvormige lijn. Door de accumulatie van het cytoplasma aan de PM is cytoplasmatische

fluorescentie veelal moeilijk te onderscheiden van membraangebonden fluorescentie.

Voor stabiele expressie worden Arabidopsis planten getransformeerd met enkelvoudige

constructen via Agrobacterium, en nadien gekruist om telkens een head en tail fusie eiwit

samen te brengen (zie resultaten BiFC in Arabidopsis).

2.2 KLONERING

Interactie werd getest in Nicotiana benthamiana voor TPLATE, Mu-like, CLC1 en CHC1

(tabel 5). Mu-like werd enkel gecombineerd met TPLATE. De structuur van Mu-like is heel

gelijkaardig aan die van de mu-adaptines. Deze subeenheden zijn in dieren niet betrokken in

clathrine binding (Shih et al., 1995). Daarom werd Mu-like niet gecombineerd met CHC1 en

CLC1. Evaluatie van fluorescentie gebeurde 3 tot 5 dagen na infiltratie.

BiFC experimenten tGFP

TPL CLC1 CHC1 Mu-like

hGFP

TPLATE x x x x

CLC1 x x x -

CHC1 x x x -

Mu-like x - - -

tabel 5 Overzicht uitgevoerde BiFC experimenten in Nicotiana benthamiana. x: uitgevoerde infiltatie, -: niet uitgevoerd

49

2.3 INFILTRATIES

De constructen werden telkens ook afzonderlijk geïnfiltreerd als negatieve controle.

Aangezien in dit geval geen volledige GFP molecule aanwezig is, zou er geen fluorescentie

mogen gedetecteerd worden. Dit was ook niet het geval. In de tabak epidermiscellen zijn

echter vele moleculen aanwezig die ook fluoresceren na excitatie met de 488nm argon laser.

Deze negatieve experimenten dienen dan ook om een idee van de autofluorescentie in dit

systeem te krijgen. Een voorbeeld van een niet-geïnfiltreerd blad, een negatieve controle, eenn

een negatieve infiltratie en een positieve infiltratie is weergegeven in figuur 24.

figuur 24 Negatieve resultaten BiFC in Nicotiana benthamiana. (autofluorescentie in het rood, GFP in het groen)

A niet geïnfiltreerd blad, overlap rood en groen. De autofluorescentie afkomstig van onder andere chloroplasten is zichtbaar

in het groene en rode detectiegebied. B negatieve controle: TPLATE-tGFP. Autofluorescentie van chloroplasten. C negatieve

infiltratie in het rode kanaal: CHC1-hGFP + CHC1-tGFP. D negatieve infiltratie in het groene kanaal: hGFP-CLC1 + tGFP-

CLC1. Autofluorescentie van chloroplasten is zichtbaar in het groene detectiegebied. E-G: positieve infiltratie: CHC-hGFP +

tGFP-CHC1. E detectie van GFP fluorescentie, F: autofluorescentie, G: overlap van E en F. De chloroplasten fluoresceren

zowel in het rode als groene detectiegebied. Bij de overlap zie je daarom de chloroplasten in het geel. Op deze manier kan

onderscheid gemaakt worden tussen fluorescentie door interactie of autofluorescentie. (schaal= 10 µm)

Fusies met volledig GFP

Voor elk eiwit dat gebruikt werd in de BiFC experimenten werd ook een fusie met volledig

GFP gelokaliseerd (fig. 25-27). De lokalisaties van de interacties kunnen op deze manier

vergeleken worden met de lokalisaties van de afzonderlijke al dan niet interagerende eiwitten.

A

B

C

D

A B C D

E F G

50

figuur 25 Lokalisatie van vrij GFP en GFP fusies van TPLATE en CLC1 in Nicotiana benthamiana.

(autofluorescentie in het rood, GFP in het groen) A vrij GFP. B TPLATE-GFP. C GFP-CLC1. D CLC1-GFP. Vrij GFP en

CLC1 lokaliseren in de kern en in het cytoplasma. De N-terminale fusie van GFP met CLC1 toont een minder homogene

lokalisatie dan de C-terminale fusie. TPLATE lokaliseert eerder ter hoogte van het nucleaire membraan en in het cytoplasma.

(witte pijlen duiden nuclei aan, schaal = 10 µm)

Vrij GFP lokaliseert in het cytoplasma en in de kern, net zoals CLC1 (fig 25). De N-terminale

fusie van CLC1 met GFP toont een minder homogene lokalisatie in het cytoplasma dan de C-

terminale fusie. Endogeen CLC1 is aanwezig in clathrin coated pits ter hoogte van het PM en

TGN en aan het oppervlak van clathrine gecoate vesikels (Konopka et al, 2008). De N-termale

fusie komt hiermee beter overeen. De C-terminale fusie leunt dichter aan bij de lokalisatie van

vrij GFP. De TPLATE-GFP fusie toont voornamelijk lokalisatie in het cytoplasma. In

vergelijking met vrij GFP lokaliseert TPLATE niet in de kern, maar eerder ter hoogte van de

nucleaire membraan. B

A

B

C

D

A

C

51

figuur 26 Lokalisatie GFP-fusies van CHC1 in Nicotiana benthamiana. (autofluorescentie in het rood, GFP in het groen)

A-B-C CHC1-GFP. D-E-F GFP-CHC1. CHC1 lokaliseert in het cytoplasma, niet in de kern. Bij beide fusies zijn

fluorescente spots zichtbaar in het cytoplasma. F is een sectie ter hoogte van het PM, waardoor meer endomembraan

structuren zichtbaar zijn. (schaal = 10 µm)

CHC1 lokaliseert in het cytoplasma, niet in de kern. Het komt net zoals CLC1 voor in

clathrine gecoate pits ter hoogte van het PM en TGN en op het oppervlak van clathrine

gecoate vesikels. Voor beide fusies van CHC1 zijn fluorescente spots zichtbaar in het

cytoplasma (fig 26).

Fusie van Mu met GFP toont aan dat Mu lokaliseert in het cytoplasma, niet in de kern (fig.

27). Deze lokalisatie is gelijkaardig aan de lokalisatie van TPLATE. Er is geen duidelijk

verschil in lokalisatie waarneembaar tussen de N- en C-terminale fusies.

D

E

F

A

B

A

B

C

52

figuur 27 Lokalisatie GFP fusie van Mu-like in Nicotiana benthamiana. (autofluorescentie in het rood, GFP in het groen)

A en B: GFP-Mu-like. C en D: Mu-like-GFP. Mu-like bevindt zich in het cytoplasma, niet in de kern. Er is geen verschil in

lokalisatie waarneembaar tussen de N- en C-terminale GFP fusie. (schaal = 10 µm)

TPLATE en CLC1

Het BiFC experiment voor interactie tussen TPLATE en CLC1 werd al eerder uitgevoerd

door Daniel Van Damme (ongepubliceerde data). Toen werd interactie aangetoond tussen

TPLATE en CLC1, en dimerisatie van CLC1. Dit experiment werd herhaald om de data te

bevestigen. De resultaten zijn weergegeven in figuur 28.

C

D

A

B

53

TPLATE-tGFP CLC1-tGFP

hGFP-TPLATE

TPLATE-hGFP

hGFP-CLC1

CLC1-hGFP

Figuur 28 Resultaat BiFC experiment voor TPLATE en CLC1 in Nicotiana benthamiana. (GFP in het groen)

Overzicht van alle geteste combinaties van TPLATE en CLC1 fusie constructen met hGFP en tGFP. (N-terminaal deel van

eGFP=hGFP, C-terminaal deel van eGFP = tGFP). TPLATE interageert met CLC1 in alle geteste combinaties. TPLATE en

CLC1 kunnen dimeriseren in alle geteste combinaties. (schaal = 10 µm).

54

figuur 29Lokalisatie van interactie tussen TPLATE en CLC1 in BiFC in Nicotiana benthamiana. (GFP in het groen)

A TPLATE-hGFP + CLC1-tGFP. B TPLATE-tGFP +CLC1-hGFP C TPLATE-tGFP + hGFP-CLC1. D hGFP-TPLATE +

CLC1-tGFP. TPLATE en CLC1 interageren met elkaar in het cytoplasma, niet in de kern. (schaal = 10 µm)

TPLATE bindt met CLC1 in alle vier de geteste combinaties (fig. 28). Dit bevestigt het

voorafgaande experiment. Daarnaast blijkt TPLATE ook te kunnen binden met zichzelf. Ook

CLC1 kan dimeriseren in beide geteste combinaties. De interactie tussen TPLATE en CLC1

vindt plaats in het cytoplasma en ter hoogte van het nucleaire membraan (fig. 29). Deze

lokalisatie is consistent met de lokalisatie van TPLATE-GFP in figuur 25B.

De lokalisatie van interactie van CLC1 met zichzelf is verschillend in de twee geteste

combinaties (fig. 30). Bij CLC1-tGFP + hGFP-CLC1 kan CLC1 enkel in het cytoplasma met

zichzelf binden, terwijl bij de tweede combinatie CLC1-tGFP + CLC1-hGFP dit ook in de

kern gebeurt. In de N-terminale GFP fusie van CLC1 in figuur 2C lokaliseert CLC1 in het

C

D

A

B

A

B

A D

55

cytoplasma en de kern, in de C-terminale fusie enkel in het cytoplasma. Het is dus

aannemelijk dat het hGFP-CLC1 fusie eiwit van de eerste combinatie niet voorkomt in de

kern, waardoor hier ook geen fluorescentie gedetecteerd wordt in de interactietest (fig. 5).

figuur 30 Lokalisatie van dimerisatie van CLC1 in BiFC in Nicotiana benthamiana (GFP in het groen). A en B: CLC1-

hGFP + CLC1-tGFP. Deze interactie vindt plaats in het cytoplasma en voornamelijk in de kern (B detail van de kern). C en

D CLC1-tGFP + hGFP-CLC1 De interactie vindt in het cytoplasma maar niet in de kern plaats. (witte pijlen duiden nuclei

aan, schaal = 10 µm)

TPLATE en TPLATE

Ter confirmatie werd het experiment voor het testen van de interactie van TPLATE met

zichzelf herhaald (fig 31). Hiervoor werden dezelfde Agrobacterium culturen gebruikt voor

infiltratie. In de beelden is de autofluorescentie van chloroplasten en stomata in het rood

weergegeven.

A

B

C

D

56

TPLATE-tGFP TPLATE-tGFP

hGFP-

TPLATE

TPLATE-hGFP

figuur 32 Lokalisatie van dimerisatie van TPLATE in BiFC in Nicotiana benthamiana. (autofluorescentie in het rood,

GFP in het groen) A en B hGFP-TPLATE + TPLATE-tGFP. De interactie is cytoplasmatisch en ter hoogte van het nucleair

membraan en het PM zijn fluorescente spots zichtbaar. (schaal = 10 µm)

TPLATE kan met zichzelf interageren, en deze interactie vindt plaats in het cytoplasma (fig.

32). Er zijn fluorescente spots zichtbaar in het cytoplasma, net zoals bij de lokalisatie van de

CLC1-GFP-fusie (fig. 25).

figuur 31 Resultaat BiFC experiment voor dimerisatie van TPLATE in Nicotiana bethamiana. (GFP in het groen)

Overzicht van de geteste combinaties van TPLATE fusie constructen met hGFP en tGFP (N-terminaal deel van eGFP=hGFP,

C-terminaal deel van eGFP = tGFP). TPLATE dimeriseert in beide geteste combinaties. (schaal = 10 µm) A

B

57

TPLATE en CHC1

Het resultaat van het BiFC experiment voor TPLATE en CHC1 is weergegeven in figuur 33.

CHC1-tGFP CHC1-tGFP

hGFP-

TPLATE

TPLATE-hGFP

figuur 33 Resultaat BiFC experiment voor TPLATE en CHC1 in Nicotiana benthamiana. Overzicht van de geteste

combinaties van TPLATE en CHC1 fusie constructen met hGFP en tGFP (N-terminaal deel van eGFP=hGFP, C-terminaal

deel van eGFP = tGFP). TPLATE en CHC1 interageren in twee van de vier geteste combinaties. (schaal = 10µm)

Interactie tussen TPLATE en CHC1 werd gedetecteerd in beide geteste combinaties (fig. 33).

De eiwitten interageren met elkaar in het cytoplasma. Deze lokalisatie is dezelfde als die van

TPLATE in figuur 2 en CHC1 in figuur 326. De cytoplasmatische lokalisatie is niet

homogeen, er zijn duidelijk fluorescente spots terug te vinden in het cytoplasma (fig. 34), net

zoals bij de lokalisatie van CHC1 in figuur 3. Om de identiteit van de fluorescente spots in het

cytoplasma te achterhalen, werd de interactie tussen TPLATE en CHC1 gecolokaliseerd met

VHA-a1-RFP. Dit eiwit is de a1 subeenheid van het vacuolair H+-ATPase in Arabidopsis dat

zich in ter hoogte van het TGN bevindt (Dettmer et al, 2006). Er is voornamelijk overlap tussen

de groene fluorescente spots, afkosmstig van TPLATE-CHC1 interactie en de rode

fluorescente spots die corresponderen met VHA-a1 ter hoogte van het TGN. Colokalisatie

betekent dus dat TPLATE en CHC1 preferentieel interageren ter hoogte van het TGN.

58

figuur 34 Lokalisatie van interactie tussen TPL en CHC1 in BiFC in Nicotiana benthamiana. (autofluorescentie in het

rood, GFP in het groen) A-C-E hGFP-TPLATE + CHC1-tGFP. B-D-F TPLATE-hGFP + CHC1-tGFP, De interactie vindt

plaats in het cytoplasma met en ter hoogte van het nucleair membraan. Er zijn fluorescente spots zichtbaar in het cytoplasma.

A-D zijn secties doorheen het midden van de cel, E en F zijn secties aan het PM waardoor meer endomembraanstructuren

zichtbaar zijn. (schaal = 10 µm)

A

B

C

D

E

F

59

figuur 35 Colokalisatie van VHA-a1-RFP en interactie tussen TPLATE en CHC1 in BiFC in Nicotiana benthamiana.

(VHA-a1 in het rood, GFP in het groen) A-I hGFP-TPLATE + CHC1-tGFP + VHA-a1-RFP. De groene spots afkomstig van

interactie tussen TPLATE en CHC1 colokaliseren voornamelijk met de rode spots afkomstig van VHA-a1 ter hoogte van het

TGN. TPLATE en CHC1 interageren dus ter hoogte van het TGN.

CHC1 en CHC1

Eén van de twee combinaties van dit experiment toont fluorescentie. Ook CHC1 kan dus met

zichzelf interageren (fig. 36). De interactie vindt plaats in het cytoplasma, niet in de kern. Dit

is eenduidig met de lokalisatie van de CHC1 GFP fusies in figuur 3. Deze fusies lokaliseren

ook in het cytoplasma en niet in de kern.

Naast fluorescente spots zijn bij dimerisatie van CHC1 in BiFC ook aggregaten aanwezig in

het cytoplasma (fig. 37). CHCs kunnen trimeriseren in dieren en zo triskelia vormen samen

met drie CLC moleculen (Schmid and McMahon, 2007). Door overexpressie van CHC1 in tabak

GFP VHA-a1 GFP+VHA-a1

A B C

D E F

G H I

60

wordt de dimerisatie en trimerisatie waarschijnlijk gestabiliseerd en hierdoor ontstaan

aggregaten. Deze aggregaten zijn dus een artefact en het gevolg van overexpressie en

stabilisatie door BiFC.

CHC1-tGFP

hGFP-CHC1

CHC1-hGFP geen interactie gevonden

figuur 37 Lokalisatie van dimerisatie van CHC1 in BiFC in Nicotiana benthamiana. (GFP in het groen, autofluorescentie

in het rood) A-C hGFP-CHC1 + CHC1-tGFP. Interactie in het cytoplasma, niet in de kern. Er zijn zowel fluorescente spots

als aggregaten van CHC1 zichtbaar. (witte pijlen duiden nuclei aan, gele pijlen wijzen op aggregaten, schaal = 10 µm)

figuur 36 Resultaat van BiFC experiment voor dimerisatie van CHC1 in Nicotiana benthamiana. Overzicht van de

geteste combinaties van CHC1 fusie constructen met hGFP en tGFP (N-terminaal deel van eGFP=hGFP, C-terminaal deel

van eGFP = tGFP) Interactie kon gedetecteerd worden in één van de twee combinaties. (schaal = 10µm)

A

B

C

61

TPLATE en Mu-like

In immunoprecipitatie experimenten uitgevoerd door Astrid Gadeyne werd Mu-like

geïdentificeerd als directe interactor van TPLATE. Daarom werd een BiFC experiment

uitgevoerd voor het testen van interactie tussen deze twee eiwitten in Nicotiana benthamiana.

Interactie tussen TPLATE en Mu werd gedetecteerd in twee van de vier combinaties van het

BiFC experiment in Nicotiana benthamiana (fig. 38). De interactie vindt plaats in het

cytoplasma, niet in de kern. Dit strookt met de lokalisatie van TPLATE en Mu-like in figuur

25.

Mu-like-tGFP TPLATE-tGFP

hGFP-

TPLATE

hGFP-Mu-like geen interactie gevonden

TPLATE-

hGFP geen interactie gevonden Mu-like-hGFP

.

figuur 38 Resultaat van BiFC experiment voor interactie tussen TPLATE en Mu-like in Nicotiana benthamiana

Overzicht van de geteste combinaties van TPLATE en Mu-like fusie constructen met hGFP en tGFP (N-terminaal deel van

eGFP=hGFP, C-terminaal deel van eGFP = tGFP) TPLATE en Mu interageren in twee van de vier combinaties. (schaal = 10

µm).

62

figuur 39 Lokalisatie van interactie tussen TPLATE en Mu in BiFC experiment in Nicotiana benthamiana. A-B:

hGFP-TPLATE + Mu-tGFP; C-D: TPLATE-tGFP + Mu-hGFP. TPLATE en Mu interageren met elkaar in het cytoplasma.

Schaal = 10 µm.

CLC1 en CHC1

Ten slotte werd ook interactie getest tussen CLC1 en CHC1 aangetoond in drie van de vier

combinaties in het BiFC experiment (fig. 40). CHC1 en CLC1 interageren in het BiFC

experiment in het cytoplasma, niet in de kern (fig. 18). Deze lokalisatie is niet homogeen, de

endomembraanlokalisatie en aggregaten zijn zeer duidelijk zichtbaar. Deze lokalisatie

correspondeert met de lokalisatie van CHC1 in figuur 26.

A

B

C

D

63

CHC1-tGFP CLC1-tGFP

hGFP-CLC1

hGFP-CHC1 geen interactie gevonden

CLC1-hGFP

CHC1-hGFP

figuur 40 Resultaat BiFC experiment voor interactie tussen CLC1 en CHC1 in Nicotiana benthamiana deel 2.

Overzicht van de geteste combinaties van TPLATE en Mu-like fusie constructen met hGFP en tGFP (N-terminaal deel van

eGFP=hGFP, C-terminaal deel van eGFP = tGFP)CLC1 interageert met CHC1 in drie van de vier geteste combinaties.

(schaal = 10 µm)

64

figuur 41 Lokalisatie van de interactie tussen CLC1 en CHC1 in BiFC in Nicotiana benthamiana. (GFP in het groen,

autofluorescentie in het rood) A-B CLC1-heGFP + CHC1-teGFP; C CHC1-hGFP + CLC1-tGFP; D-F hGFP-CLC1 + CHC1-

tGFP. CHC1 en CLC1 interageren in het cytoplasma. Er zijn duidelijke aggregaten zichtbaar. (schaal = 10 µm)

A

C

D

E

F

B

65


3. BIFC IN ARABIDOPSIS THALIANA

In immunoprecipitatie experimenten uitgevoerd door Astrid Gadeyne werd Mu-like

geïdentificeerd als een directe interactor van TPLATE (ongepubliceerde data). De BiFC

experimenten in Nicotiana benthamiana toonden ook interactie tussen TPLATE en Mu-like

aan. Epidermale cellen in bladeren zijn echter gedifferentieerd en delen niet meer. Omdat de

interactie tussen TPLATE en Mu-like voornamelijk relevant is tijdens de celdeling, werd

interactie tussen TPLATE en Mu ook geëvalueerd in delende cellen. Delende cellen die

makkelijk toegankelijk zijn voor confocale microscopie zijn terug te vinden in het

wortelapicaal meristeem van Arabidopsis zaailingen.

De acht constructen voor BiFC voor TPLATE en Mu-like werden getransformeerd naar

Arabidopsis. De tGFP-constructen bleken niet correct, en hiervan werden dan ook geen data

gegenereerd. Er werden zo zes lijnen bekomen. Primaire transformanten werden uitgezaaid op

selectief medium en geselecteerde zaailingen werden vervolgens opgegroeid in grond. Na een

aantal weken werden voor elk construct de planten met normaal fenotype geselecteerd en

werd een rozetblaadje geoogst. Hieruit werd het RNA gezuiverd en 1µg ervan omgezet tot

cDNA. Om te bepalen welke planten per lijn het construct het sterkst tot expressie brachten,

werden PCR reacties voor amplificatie van hGFP (400 bp) of tGFP (200 bp) en eIF-4A1 (150

bp) uitgevoerd op het cDNA van de planten. De resultaten zijn weergegeven in figuur 42-45.

De intensiteit van de bandjes die corresponderen met amplificatie van eIF-4A1 reflecteert de

hoeveelheid cDNA waarop de PCR werd uitgevoerd. Dit kan dus gebruikt worden ter

normalisatie, om de verschillende planten met hetzelfde construct met elkaar te kunnen

vergelijken. Per construct werden één of twee plant geselecteerd op basis van de intensiteit

van de bandjes voor hGFP of tGFP, rekening houdend met het resultaat voor eIF-4A1. De

geselecteerd planten zijn aangeduid met een witte pijl in figuren 42-45.

66

figuur 42 qPCR op BiFC lijnen in Arabidopsis. qPCR voor hGFP (bovenaan) en eIF-4A1(onderaan) op vijf primaire

transformanten die hGFP-Mu tot expressie brengen (links) en 5 primaire transformanten met het Mu-hGFP construct (rechts).

De planten met de sterkste expressie van het construct, aangeduid met een witte pijl, werden verder gebruikt voor kruisingen.

De planten werden geselecteerd op basis van de intensiteit van de bandjes bekomen met amplificatie van hGFP. De intensiteit

van de bandjes van amplificatie van eIF-4A1 werden gebruikt voor normalisatie. Bij amplificatie van hGFP is de saturatie

weergegeven. Voor het hGFP-Mu construct werd de primaire transformant met de hoogste expressie niet gebruikt voor de

kruisingen omwille van afwijkend fenotype ten opzichte van wild type (zie verder). Daarom werd de plant met de tweede

hoogste expressie geselecteerd.

figuur 43 qPCR op BiFC lijnen in Arabidopsis. qPCR voor tGFP (bovenaan) en eIF-4A1(onderaan) op acht transformanten

met het Mu-tGFP construct (rechts). De planten met de sterkste expressie van het construct, aangeduid met een witte pijl,

werden verder gebruikt voor kruising. De planten werden geselecteerd op basis van de intensiteit van de bandjes bekomen

met amplificatie van tGFP. De intensiteit van de bandjes van amplificatie van eIF-4A1 werd gebruikt voor normalisatie. Mu

= Mu-like.

67

figuur 44 qPCR op BiFC lijnen in Arabidopsis. qPCR voor tGFP (bovenaan) en eIF-4A1(onderaan) op drie planten van de

TPLATE-hGFP lijn en drie planten van de hGFP-TPLATE lijn. De planten met de sterkste expressie van het construct,

aangeduid met een witte pijl, werden verder gebruikt voor kruising. De planten werden geselecteerd op basis van de

intensiteit van de bandjes bekomen met amplificatie van hGFP. De intensiteit van de bandjes van amplificatie van eIF-4A1

werd gebruikt voor normalisatie.TPL=TPLATE.

figuur 45 qPCR op BiFC lijnen in Arabidopsis. qPCR voor tGFP (bovenaan) en eIF-4A1(onderaan) op zes transformanten

met het TPLATE-tGFP construct. De planten met de sterkste expressie van het construct, aangeduid met een witte pijl,

werden verder gebruikt voor kruising. De planten werden geselecteerd op basis van de intensiteit van de bandjes bekomen bij

amplificatie van tGFP. De intensiteit van de bandjes van amplificatie van eIF-4A1 werd gebruikt voor normalisatie.

68

De geselecteerde planten werden met elkaar gekruist (tabel 6). Er werden vier kruisingen

uitgevoerd, corresponderend met vier combinaties voor BiFC (de tGFP-ORF clones niet

meegerekend). Voor elke kruising werden 2-3 siliques bevrucht. De nakomelingen werden

uitgezaaid op medium zonder selectie. Na een aantal dagen werd op een pool van vijf

zaailingen per silique van elke kruising de qPCR herhaald (fig. 46-47). De kans dat de

zaailingen een construct overerven van één van de twee ouders is ½. De kans voor elke

nakomeling om beide constructen te bevatten is ¼. In een pool van vijf is er dus statistisch

gezien minstens één zaailing die beide constructen bevat. Deze qPCR werd enkel uitgevoerd

voor die kruisingen waarvoor ook interactie werd gedetecteerd in de BiFC experimenten in

tabak (tab. 6).

tGFP-

TPLATE

TPLATE-tGFP tGFP-Mu-

like

Mu-like-tGFP

hGFP-

TPLATE

niet getest in Arabidopsis

construct niet

correct

x

interactie

aangetoond in

BiFC in

Nicotiana

TPLATE-

hGFP construct niet

correct x

hGFP-Mu-

like construct niet

correct x

niet getest in Arabidopsis

Mu-like-

hGFP construct niet

correct

x

interactie

aangetoond in

BiFC in

Nicotiana

In de eerste rij en de eerste kolom zijn de acht gegenereerde lijnen voor BiFC in Arabidopsis weergegeven. De uitgevoerde

kruisingen zijn aangeduid met een kruisje. Voor deze kruising werd per construct de plant met de sterkste expressie

geselecteerd met qPCR voor hGFP of tGFP en eIF-4A1. Voor twee van deze acht combinaties werd interactie aangetoond in

de BiFC experimenten in Nicotiana.

tabel 6 Overzicht van de kruisingen voor BiFC in Arabidopsis.

69

figuur 46 qPCR lijnen voor BiFC in Arabidopsis. Op de nakomelingen van de kruising werd de qPCR voor amplificatie

van hGFP (boven) en tGFP (midden) en eIF-4A1 (onder) -herhaald voor een pool van vijf zaailingen per bevruchte silique.

De PCR werd nogmaals uitgevoerd op het cDNA van de ouderplanten van de kruising (rechts in de gel aangeduid met 1-4).

Het Mu-hGFP construct is aanwezig in ouder 1 en 2, maar in geen enkele van de pools van nakomelingen. Het

TPLATE-tGFP construct is duidelijk aanwezig in ouder 3 en 4. Bij de nakomelingen is er slechts heel zwakke

amplificatie zichtbaar.

70

figuur 47 qPCR lijnen voor BiFC in Arabidopsis. Op de nakomelingen van de kruising werd de qPCR voor amplificatie

van hGFP (boven, ) en tGFP (midden) en eIF-4A1 (onder) herhaald voor een pool van vijf zaailingen per bevruchte silique.

De PCR werd ook nogmaals uitgevoerd op het cDNA van de oudeplanten van de kruising (rechts aangeduid met 1-2). Het

TPLATE-hGFP construct is duidelijk aanwezig in ouder 1 (rechts boven) en in alle drie de pools van nakomelingen van de

kruising (links boven). Het Mu-tGFP construct is aanwezig in ouder 2 (rechts onder) en in alle drie de pools van

nakomelingen. Amplificatie van eIF-4A1 toont dat in zowel bij de nakomelingen als bij de ouders cDNA aanwezig is.

71

In de nakomelingen van de kruising van hGFP-TPLATE met Mu-tGFP is er expressie van

beide constructen in de nakomelingen. Enkel voor deze combinatie werd fluorescentie

geevalueerd in de wortels van 16 zaailingen. Eerst werden de zaailingen geincubeerd met

FM4-64, een kleurstof die fluoresceert wanneer deze membraangeassocieerd is (Jelinkova 2010).

Hierdoor is de PM van de cellen duidelijk zichtbaar. Het ‘quiescent center’ (QC), en delende

cellen zijn makkelijker terug te vinden en de zaailingen kunnen makkelijker gepositioneerd

worden. TPLATE en Mu lokaliseren beiden op de celplaat. Bij interactie in BiFC zouden dus

groen fluorescerende celplaten te zien zijn. In geen enkele van de onderzochte zaailingen

werd echter interactie gedetecteerd (fig. 48).

figuur 48 Resultaat BiFC experiment in Arabidopis. A-B: WT zaailing; C: Zaailingen van de kruising hGFP-TPL x tGFP-

Mu. In de zaailing van de kruising kan geen fluorescentie corresponderend met interactie gedetecteerd worden. Het PM en

vroege endosomen zijn weergegeven in het rood door incubatie van de zaailingen met FM4-64. (autofluorescentie in het

groen door verhoging van de laserintensiteit, schaal = 10 µm)

De interacties tussen Mu-like en TPLATE kon dus niet bevestigd worden. Dit kan te wijten

zijn aan de lage expressie niveaus van de constructen in de nakomelingen van de uitgevoerde

kruisingen. Het expressieniveau zal verder geoptimaliseerd worden via selfing van de planten

die nu heterozygoot zijn voor deze constructen, vooral voor de constructen met hGFP fusie.

Het experiment kan dan herhaald worden om interactie tussen Mu-like en TPLATE ook in

delende cellen in Arabidopsis aan te tonen.

A B C

72


4. INTERACTIE VIA ECTOPISCHE MISLOKALIZATIE

IN BY-2

Naast Y2H en BiFC, veelgebruikte technieken om interactie te onderzoeken, werd ook een

derde benadering gebruikt: ectopsische mislokalisatie van TPLATE om interactie met CLC1

aan te tonen.

TPLATE werd tot expressie gebracht als fusie met de destructie-box (D-box) van cycline

B1;1 en GFP in BY-2 cellen. De D-box of destructie–box is het deel van de

aminozuursequentie van B types cyclines dat belangrijk is voor de timing van afbraak tijdens

de celcyclus (fig. 49). Deze sequentie zorgt er niet alleen voor dat cycline B1 eiwit

afgebroken wordt tijdens de metafase-anafase transitie (Criqui et al, 2000), maar ook

lokalisatie ter hoogte van de chromosomen tijdens de metafase (fig. 49).

figuur 49 Lokalisatie van CYCB1;2 in delende BY-2 cellen. CYCB1;2-RFP (rood) lokaliseert ter hoogte van de

chromosomen in metafase cellen en wordt afgebroken tijdens metafase-anafase transitie waardoor het rode signaal ter hoogte

van de chromosomen verdwijnt (gebaseerd op Boruc et al., 2010).

De D-box werkt niet alleen voor de cyclines zelf, maar ook als deze sequentie aanwezig is in

andere eiwitten. Dit systeem werd gebruikt om het belang van RUNKEL in cytokinese aan te

tonen. Door fusie van RUNKEL met de N-terminus van cycline B1;2, die de D-box bevat,

wordt RUNKEL afgebroken tijdens anafase. Het fusie-eiwit, tot expressie gebracht in ruk

mutanten, was niet in staat om de cytokinese defecten van deze mutant te complementeren,

wat een bewijs leverde dat RUNKEL voornamelijk een rol speelf na de metaphase-anaphase

transitie (Krupnova et al, 2009).

In dit experiment werd de D-box van cycline B1;1 niet gebruikt omwille van de afbraak, maar

wel voor ectopische mislokalisatie van TPLATE. TPLATE lokaliseert normaal niet ter hoogte

73

van de chromosmen tijdens metafase (fig. 50). Door fusie met de D-box wordt TPLATE wel

naar de chromosomen gerekruteerd tijdens metafase, met fluorescente chromosomen die

groen tot gevolg (fig. 51). Als TPLATE kan binden met CLC1, verwacht je CLC1 ook ter

hoogte van de chromosomen. Daarom werden BY-2 cellen die het TPLATE-Dbox-GFP

construct tot expressie brengen, getransformeerd met een construct voor CLC1-mCHERRY

door cocultivatie met Agrobacterium.

figuur 50 Lokalisatie van TPLATE-GFP in BY-2 cellen tijdens metafase. (GFP in het groen) TPLATE bevindt zich niet

ter hoogte van de chromosomen tijdens metafase. (schaal = 20 µm).

Bij interactie zal CLC1 door binding met TPLATE ook lokaliseren ter hoogte van de

chromosomen in metafase cellen. Dit is echter niet het geval: er kon geen co-lokalizatie tussen

CLC1 en TPLATE waargenomen worden ter hoogte van de chromosomen in metafase (fig.

51B).

figuur 51 Confocale sectie van een representatieve BY-2 cel in metafase A: TPLATE-DboxGFP (groen); B: CLC1-

mCHERRY (rood). De D-box zorgt ervoor dat TPLATE wordt gerekruteerd naar de chromosomen in metafase cellen. Bij

interactie met TPLATE zou CLC1 ook ter hoogte van de chromosomen lokaliseren tijdens metafase. C:TPLATE-DboxGFP

en CLC1-mCHERRY (A+B). Er is geen colokalisatie van TPLATE en CLC1 in dit systeem. (schaal = 20µm).

A C A B

74

Hoewel ectopische lokalisatie van een eiwit een elegante manier is om in vivo interactie van

twee eiwitten via co-lokalizatie aan te tonen is deze techniek niet bruikbaar voor de interactie

tussen TPLATE en CLC1. Waarschijnlijk vereist de interactie tussen beide eiwitten de

aanwezigheid van andere eiwitten van het TPLATE complex en/of speelt de omgeving in de

cel een rol. TPLATE en CLC1 zijn onder normale omstandigheden geassocieerd met de

membraanfractie van de cel. Integrale membraancomponenten zoals fosfolipiden kunnen dus

een belangrijke rol spelen bij hun interactie.

75

HOOFDSTUK 4: DISCUSSIE

HET TPLATE COMPLEX

TPLATE werd oorspronkelijk opgepikt wegens zijn specifieke lokalisatie ter hoogte van de

celplaat en de delingszone in de cortex (‘cortical division zone’, CDZ) tijdens de verankering

van de celplaat op het einde van de cytokinese. TPLATE is plantspecifiek en vertoont

similariteit met adaptor eiwitten betrokken in membraantransport. Constitutieve RNAi in BY-

2 cellen met een construct gericht tegen het tabakshomoloog van TPLATE leidde tot defecten

bij celplaatverankering. Dit is in overeenstemming met de lokalisatie van TPLATE aan de

CDZ (Van Damme et al., 2006).

Om inzicht te krijgen over de rol van TPLATE tijdens celplaatverankering werden TPLATE-

interagerende eiwitten geïdentificeerd via TAP experimenten (Astrid Gadeyne,

ongepubliceerde data). Op deze manier werden 12 eiwitten gevonden, waarvan er zeven

bevestigd konden worden in verschillende onafhankelijke TAP experimenten. Een aantal van

deze eiwitten zijn gelinkt met clathrine gemedieerde endocytose. Verschillende interactors

vertonen structurele similariteit met subeenheden van adaptorcomplexen betrokken in

clathrine gemedieerde endocytose. Ook TPLATE zelf vertoont homologie met adaptor

eiwitten. Het N-terminale gedeelte van TPLATE is structureel homoloog met het adaptin_N

domein., ook aanwezig in de grote subeenheden van de AP-1, AP-2, AP-3 en AP-4 adaptor

complexen. Verschillende leden van het TPLATE complex vertonen een lokalisatie die

identiek aan die van TPLATE in delende BY-2 cellen, wat er sterk op wijst dat deze eiwitten

deel uitmaken van een enkel complex tijdens de celdeling. Ten slotte lokaliseert CLC1 ook op

de celplaat en in de CDZ in BY-2 cellen. Interactie tussen TPLATE en CLC1 werd al

aangetoond met behulp van Y2H en BiFC in Nicotiana benthamiana (Daniel Van Damme,

ongepubliceerde data). Er zijn dus verschillende indicaties voor een link met clathrine

gemedieerde endocytose. Om het TPLATE complex verder te karakteriseren werd een studie

uitgevoerd van de binaire interacties tussen de leden van het complex onderling. Verder werd

ook de interactie van clathrine met de componenten van het complex en TPLATE zelf in het

bijzonder onderzocht. Er werden drie verschillende methoden gebruikt: Y2H, BiFC in

Nicotiana benthamiana en Arabidopsis thaliana en mislokalisatie in Nicotiana tabacum BY-2

cellen.

76

BINAIRE GIST-TWEE-HYBRIDE INTERACTIES

Voor de interactietest werden TPLATE en zes andere leden van het complex samen met

CLC1, CLC2, CHC1 en CHC2 uit Arabidopsis ingesloten. Als alle combinaties getest

worden, zijn dit meer dan honderd interacties. De Y2H methode laat toe om snel een groot

aantal interacties in één experiment te testen, en leent zich hier dus uitstekend voor. Op deze

manier werden interactie aangetoond tussen sigma-like en SH3-like, tussen TPLATE en SH3-

like, en tussen de CLC en CHC subeenheden.

Sigma-like is structureel gelijkaardig aan de sigma subeenheden van de klassieke

adaptorcomplexen en ζ-COP van het COPI coatomeer. In dieren stabiliseert het sigma adaptin

het adaptorcomplex door interactie met de andere subeenheden (Robinson & Bonifacino, 2001).

Het ζ-COP stabiliseert interactie tussen β-COP en γ-COP. Daarnaast is de sigma-subeenheid

in de AP-1 en AP-2 complexen ook betrokken in de binding met cargo molecules samen met

de γ-subeenheid of de α-subeenheid (Takatsu et al, 2001). De AP-1 en AP-2 Adaptor complexen

kunnen cargomoleculen herkennen aan de hand van twee motieven: een tyrosine-gebaseerd

Yxx motief en dileucine-gebaseerd [DE]XXXL[LI] motief. De γ/ζ1 en α/ζ2

hemicomplexen kunnen dileucine motieven binden in het cytoplasmatische gedeelte van

cargomoleculen en op deze manier bijdragen in de sortering (Doray et al., 2007). Voor zover ons

bekend interageert de sigma-subeenheid van adaptorcomplexen in dieren niet met

accessorische eiwitten. SH3-like bevat een SH3 of Src3 homology domein. Dit domein is in

dieren aanwezig in accessorische eiwitten zoals amphiphysine, voor rekrutering van de

dynamines (David et al, 1996). SH3-like zou dus ook een accessorische eiwit kunnen zijn met

een ongekende functie.

Er zijn verschillende eiwitten met SH3-domeinen bekend in Arabidopsis. Deze Arabidopsis

thaliana SH3-containing proteins (AtSH3Ps) zijn betrokken in transport van clathrine gecoate

vesikels (Lam et al, 2001). De eiwitten zijn gelijkaardig aan eiwitten uit dieren en gist betrokken

in vorming en afsnoering van vesikels met een clathrinemantel. AtSH3P1 bijvoorbeeld

colokaliseert met clathrine ter hoogte van het PM en op vesikels afgeleid van het TGN. Via

Y2H screening werd interactie geïdentificeerd tussen AtSH3P1 en een ‘auxilin-like’ eiwit.

Auxiline is in dieren belangrijk voor de stimulatie van het verwijderen van de clathrinemantel

via rekrutering van Hsc70 (Jiang et al, 1997). AtSH3P1 bindt met zijn SH3 domein het proline-

rijk domein (PRD) van auxiline-like. De stimulatie van ‘uncoating’ wordt verhinderd bij

aanwezigheid van AtSH3P1. Dit eiwit zou dus een regulatorische rol kunnen spelen in het

77

verwijderen van de clathrinemantel. De rol van AtSH3Ps als accessorische eiwitten betrokken

in de uncoating van clathrine gecoate vesikels illustreert de link tussen SH3-like en clathrine

gemedieerde endocytose.

Ook TPLATE interageert met SH3-like in gist. TPLATE bevat een N_adaptin domein, dat

ook aanwezig is in de N-terminus van de grote subeenheden van de adaptorcomplexen.

Daarnaast bezit het ook een β-COP specifiek element dat aanwezig is in de grote β-

subeenheid van het COP coatomeer. TPLATE kan dus mogelijk de functie van een grote

subeenheid vervullen (Van Damme et al., 2006). De grote subeenheden binden accessorische

eiwitten via hun ‘appendage’ domein aan hun C-terminus (Owen et al, 2000). Deze accessorische

eiwitten hebben eerder een regulatorische rol in vesikelvorming door rekrutering van andere

eiwitten met een specifieke activiteit in bijvoorbeeld het afsnoeren van vesikels of het

verwijderen van de clathrine mantel. SH3-like zou kunnen functioneren als accessorisch eiwit

dat bindt met TPLATE als grote subeenheid van het adaptorcomplex.

Tenslotte werden ook interacties tussen CLC1 en 2 enerzijdes en CHC1 en 2 anderzijds

gedetecteerd. Deze interacties zijn voorheen nog niet effectief aangetoond in planten. Het

terugvinden van deze interactie in ons experiment wijst er op dat het experiment correct werd

uitgevoerd. Het aantal interacties gevonden met het Y2H experiment is echter lager dan wat je

zou verwachten voor een complex met zeven subeenheden. De leden van het complex zijn

bevestigd in meerdere onafhankelijke TAP experimenten met verschillende leden als bait-

eiwit. Het TPLATE complex is dus zeer robuust (Astrid Gadeyne, ongepubliceerd). Opdat de

zeven subeenheden een robuust complex kunnen vormen, moeten er meer interacties

plaatsvinden dan het aantal door ons geïdentificeerd via Y2H. Er zijn dus vals negatieven.

Deze interacties kunnen te zwak zijn voor detectie, of er kunnen extra essentiële factoren voor

interactie ontbreken in het gist systeem (zie verder). In tegenstelling tot het TPLATE complex

konden de interacties binnen de klassieke AP complexen oorspronkelijk wel geïdentificeerd

worden via Y2H (Page & Robinson, 1995). De γ-subeenheid van het AP-1 complex interageert

met de β- en ζ-subeenheid. Later werd een homoloog van γ-adaptin ontdekt, γ2 genoemd. In

Y2H experimenten kon men interactie van het γ2 met de σ-subeenheid identificeren, maar niet

met het β-adaptin. Daarom werd een Y3H experiment uitgevoerd waar interactie tussen γ2 en

β getest werd in aanwezigheid van het σ-adaptor eiwit. In dit experiment kon wel interactie

gedetecteerd worden (Takatsu et al., 2001). De σ-subeenheid kan samen met γ2 β binden, of

interactie met ζ zorgt ervoor dat γ2 de juiste conformatie kan aannemen voor interactie met β-

78

adaptin. Het zou dus mogelijk kunnen zijn dat meer interacties gedetecteerd kunnen worden

in een Y3H experiment als een derde subeenheid wordt toegevoegd, zoals bv. Sigma-like. Een

andere mogelijkheid is dat interacties niet gedetecteerd kunnen worden door verschillen in

conformatie tussen subeenheden als ze in het complex gebonden zijn, of als ze geïsoleerd

voorkomen zoals in het Y2H systeem (Page & Robinson, 1995).

BIFC IN NICOTIANA BENTHAMIANA EN ARABIDOPSIS

THALIANA

Een aantal interacties werden ook getest in een plantsysteem. Doordat voor elke twee eiwitten

theoretisch acht combinaties getest moeten worden, is het praktisch niet evident om alle

paarsgewijse interacties te onderzoeken via BiFC. Daarom werden in eerste instantie enkel

TPLATE, CLC1, CHC1 en Mu-like getest. Mu-like werd meegenomen omdat interactie

tussen TPLATE en Mu-like eerder gedemonstreerd werd met coIP (Astrid Gadeyne,

ongepubliceerd). Het transiente BiFC experiment had in eerste instantie als doel die

combinaties te identificeren waarbij interactie waargenomen kon worden om deze vervolgens

in Arabidopsis te testen. In de BiFC experimenten in Nicotiana werden naast interacties ook

GFP-fusies van de onderzochte eiwitten gelokaliseerd. De expressie van de constructen is

transiënt, en kan heel sterk zijn. Hierdoor zijn lokalisaties niet altijd betrouwbaar. CLC1

lokaliseert in zowel de N- als C- terminale fusie in het cytoplasma en de kern. Endogeen

CLC1 is aanwezig ter hoogte van het clathrine ‘coated pits’ op het TGN en PM. De N-

terminale fusie van CLC1 met GFP resulteert in een minder homogene fluorescentie in het

cytoplasma terwijl de C-terminale fusie vooral in de kern lokaliseert. De N-terminale fusie

correspondeert beter met de lokalisatie van CHC, en heeft daardoor meer kans om de juiste

lokalisatie te zijn. De C-terminale fusie sluit dichter aan bij de lokalisatie van vrij GFP. Bij

beide GFP-fusies van CHC1 is fluorescentie zichtbaar in het cytoplasma en de kern.

Daarnaast zijn er ook fluorescente spots zichtbaar, die corresponderen met het PM en TGN.

De C-terminale fusie van TPLATE en beide fusies van Mu-like lokaliseerden in het

cytoplasma en ter hoogte van het nucleaire membraan maar niet in de kern. De GFP-TPLATE

fusie werd niet geanalyseerd, maar deze werd eerder wel in de nucleus lokaliseert in BY-2

cellen (Daniel Van Damme, ongepubliceerd). Dit is waarschijnlijk een artefact eigen aan

tabakcellen, want in Arabidopsis komt GFP-TPLATE niet voor in de kern en lokaliseert dit

N-terminale fusie-eiwit identiek aan het C-terminale fusie-eiwit (TPLATE-GFP). Dit

benadrukt nogmaals dat lokalisaties in heterologe systemen, in dit geval een Arabidopsis eiwit

79

in epidermale cellen van Nicotiana, steeds met de nodige voorzichtigheid moeten

geïnterpreteerd worden. Het BiFC systeem wordt in de eerste plaats gebruikt voor detectie

van interactie. De epidermale cellen in de bladeren delen niet, terwijl het TPLATE complex

net een rol speelt tijdens cytokinese. De lokalisaties geven dus geen informatie over wat er

gebeurt tijdens celdeling. Het aantonen interactie tussen de geteste eiwitten en de lokalisatie

ter hoogte van het PM en TGN kan wel de link tussen het TPLATE complex en clathrine

gemedieerde endocytose versterken.

In de experimenten werd interactie aangetoond tussen TPLATE enerzijdes en CLC1 en CHC1

anderzijds. In beide gevallen zijn fluorescente spots zichtbaar. Interactie met CLC1 werd al

eerder gedemonstreerd (Daniel Van Damme, ongepubliceerd). TPLATE is vertoont

homologie met adaptormoleculen. De grote subeenheden van adaptorcomplexen zijn

betrokken in de binding met clathrine door interactie met CHC. Het CHC eiwit heeft een β-

propeller domein aan de N-terminus waarmee het bindt met de adaptins (Shih et al, 1995). Het

aantonen van interactie tussen TPLATE en CHC1 versterkt de link tussen TPLATE en

clathrine gemedieerde endocytose.

TPLATE, CLC1 en CHC1 bleken in staat tot dimerisatie. De dimerisatie van TPLATE komt

voor bij twee combinaties: TPLATE-hGFP + TPLATE-tGFP en hGFP-TPLATE + TPLATE-

tGFP. Bij de combinatie van TPLATE-hGFP + TPLATE-tGFP, komt dimerisatie enkel voor

in het cytoplasma en ter hoogte van het nucleair membraan. Bij hGFP-TPLATE + TPLATE-

tGFP daarentegen komt er ook interactie komt in de kern. Bij beide fusies zijn ook

fluorescente spots zichtbaar in het cytoplasma. Zoals eerder vermeld lokaliseert GFP-

TPLATE in de nucleus in BY-2 cellen, terwijl TPLATE-GFP dit niet doet. De nucleaire

lokalisatie bij de N-terminale fusies is dus waarschijnlijk gelijkaardig aan de lokalisatie van

GFP-TPLATE in BY-2 en een artefact van het systeem. TPLATE is het enige eiwit in het

TPLATE complex dat zou kunnen functioneren als grote subeenheid in een adaptorcomplex.

Dimerisatie van TPLATE kan dus compenseren voor het ontbreken van een tweede grote

subeenheid. CHC1 en CLC1 vormen in cellulaire omgeving samen hexameren in de vorm van

triskelia. Bij het herenigen van hGFP en tGFP wordt de interactie tussen de CHCs

gestabiliseerd. Dit in combinatie met overexpressie geeft aanleiding tot het ontstaan van

aggregaten.Deze aggregaten zijn sterk zichtbaar bij de visualisatie van interactie tussen CHC1

en CHC1 en tussen CHC1 en CLC1, en kunnen groter zijn dan de kern.

80

De fluorescente spots zichtbaar bij de combinatie hGFP-TPLATE + CHC1-tGFP suggereren

interactie ter hoogte van ‘clathrine coated pits’ op het TGN. Om dit te bevestigen werd deze

interactie gecolokaliseerd met VHA-a1, de vacuolaire H+-ATPase subeenheid a1 die

standaard gebruikt wordt als merker voor het TGN (Krebs et al., 2009). Er werd gedeeltelijke

colokalisatie gevonden tussen de fluorescente spots, wat aantoont dat interactie tussen

TPLATE en CHC1 plaatsvindt ter hoogte van het TGN. TPLATE lokaliseert in Arabidopsis

echter niet ter hoogte van het TGN (Daniel Van Damme, ongepubliceerd). Wat we zien in

BiFC in Nicotiana is waarschijnlijk een artefact waarbij TPLATE door CLC1 en CHC1 naar

het TGN wordt getrokken. De epidermale cellen in de bladeren van Nicotiana delen immers

niet, terwijl TPLATE voornamelijk gelinkt wordt met een functie tijdens de finale fasen van

de celdeling. Dit benadrukt het belang van de studie van de interacties met TPLATE in

delende cellen, zoals in BiFC in Arabidopsis.

Ook interactie tussen TPLATE en Mu-like, eerder gedemonstreerd met CoIP (Astrid

Gadeyne, ongepubliceerd), werd bevestigd met BiFC. Mu-like heeft een structuur die heel

gelijkaardig is aan de structuur van de mu-adaptins. In de klassieke adaptor complexen is er

ook interactie tussen een grote subeenheid en het mu-adaptin (Robinson et al., 2001). Dit is

opnieuw een aanwijzing voor de rol van het TPLATE complex als potentieel alternatief

plantspecifiek adaptor complex.

Door het gebruiken van de Y2H methode en BiFC in Nicotiana, idenficeren we interacties in

een heteroloog systeem en in niet-delende cellen. Het TPLATE complex bestaat uit eiwitten

afkomstig uit Arabidopsis en speelt mogelijkerwijs een rol tijdens celdeling. Het is dus ook

belangrijk de gedetecteerde interacties in situ te analyseren in Arabidopsis. De geteste

combinaties die fluorescentie opleverden in Nicotiana werden onderzocht in Arabidopsis. De

interactie tussen Mu-like en TPLATE kon echter niet bevestigd worden in Arabidopsis. Dit

kan te wijten zijn aan het expressieniveau van de hGFP en tGFP constructen in de

nakomelingen. De acht combinaties voor BiFC werden gegenereerd door het kruisen van

planten met enkelvoudige constructen. De expressie van de enkelvoudige constructen werd

voor de kruising geverifieerd via qPCR-analyse van hGFP en tGFP. Deze analyse werd

herhaald op de nakomelingen van de kruisingen. De expressie van de hGFP en tGFP

constructen bleek echter veel zwakker in deze nakomelingen ten opzichte van die in de

ouders. Hiervoor is niet direct een eenvoudige verklaring mogelijk behalve het feit dat je bij

kruising het totale aantal inserties halveert, wat een weerslag heeft op het globale

expressienieau. Na verdere optimalisatie van het expressieniveau van de constructen door

81

zelfbestuiving van de nakomelingen kan deze interactie mogelijk toch aangetoond worden in

Arabidopsis..

INTERACTIE VIA ECTOPISCHE MISLOKALIZATIE IN BY-2

Interactie tussen TPLATE en CLC1 werd eerder aangetoond in BiFC en Y2H experimenten.

De afwezigheid van interactie tussen TPLATE en CLC1 in dit systeem toont aan dat er

waarschijnlijk andere eiwitten ook een rol spelen bij deze interactie die niet gerekruteerd

worden naar de chromosomen of die niet aanwezig zijn tijdens metaphase.. De afwezigheid

van interactie kan in dit geval niet verklaard worden door de positie van de fluorochromen (C-

terminale fusie), aangezien interactie in BiFC in Nicotiana wel optreedt tussen C-terminale

fusies.

BINAIRE INTERACTIE STUDIE

De interacties die werden gedetecteerd in deze masterthesis verschilden voor de twee

gebruikte strategieën. Y2H en BiFC zijn dus complementair. Verder volgt een vergelijking

van beide technieken en worden voor- en nadelen aangehaald.

Y2H VERSUS BIFC

Zowel Y2H als BiFC zijn gebaseerd op complementatie en laten directe detectie toe van

interacties in levende cellen. Eén van de grote uitdagingen voor de directe detectie is dat de

meeste eiwitten meerdere interactiepartners hebben in een cel (Kerppola, 2008). In vele

methoden kan interactie van de bestudeerde eiwitten met andere cellulaire eiwitten

interfereren met de detectie. Bij de BiFC benadering wordt dit probleem omzeild door

overexpressie van de eiwitten onder studie. Door transiënte en dus sterke expressie in de

bladeren van Nicotiana benthamiana kunnen echter niet-natieve interacties ontstaan of

kunnen de eigenschappen van de interacties beïnvloed worden. Een voorbeeld hiervan zijn de

aggregaten die teruggevonden werden bij de dimerisatietesten met CHC1. Interactie met

endogene eiwitten is minder waarschijnlijk in Y2H, omdat de onderzochte eiwitten uit

Arabidopsis tot expressie gebracht worden in een heteroloog systeem (Saccharomyces

cerevisiae). Toch kan interactie met de endogene gisteiwitten niet uitgesloten worden

(Kerppola, 2008).

Een voordeel van complementatie gebaseerde methoden is dat het signaal voor interactie, in

dit geval groei of fluorescentie, enkel afkomstig is van de twee eiwitten waartussen interactie

82

wordt getest. Complexen die gevormd worden met andere partners worden niet gedetecteerd.

Er is ook geen informatie vereist over de structuur van de onderzochte eiwitten. De

gedetecteerde interacties kunnen wel indirect zijn (Kerppola, 2008).

Het belangrijkste voordeel van BiFC is dat het interactie onderzoekt in de normale cellulaire

omgeving en dat dit ook in situ informatie oplevert . Bij sterke expressie dient de lokalisatie

weliswaar met de nodige voorzichtigheid geïnterpreteerd te worden. De interpretatie van de

resultaten vereist geen complexe verwerking of compensatie voor andere bronnen van

fluorescentie. Bij Y2H daarentegen moet wel getest worden voor autoactivatie voor de

interactietest gestart kan worden. Door de lage intrinsieke fluorescentie is de meeste cellen,

laat BiFC toe interacties te visualiseren in elk weefsel of celtype waarin de fusie eiwitten tot

expressie gebracht kunnen worden. Als twee eiwitten met elkaar interageren, en hGFP en

tGFP dichter bij elkaar komen en binden waardoor de interactie tussen de onderzochte

eiwitten gestabiliseerd wordt. Hierdoor kunnen ook zwakke of transiënte interacties

gedetecteerd De eiwitten waaraan de GFP fragmenten bevestigd worden moeten niet direct

interageren met elkaar, maar wel deel zijn van hetzelfde complex (Hu et al, 2002). Interacties

kunnen ook indirect zijn als een endogene gist eiwit als ‘brug’ fungeert (Walhout et al, 2000)

Het Y2H assay heeft naast het voordeel van de hoge doorvoer toch een aantal intrinsieke

nadelen die aanleiding geven tot vals positieve en vals negatieve resultaten. Vals positieven

zijn gedetecteerde interacties die niet biologisch relevant zijn. Dit zijn bijvoorbeeld eiwitten

die in een plant niet in hetzelfde celcompartiment voorkomen. Hierdoor is validatie van

geïdentificeerde interacties vereist. In het systeem zijn een aantal aanpassingen aangebracht

om het aantal vals positieve resultaten te verminderen. De eiwitten zijn gekloneerd in ‘low

copy number’ vectoren en er worden twee reportergenen gebruikt met onafhankelijke

promotors (Walhout et al, 2000).

Vals negatieven zijn eiwitten die wel interageren maar niet gedetecteerd worden. Dit kan

verschillende oorzaken hebben. Voor detectie van interactie moeten de eiwitten kunnen

interageren in de nucleus. Als één of beide eiwitten niet naar de kern getransporteerd wordt,

bijvoorbeeld omdat het membraanverankerd is of bindt met membranen, kan interactie niet

gedetecteerd worden. In dit geval kunnen alternatieven zoals split-Ubiquitin aangewend

worden (zie verder) De interactie kan ook gewoon te zwak zijn voor detectie. Daarnaast kan

interactie ook verhinderd worden door sterische hindering door de fusie met één van de TF

domeinen (Vidal et al.,1999). Dit geldt ook voor BiFC. Beide delen van GFP kunnen aan de N-

83

of C-terminus van beide eiwitten bevestigd worden. Hierdoor zijn er voor elk eiwit vier

constructen, en moeten acht combinaties getest worden (Kerppola, 2008).

Voor sommige interacties zijn post-translationele modificaties van de interagerende eiwitten

nodig zoals fosforylatie. Als het kinase vereist voor fosforylatie niet aanwezig is in gist,

zullen de eiwitten waarschijnlijk niet interageren. Ook de ‘folding’ of stabiliteit van de DB-X

of AD-Y fusie eiwitten kan de eigenschappen van transcriptie activatie beïnvloeden. Ten

slotte kunnen bepaalde fusie-eiwitten toxisch zijn, en dit beïnvloedt de leefbaarheid van de

cellen. Vals negatieve resultaten komen frequent voor bij de Y2H methode. De ‘false negative

rate’ wordt geschat op 45% (Walhout et al., 2000). Dit kan het lage aantal teruggevonden

interacties verklaren.

CONCLUSIE

Het TPLATE complex is zeer robuust. In deze masterthesis konden een aantal interacties

bevestigd worden, zoals de interactie tussen TPLATE en CLC1. Daarnaast hebben we ook

een aantal nieuwe interacties gevonden. Zo weten we nu dat TPLATE kan binden met SH3-

like, en dat ook Sigma-like en SH3-like met elkaar interageren (zie figuur 1). We hebben ook

de link tussen het TPLATE complex en clathrine versterkt, onder andere door het aantonen

van interactie tussen TPLATE en CHC1. Daarnaast bleek ook TPLATE in staat te zijn te

dimeriseren.

84

figuur 52 Het TPLATE complex. TPLATE werd gebruikt als bait bij TAP experimenten waarbij 12 interagerende

eiwitten geïdentificeerd werden (gele en groene eiwitten). De gele interactors zijn éénmalig gedetecteerd, de groene

interactors werden in meerdere onafhankelijke TAP experimenten teruggevonden. De rode lijnen zijn interacties

geïdentificeerd via BiFC in Nicotiana benthamiana, dikkere lijnen wijzen op interacties aangetoond via Y2H.

Via Y2H konden minder interacties gedetecteerd worden dan logischerwijs aanwezig moeten

zijn in een complex met 7 subeenheden. Om verder te link tussen het plantspecifieke

TPLATE complex en adaptor complexen in dieren te versterken, kunnen andere technieken

voor de detectie van binaire interacties aangewend worden. Zoals eerder vermeld levert Y3H

met toevoeging van een derde component zoals Sigma-like, misschien meer interacties op.

Als alternatief kan ook split-Ubiquitin gebruikt worden. Deze techniek laat toe interactie

tussen twee eiwitten te onderzoeken op hun natuurlijke lokalisatie binnen de cel (Johnsson &

Varshavsky, 1994).

Naast het detecteren van de interacties, is hun in situ karakterisatie tijdens celdeling in

Arabidopsis essentieel. Deze karakterisatie en verdere functionele analyse brengen het

achterhalen van de specifieke rol van het TPLATE complex tijdens cytokinese mogelijk een

stapje dichterbij.

85

HOOFDSTUK 4: MATERIAAL EN METHODE

BINAIRE GIST-TWEE-HYBRIDE INTERACTIES

CONSTRUCTEN

De genen gebruikt voor Y2H werden gekloneerd in destinatievectoren pDEST22 (met

activatiedomein, gen voor tryptofaan biosynthese en ampicilline resistentie) en pDEST32

(met DNA bindend domein, gen voor leucine biosynthese en gentamycine resistentiemerker)

(Invitrogen) met behulp van ‘gateway cloning technology’. De genen werden vanuit

beschikbare ‘entry clones’ (gegenereerd door Astrid Gadeyne) gekloneerd met LR klonase

(Invitrogen), en getransformeerd naar E.coli DH5α-cellen met behulp van een hitteshock

protocol (42 sec bij 42°C in een waterbad, vervolgens werd 900µl SOC medium toegevoegd

en de cellen werden gedurende 1 uur geïncubeerd vooraleer uit te platen). De

getransformeerde bacteriën werden kort afgedraaid bij 14000 rpm, terug opgelost in 100 µl

medium en uitgeplaat op LuriaBroth+ (LB+) medium (10 g/l tryptone , 5 g/l gistextract, 10 g/l

NaCl, 20 g/l agar, pH 7) met 50 mg/l carbenicilline (selectie voor pDEST22) of 20 mg/l

gentamycine (selectie voor pDEST32). Individuele kolonies werden opgegroeid en ofwel

handmatig geïsoleerd uit de E.coli cellen met de ‘High Pure Plasmid Isolation Kit’ van Roche

zoals beschreven in de handleiding, ofwel met de robot (Wizard Magnesil Plasmid

Purification System van PROMEGA).

TRANSFORMATIE VAN GIST

De pDEST22 en pDEST32 expressievectoren werden getransformeerd naar Saccharomyces

cerevisiae stammen PJ694α en PJ694a met behulp van een hitteshock protocol (zie

addendum). De resulterende transformanten werden geselecteerd door groei op SD medium

(26.7 g/l minimal SD base, Clontech) met DropOut Supplement (tussen 0.62 en 0.74

g/lafhankelijk van het type supplement, DO Supplement, Clontech) -Trp (voor pDEST22) en

DO Supplement -Leu (voor pDEST32) en 20 g/l agar (select agar, Invitrogen) bij 30°C

gedurende twee dagen.

AUTOACTIVATIETEST EN INTERACTIETEST

De gisten werden voor mating opgegroeid in SD-Leu voor pDEST32 of SD-Trp voor

pDEST22 in multiwell blokken. De mating gebeurde in 2xYPDA medium (50 g/l YPD,

Clontech, en 73 mg/l adenine) gedurende 1 dag (protocol zie addendum). Na mating werden

86

de gisten twee dagen gegroeid (schudden bij 900rpm) in vloeibaar SD-Leu-Trp medium bij

30°C in 96-well platen met ronde bodem. Na 2 dagen werden de OD600-waarden van de

culturen gemeten (SoftMaxPro software) en verdund naar OD600 van 0.2 in SD-Leu-Trp-His.

Van deze verdunning werd telkens 5 µl uitgeplaat op SD-Leu-Trp met agar enerzijds en SD-

Leu-Trp-His medium met agar en 0, 10, 20, 30 en 50mM 3-amino-1,2,4-triazol (3AT, Sigma

Aldrich) anderzijds. Groei werd geëvalueerd na 3 dagen incubatie bij 30°C.

LACZ TEST

De rest van de verdunning met OD600 van 0.2 van elke cultuur werd in een 96-well plaat met

vlakke bodem 5 min. afgedraaid bij 1700 rpm. Na verwijderen van het supernatans, werd de

plaat eerst kort in vloeibaar stikstof gebracht om de cellen open te breken. Daarna werd 100µl

lacZ buffer (60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4.H2O, 10 mM KCl, 1 mM MgSO4.7H2O, pH

7) met X-gal (1.67 ml per 100 ml buffer van een 40 mg/l oplossing) en β-mercaptoethanol

(0.27 ml/ 100 ml oplossing) toegevoegd per well. Na toevoegen van de buffer werd de plaat

geïncubeerd bij 37°C tot het blauw precipitaat zichtbaar was. De plaat werd ingescand om de

kleur van het precipitaat te evalueren.

CONTROLE PCR

De aanwezigheid van Sigma-like en SH3-like en SH3-like en TPLATE in de gisten die

interactie aanwijzen werd geverifieerd via PCR met specifieke primers voor Sigma-like, SH3-

like en TPLATE (zie tabel) De cellen werden eerst terug opgegroeid op vast SD-Leu-Trp

medium. Om de celwand af te breken werden de cellen behandeld met zymolyase (ZYMO

RESEARCH, protocol zie addendum). Het PCR schema is weergegeven in tabel 2. De PCR

werd uitgevoerd met een Icycler toestel van BioRad.

87

tabel 2 Primersequenties voor PCR op gist. De gisten die interactie aantoonden tussen Sigma-like en SH3-like en tussen

SH3-like en TPLATE werden geverifieerd voor aanwezigheid van de primers via PCR.

tabel 3 PCR schema voor controle PCR op gist

gen primer sequentie

TPLATE Forward 5’-

GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGGACATTCTTTTTGCT

CAGATCC-3’

Reverse 5’-

GGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGTTAACTTTGGTATATTTT

CTATCTTTGCA-3’

SH3-like Forward 5’- AAAAAGCAGGCTCCACCATGGCGGAATCGTCTGGTAC-3’

Reverse 5’ AGAAAGCTGGGTCAGATTGATTGACGTATAGAACAGG-3’

Sigma-

like

Forward 5’- AAAAAGCAGGCTCCACCATGATCCTAGCTGTGTTGTTCG-3’

reverse 5’- AGAAAGCTGGGTCAACTTCAGAAGGAGGTTTCAATC-3’

PCR schema gisten

1 1x 94°C 2 min.

2 10x

94°C 30 sec.

6555°C 30 sec.

72°C 4 min.

3 30x

94°C 30 sec.

55°C 30 sec.

72°C 4 min.

4 1x 4°C ∞

88

BIFC IN NICOTIANA BENHTAMIANA EN ARABIDOPSIS

THALIANA

CONSTRUCTEN

De genen voor TPLATE, Mu-like, CLC1 en CHC1 werden gekloneerd via ‘gateway cloning

technology’ in de vectoren pH7m34GW en pK7m34GW (Karimi et al, 2007) voor C-terminale

fusie met ‘head’ en ‘tailGFP’ (Boruc et al) respectievelijk, en pH7m24GW2 en pK7m24GW2

voor N-terminale fusie met ‘headGFP’ en ‘tailGFP’ respectievelijk. Voor deze klonering met

LR klonase (Invitrogen) werden in het labo beschikbare ‘entry clones’ gebruikt, en de

bekomen vectoren werden getransformeerd naar E.coli DH-5α-cellen via hitteshock. De

bacteriën werden gegroeid op LB+ medium met 100 mg/l spectinomycine. Na selectie werden

de bacteriën opnieuw opgegroeid in vloeibaar LB+ medium met 100 mg/l spectinomycine

voor isolatie met de ‘High Pure Plasmid Isolation Kit’ van Roche zoals beschreven in de

handleiding. Na controle van de vectoren via restrictiedigesten, werden ze getransformeerd

naar Agrobacterium tumefaciens stammen C58 en LBA 4404 via elektroporatie (protocol zie

addendum). Agro’s werden geselecteerd op basis van aanwezige selectiemerkers op YEB

medium (5 g/l rundextract, 1 g/l gistextract, 5 g/l peptone, 5 g/l sucrose, 300 mg/l

MgSO4.7H2O, 20 g/l agar) met 100 mg/l spectinomycine en 20 mg/l gentamycine.

PLANTENMATERIAAL EN TRANSFORMATIE

Arabidopsis planten (Arabidopsis thaliana ecotype Colombia) werden getransformeerd met

de constructen voor BiFC voor TPLATE en Mu-like via floral dip (Clough & Bent, 1998). De

resulterende primaire transformanten werden na sterilisatie uitgezaaid op Murashige and

Skoog medium (½ MS medium met 4,308 g Murashige–Skoog(MS) zouten, 0,5 g MES buffer

(2-[N-Morpholino]ethane sulfonic acid), 0,1 g/l Myo-inositol en 10 g/l sucrose, pH 5,7]) met

100 mg/l carbenicillline (voor het afdoden van de resterende agro’s) en 50 mg/l kanamycine

(voor constructen met teGFP) of 100 mg/l carbenicilline en 20 mg/l hygromycine (voor

constructen met heGFP). Na 3 dagen vernalisatie bij 4°C werden de planten gegroeid in lange

dag condities (16 uur licht) en bij 21°C. Voor hygromycine selectie werden de platen na 1 dag

in de groeikamer afgedekt gedurende 1 dag, waardoor elongatie van de hypocotyl van

resistente zaailingen optreedt en deze sneller geïdentificeerd kunnen worden. De planten

werden na selectie overgezet naar de grond en na 4 weken werden 2 of 3 bladeren per plant

geoogst voor RNA extractie (protocol zie addendum) met de ‘RNA extraction kit’ van Qiagen

zoals beschreven in de handleiding. Eén µg RNA werd gebruikt voor cDNA synthese (IScript,

89

BIO RAD). Om de planten met de hoogste expressie van de constructen te selecteren, werd

een PCR uitgevoerd op het cDNA met primers voor amplificatie van heGFP (forward: 5’-

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCA-3’; reverse: 5’-

GGCCATGATATAGACGTTGTGGCTGTTGTA-3’) en teGFP (forward: 5’-

GACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGA-3’; reverse: 5’-

CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTG-3’ ), en eIF-4A1 (forward: 5’-

ACGGAGACATGGACCAGAAC-3’; reverse: 5-GCTGAGTTGGGAGATCGAAG-3’) als

normalisatie primers ter controle van het cDNA.

tabel 4 PCR schema voor qPCR op Arabidopsis planten voor hGFP en tGFP.

PCR schema hGFP en tGFP

1 1x 94°C 2 min.

2 30x

94°C 30 sec.

55°C 30 sec.

72°C 15 sec

3 1x 4°C ∞

Voor elk construct werden de planten met de sterkste expressie geselecteerd op basis van

intensiteit van de bandjes op een 1% agarosegel. De geselecteerde planten werden met elkaar

gekruist, om de constructen voor BiFC te combineren in de nakomelingen. De resulterende

siliques werden geoogst na 2 weken. Na sterilisatie met NaOCl (protocol zie addendum)

werden de zaadjes uitgezaaid op ½ MS en 3 dagen bij 4°C geïncubeerd. Na 3 dagen van

kieming en groei in continu licht bij 21°C, werd via PCR op het cDNA van een pool van 5

zaailingen de expressie van de constructen geverifieërd vooraleer de fluorescentie te

evalueren.

Voor infiltratie van Nicotiana benthamiana bladeren werden de agrobacteria geïnoculeerd in

5ml YEB medium met 100 mg/l spectinomycine en 20 mg/l gentamycine. De agroculturen

werden verdund tot een OD600 van 0.5, en 2 tot 3 uur geïncubeerd in infiltratiebuffer (10 mM

MgCl2, 10 mM MES pH 5.7, 100 µM acetosyringone in dH2O voor 50 ml buffer). Voor

infiltratie werd gebruik gemaakt van het p19 systeem om posttranscriptionele gene silencing

te verhinderen en zo expressie te verhogen (Voinnet et al., 2003). Bij elke infiltratie werd de

corresponderende Agrobacteria gelijke hoeveelheden gemengd in 6-well platen. Eén ml van

90

het mengsel werd opgezogen met een 1 ml spuit zonder naald. De spuit werd aan de

onderkant van een blad van een Nicotiana plant geplaatst. Door een vinger langs de bovenkant

van het blad te leggen werd tegendruk gegeven. Evaluatie van de fluorescentie gebeurde 4

dagen na infiltratie.

INTERACTIE VIA ECTOPISCHE MISLOKALIZATIE IN BY-2

KLONERING

De WT tabak cellijn BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) werd getransformeerd

met een 35S::TPLATE-DboxGFP construct via Agrobacterium transformatie (protocol zie

addendum). Calli werden geselecteerd op kanamycine en geëvalueerd op fluorescentie met de

fluorescentie microscoop. Vervolgens werd van één callus een vloeibare cultuur gestart, en

nogmaals getransformeerd, nu met een CLC1-mCHERRY construct.

PLANTENMATERIAAL

De tabak cellijn BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) werd in cultuur gehouden

in vloeibaar medium met 4.305 g MS zouten, KH2PO4, 30 g sucrose, 0.4 mg

2,4dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 1 mg thiamine, 100 mg myo-inositol, pH 5.8.(Geelen

& Inze, 2001) Elke week werd 2 ml cultuur getransfereerd naar 40 ml vers medium en

geschud bij 25°C. BY-2 cellen werden getransformeerd door cocultivatie met Agrobacterium,

en daarna uitgeplaat op hetzelfde medium waaraan 6.5 g agar voor plantcultuur en 30 mg/l

hygromycine, 500 mg/l carbenicilline en 200 mg/l vancomycine werd toegevoegd. Van de

calli werd elke maand een subcultuur gemaakt en gegroeid in het donker bij 25°C (protocol

zie addendum).

VISUALISATIE

Arabidopsis zaailingen en geinfiltreerde Nicotiana benthamiana bladeren werden

gevisualiseerd tussen slide en coverslip en FM4-64 (2mM stock, 4ul in 1ml MQ dus een 8 µM

oplossing) werd gebruikt om de plasmamembranen van de Arabidopsis wortelcellen te

merken. BY-2 cellen werden geïncubeerd in een chambered coverglass system (Labtek) en

geimobiliseerd in BY-2 medium met vitaminen en 0.8% low melting point agarose

(Invitrogen). Visualisatie gebeurde gebruikmakend van Zeiss 510, Zeiss Exciter, Zeiss 710 en

Olympus FV1000 confocale microscopen met standaard settings voor excitatie en emissie

voor eGFP en FM4-64. Er werd steeds gebruikgemaakt van een 488 Argon laser voor

91

excitatie van eGFP en de emissie werd enerzijds gedetecteerd gebruikmakend van een 500-

530nm bandpass filter (Zeiss 510 en Zeiss Exciter) of via spectrale detectie tussen 500 en

530nm (Zeiss 710 en Olympus FV1000). Beelden werden genomen via een 20x droog of een

63x water gecorrigeerde objectieflens en 1 en 3x digitale zoom werd toegepast. FM4-64 werd

gedetecteerd via excitatie en emissie. Autofluorescentie en mCHERRY expressie werd

gedetecteerd gebruikmakend van settings voor DsRed (514nm excitatie en detectie van

600nm tot 700nm) Bleedthrough van beide signalen werd vermeden door beide kanalen

individueel op te nemen (sequentiele frame scan mode).

92

REFERENTIES

Anderson RGW (1998) The caveolae membrane system. Annual Review of Biochemistry 67:

199-225

Balasubramanian MK, Bi EF, Glotzer M (2004) Comparative analysis of cytokinesis in

buddina yeast, fission yeast and animal cells. Curr Biol 14(18): R806-R818

Blackbourn HD, Jackson AP (1996) Plant clathrin heavy chain: Sequence analysis and

restricted localisation in growing pollen tubes. Journal of Cell Science 109: 777-786

Boruc J, Mylle E, Duda M, De Clercq R, Rombauts S, Geelen D, Hilson P, Inze D, Van

Damme D, Russinova E Systematic Localization of the Arabidopsis Core Cell Cycle Proteins

Reveals Novel Cell Division Complexes. Plant Physiology 152(2): 553-565

Boutte Y, Crosnier MT, Carraro N, Traas J, Satiat-Jeunemaitre B (2006) The plasma

membrane recycling pathway and cell polarity in plants: studies on PIN proteins. Journal of

Cell Science 119(7): 1255-1265

Boutte Y, Frescatada-Rosa M, Men SZ, Chow CM, Ebine K, Gustavsson A, Johansson L,

Ueda T, Moore I, Jurgens G, Grebe M Endocytosis restricts Arabidopsis KNOLLE syntaxin

to the cell division plane during late cytokinesis. Embo Journal 29(3): 546-558

Chen RY, Kim O, Li M, Xiong XS, Guan JL, Kung HJ, Chen HG, Shimizu Y, Qiu Y (2001)

Regulation of the PH-domain-containing tyrosine kinase Etk by focal adhesion kinase through

the FERM domain. Nature Cell Biology 3(5): 439-444

Clough SJ, Bent AF (1998) Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated

transformation of Arabidopsis thaliana. Plant Journal 16(6): 735-743

Couchy I, Bolte S, Crosnier MT, Brown S, Satiat-Jeunemaitre A (2003) Identification and

localization of a beta-COP-like protein involved in the morphodynamics of the plant Golgi

apparatus. Journal of Experimental Botany 54(390): 2053-2063

Cutler SR, Ehrhardt DW (2002) Polarized cytokinesis in vacuolate cells of Arabidopsis. Proc

Natl Acad Sci U S A 99(5): 2812-2817

David C, McPherson PS, Mundigl O, DeCamilli P (1996) A role of amphiphysin in synaptic

vesicle endocytosis suggested by its binding to dynamin in nerve terminals. Proc Natl Acad

Sci U S A 93(1): 331-335

Dettmer J, Hong-Hermesdorf A, Stierhof YD, Schumacher K (2006) Vacuolar H+-ATPase

activity is required for Endocytic and secretory trafficking in Arabidopsis. Plant Cell 18(3):

715-730

Dhonukshe P, Aniento F, Hwang I, Robinson DG, Mravec J, Stierhof YD, Friml J (2007)

Clathrin-mediated constitutive endocytosis of PIN auxin efflux carriers in Arabidopsis. Curr

Biol 17(6): 520-527

93

Dhonukshe P, Baluska F, Schlicht M, Hlavacka A, Samaj J, Friml J, Gadella TWJ (2006)

Endocytosis of cell surface material mediates cell plate formation during plant cytokinesis.

Developmental Cell 10(1): 137-150

Edeling MA, Mishra SK, Keyel PA, Steinhauser AL, Collins BM, Roth R, Heuser JE, Owen

DJ, Traub LM (2006) Molecular switches involving the AP-2 beta 2 appendage regulate

endocytic cargo selection and clathrin coat assembly. Developmental Cell 10(3): 329-342

Favery B, Chelysheva LA, Lebris M, Jammes F, Marmagne A, de Almeida-Engler J, Lecomte

P, Vaury C, Arkowitz RA, Abad P (2004) Arabidopsis formin AtFH6 is a plasma membrane-

associated protein upregulated in giant cells induced by parasitic nematodes. Plant Cell 16(9):

2529-2540

Geelen DNV, Inze DG (2001) A bright future for the bright yellow-2 cell culture. Plant

Physiology 127: 1375-1379

Geldner N, Friml J, Stierhof YD, Jurgens G, Palme K (2001) Auxin transport inhibitors block

PIN1 cycling and vesicle traficking. Nature 413(6854): 425-428

Haucke V, De Camilli P (1999) AP-2 recruitment to synaptotagmin stimulated by tyrosine-

based endocytic motifs. Science 285(5431): 1268-1271

Holstein SEH (2002) Clathrin and plant endocytosis. Traffic 3(9): 614-620

Hong Z, Bednarek SY, Blumwald E, Hwang I, Jurgens G, Menzel D, Osteryoung KW,

Raikhel NV, Shinozaki K, Tsutsumi N, Verma DPS (2003) A unified nomenclature for

Arabidopsis dynamin-related large GTPases based on homology and possible functions. Plant

Molecular Biology 53(3): 261-265

Hoshino H, Yoneda A, Kumagai F, Hasezawa S (2003) Roles of actin-depleted zone and

preprophase band in determining the division site of higher-plant cells, a tobacco BY-2 cell

line expressing GFP-tubulin. Protoplasma 222(3-4): 157-165

Hu CD, Chinenov Y, Kerppola TK (2002) Visualization of interactions among bZip and Rel

family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Molecular

Cell 9(4): 789-798

Hwang I, Robinson DG (2009) Transport vesicle formation in plant cells. Current Opinion in

Plant Biology 12(6): 660-669

Jahn R, Lang T, Sudhof TC (2003) Membrane fusion. Cell 112(4): 519-533

Jiang RF, Greener T, Barouch W, Greene L, Eisenberg E (1997) Interaction of auxilin with

the molecular chaperone, Hsc70. Journal of Biological Chemistry 272(10): 6141-6145

Johnsson N, Varshavsky A (1994) SPLIT UBIQUITIN AS A SENSOR OF PROTEIN

INTERACTIONS IN-VIVO. Proc Natl Acad Sci U S A 91(22): 10340-10344

94

Jurgens G (2005a) Cytokinesis in higher plants. Annu Rev Plant Biol 56: 281-299

Jurgens G (2005b) Plant cytokinesis: fission by fusion. Trends Cell Biol 15(5): 277-283

Kang BH, Rancour DM, Bednarek SY (2003) The dynamin-like protein ADL1C is essential

for plasma membrane maintenance during pollen maturation. Plant Journal 35(1): 1-15

Karahara I, Suda J, Tahara H, Yokota E, Shimmen T, Misaki K, Yonemura S, Staehelin LA,

Mineyuki Y (2009) The preprophase band is a localized center of clathrin-mediated

endocytosis in late prophase cells of the onion cotyledon epidermis. Plant Journal 57(5): 819-

831

Karimi M, Bleys A, Vanderhaeghen R, Hilson P (2007) Building blocks for plant gene

assembly. Plant Physiology 145(4): 1183-1191

Kerppola TK (2008) Biomolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis as a probe

of protein interactions in living cells. Ann Rev Biophys 37: 465-487

Kirchhausen T (2000) Three ways to make a vesicle. Nat Rev Mol Cell Biol 1(3): 187-198

Konopka CA, Backues SK, Bednarek SY (2008) Dynamics of Arabidopsis dynamin-related

protein 1C and a clathrin light chain at the plasma membrane. Plant Cell 20(5): 1363-1380

Krupnova T, Sasabe M, Ghebreghiorghis L, Gruber CW, Hamada T, Dehmel V, Strompen G,

Stierhof YD, Lukowitz W, Kemmerling B, Machida Y, Hashimoto T, Mayer U, Jurgens G

(2009) Microtubule-Associated Kinase-like Protein RUNKEL Needed for Cell Plate

Expansion in Arabidopsis Cytokinesis. Curr Biol 19(6): 518-523

Lam BCH, Sage TL, Bianchi F, Blumwald E (2001) Role of SH3 domain-containing proteins

in clathrin-mediated vesicle trafficking in Arabidopsis. Plant Cell 13(11): 2499-2512

Lauber MH, Waizenegger I, Steinmann T, Schwarz H, Mayer U, Hwang I, Lukowitz W,

Jurgens G (1997) The Arabidopsis KNOLLE protein is a cytokinesis-specific syntaxin. J Cell

Biol 139(6): 1485-1493

Lee YRJ, Giang HM, Liu B (2001) A novel plant kinesin-related protein specifically

associates with the phragmoplast organelles. Plant Cell 13(11): 2427-2439

Liu B, Palevitz BA (1992) ORGANIZATION OF CORTICAL MICROFILAMENTS IN

DIVIDING ROOT-CELLS. Cell Motility and the Cytoskeleton 23(4): 252-264

Lloyd C, Hussey P (2001) Microtubule-associated proteins in plants - Why we need a map.

Nat Rev Mol Cell Biol 2(1): 40-47

McMahon HT, Mills IG (2004) COP and clathrin-coated vesicle budding: different pathways,

common approaches. Current Opinion in Cell Biology 16(4): 379-391

95

Men SZ, Boutte Y, Ikeda Y, Li XG, Palme K, Stierhof YD, Hartmann MA, Moritz T, Grebe

M (2008) Sterol-dependent endocytosis mediates post-cytokinetic acquisition of PIN2 auxin

efflux carrier polarity. Nature Cell Biology 10(2): 237-U124

Mineyuki Y (1999) The preprophase band of microtubules: Its function as a cytokinetic

apparatus in higher plants. International Review of Cytology - a Survey of Cell Biology, Vol

187 187: 1-49

Nishihama R, Soyano T, Ishikawa M, Araki S, Tanaka H, Asada T, Irie K, Ito M, Terada M,

Banno H, Yamazaki Y, Machida Y (2002) Expansion of the cell plate in plant cytokinesis

requires a kinesin-like protein/MAPKKK complex. Cell 109(1): 87-99

Norbury CC (2006) Drinking a lot is good for dendritic cells. Immunology 117(4): 443-451

Oliferenko S, Chew TG, Balasubramanian MK (2009) Positioning cytokinesis. Genes Dev

23(6): 660-674

Otegui MS, Mastronarde DN, Kang BH, Bednarek SY, Staehelin LA (2001) Three-

dimensional analysis of syncytial-type cell plates during endosperm cellularization visualized

by high resolution electron tomography. Plant Cell 13(9): 2033-2051

Owen DJ, Vallis Y, Pearse BMF, McMahon HT, Evans PR (2000) The structure and function

of the beta 2-adaptin appendage domain. Embo Journal 19(16): 4216-4227

Page LJ, Robinson MS (1995) TARGETING SIGNALS AND SUBUNIT INTERACTIONS

IN COATED VESICLE ADAPTER COMPLEXES. J Cell Biol 131(3): 619-630

Praefcke GJK, McMahon HT (2004) The dynamin superfamily: Universal membrane

tubulation and fission molecules? Nat Rev Mol Cell Biol 5(2): 133-147

Preuss ML, Serna J, Falbel TG, Bednarek SY, Nielsen E (2004) The Arabidopsis Rab GTPase

RabA4b localizes to the tips of growing root hair cells. Plant Cell 16(6): 1589-1603

Reichardt L, Stierhof YD, Mayer U, Richter S, Schwarz H, Schumacher K, Jurgens G (2007)

Plant cytokinesis requires de novo secretory trafficking but not endocytosis. Curr Biol 17(23):

2047-2053

Renault L, Christova P, Guibert B, Pasqualato S, Cherfils J (2002) Mechanism of domain

closure of Sec7 domains and role in BFA sensitivity. Biochemistry 41(11): 3605-3612

Robinson DG, Jiang LW, Schumacher K (2008) The endosomal system of plants: Charting

new and familiar territories. Plant Physiology 147(4): 1482-1492

Robinson MS, Bonifacino JS (2001) Adaptor-related proteins. Current Opinion in Cell

Biology 13(4): 444-453

Samuels AL, Giddings TH, Staehelin LA (1995) CYTOKINESIS IN TOBACCO BY-2 AND

ROOT-TIP CELLS - A NEW MODEL OF CELL PLATE FORMATION IN HIGHER-

PLANTS. J Cell Biol 130(6): 1345-1357

96

Sato K, Nakano A (2007) Mechanisms of COPII vesicle formation and protein sorting. Febs

Letters 581(11): 2076-2082

Scheele U, Holstein SEH (2002) Functional evidence for the identification of an Arabidopsis

clathrin light chain polypeptide. Febs Letters 514(2-3): 355-360

Schmid EM, McMahon HT (2007) Integrating molecular and network biology to decode

endocytosis. Nature 448(7156): 883-888

Segui-Simarro JM, Austin JR, White EA, Staehelin LA (2004) Electron tomographic analysis

of somatic cell plate formation in meristematic cells of arabidopsis preserved by high-pressure

freezing. Plant Cell 16(4): 836-856

Shih W, Gallusser A, Kirchhausen T (1995) A clathrin-binding site in the hinge of the beta 2

chain of mammalian AP-2 complexes. Journal of Biological Chemistry 270(52): 31083-

31090

Smith LG, Hake S, Sylvester AW (1996) The tangled-1 mutation alters cell division

orientations throughout maize leaf development without altering leaf shape. Development

122(2): 481-489

Soyano T, Nishihama R, Morikiyo K, Ishikawa M, Machida Y (2003) NQK1/NtMEK1 is a

MAPKK that acts in the NPK1 MAPKKK-mediated MAPK cascade and is required for plant

cytokinesis. Genes Dev 17(8): 1055-1067

Spang A (2008) The life cycle of a transport vesicle. Cellular and Molecular Life Sciences

65(18): 2781-2789

Takatsu H, Futatsumori M, Yoshino K, Yoshida Y, Shin HW, Nakayama K (2001) Similar

subunit interactions contribute to assembly of clathrin adaptor complexes and COPI complex:

Analysis using yeast three-hybrid system. Biochemical and Biophysical Research

Communications 284(4): 1083-1089

Takei K, Haucke V (2001) Clathrin-mediated endocytosis: membrane factors pull the trigger.

Trends Cell Biol 11(9): 385-391

Tebar F, Sorkina T, Sorkin A, Ericsson M, Kirchhausen T (1996) Eps15 is a component of

clathrin-coated pits and vesicles and is located at the rim of coated pits. Journal of Biological

Chemistry 271(46): 28727-28730

Thiele K, Wanner G, Kindzierski V, Jurgens G, Mayer U, Pachl F, Assaad FF (2009) The

timely deposition of callose is essential for cytokinesis in Arabidopsis. Plant Journal 58(1):

13-26

Uemura T, Sato MH, Takeyasu K (2005) The longin domain regulates subcellular targeting of

VAMP7 in Arabidopsis thaliana. Febs Letters 579(13): 2842-2846

97

Valster AH, Pierson ES, Valenta R, Hepler PK, Emons AMC (1997) Probing the plant actin

cytoskeleton during cytokinesis and interphase by profilin microinjection. Plant Cell 9(10):

1815-1824

van Damme D, Coutuer S, De Rycke R, Bouget FY, Inze D, Geelen D (2006) Somatic

cytokinesis and pollen maturation in Arabidopsis depend on TPLATE, which has domains

similar to coat proteins. Plant Cell 18(12): 3502-3518

Van Damme D, Inze D, Russinova E (2008) Vesicle trafficking during somatic cytokinesis.

Plant Physiology 147(4): 1544-1552

Van Damme D, Vanstraelen M, Geelen D (2007) Cortical division zone establishment in plant

cells. Trends in Plant Science 12: 458-464

Walhout AJM, Boulton SJ, Vidal M (2000) Yeast two-hybrid systems and protein interaction

mapping projects for yeast and worm. Yeast 17(2): 88-94

Weingartner M, Criqui MC, Meszaros T, Binarova P, Schmit AC, Helfer A, Derevier A,

Erhardt M, Bogre L, Genschik P (2004) Expression of a nondegradable cyclin B1 affects

plant development and leads to endomitosis by inhibiting the formation of a phragmoplast.

Plant Cell 16(3): 643-657

Wigge P, Kohler K, Vallis Y, Doyle CA, Owen D, Hunt SP, McMahon HT (1997)

Amphiphysin heterodimers: Potential role in clathrin-mediated endocytosis. Molecular

Biology of the Cell 8(10): 2003-2015

98

ADDENDUM: PROTOCOLS

Protocol Gist transformatie (Daniel Van Damme)

Materiaal :

YPDA-medium : 50 g YPDA-medium oplossen in 1l gedestilleerd water en

autoclaveren

gist medium:

o SD -Leu: voor 1L

+ pH aanpassen to 5.9 met 1M KOH

+ 20 g agar (niet toevoegen voor vloeibaar medium)

+ autoclaveren

+ hoge ronde platen 8 cm diameter

o SD -Trp: voor 1L

+ pH aanpassen to 5.9 met 1M KOH

+ 20 g agar (niet toevoegen voor vloeibaar medium)

+ autoclaveren

+ hoge ronde platen 8 cm diameter

PEG 50%:

o X g PEG 3500 oplossen in X ml water

o Opwarmen tot 60°C om PEG op te lossen

o Afkoelen op ijs (moet afgekoeld zijn voor transformatie)

1M LiAc pH 7.5 (pH aanpassen met verdund azijnzuur en autoclaveren)

100% DMSO

10x TE buffer

o 0.1M Tris-HCl

o 10 mM EDTA (stockoplossing 0.5 M50x verdunnen)

o pH 7.5

o autoclaveren

CarrierDNA: (10 mg/ml)

Minimal SD Base 26.7 g

DO Supplement –Leu 0.69g

Gedestilleerd water 1 l

Minimal SD Base 26.7 g

DO Supplement -Trp 0.74g

Gedestilleerd water 1 l

99

o Net voor gebruik het DNA denatureren door het 10 min. bij 95°C te zetten en

erna onmiddellijk af te koelen op ijs

Steriel gedestilleerd water

Spectrofotometer, centrifuge

Methode:

DAG 1:

o Oplossingen voor transformatiemix afkoelen

o 50 ml 2x YPDA-medium overnacht opwarmen bij 30°C

o Platen gieten

o Gisten voor transformatie opgroeien van op plaat in YPDA-medium, bij 30°C

en 200rpm overnacht tot OD660>2.5

DAG2:

o Plasmiden voor transformatie verdunnen tot 30 ng/µl voor single

transformaties, 60 ng/µl voor dubbel transformaties (34µl plasmiden van

30ng/µl of 17µl van 60ng/µl nodig)

o Competente gistcellen maken:

OD660 van de gegroeide cultuur meten: hiervoor cultuur 10x

verdunnen in YPDA medium (100 µl gistcultuur en 900 µl YPDA-

medium)

Gistcultuur verdunnen in 50 ml opgewarmde YPDA-medium tot

OD660 van 0.25

Cellen incuberen voor 2 delingen, dus ongeveer 4 uur tot OD660=1

OD660 meten

Gisten centrifugeren gedurende 5 min. bij 2000 rpm in falcons

Carrier DNA 10 min. opwarmen bij 95°C en dan onmiddellijk afkoelen

op ijs

Cellen wassen met 25 ml steriel water (cellen terug oplossen in water

en afdraaien, supernatans verwijderen)

Gistcellen terug oplossen in 1ml steriel water, overbrengen naar epjes

en afdraaien, supernatans verwijderen

Gistcellen weer oplossen in steriel water, volume= 1ml x gemeten

OD660, goed vortexen en uitverdelen per 100µl in nieuwe epjes, op ijs

zetten

o 34 µl van elke plasmide overbrengen naar epje

o Transformatiemix samenstellen:

1 reactie (µl) 20 reacties (µl)

PEG3500 50% 240 4800

LiAc 1M 36 720

CarrierDNA 10 200

H2O 35 700

TE 10x 5 700100

100

326 6520

+ aan elk epje met plasmide 326 µl transformatiemix toevoegen en op ijs

koelen

o Gistcellen centrifugeren gedurende 30 sec bij 14000rpm en supernatans

verwijderen

o Transformatiemix met plasmiden toevoegen aan de cellen en resuspenderen

o Kort vortexen

o 40 min. in waterbad van 42°C zetten

o 30 sec. centrifugeren en supernatans verwijderen

o Gistcellen terug oplossen in 200 µl steriel water

o Uitplaten op selectief SD medium en incuberen bij 30°C

o Kolonies zichtbaar na 2-4 dagen

101

Protocol gist mating

Materiaal :

2x YPDA-medium

Vloeibaar SD-Leu en SD-Trp medium

MTP met vlakke en ronde bodem, en NUNC platen 0.5 ml

Methode:

DAG 1:

o 200µl vloeibaar SD-Leu (pDEST32) of SD-Trp (pDEST22) per well

toevoegen in MTP met vlakke bodem (met multichannel pipet met steriele

tips!)

o Gisten voor mating inoculeren vanop plaat: met steriele tip gist nemen en

resuspenderen in het vloeibare medium (aantal keer op en neer pipetteren)

o Plaat afsluiten met papieren tape

o Overnacht schudden bij 30° C (of 28°C)

DAG 2:

o 125µl 2x YPDA-medium in elke well van MTP met ronde bodem

o 20µl van gisten met pDEST22 en 20µl van gisten met pDEST32 toevoegen

aan elke well

o Plaat afsluiten met papieren (ademend) tape

o Overnacht schudden bij 28°C

DAG3:

o MTP afdraaien voor 5 min. bij 1700 rpm

o Supernatans verwijderen

o Aan elke well 100 µl SD-Leu-Trp toevoegen en cellen terug oplossen

o Afdraaien voor 5 min. bij 1700rpm

o Supernatans verwijderen

o Gistcellen terug oplossen in 100 µl SD-Leu-Trp

o In NUNC plaat (0.5 ml) in elke well 285µl SD-Leu-Trp toevoegen

o 15µl van elke gistcultuur overbrengen naar NUNC plaat

o Ook 15µl van elke controle cultuur in 285µl SD-Leu-Trp verdunnen

o Plaat afsluiten met papieren tape

o 2 dagen schudden bij 30°C

o SD-Leu-Trp en SD-Leu-Trp-His + 3AT (0, 10,20, 30, 50 mM) gieten

102

DAG 5:

o Gistculturen 10 x verdunnen in MTP met vlakke bodem in 100 µl (10 µl

gistcultuur en 90µl SD-Leu-Trp)

o OD600 meten

o Culturen verdunnen naar OD600 0.2 in 200 µl

o 5 µl van elke cultuur spotten op SD-Leu-Trp en SD-Leu-Trp-His met elke

concentratie van 3AT (dus 6 platen in het totaal per MTP met gistculturen) met

multichannel met steriele tips

o 3 dagen incuberen bij 30°C

o LacZ test:

Rest van de verdunde gistcultuur (in 200 µl) gebruiken voor LacZ test

MTP afdraaien 4000rpm 5 min.

Supernatans afnemen door plaat om te keren op papier

Plaat bevriezen in vloeibare stikstof om cellenopen te breken

lacZ buffer (60 mM Na2HPO4, 40 mM NaH2PO4.H2O, 10 mM KCl, 1

mM MgSO4.7H2O, pH 7) bereiden:

100 ml buffer

0.27 ml β-mercaptoethanol

1.67 ml Xgal oplossing (4%: 40mg Xgal oplossen in 1ml

DMSO)

100 µl buffer toevoegen aan elke well

Plaat bevriezen in vloeibare N2

Incuberen bij 37°C

Zymolyase protocol

0.1 M sodium phasphate buffer : -3.1 g/l NaH2PO4.H2O (138g/mol)

- 10.9 g/l Na2HPO4

pH 7.4

-Per reactie: -14 µl buffer

- 4 µl zymolyase toevoegen

-gistcellen oplossen in buffer met zymolyase

- 30 min bij 37 °C en 10 min bij 95°C incuberen (beiden in PCR toestel)

- op ijs zetten, verdunnen in 60-80µl water

-5 µl hiervan als template gebruiken in een 50 µl PCR reactie

Protocol Agrobacterium transformatie

-Voeg 2 µ plasmid DNA bij 40 ml bacteria, zet 1min op ijs

- breng het mengsel over in een gekoelde electroporatie cuvet (er mogen geen bubbels

aanwezig zijn)

- voeg na electroporation (bij 400 ohm en 2.5 V) zo snel mogelijk 900 µl SOC

medium toe en transfereer naar falcon

- laat 2 uur schudden bij 28°C

103

-Plaat uit op YEB + Spec (100 mg/l) +Gm (20 mg/l)

Na 2 dagen zijn kolonies te zien

Protocol zaadsterilisatie

- 70% Ethanol 2 min laten inwerken op de zaadjes

- 3.5 ml NaOCl met 2 druppeltjes Tween 20 in 10 ml H2O 15 min laten inwerken

- supernatans afnemen

- 3 x wassen met (1ml)steriel H2O

Protocol RNA isolatie

1. plantje in 2 ml epje brengen en bolletje van 4 mm toevoegen

2. bevriezen in vloeibare stikstof

3. centrifuge koelen:laten draaien met fast cool op 4°C

4. grinden in RETSCH 30 sec bij frequentie 30 en terug in vloeibare stikstof (blokjes

liggen onderaan in diepvries ertegenover + controleren of er geen gaatjes in de epjes

zitten)

5. epjes uit vloeibare stikstof halen, tegen tikken en opendoen: één voor één

6. 1ml Trizol toevoegen voor plantenweefsel ontdooid is en schudden (kijken of er

gaatjes in epjes zijn en aantal keer omdraaien, in de TREKKAST)

7. 5 min laten staan op KT

8. 200 µl chloroform (trekkast) toevoegen en 15 sec vortexen ( controleren of er gaatjes

in epjes zitten en dichthouden met vinger)

9. 15 min centrifugeren bij 4°C en 12000xg

10. Centrifuge aantal min. gewoon laten draaien om op te warmen

11. Bovenste fase afnemen en overbrengen naar nieuw epje (niet alles moet mee, ¾ is

meer dan genoeg)

12. 500 µl isopropanol (trekkast) toevoegen en schudden

13. 10 min. laten staan op KT

14. Overbrengen naar RNeasy kolom (in 2 keer als nodig, kit Qiagen rode doos)

15. 15 sec centrifugeren op KT bij 8000xg

16. 700 µl RWI buffer toevoegen

17. 15 sec centrifugeren bij 8000xg op KT

18. 500 µl RPE buffer toevoegen

19. 15 sec afdraaien bij 8000xg op KT

20. Doorloop verwijderen en 1 min. centrifugeren op max. snelheid

21. Elueren met 50 µl DEPC(= RNase vrij H2O) in epjes van kit

22. 15 sec. centrifugeren bij 8000xg + OP IJS HOUDEN!!! (RNA kan aantal uur op ijs

staan maar niet overnacht!)

23. RNA concentratie meten met filtertips (als blanco RNase vrij H2O gebruiken)

24. Volume voor 1 µg RNA bereken

104

25. cDNA synthese: iScript Invitrogen (1e diepvries, kartonnen doosje bovenste schap,

groen en geel)

reactie: - 4 µl mix

-1 µl transcriptase

-1µg RNA

- aanvullen tot 20 µl met RNase vrij H2O

in PCR machine: (programma zit er al in onder stnes)

5 min. 25°C

30 min. 42°C

5 min. 85°C (+ 4°C aanhouden)

180 µl MQ toevoegen en hiervan 5 µl gebruiken voor volgende PCR

26. PCR voor kwantificatie:

Reactie:

5 µl cDNA

5µl buffer

0.5 µl Taq

2.5 µl MgCl2

1 µl van BEIDE primers

1 µl dNTP’s

34 µl H2O

50 µl

PCR schema:

94°C 2 min.

94°C 30 sec.

65°C 30 sec.

72°C 10 sec.

4°C aanhouden

30x

105

Infiltratie van Nicotiana benthamiana met Agrobacteria

DAG 1 :

Agrocultuur opgroeien

- Vanop plaat : met tip agro’s nemen en in 5ml vloeibaar YEB medium met gepaste

antibiotica oplossen in 50 ml falcon, dop losdraaien en met witte tape afsluiten,

schudden bij 28°C

- Van glycerolstock: 100µl glycerolstock in 5 ml vloeibaar YEB medium met gepaste

antibiotica op en neer pipetteren, dop losdraaien en afsluiten met witte tape, schudden

bij 28°C

DAG 2 :

Agrocultuur verdunnen :

- …. µl cultuur overbrengen naar 5ml nieuw medium, weer dop losdraaien en afsluiten

met witte tape

DAG 3:

Infiltratie :

- OD600 van de cultuur meten :

o 250µl cultuur in 750µl vloeibaar YEB medium (met gepaste antibiotica)

verdunnen en OD600 van verdunning meten (blanco is 1 ml vloeibaar

medium)

o Gemeten waarden *4

o Volume cultuur x berekenen nodig OD van 0.5 in volume van 10ml

0.5 * 10/OD600=x

o Dit volume overbrengen naar epje van 2 ml

o 20 min afdraaien bij 4000xg

o Supernatans afdraaien en cellen terug oplossen in 10 ml buffer in 12 ml falcon

50ml buffer: -500µl MgCl2 (1M)

- 1ml MES (0.5 M)

106

Voor 1L

50 mM MES 10,66g

2 mM Na2HPO4 0,28g

0.5 % glucose 5,0g

Adjust to pH 5.6

- 50µl acetosyringone (0.1 M)

- 48,45 ml dH2O

o Agro’s 2-3 uur laten schudden

o Agro’s in gelijke verhouding mengen in 12-well platen en met 1ml spuitje

infiltreren op onderkant van het blad (met vinger tegendruk geven op de

bovenkant van het blad en zachtjes spuitje leegduwen)

o Met markeerstiftje omtrek van de spot aanduiden op de bovenkant van het blad

o Planten veel water geven na infiltratie

107

BY-2 TRANSFORMATION (DANNY GEELEN 23-2-2000)

Plant medium:

for BY-2 liquid cultures 1L

MS salts (no additives Duchefa) 4.302 g

KH2PO4 0.2 g

Sucrose 30 g

pH with 1 M KOH 5.8

prepare 25 erlenmeyers 250 mL containing 40 mL medium and autoclave.

for solid medium 1L

add plant tissue culture agar 6.5 g

autoclave

prior to use, add BY-2 vitamines (1 mL/1L, or 40 uL in each erlenmeyer)

BY-2 VITAMINES 50 ML (H20)

108

2,4D (auxin, dissolve in 1mL ethanol) 0.02 g

thiamine 0.05 g

myo-inositol 5 g

filter sterilize, aliquot 10 mL in 10 mL falcon tubes, store at –20 C

Prior to use, melt and dissolve

GROWING THE CULTURES

Use 250 mL erlenmeyers, red screw cap, 40 mL of medium.

Add vitamines prior to use.

Inoculate (the volume depends a bit on the history of the cells, after a while they grow faster)

of cells using a 5 mL sterile plastic pipet. Release the cells directly into the medium

Untighten the screw cap one full turn, and seal with surgical tape (permits airflow)

Incubate on in a shaker, 28 C, 150 rpm.

Refresh each week, same time, same procedure, normally 1/40 dilution of a 7-day old culture.

Cells can be kept viable at least a week when stored at 4 C

To maintain a backup culture, grow the cells on a solid plate. As such it can be grown at 25C

up to one month. Refresh when browning of the callus starts to appear.

Transformation:

DAY 1 (we standardly do this Friday afternoon, during the weekend, the shaker

remains rather closed, as only few people work then and cells do not stop shaking, which

improves the quality)

1. dilute BY-2 culture 2, 3 and 4 mL in 40mL, erlenmeyer 250 mL at 28 C

The density of the BY-2 is by far the most important. If the density of the BY-2 is OK, the

transformation will work with any volume of agrobacterium. To be sure about the density, we

use the above 3 dilutions and at least one of these will give transformants with a certainty of

over 90%.

2. grow Agrobacterium (LBA4404) in 5-10 mL YEB with antibiotics (NO RIFAMPYCIN !)

C58 Strain does not work as well as LBA4404 in our hands.

109

3. Dilute the growing agrobacterium culture 1/5 the afternoon before day 3 (Sunday in our

protocol)

DAY3 (MONDAY)

Take 4 mL BY-2 culture and decant in a petridish plate (round and deep ones, NOT the ones

used for bacteria but the same diameter). Mix gently with various concentrations (we

normally only use 300ul) of bacteria (10 uL to 500 uL, ON culture). Incubate at max 25 C to

28C without shaking or moving.

DAY5 (WEDNESDAY)

Plate all cells on selective medium (BY2 medium containing 500 mg/L Carbenicilline and

200 mg/L Vancomycin. Kan = 100mg/L and Hygro = 30 mg/L).

If you put the plate upright, the cells should only slightly slide down or not at all, that is the

optimal density to plate them out. If they are too few or too thick, the efficiency will drop.

When plating, try to cover the entire plate by swirling the mix around after closing the plate.

After 14 days, calli should become visible. Cut them or pick with tooth pick and transfer to

new selective medium (including the Vanc and Carb). Check about 100 calli for expression.

Start a transformed BY-2 liquid culture by transferring a 1 cm callus in 20 mL medium in a

250 mL erlenmeyer.

To set up a liquid culture, we add Vanc and Carb for some weeks and later on, we only use

the Kan or Hygro selection and eventually we drop that too. Supertransformation of a line

works best if the line has grown for some weeks without any selection.

Supertransformation often leads to selective silencing of one of the markers, so if it is

possible, use different promoters or screen a lot of transformants!

De binaire interactiestudie van het TPLATE complex

Documents

Transcript of De binaire interactiestudie van het TPLATE complex