CONTINUE DESINFECTIE VAN VIRAAL GECONTAMINEERD … · ontdekte als één van de eerste dat...

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

Vakgroep Biochemische en Microbiële Technologie

Laboratorium voor Microbiële Ecologie en Technologie

Academiejaar 2009-2010

CONTINUE DESINFECTIE VAN VIRAAL GECONTAMINEERD

WATER MET BIOGEEN ZILVER

Eline CHRISTIAENS

Eerste Master in de Farmaceutische zorg

Promotor

Prof. dr. ir. N. Boon

Commissarissen

Prof. dr. Apr. H. Nelis

Prof. dr. T. Coenye

AUTEURSRECHT

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie

beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik

valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de

verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze

masterproef.”

4 mei 2010

Promotor Auteur

Prof. dr. ir. N. Boon Eline Christiaens

DANKWOORD

Het maken van een thesis kan niet zonder de hulp van enkele mensen, die ik hier graag even

wil bedanken. In eerste instantie wil ik mijn promotor Prof. dr. ir. Nico Boon en ook Prof. dr.

ir. Willy Verstraete bedanken voor het leeswerk en alle waardevolle tips. Ook bedankt aan

Elke De Clerck van Janssen Pharmaceutica voor het voorzien van biogeen zilver en dr. Kim

Verbeken en Peter Mast voor de SEM analyses. Hierbij bedank ik ook ir. Simon de Corte voor

de hulp bij het maken van de dwarsdoorsneden van de membranen. Verder wil ik Christine

Graveel en Regine Haspeslagh bedanken voor het voorzien van de nodige flessen Spa. Ook

wil ik Ria Van Hulle bedanken voor de ICP-OES analyses. Ik wil hierbij ook mijn ouders en

broer bedanken voor de deugddoende steun en Ruth Bral en Barbara Calle omwille van hun

immer aanwezige bereidheid om te helpen. In het bijzonder wil ik mijn begeleider Bart De

Gusseme bedanken voor het lees- en verbeterwerk, de hulp bij de experimenten en de

ondersteuning en raad bij het maken van deze thesis. Veel leesplezier.

INHOUDSOPGAVE

1. INLEIDING ............................................................................................................................. 1

1.1. DE ANTIMICROBIËLE WERKING VAN ZILVER ........................................................................... 1

1.1.1. Antibacteriële werking van zilver ............................................................................ 1

1.1.2. Antivirale werking van zilver ................................................................................... 3

1.1.3. Antifungale werking van zilver ................................................................................ 3

1.2. TOEPASSING VAN ZILVER IN FARMACEUTISCHE PREPARATEN. .............................................. 4

1.2.1. Geschiedenis .......................................................................................................... 4

1.2.2. Zilvernitraat ........................................................................................................... 4

1.2.3. Zilversulfadiazine ................................................................................................... 5

1.2.4. Zilververbanden ..................................................................................................... 6

1.3. GEVAAR VAN VIRAAL GECONTAMINEERD WATER – BEHANDELING VAN AFVALWATER ....... 7

1.3.1. Virale gastro-enteritis ............................................................................................. 7

1.3.2. Gevaar van diarree ................................................................................................. 8

1.3.3. Virusuitbraken ....................................................................................................... 8

1.3.4. Behandeling van afvalwater ................................................................................... 9

1.3.5. Behandeling van drinkwater ................................................................................... 9

1.3.6. Normen voor virale contaminanten ...................................................................... 11

1.3.7. Nood aan ‘nieuwe’ desinfectiemethoden: biogeen zilver ....................................... 11

1.4. VEILIG GEBRUIK VAN ZILVER VOOR DE GEZONDHEID VAN MENS EN MILIEU ...................... 12

1.4.1. Invloed van zilver op de gezondheid ..................................................................... 12

1.4.2. Invloed van zilver op het milieu ............................................................................ 14

1.4.3. Normen voor zilverconcentratie in water .............................................................. 14

1.4.4. Normen voor nanopartikels .................................................................................. 14

1.4.5. Inkapselen van biogene zilvernanopartikels .......................................................... 15

2. OBJECTIEVEN ...................................................................................................................... 17

3. MATERIALEN EN METHODEN ............................................................................................... 18

3.1. PRODUCTIE VAN BIOGEEN ZILVER ........................................................................................ 18

3.2. CONCENTRATIEBEPALING ZILVERIONEN ............................................................................... 18

3.3. ENTEROBACTER AEROGENES ................................................................................................ 18

3.4. GROEI EN DETECTIE VAN BACTERIOFAAG UZ1 ..................................................................... 19

3.5. AANMAAK STOCK BACTERIOFAAG UZ1 ................................................................................. 19

3.6. NEUTRALIZER ......................................................................................................................... 20

3.7. VASTLEGGEN BIOGEEN ZILVER OP NANOCERAM FILTER ...................................................... 20

3.7.1. NanoCeram filter .................................................................................................. 20

3.7.2. Filtersysteem ....................................................................................................... 21

3.8. INKAPSELEN BIOGEEN ZILVER IN MEMBRANEN.................................................................... 22

3.8.1. Membraanproductie ............................................................................................ 22

3.8.2. Karakterisering membraan ................................................................................... 22

3.8.3. Batchtest ............................................................................................................. 23

3.8.4. Single membrane unit for reusable filtrate ............................................................ 23

3.8.4.1. Opstelling SMURF .................................................................................................. 23

3.8.4.2. Staalname SMURF ................................................................................................. 24

3.9. BATCHTEST AG+ .................................................................................................................... 25

3.10. VASTZETTEN BIOGEEN ZILVER OP ZEOLIET ........................................................................... 25

3.10.1. Batchtest ............................................................................................................. 25

3.10.2. Opstroom vast bed filter ....................................................................................... 26

3.11. VERWERKING VAN DE DATA ................................................................................................. 27

4. RESULTATEN ....................................................................................................................... 28

4.1. NEUTRALIZER ......................................................................................................................... 28


4.2.1. Doelstelling .......................................................................................................... 28

4.2.2. Virusverwijdering ................................................................................................. 28

4.2.3. Zilverconcentratie ................................................................................................ 29


4.3.1. Doelstelling .......................................................................................................... 29

4.3.2. Karakterisering membraan ................................................................................... 29

4.3.3. Batchtest ............................................................................................................. 32

4.3.3.1. Virusverwijdering................................................................................................... 32

4.3.3.2. Zilverconcentratie .................................................................................................. 33

4.3.4. Single membrane unit for reusable filtrate ............................................................ 34



4.4. BATCHTEST AG+ ..................................................................................................................... 36


4.5.1. Doelstelling .......................................................................................................... 37

4.5.2. Batchtest ............................................................................................................. 37

4.5.3. Opstroom vast bed filter ....................................................................................... 37



5. DISCUSSIE ........................................................................................................................... 40



5.2.1. Virusinactivatie door membranen in batchtest ...................................................... 42

5.2.2. Virusinactivatie door continue desinfectie met de SMURF ..................................... 42

5.2.3. Ag+-vrijstelling uit het PVDF membraan met bio-Ag0 .............................................. 43


6. CONCLUSIE ......................................................................................................................... 47

7. LITERATUURLIJST ................................................................................................................ 49

LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN

ATP: Adenosinetrifosfaat

DMF: Dimethylformamide

DNA: Deoxyribonucleic acid of deoxyribonucleïnezuur

EDX: Energy dispersive X-ray of energie dispersieve X-stralen

HIV-1: Human immunodeficiency virus 1

HRT: Hydraulische retentietijd

ICP-OES: Inductive coupled plasma - optical emission spectrometry of inductief gekoppeld

plasma optische emissie spectrometrie.

LB: Lubia Bertuni

LOD: Limit of detection of detectielimiet

MNV-1: Murine norovirus 1

pfu: Plaque forming units

PVDF: Polyvinylideen fluoride

RNA: Ribonucleic acid of ribonucleïnezuur

RWZI: Rioolwaterzuiveringsinstallatie

RZR: Reactieve zuurstofradicalen

SEM: Scanning elektronen microscoop

SMURF: Single membrane unit for reusable filtrate

spp: species

TEM: Transmissie elektronen microscoop

USEPA: United States Environmental Protection Agency

Vact: actief volume

WHO: World Health Organization

wt%: gewichtsprocent

Hoofdstuk 1: Inleiding

1

1. INLEIDING

1.1. DE ANTIMICROBIËLE WERKING VAN ZILVER

Zilver was al reeds in de oudheid bekend als een desinfectiemiddel, zelf Alexander de

Grote gebruikte zilveren vaten om water in te bewaren (Sintubin et al., 2009). Wanneer

zilver in contact komt met bloed of een ander lichaamsvocht ioniseert het metallisch zilver

tot Ag+, Ag2+ of Ag3+. Ag2+ en Ag3+ hebben een minder groot antimicrobieel vermogen dan

Ag+. Dit wil zeggen dat de antimicrobiële werking van zilver afhankelijk is van de hoeveelheid

Ag+ die gevormd wordt (Edwards-Jones, 2009), hoewel metallisch zilver ook werkzaam is (De

Gusseme et al., 2010). De antimicrobiële eigenschappen zijn zowel beschreven tegen

bacteriën als tegen fungi en virussen.

1.1.1. Antibacteriële werking van zilver

Bacteriën worden op verschillende mogelijke manieren beïnvloed door Ag+ . Wanneer Ag+

in een bacterie penetreert, zal het DNA overgaan van een gerelaxeerde toestand naar een

gecondenseerde toestand (Feng et al., 2000). In gecondenseerde toestand is het DNA niet

meer in staat tot replicatie. Uiteindelijk leidt dit tot celdood. Door binding van zilverionen op

het DNA wordt de bacteriële groei eveneens geïnhibeerd (Modak & Fox, 1973).

Daarnaast kunnen zilverionen (Ag+), net als andere zware metalen, interageren met

thiolgroepen van eiwitten, waardoor de eiwitten hun functie verliezen (Liau et al., 1997).

Een rechtstreeks gevolg hiervan is het inactiveren van enzymen. Door binding met

thiolgroepen van enzymen die deel uitmaken van het respiratieproces in het celmembraan,

wordt respiratie onmogelijk en sterft de bacterie. De respiratieketen kan eveneens worden

losgekoppeld van de oxidatieve fosforylatie door directe inwerking van Ag+ op het

celmembraan van de bacterie (Edwards-Jones, 2009).

Een ander belangrijk aspect in de antibacteriële werking van Ag+ is de vorming van

reactieve zuurstofradicalen (RZR) (Matsumura et al., 2003; Park et al., 2009). De

zuurstofradicalen worden voornamelijk gevormd bij de thiol-interactie tussen het zilver en

de enzymen van de respiratieketen. Superoxide (O2-) en waterstofperoxide (H2O2) kunnen

door middel van hun oxiderende eigenschappen de celwand beschadigen en zo de bacterie

lyseren (Chang et al., 2008).


2

Tevens heeft Ag+ een rechtstreekse invloed op de permeabiliteit van het membraan. Zo

wordt de opname van fosfaat in Escherichia coli geïnhibeerd (Schreurs & Rosenberg, 1982)

en is er verlies van protonen bij Vibrio cholerae (Dibrov et al., 2002). De protonengradiënt

over het cytoplasmatische membraan van bacteriën is cruciaal voor de synthese van ATP,

opname van nutriënten en de voortbeweging van de bacterie door middel van een flagel.

Afname van die gradiënt kan daardoor leiden tot het afsterven van de bacterie (Dibrov et al.,

2002).

Zilvernanopartikels (nAg0) breken de lipopolysacchariden van de bacterie af en door

vorming van holtes in het membraan, zoals te zien is in Figuur 1.1, verhogen ze de

membraanpermeabiliteit (Sondi & Salopek-Sondi, 2004), wat uiteindelijk kan leiden tot

cellyse (Figuur 1.2). Het werkingsmechanisme van nAg0 is nog niet volledig opgehelderd,

maar volgens Morones et al. (2005) penetreren de nAg0 in de cel en veroorzaken ze schade

aan het DNA. Bovendien kunnen ze Ag+ vrijstellen in oplossing (Morones et al., 2005).

Volgens Chang et al. (2008) worden RZR gevormd die de celwand aantasten.

FIGUUR 1.1.: SEM-AFBEELDING VAN E. COLI: a) ZONDER TOEVOEGING VAN

ZILVERNANOPARTIKELS, b) NA INWERKING VAN 50 µg/cm³ ZILVERNANOPARTIKELS

GEDURENDE 4 UUR, RESULTEREND IN HOLTEVORMING (Sondi & Salopek-Sondi, 2004).

FIGUUR 1.2.: TEM-AFBEELDING VAN P. AERUGINOSA: a) ZONDER TOEVOEGING VAN

ZILVERNANOPARTIKELS, b) MET TOEVOEGING VAN ZILVERNANOPARTIKELS, RESULTEREND

IN EEN DUIDELIJKE BESCHADIGING VAN HET CELMEMBRAAN (Morones et al., 2005).


3

1.1.2. Antivirale werking van zilver

Zilverionen (Ag+) worden vaak gebruikt in combinatie met koperionen (Cu2+). De

koperionen binden met het negatief geladen oppervlak van de virussen en penetreren in de

envelop van het virus. Zo creëren ze een toegang voor de zilverionen die op verschillende

manieren (zie eerder) kunnen interageren met onderdelen van het virus, met als doel de

inactivatie. (http://www.lenntech.com/processes/disinfection/chemical/disinfectants-copper-silver-ionization.htm)

Zilvernanopartikels met een afmeting van 1 tot 10 nm binden op gp120 glycoproteïnen

die zich bevinden op het oppervlak van het HIV-1 virus (Elechiguerra et al., 2005). Figuur 1.3

toont het oppervlak van het HIV-1 virus, waarop de zilvernanopartikels gebonden zitten. Zo

verhinderen ze de adhesie van het virus op een gastheercel. Uit onderzoek bleek eveneens

dat zilvernanopartikels van 10 nm groot, een toxisch effect hebben op het apenpokkenvirus

(Rogers et al., 2008). Volgens De Gusseme et al. (2010) resulteert het contact tussen de

zilvernanopartikels en het MNV-1 virus in een aantasting van het virale capside.

FIGUUR 1.3.: OP HET OPPERVLAK VAN HET HIV-1 VIRUS ZITTEN ZILVERNANOPARTIKELS

GEBONDEN (Elechiguerra et al., 2005). ENKELE ZILVERNANOPARTIKELS ZIJN AANGEDUID.

1.1.3. Antifungale werking van zilver

Zilvernanopartikels hebben een antifungale werking en doden Candida spp. bij een

concentratie van 1 mg/L (Panacek et al., 2009). De celwand van fungi bestaat uit glucanen,

chitine en mannoproteïnen (Cao et al., 1999). Ag+ inhibeert het fosfomannose isomerase,

een enzym dat nodig is bij de biosynthese van de mannoproteïnen (Mastrolorenzo et al.,

2000; Smith & Payton, 1994).

http://www.lenntech.com/processes/disinfection/chemical/disinfectants-copper-silver-ionization.htm


4

1.2. TOEPASSING VAN ZILVER IN FARMACEUTISCHE PREPARATEN.

1.2.1. Geschiedenis

De eerste publicatie over het gebruik van zilver dateert van 1617, waarbij zilvernitraat

onder vaste vorm werd gebruikt. Het kreeg de naam lapis infernalis, verwijzend naar de pijn

bij het gebruik van de steen (Klasen, 2000a). Tijdens de 18e eeuw gebruikte men het bij de

behandeling van chronische wonden en ulcera, door met de steen in de wonde te wrijven en

zo wild vlees te verwijderen. Dit kwam herstel van de wonde ten goede, omdat op die

manier de epidermis terug kon dichtgroeien. Johan Nepomuk Rust (Oostenrijk, 1775-1840)

ontdekte als één van de eerste dat zilvernitraat ook heilzaam was voor brandwonden. Hij

gebruikte hiertoe zilvernitraatoplossing in een concentratie van 0,2 % (Klasen, 2000a).

Verder werd zilver veel toegepast bij de behandeling van tetanus en reuma (Atiyeh et al.,

2007). Aan het einde van de 19e eeuw werd een zilvernitraatoplossing (2 %) door Carl Credé

(Duitsland, 1818-1892) gebruikt om Ophtalmia neonatorum te behandelen (Klasen, 2000a).

Tijdens de 20e eeuw gebruikte men zilverpapier en zilvernitraatoplossing om wonden en

brandwonden te behandelen en werd zilver tevens gebruikt ter behandeling van gonorroe

en verkoudheden (Atiyeh et al., 2007; Klasen, 2000a). Tijdens de tweede oorlog moest zilver

inboeten aan populariteit door de opkomst van penicilline en sulfonamiden, maar door

resistentie-ontwikkeling tegen antibiotica en de publicatie van Moyer in 1965 over gebruik

van zilvernitraat bij brandwonden is zilver nooit volledig van het toneel verdwenen (Klasen,

2000a, 2000b).

1.2.2. Zilvernitraat

Tijdens de jaren ’60 werden de zilverproteïnen, die slechts een geringe antibacteriële

werking hadden, vervangen door zilverzouten (Atiyeh et al., 2007). Het zilverzout dat

gebruikt werd bij de behandeling van brandwonden was zilvernitraat (AgNO3). De

behandeling van brandwonden kende een grote doorbraak door de publicatie van

“Treatment of large human burns with 0,5 % silver nitrate solution” door Moyer in 1965. Hij

constateerde dat zilvernitraat actief is tegen Staphylococcus aureus, Pseudomonas

aeruginosa, Escherichia coli en hemolytische streptococcen (Moyer et al., 1965). Gebruik van

zilvernitraat ter behandeling van brandwonden verkortte het verblijf in het ziekenhuis en

zorgde er tevens voor dat er minder huidtransplantaties nodig waren. Ziffren (1968) kwam


5

tot dit besluit door een groep patiënten, behandeld met zilvernitraat, te vergelijken met

brandwondpatiënten die een andere behandeling kregen gedurende de periode 1930 -

1960. Bovendien waren er minder complicaties zoals sepsis en waren er minder dodelijke

slachtoffers (Ziffren, 1968).

Het gebruik van zilvernitraat bracht enkele complicaties met zich mee. Na het bereiken

van de bloedbaan kan het zilverion binden op Cl-, HCO3- , CO3

- of de anionvorm van eiwitten,

waardoor het gehalte van chloor en natrium in het bloed daalt (Klasen, 2000b). Als Ag+ in de

wonde complexeert met Cl- wordt AgCl gevormd en vormt dit een zwarte neerslag (Edwards-

Jones, 2009). Praktisch gezien was er ook een belangrijk nadeel verbonden aan het gebruik

van zilvernitraat. Alles wat in contact is geweest met zilvernitraat en blootgesteld werd aan

licht, werd zwart (Atiyeh et al., 2007). Bovendien kunnen bepaalde Gram-negatieve

bacteriën nitraat reduceren tot nitriet, wat leidt tot oxidatieve celschade en

methemoglobinemie (Atiyeh et al., 2007; Fuller, 2009).

1.2.3. Zilversulfadiazine

Zilversulfadiazine is vandaag ongetwijfeld het meest bekende preparaat met zilver en is in

België bekend onder de merknaam Flammazine® (Figuur 1.4). Het wordt geformuleerd als

een hydrofiele crème met 1 wt% zilversulfadiazine (Christiaens et al., 2010a). Dit preparaat is

een waardevol alternatief voor de 0,5 % zilvernitraatoplossing, aangezien bij gebruik minder

elektrolietstoornissen optreden, geen vorming van nitriet mogelijk is en tevens geen

zwartverkleuring optreedt onder invloed van licht (Fuller, 2009).

FIGUUR 1.4.: FLAMMAZINE® 1 % CRÈME (SOLVAY PHARMA).

(http://www.newpharma.be/upload/img/medecines/0042150-nl-500.jpg)

Het was Fox die in de 1968 zilvernitraat en natriumsulfadiazine combineerde voor de

behandeling van brandwonden en andere wonden. Door substitutie van een


6

waterstofatoom door het zilveratoom op sulfadiazine, ontstond zilversulfadiazine (Edwards-

Jones, 2009; Klasen, 2000b). Sulfadiazine is een antibacterieel middel, behorend tot de

klasse van de sulfonamiden. Sulfadiazine is een competitieve inhibitor van para-

aminobenzoëzuur, wat nodig is voor de synthese van foiumzuur. Dit laatste is nodig bij de

opbouw van thymidine en dus bij de synthese van DNA (Meyers et al., 1980). Sulfonamiden

gaan dus de groei en de overleving van bacteriën tegen.

Aangezien para-aminobenzoëzuur en sulfadiazine competitieve inhibitoren zijn, kan

toevoeging van para-aminobenzoëzuur de werking van sulfadiazine teniet doen. Fox

constateerde echter dat toevoeging van para-aminobenzoëzuur geen invloed had op de

werking van zilversulfadiazine en zo ontstond onzekerheid over de functie van sulfadiazine in

het preparaat (Fox & Modak, 1974). Zilversulfadiazine dissocieert in de wonde en enkel het

zilver bindt op DNA, RNA, eiwitten en polysacchariden in de bacterie, terwijl sulfadiazine niet

bindt op componenten van de bacterie (Modak & Fox, 1973). Op die manier werd de groei

van Pseudomonas aeruginosa geïnhibeerd en kwantitatief gerelateerd aan de hoeveelheid

zilver die bindt op het DNA (Modak & Fox, 1973).

Hoewel sulfadiazine volgens Modak en Fox (1973) niet tussenkomt in de bactericide

werking van zilversulfadiazine, zag Fox (1974) dat het toch effectiever was dan andere

zilverhoudende componenten. Mogelijks is dit te wijten aan een verschil in de dissociatie en

de reactiesnelheid onder fysiologische omstandigheden (Fox & Modak, 1974). Bij dissociatie

kan Ag+ een complex vormen met Cl- in de wonde, met vorming van AgCl. Doordat er echter

een trage en continue vrijstelling is van Ag+ uit de matrix van sulfadiazine, treden minder

elektrolietstoornissen op dan bij gebruik van de zilvernitraatoplossing (Fox & Modak, 1974).

Net als bij gebruik van zilvernitraat kan echter methemoglobinemie voorkomen, maar hier is

het sulfadiazine die Fe2+ oxideert tot Fe3+ en bovendien is daarvan maar 1 geval gekend

(Fuller, 2009). Het betreft een 3 jarig jongetje die voor 55% verbrand was en die leed aan

thalassemia (Tsai et al., 2005).

1.2.4. Zilververbanden

In België zijn tevens zilververbanden te verkrijgen, zoals Aquacel-Ag® (Convatec) en

Biatain-Ag® (Coloplast). Deze worden gebruikt bij geïnfecteerde wonden en brandwonden,

maar er is geen evidentie voor een gunstig effect op de wondheling (Christiaens et al.,

2010b). Er zijn verschillende factoren die een rol spelen bij het afdoden van de micro-


7

organismen in de wonden, zoals de distributie en de concentratie van zilver in het verband

(Chopra, 2007).

1.3. GEVAAR VAN VIRAAL GECONTAMINEERD WATER – BEHANDELING VAN AFVALWATER

De nood aan desinfectie van water wordt aangetoond aan de hand van enkele cijfers die

vrijgegeven werden door de WHO. In 2002 hadden 1,1 miljard mensen geen toegang tot

veilig drinkwater en hadden 2,6 miljard mensen geen toegang tot waterzuivering. Dit komt

overeen met respectievelijk 17% en 42% van de toenmalige wereldbevolking.

(http://www.who.int/water_sanitation_health/publications/facts2004/en/index.html)

Bovendien is in gebieden met weinig watervoorziening het hergebruik van water van

essentieel belang.

1.3.1. Virale gastro-enteritis

De mens is vatbaar voor verschillende virale infecties. Enkele virussen die kunnen

overleven in water en dus mensen kunnen besmetten na consumptie van dit besmet water,

zijn het norwalkvirus, norovirus (=norwalk-like virus), rotavirus en adenovirus (Hedberg &

Osterholm, 1993). Dit zijn allemaal virussen die gastro-enteritis, in de volksmond buikgriep,

kunnen veroorzaken, na overdracht via de fecaal-orale route. Symptomatisch wordt dit

gekenmerkt door waterige diarree en braken (Glass et al., 2009). Volgens een Nederlandse

studie omtrent de oorzaak van gastro-enteritis spant het norovirus de kroon, aangezien het

in 11% van de gevallen aan de basis lag van de gastro-enteritis en 21% van de gevallen van

virale oorsprong was (de Wit et al., 2001). Het norovirus is een naakt virus met een

enkelstrengige RNA keten en het behoort tot de klasse van calicivirussen (Glass et al., 2009).

Het Norwalkvirus, het prototype van het norovirus, heeft een lage infectieuze dosis. De dosis

waarbij 50% van de proefpersonen de infectie krijgt (ID50) is slechts 18 virussen (Teunis et al.,

2008). Dit verklaart het vaak optreden van epidemieën.

Ook hepatitis A en hepatitis E worden overgedragen via de fecaal-orale route (Leclerc et

al., 2002). In de industrielanden komt vooral hepatitis A voor, als gevolg van de consumptie

van ongekookte schaaldieren zoals oesters. In de ontwikkelingslanden komt vooral hepatitis

E voor als gevolg van het drinken van besmet water (Leclerc et al., 2002). Hepatitis A is een

RNA virus dat tot de klasse van de picornavirussen behoort, terwijl Hepatitis E een RNA virus

is dat net als het norovirus een calicivirus is (Balayan, 1997; Santti et al., 1999).


8

1.3.2. Gevaar van diarree

Gastro-enteritis gaat gepaard met diarree, een niet ongevaarlijk symptoom. Elk jaar zijn

er 2,5 miljard kinderen jonger dan 5 jaar die diarree krijgen en bij 1,5 miljoen kinderen leidt

het tot de dood (UNICEF/WHO, 2009). Dit komt overeen met 16% van alle kindersterftes.

Diarree is dan ook – op pneumonie na - de grootste veroorzaker van sterfte bij kinderen

jonger dan 5. Er sterven meer kinderen ten gevolge van diarree, dan dat er kinderen sterven

door AIDS, mazelen en malaria samen (13%). Van de kinderen die sterven door diarree zijn

80% afkomstig uit Zuid-Azië en Afrika (UNICEF/WHO, 2009).

Kinderen jonger dan 5 die gehospitaliseerd zijn omwille van gastro-enteritis zijn in 40%

van de gevallen geïnfecteerd met het rotavirus (UNICEF/WHO, 2009). Van de 1,5 miljoen

kinderen die sterven ten gevolge van diarree zijn 600 000 kinderen het slachtoffer geworden

van het rotavirus, dus eveneens 40% (Parashar et al., 2006).

1.3.3. Virusuitbraken

Het belang van een goede waterdesinfectie blijkt uit de verschillende uitbraken van

gastro-enteritis, door het drinken van water gecontamineerd met het norovirus. Acute

uitbraken kunnen worden veroorzaakt door contaminatie van het grondwater (Maunula et

al., 2005), maar eveneens door inefficiënte desinfectie van het water op kleine schaal, zoals

op schepen (Cramer et al., 2006). Daarnaast kan het probleem zich ook situeren bij het

waterzuiveringsstation, waarbij sowieso virussen voorkomen in het effluent, zoals besproken

wordt in Hoofdstuk 1.3.4. In Nederland was er in juni 2002 een uitbraak van gastro-enteritis

bij kinderen van een basisschool op schooluitstap (Hoebe et al., 2004). Voedsel was de

oorzaak niet, aangezien iedereen zelf eten mee had. De kinderen hadden op de warme dag

in een recreatieve fontein gespeeld. Het water dat uit de fontein kwam, werd terug

opgevangen in een ondergronds reservoir en hergebruikt. Het water werd gefilterd en

handmatig werd hypochloriet toegevoegd, maar het gehalte aan chloor werd niet regelmatig

gecontroleerd. Het gevolg was dat 87 van de 167 kinderen die in de fontein hadden gespeeld

en 25 van de 40 kinderen die het water van de fontein hadden gedronken, ziek werden. In

de faeces van sommige kinderen bleek norovirus aanwezig te zijn en in het water werd het

eveneens terug gevonden, samen met een te hoge titer aan bacteriën. Dit is duidelijk een

geval van inefficiënte desinfectie van water op kleine schaal en dit leidde uiteindelijk tot

enkele maatregelen. Als eerste werd het toevoegen van chloor op punt gesteld en werd het


9

gehalte frequent gecontroleerd met als streefdoel 1,2 mg/L. Daarnaast werd het water

regelmatiger vervangen, vooral op warme zomerdagen en werd het waterzuiveringssysteem

geoptimaliseerd. In Italië was er in een vakantieoord in juli 2000 eveneens een uitbraak van

gastro-enteritis door infectie met het norovirus (Boccia et al., 2002). Kort voor de uitbraak

was er een breuk in de waterleiding en bij een inspectie bleek de watertank verbonden te

zijn met een irrigatiesysteem dat niet werd gebruikt. In totaal werden 344 mensen ziek.

1.3.4. Behandeling van afvalwater

Afvalwater wordt in rioolwaterzuiveringsinstallaties (RWZI’s) gezuiverd, zodat het water

terug kan gebruikt worden voor lozing in het milieu. Het water wordt hiertoe eerst

onderworpen aan een mechanische voorzuivering, waarbij grof materiaal uit het water

wordt verwijderd door middel van roosters. Daarna volgt de biologische zuivering met een

aërobe slibbehandeling, zodat organisch materiaal wordt afgebroken. Uiteindelijk wordt het

water voor bepaalde tijd gestockeerd in nabezinktanks, zodat het slib bezinkt en het

bovenstaande water gezuiverd is. (http://www.aquafin.be/nl/indexb.php?n=9&e=43&s=48)

In de Verenigde Staten is onderzoek gedaan naar de aanwezigheid van virussen in het

afvalwater (Symonds et al., 2009). Hiertoe heeft men in 11 verschillende staten het

ongezuiverde (influent) en het gezuiverde (effluent) afvalwater in RWZI’s geanalyseerd en

vergeleken. Door middel van PCR werden in alle influentstalen adenovirussen en

picobirnavirussen aangetoond, terwijl deze nog in respectievelijk 25 % en 33 % van de

effluentstalen aanwezig waren. In 75 % van de influentstalen waren enterovirussen

aanwezig en na zuivering van het water waren er nog aanwezig in 8 % van de effluentstalen.

Norovirussen ten slotte, werden teruggevonden in 58 % van de influentstalen en 8 % van de

effluentstalen. Deze studie toont dus aan dat adenovirussen, picobirnavirussen,

enterovirussen en norovirussen in grote mate aanwezig zijn in ongezuiverd afvalwater en dat

de huidige RWZI’s de virussen niet volledig elimineren uit het water.

1.3.5. Behandeling van drinkwater

De conventionele drinkwaterbehandeling bestaat uit enkele fysische processen,

waaronder coagulatie/flocculatie, sedimentatie en filtratie en wordt gevolgd door chemische

desinfectie, zoals beschreven staat in de ‘Drinking Water Treatment’ door de USEPA (1999).

Coagulatie van colloïdale deeltjes in het water gebeurt door het toevoegen van coagulantia


10

zoals aluminium en ijzerzouten. Colloïdale deeltjes blijven in water in oplossing omwille van

onderlinge afstoting door hun negatieve lading. Aluminium en ijzerzouten zullen in water

oplossen en positief geladen ionen vrijstellen. Deze binden onder invloed van

elektrostatische aantrekking op het oppervlak van de colloïden en neutraliseren zo hun

negatieve lading. Door roeren zullen de deeltjes met elkaar binden en vlokken vormen. Dit

proces wordt flocculatie genoemd. De deeltjes zullen uiteindelijk sedimenteren of op het

oppervlak drijven, waarna ze door filtratie verwijderd worden uit het water (USEPA, 1999).

Door filtratie worden bacteriën en protozoa uit het water verwijderd. De verwijdering van

virussen door middel van fysische methoden is moeilijker doordat hun afmeting varieert

binnen de nanoschaal (50-100 nm). Dit wil zeggen dat ze niet worden tegengehouden door

microfiltratie. Bovendien zijn virussen negatief geladen en zullen ze dus niet adsorberen op

negatief geladen membranen, die worden gebruikt bij filtratie (Nwachcuku & Gerba, 2004).

Door toevoegen van aluminium of zilverzouten echter, wordt de negatieve lading van de

virussen geneutraliseerd en zullen de virussen coaguleren tot deeltjes die wel worden

tegengehouden bij microfiltratie. De aluminiumcoagulantia op zichzelf hebben evenwel ook

werking, aangezien tijdens hydrolyse van het coagulant polymeren worden gevormd die

virussen sterk adsorberen (Matsui et al., 2003). Hierdoor wordt het virus geïnactiveerd.

Chemische desinfectie is mogelijk door toevoeging van chloor (NaOCl en HOCl), maar ook

ozon en UV zijn mogelijk. Deze chemische processen vormen de belangrijkste barrière voor

virussen (Nwachcuku & Gerba, 2004). Alle drie zijn ze effectief, maar ze hebben ook allen

hun nadelen. Chloor wordt het meest gebruikt voor chemische desinfectie. Voor de

chloorbehandeling moet echter een zuiveringsstap worden ingevoerd en moeten de virussen

worden gedispergeerd (Shin & Sobsey, 2008). Wanneer viruspartikels voorkomen als

aggregaten kan chloor de virussen namelijk niet afdoden. Daarenboven is er nog een

belangrijk nadeel verbonden aan het gebruik van chloor. Er worden namelijk desinfectie

bijproducten gevormd waarvoor strenge reglementeringen bestaan omwille van hun

toxiciteit (Richardson, 2003). Enkele voorbeelden zijn chloroform, formaldehyde,

trichlooracetonitrile en N-nitrosodimethylamine. Vooral de vorming van deze laatste stof

verdient aandacht omwille van zijn potentiële carcinogene eigenschappen (Mitch & Sedlak,

2002). Ultraviolet licht (UV) kan een alternatief zijn voor de chloorbehandeling, maar UV

doodt adenovirussen onvoldoende af, door hoge resistentie (Shannon et al., 2008). Een


11

derde vorm van chemische desinfectie is ozon (O3). Net als bij chloor worden er echter

desinfectie bijproducten gevormd, waaronder trihalonitromethanen (Krasner et al., 2006).

1.3.6. Normen voor virale contaminanten

In de VS werden de normen voor drinkwater vastgelegd in de ‘National primary drinking

water regulations’. In de Long Term 2 Enhanced Surface Water Treatment Rule staat

beschreven dat door behandeling van het water 99,99% van de virussen verwijderd of

geïnactiveerd moet worden. Dit komt overeen met een reductie van de concentratie met 4

logeenheden (EPA, 2006). De Europese Unie geeft in de richtlijn 98/83/EC van 3 november

1998 geen vermelding over virussen als parameter voor de kwaliteit van het water, bestemd

voor menselijke consumptie (EUR-lex, 1998).

1.3.7. Nood aan ‘nieuwe’ desinfectiemethoden: biogeen zilver

In de wetenschap dat er veel virussen aanwezig zijn in het afvalwater en dat er nadelen

verbonden zijn aan de huidige chemische desinfectiemethoden, rijst de vraag naar andere

desinfectiemethoden. Dit is vooral van belang in gebieden waar men het afvalwater moet

hergebruiken. Er kan gezocht worden naar nieuwere technieken, maar even goed

teruggegrepen worden naar oude waardevolle manieren. Het mogelijk gebruik van biogene

zilvernanopartikels (bio-Ag0) om viraal gecontamineerd water te desinfecteren werd

onderzocht (De Gusseme et al., 2010). In dit onderzoek werd gebruik gemaakt van metallisch

zilver, aangezien ionisch zilver de eigenschap heeft om meteen te complexeren met negatief

geladen ionen en te precipiteren (Atiyeh et al., 2007). De biogene zilvernanopartikels

werden aangemaakt na pH-verhoging door gebruik te maken van Lactobacillus fermentum,

zoals beschreven door Sintubin et al. (2009). Het zilver werd toegevoegd als een diamine-

complex, aangezien Ag+ bij hoge pH een oxideneerslag vormt. Op het oppervlak van L.

fermentum werd Ag+ gereduceerd tot Ag0 door middel van reducerende suikers en

gedispergeerd vastgelegd (Figuur 1.5) (Sintubin et al., 2009).


12

FIGUUR 1.5.: DE REDUCTIE VAN AG+ NAAR Ag0 OP HET OPPERVLAK VAN DE L. FERMENTUM.

a OP HET OPPERVLAK VAN DE BACTERIE ZIJN REDUCERENDE SUIKERS (BV. GLUCOSE) EN

GEPROTONEERDE ANIONISCHE FUNCTIONELE GROEPEN (-RH) AANWEZIG. b DOOR STIJGING

VAN DE pH DISSOCIËREN DE PROTONEN, WAARDOOR EEN NEGATIEF GELADEN

FUNCTIONELE GROEP ONTSTAAT, DIE Ag+ KAN ADSORBEREN. HET SUIKER KOMT BIJ HOGE

pH VOOR IN Z’N ALDEHYDE VORM EN KAN Ag+ REDUCEREN. c Ag+ IS GEREDUCEERD TOT Ag0

EN DE ALDEHYDEFUNCTIE VAN HET SUIKER IS GEOXIDEERD TOT EEN CARBONZUUR (Sintubin

et al., 2009).

De zilvernanopartikels bevinden zich dus op het oppervlak van dode bacteriën, waardoor

aggregatie van het zilver niet mogelijk is. Toevoeging van 5,4 mg bio-Ag0 per liter water, dat

geïnfecteerd was met UZ1 bacteriofagen, resulteerde in een reductie van de

faagconcentratie met 4 logeenheden in amper 1 uur (De Gusseme et al., 2010).

1.4. VEILIG GEBRUIK VAN ZILVER VOOR DE GEZONDHEID VAN MENS EN MILIEU

Zilver kan nefaste gevolgen hebben voor zowel de mens als de natuur. Dit wordt hier

besproken, net als de mogelijke technieken voor veilig gebruik van zilver, zonder gevaar voor

de mens en het milieu.

1.4.1. Invloed van zilver op de gezondheid

Als het menselijk lichaam in contact komt met een te hoge concentratie zilver, kan argyria

optreden (Greene & Su, 1987). Hierbij zet zilver zich af in de huid, de nagels, de ogen, de

mucosale membranen en verschillende organen (Greene & Su, 1987; Panyala et al., 2008).

Waar zilver zich afzet treedt een blauw-grijze verkleuring op die wordt geïnduceerd door

zilver zelf, maar ook door melanine dat wordt aangemaakt onder invloed van het zilver. Deze

opvallende pigmentatie is vaak het enigste symptoom van argyria en is het meest

uitgesproken op lichaamsdelen die het meest worden blootgesteld aan de zon, zoals het


13

gezicht en de handen (Greene & Su, 1987) (Figuur 1.6). Greene & Su (1987) onderscheiden

twee mogelijke vormen van argyria, namelijk lokale argyria en algemene argyria. Lokale

argyria ontstaat door direct contact van de huid met zilverhoudende substanties. In dit geval

dringt zilver de huid binnen via de zweetklieren. Algemene argyria treedt op wanneer in het

bloed een te hoge concentratie zilver aanwezig is. Zilver kan het bloed bereiken via de

longen, maar ook via het gastro-intestinaal stelsel of via directe injectie. Wanneer bij de

analyse van een huidbiopsie kleine zilvergranules (< 1 µm) worden gedetecteerd in de

dermis en de exocriene zweetklieren wordt de diagnose van argyria gesteld (Greene & Su,

1987). Deze granules bevatten zilversulfide (Pariser, 1978). Er is geen behandeling ter

beschikking, maar op lange termijn zijn er volgens Greene & Su (1987) geen gevolgen voor

de gezondheid, met uitzondering van sociale en psychologische gevolgen. Een andere bron

daarentegen meldt de ontwikkeling van manisch depressieve psychosen, aorta aneurysma

en uiteindelijk zelf overlijden van de patiënt (Panyala et al., 2008).

FIGUUR 1.6.: ROSEMARY JACOBS (LINKS) LIJDT AAN ARGYRIA, NA GEBRUIK VAN

NEUSDRUPPELS MET ZILVER. VERGELEKEN MET DE ANDERE DAME, VALT DE GRIJS-BLAUWE

VERKLEURING STERK OP. (© 1998 Chick Schwartz (http://www.webanstrich.de/rosemary/silverfraud.html)

Er is slechts 1 geval gekend van systemische argyria ten gevolge van overmatig gebruik

van zilversulfadiazine (Payne et al., 1992). Argyria is een gekende complicatie bij het gebruik

van flammazine ter behandeling van brandwonden. In dit geval echter gebruikte de patiënt

50 g flammazine per 2 dagen en dit gedurende 5 maanden, ter behandeling van ulcera. Er

trad verkleuring op van de huid en de man werd gevoelloos in de armen. De diagnose van

argyria neuropathie werd gesteld.


14

1.4.2. Invloed van zilver op het milieu

Wanneer zilver terechtkomt in de bodem, kan het daar bacteriën afdoden die cruciaal zijn

in het ecologisch systeem, zoals beschreven door Panyala et al. (2008). In de bodem zitten

onder andere chemolithotrofe bacteriën. Zij gebruiken inorganische componenten als

elektrondonor om energie te produceren, maar ook nutriënten die essentieel zijn voor de

bodem. Heterotrofe bacteriën voeden zich met organische componenten en staan in voor

stikstoffixatie. Hierbij worden nitraten omgezet in stikstofgas, vandaar de naam

denitrificatie. Dit is een essentieel proces, aangezien een teveel aan nitraten de

productiviteit van planten verlaagt. Hierdoor zouden rivieren en meren te rijk worden aan

voedsel. Bovendien verontreinigen nitraten het water. Zilver kan dus leiden tot een

verstoring van het ecologisch systeem van de bodem, louter door z’n antibacteriële werking.

(Panyala et al., 2008)

Ag+ is toxisch voor zoetwatervissen, door z’n inhiberend effect op het basolaterale Na+,K+-

ATPase, ter hoogte van de kieuwen (Wood et al., 1999). Dit heeft als gevolg dat Na+ en Cl-

niet meer actief kunnen worden opgenomen in de cel, waardoor de osmoregulatie wordt

verstoord en de vis kan sterven (Morgan et al., 1997). Bij zoutwatervissen is een grotere

concentratie zilver nodig om toxiciteit te induceren, door de complexatie van Ag+ met Cl-

(Wood et al., 1999).

1.4.3. Normen voor zilverconcentratie in water

De United States Environmental Protection Agency (USEPA) raadt een limiet aan voor

zilver van 0,1 mg/L water (USEPA, 2009). Dit is echter een aanbeveling, geen verplichte

grens. In de richtlijn 98/83/EC van 3 November 1998 over de kwaliteit van het water voor

consumptie binnen de Europese Unie, werd geen richtlijn opgegeven voor het gehalte aan

zilver in het afvalwater (EUR-lex, 1998).

1.4.4. Normen voor nanopartikels

Nanopartikels zijn te vinden in allerlei producten en worden vaak gebruikt zonder dat de

consument het beseft. Zo zijn er nanodeeltjes te vinden in cosmetica, zoals bvb. in

zonnecrèmes die nanopartikels van titaniumdioxide bevatten1. Daarnaast wordt

1 http://home.fnv.nl/02werkgeld/arbo/themas/gevaarlijke-stoffen/Nanotechnologie.htm


15

nanotechnologie onder andere ook toegepast in de textiel- en auto-industrie, maar ook in de

voeding en in farmaceutische preparaten. De reden voor de opmars van deze technologie is

het feit dat stoffen op nanoniveau andere eigenschappen krijgen2. Zo worden

nanokoolstofdeeltjes gebruikt in tennisrackets omdat het een licht en sterk materiaal is3.

Aangezien nanodeeltjes andere eigenschappen hebben dan het standaardmateriaal, zijn er

ook andere risico’s mee verbonden4. Door het wijdverspreide gebruik en de verschillende

toepassingen komt iedereen ongetwijfeld in contact met nanopartikels, zowel consumenten

als werknemers van bedrijven die nanotechnologie toepassen. Dit heeft geleid tot vele

vragen en discussies. Bovendien was er nog geen regelgeving omtrent het veilig gebruik

ervan. Ondertussen is de wetgeving voor cosmetica na de opkomst van nanotechnologie

aangepast door de Europese Commissie. Zo moet vermeld worden op het etiket dat het

product nanopartikels bevat en zijn toxicologische testen verplicht. Gezien de voorlopig nog

onbekende gevaren van nanotechnologie is uitbreiding van de wetgeving noodzakelijk en is

verder onderzoek naar de mogelijke gevaren voor de mens en het milieu een must5. Om de

veiligheid van onderzoekers te waarborgen zijn er sinds 2008 aanbevelingen voor veilig

gebruik van nanopartikels tijdens het onderzoek6.

1.4.5. Inkapselen van biogene zilvernanopartikels

Om de gevolgen van toxische concentraties van zilver en/of nanopartikels te voorkomen,

is het interessant om zilver in te bedden in membranen of filters en het afvalwater doorheen

deze membranen of filters te sturen. Door de inkapseling van de zilvernanopartikels komt

slechts een geringe hoeveelheid Ag+ vrij in het drinkwater en is het ongevaarlijk voor de

mens en het milieu. Bovendien is op die manier een continue desinfectie van het water

mogelijk. Zo werd reeds een NanoCeram filter gebruikt om water te zuiveren van virussen

(De Gusseme et al., 2010). Het filtermateriaal bestond uit 31,25 mg bio-Ag0/m², aangebracht

op de positief geladen filter, wat resulteerde in een daling van de virusconcentratie met

3,8 logeenheden. De filter op zich hield ook virussen tegen, aangezien de concentratie

daalde met 1,5 log wanneer de filter zonder zilver op gebruikt werd. Dit was de eerste keer

2 http://www.vacature.com/scripts/Actueel/displayarticle.asp?ID=9650&artCount=7&startPos=1&artsLoaded=1

3 http://www.trosradar.nl/index.php?id=nieuws_detail&tx_ttnews[tt_news]=27921&cHash=27921142

4 http://home.fnv.nl/02werkgeld/arbo/themas/gevaarlijke-stoffen/Nanotechnologie.htm

5 http://www.bondbeterleefmilieu.be/page.php/30/412/11030

6 ftp://ftp.cordis.europa.eu/pub/fp7/docs/nanocode-recommendation.pdf


16

dat biogene metallische zilvernanopartikels, die extracellulair werden aangemaakt, gebruikt

werden voor continue desinfectie van viraal gecontamineerd water.

Naast het inkapselen van de zilvernanopartikels in een filter is het ook mogelijk om ze in

te bedden in membranen. Membraan bioreactoren danken hun virusverwijdering aan

filtratie, maar ook aan de biofilm die gevormd wordt op het membraan (Wu et al., 2009). De

vorming van een biofilm heeft echter ook nadelen, aangezien het leidt tot verstopping van

het membraan, hogere energiekosten en bovendien is het membraan sneller aan vervanging

toe (Wu et al., 2009). Zilvernanopartikels werden hiertoe ingebed in polysulfon membranen,

met als doel zowel de virusverwijdering als het voorkomen van de vorming van een biofilm

(Zodrow et al., 2009). In het verleden werden eveneens palladiumnanopartikels

geïmmobiliseerd in polysulfon en polyvinylideen fluoride (PVDF) membranen (Hennebel et

al., 2010). Het werd toegepast ter verwijdering van diatrizoaat, een moeilijk afbreekbaar X-

ray contrastmedium, uit water. Biogene palladiumnanopartikels werden eveneens gebruikt

ter verwijdering van trichloroethyleen, waarbij de palladiumnanopartikels werden

vastgelegd op zeoliet (Hennebel et al., 2009).

Zeolieten zijn mineralen met een kristallijne structuur en worden vaak gebruikt als

kationuitwisselaar omwille van hun negatieve lading (Wang & Peng, 2009). Door hun grote

poriën kunnen ze water en kationen binden en hebben ze een groot adsorptieoppervlak.

Zeolieten kunnen dus positief geladen metalen adsorberen, waaronder ook zilver (Zeomic

2,5 %). Zeomic heeft een bewezen antibacteriële werking en is ook actief tegen gisten en

fungi. (http://www.zeomic.co.jp/english/04_01_zeomic.html)

Hoofdstuk 2: Objectieven

17

2. OBJECTIEVEN

Het doel van deze scriptie is nagaan of biogeen zilver gebruikt kan worden voor de

continue desinfectie van virussen. Gezien de drinkwaterlimiet voor Ag+ van 0,1 mg/L en de

ongerustheid omtrent het gebruik van nanopartikels, is het de bedoeling om het biogeen

zilver te immobiliseren, zodat het verlies in het filtraat beperkt wordt. Teneinde een

innovatieve én een veilige desinfectiemethode op basis van biogeen zilver te ontwikkelen,

zullen 3 strategieën voor immobilisatie worden onderzocht.

In eerste instantie zal het biogeen zilver worden verankerd op een NanoCeram filter,

analoog zoals eerder gedaan werd door De Gusseme et al. (2010). In een reactoropstelling

zal de zilvervrijstelling worden opgevolgd en eveneens de virusverwijdering worden

onderzocht. Hiervoor zullen stalen worden genomen met en zonder toevoeging van een

neutralizer. De neutralizer vangt het vrije Ag+, zodat de nawerking van Ag+ bestudeerd kan

worden. In een volgend experiment zal het biogeen zilver worden ingebed in een

polymeermembraan. Deze worden net als bij Zodrow et al. (2009) aangemaakt via de fase-

inversie techniek. Om inzicht te krijgen in het werkingsmechanisme zal het membraan

worden gekarakteriseerd met scanning elektronen microscoop en energie dispersieve X-

stralen. De virusinactivatie en zilvervrijstelling zullen eerst worden onderzocht in een

batchexperiment en vervolgens in een membraanreactor, de zogenaamde Single Membrane

Unit for Reusable Filtrate (SMURF). Tenslotte zal zeoliet worden gebruikt als drager voor het

biogeen zilver, aangezien het een kationuitwisselaar is met een groot specifiek oppervlak. De

virusinactivatie zal eerst onderzocht worden in een batchtest. Vervolgens zal het zeoliet

worden gebruikt als vast bed in een opstroomkolom voor continue desinfectie. Bij alle drie

de opstellingen wordt eveneens getracht om enig inzicht te krijgen in het

werkingsmechanisme.

Als virale contaminant zal de UZ1 bacteriofaag worden gebruikt. Het is een model voor

enterische virussen die aanwezig zijn in water, aangezien het Enterobacter aerogenes

infecteert, een bacterie behorend tot de normale gastro-intestinale microbiota (Verthe et

al., 2004). De aanwezigheid van bacteriofagen wijst op de mogelijke aanwezigheid van

enterische virussen, aangezien ze typisch voorkomen in de uitwerpselen van de mens

(Grabow, 2001). Bovendien zijn bacteriofagen handig in gebruik, gezien hun makkelijke en

snelle detectie via plaque assays.

Hoofdstuk 3: Materialen en methoden

18

3. MATERIALEN EN METHODEN

3.1. PRODUCTIE VAN BIOGEEN ZILVER

Biogeen zilver werd, zoals beschreven in Hoofdstuk 1.3.7, geproduceerd met behulp van

Lactobacillus fermentum. Op deze bacterie worden zilverionen (Ag+) tot Ag0 gereduceerd en

vastgehouden. De reductie heeft het grootste rendement bij hoge pH (pH 11,5) en

bovendien gaat de reactie dan sneller door (Sintubin et al., 2009). Het biogeen zilver dat in

deze scriptie werd gebruikt, werd geproduceerd door Janssen Pharmaceutica (Beerse,

België) en heeft een grootte van 11,2 ± 0,9 nm. De stock van biogeen zilver in suspensie

bevatte 15,89 mg bio-Ag0/mL. Het poeder dat werd verkregen door sproeidrogen bevatte

132,92 mg bio-Ag0/g.

3.2. CONCENTRATIEBEPALING ZILVERIONEN

Voor de Ag+-concentratiebepaling bij het experiment met het 250 mg/m² membraan in de

SMURF reactor, werd een zilverelektrode (M370T ProLine Plus pH/Ion/ORP meter, Prosense,

Oosterhout, Nederland) gebruikt, met een LOD van 10 µg/L. Bij de andere experimenten

werd inductief gekoppeld plasma optische emissie spectrometrie (ICP-OES) (Varian Vista

MPX, Varian, Middelburg, Nederland) toegepast. De LOD bedroeg 100 µg/L. Via deze

methode werd het zilver dat in oplossing was gekwantificeerd.

3.3. ENTEROBACTER AEROGENES

Na groei op Luria Bertani (LB) platen (Tabel 3.1) werd LB bouillon (LB medium zonder

agar) geïnoculeerd met E. aerogenes BE1 cultuur LMG 22092 (LMG cultuurcollectie,

Universiteit Gent, België). Dit werd geïncubeerd op een schudder bij 37°C.

TABEL 3.1.: SAMENSTELLING LB-MEDIUM

Component Concentratie (g/L)

Trypton (Applichem, Darmstadt, Duitsland) 10

NaCl (VWR, Leuven, België) 5

Gistextract (Oxoid, Basingstoke, Verenigd-Koninkrijk) 5

Agar (VWR, Leuven, België) 15


19

3.4. GROEI EN DETECTIE VAN BACTERIOFAAG UZ1

Voor de detectie van bacteriofaag UZ1 werd de soft agar layer methode toegepast

(Adams, 1959). Hierbij werd een verdunningsreeks gemaakt in SM medium (Tabel 3.2). Van

elke verdunning werd telkens 100 µL gemengd met 400 µL mid-log fase E. aerogenes in 2,5

mL soft agar (0,5 % agar). Dit werd uitgegoten op petriplaten met LB agar en ’s nachts

geïncubeerd bij 37°C. Bacteriofagen werden geteld als plaque forming units (pfu) en hun

concentratie werd uitgedrukt in pfu/mL staal, waarbij de LOD 1,0 x 102 pfu/mL was.

TABEL 3.2.: SAMENSTELLING SM-MEDIUM

Component Concentratie (g/L)

Tris-HCl (Vel, Leuven, België) 7,880

NaCl (VWR, Leuven, België) 5,844

MgSO4 (Merck, Darmstadt, Duitsland) 1,204

Gelatine (VWR, Leuven, België) 0,1

37 % HCl (VWR, Leuven, België) pH 7,5

3.5. AANMAAK STOCK BACTERIOFAAG UZ1

Een faagstock werd bekomen van De Gusseme et al (2010). Hiervan werd in tienvoud

100 µL gemengd met 400 µL mid-log fase E. aerogenes en 2,5 mL soft agar. Dit werd

uitgegoten op petriplaten met LB agar en ’s nachts geïncubeerd bij 37°C. De toplaag van 5

platen werd afgeschraapt en opgelost in 10 mL SM medium. Na centrifugatie gedurende

10 min bij 10000 x g werd het supernatans gefilterd door een filter met een poriëngrootte

van 0,22 µm (Millex, Millipore, Ierland). De stock werd bewaard bij -80°C (Verthe et al.,

2004). Voor de bepaling van de concentratie van de faagstock werd de methode gebruikt die

eerder besproken werd in Hoofdstuk 3.4. De concentratie van de gebruikte stocks is te

vinden in Tabel 3.3.

TABEL 3.3.: CONCENTRATIE FAAGSTOCK

Faagstocknummer Concentratie (pfu/ml)

5 (7,50 ± 4,70) x 109

6 (8,85 ± 5,87) x 108

7 (9,63 ± 0,63) x 109

9 (2,63 ± 0,25) x 108


20

3.6. NEUTRALIZER

Om de werking van zilver op een bepaald tijdstip na te gaan, werd voor de analyse van de

UZ1 stalen in deze scriptie een neutralizer toegevoegd aan het staal, op het moment van de

staalname. Door binding met de thiolfunctie werd de activiteit van het vrijgestelde Ag+

stilgelegd. Om virusinactivatie door de neutralizer zelf uit te sluiten werden de neutralizers

getest. De verschillende neutralizers zijn met hun overeenkomstige concentratie te vinden in

Tabel 3.4. Aan 5 mL van elke neutralizer werd 5 mL faagoplossing (9,63 x 108 pfu/mL;

faagstock 7) toegevoegd.

TABEL 3.4.: NEUTRALIZERS

Neutralizer Concentratie

stockoplossing (g/L)

Concentratie in

staal (g/L)

Natriumthiosulfaat (VWR, Leuven, België) 1,46 0,73

Natruimthioglycolaat (Sigma-Aldrich, St Louis, VSA) 1 0,50

Natriumthiosulfaat/Natriumthioglycolaat 1,46/1 0,73/0,50

3.7. VASTLEGGEN BIOGEEN ZILVER OP NANOCERAM FILTER

3.7.1. NanoCeram filter

Om de desinfecterende eigenschappen van bio-Ag0 na vastlegging op een filter te

onderzoeken, werd de NanoCeram filter gebruikt, die eerder ook gebruikt werd door De

Gusseme et al. (2010). De NanoCeram filter is een positief geladen filter, die 35 tot 38 %

aluminiumvezels (AlOOH) bevat. De vezels hadden een diameter van 2 nm en waren 200 tot

300 nm lang. De filter had een oppervlakte van 500 tot 600 m²/g en vormde zo een groot

adsorptieoppervlak voor negatief geladen partikels. De filter had een oppervlakte van

0,32 m², bevatte 74 g actief filtermateriaal en woog 193 tot 200 g (De Gusseme et al., 2010).

Op de filter werd 150 mL van een biogene zilversuspensie gesproeid, met een concentratie

van 100 mg/L. De filter bevatte dus 15 mg biogeen zilver, of 46,875 mg bio-Ag0/m² filter. Per

gram actief filtermateriaal was er 0,2 mg bio-Ag0 geadsorbeerd. Na besproeiing met de

zilversuspensie, werd de filter gedroogd bij 25°C gedurende 12 uur.


21

3.7.2. Filtersysteem

De NanoCeram filter bevond zich in de filterhouder (Figuur 3.1). Het influent bereikte

door middel van een pomp de filterhouder en werd langs de buitenzijde doorheen de filter

naar de binnenzijde van de filter gepompt (Watson/Marlow, Cornwall, Verenigd-Koninkrijk).

Het compartiment waarin de filter zat, had een volume van 1,20 L zonder de filter en 1,05 L

(=Vact) met de filter. Er werd 10 L Spa blauw, waaraan 8,85 x 104 pfu/mL UZ1 fagen

(faagstock 6) werden toegevoegd, door de filter gestuurd door middel van een

pompsysteem met een debiet van 18,46 L/uur (=Q). Dit komt overeen met een hydraulische

retentietijd (HRT= Vact/Q) van 3,4 min. Gedurende 30 minuten werd om de 5 minuten een

staal genomen. Aan 3 mL staal, voor analyse van UZ1, werd 1 mL van een 1 g/L

natriumthioglycolaat en 1,46 g/L natriumthiosulfaat neutralizer toegevoegd. Er werden

eveneens stalen genomen waaraan de neutralizer niet werd toegevoegd.

FIGUUR 3.1.: DE REACTOR MET DE NANOCERAM FILTER. HET INFLUENT WERD VAN DE

BUITENKANT NAAR DE BINNENKANT VAN DE FILTER GEPOMPT EN BEREIKTE ZO HET

EFFLUENTVAT.


22

3.8. INKAPSELEN BIOGEEN ZILVER IN MEMBRANEN

3.8.1. Membraanproductie

Het gesproeidroogd bio-Ag0 werd toegevoegd aan dimethylformamide (DMF) (Sigma-

Aldrich, St Louis, VSA) onder roeren. Het mengsel werd 10 minuten in een ultrasoonbad

geplaatst bij 50°C, om eventuele aggregaten te dispergeren. Als polymeer werd

polyvinylideen fluoride (PVDF) (Kyanar 500®, Arkema, Amsterdam, Nederland) gebruikt in

een concentratie van 14 wt% (Hennebel et al., 2010). Dit werd geleidelijk onder roeren aan

de oplossing toegevoegd, tot het polymeer volledig opgelost was. Uiteindelijk werden drie

polymeeroplossingen gemaakt met respectievelijk 0, 1000 en 10000 mg bio-Ag0/L.

Met deze oplossingen werden drie membranen gemaakt via de fase-inversie techniek. Op

een niet-geweven polyethyleen-polypropyleen steunlaag (Novatex FO 2471, Freudenberg,

Duitsland) van 0,12 m² werd 30 mL van de polymeeroplossing aangebracht door middel van

een automatische filmapplicator (Elcometer 4340, Hermalle-sous-Argenteau, België), na

bevochtigen van de steunlaag met DMF. De dikte van de natte film bedroeg 250 µm. Na het

gieten van het membraan en verdampen van het solvent werd het membraan

ondergedompeld in gedestilleerd water, waar de fase-inversie doorging (Boussu et al., 2006).

Door neerslaan van het polymeer werd het membraan gevormd. Een membraan van

0,12 m², gemaakt met 1000 mg/L oplossing, bevatte theoretisch 30 mg bio-Ag0, of 250 mg

bio-Ag0/m². Het membraan vervaardigd met de 10000 mg/L oplossing bevatte theoretisch

2500 mg bio-Ag0/m².

3.8.2. Karakterisering membraan

Zowel een dwarsdoorsnede van het membraan als de toplaag van het membraan met

2500 mg bio-Ag0/m² werd bestudeerd om de morfologie van het membraan te bekijken en

de lokalisatie van de zilvernanopartikels te bepalen. De dwarsdoorsnede van het membraan

werd gemaakt door het membraan te bevochtigen en onder te dompelen in vloeibare

stikstof. Vervolgens kon het membraan gebroken worden.

Op het staal, een stukje droge membraan, werd een dun laagje goud aangebracht (Baltec

AG, Balzers, Liechtenstein) vooraleer het onder vacuüm bekeken werd met een FEI XL30

Scanning Elektronen Microscoop (SEM) (FEI, Eindhoven, Nederland). De SEM was uitgerust


23

met een LaB6 filament (elektronenbron) en een energie dispersieve X-straal spectroscopie

(EDAX, Tilburg, Nederland).

3.8.3. Batchtest

Deze test heeft als doel het nagaan van de desinfecterende eigenschappen van de

membranen. Ook de invloed van de concentratie bio-Ag0 en de oppervlakte van de

membranen werd onderzocht. Dit werd getest door stukjes van de membranen onder te

dompelen in 200 mL Spa blauw (Spadel, Brussel, België). Het membraan met 250 mg bio-

Ag0/m² was 25,92 cm² groot, dat van 2500 mg bio-Ag0/m² was 2,592 cm² groot. Beide stukjes

membraan bevatten dus dezelfde absolute hoeveelheid zilver (0,648 mg). Tevens werd van

het membraan met 2500 mg/m² een stuk van 25,92 cm² gebruikt. Aan de drie oplossingen

werden UZ1 bacteriofagen (faagstock 7) toegevoegd tot een concentratie van 9,63 x 105

pfu/mL. De oplossingen werden op een roerder gezet en stalen werden genomen bij de

start, na 2, 4 en 24 uur. De stalen voor analyse van UZ1 (3 ml) werden onmiddellijk

geneutraliseerd met 1 ml van een natriumthiosulfaat-natriumthioglycolaat (1,46 g/L – 1 g/L)

neutralizer (Tilton & Rosenberg, 1978).

3.8.4. Single membrane unit for reusable filtrate

3.8.4.1. Opstelling SMURF

De Single Membrane Unit for Reusable Filtrate (SMURF) bestond uit een reactorvat met

een actief volume van 9 L (Figuur 3.2). In de reactor bevond zich een membraanhouder,

waarop langs beide zijden een 0,062 m² membraan bevestigd was. Het water werd langs de

buitenzijde door de membranen gepompt, naar het gedeelte tussen de membranen en de

houder en vervolgens centraal verwijderd naar het effluentvat. Daarvoor werd een

peristaltische pomp gebruikt. Het influent werd eveneens via een peristaltische pomp

gedoseerd onderaan het membraan. Door middel van beluchting met perslucht werd het

influent in de reactor gemixt en overlangs over de membranen geleid (cross-flow principe).

Dit principe, samen met relaxatieperioden voor het membraan (door discontinu pompen)

hielp verstopping te voorkomen.


24

FIGUUR 3.2.: OPSTELLING VAN DE SMURF. HET INFLUENT GAAT DOOR HET MEMBRAAN EN

BEREIKT ZO HET EFFLUENTVAT.

3.8.4.2. Staalname SMURF

30 L Spa blauw, waaraan 8,85 x 104 pfu/mL UZ1 fagen (faagstock 6) werden toegevoegd,

werd door het membraan (250 mg/m² en 2500 mg/m²) gestuurd door middel van een

pompsysteem met een debiet van 0,375 L/uur. Dit resulteerde in een hydraulische

verblijftijd van 1 dag. Zowel van het influent als van het effluent werden stalen genomen op

geregelde tijdstippen, zodat de virusinactivatie in functie van de tijd kon worden onderzocht.

Het debiet bij het membraan zonder zilver bedroeg eveneens 0,375 L/uur en de concentratie

van de UZ1 bacteriofagen bedroeg 7,5 x 105 (faagstock 5). De stalen werden in afwachting

van verdere analyse gestockeerd bij 4°C. Bij het membraan met 0 en 250 mg bio-Ag0/m²

werd aan de effluent-stalen voor analyse van UZ1 bij staalname meteen natriumthiosulfaat

(5 g/L) toegevoegd om het vrijgekomen Ag+ te reduceren tot Ag0, zoals beschreven in de ISO-

norm: NBN EN 13697:2001. Het metallisch zilver sloeg neer en het zilver kon verder geen

desinfecterende werking meer uitvoeren. Zo kon het effect van het zilver dat in het

membraan zat bestudeerd worden. Bij het membraan met 2500 mg bio-Ag0/m² werd als

neutralizer 1 g/L natriumthioglycolaat en 1,46 g/L natriumthiosulfaat gebruikt. Per 3 mL staal

voor UZ1 analyse werd 1 mL neutralizer toegevoegd. Voor het membraan met 2500 mg bio-


25

Ag0/m² werd dezelfde test herhaald bij een debiet van 9 L/uur, wat resulteerde in een

hydraulische verblijftijd van 1 uur.

3.9. BATCHTEST AG+

Het doel van deze test is het effect nagaan van verschillende concentraties Ag+ in functie

van de tijd. Hiertoe werd 50 µL van een 1/100 verdunning van faagstock 7 aan 100 µL van

een Ag+-oplossing toegevoegd in welletjes van een 96-Well-plaat. Op 12 verschillende

tijdstippen werden volgende Ag+-concentraties getest: 5,4 mg/L, 0,05 mg/L en 0,01 mg/L.

Voor de Ag+-oplossing werd AgNO3 (Sigma-Aldrich, St Louis, VSA) gebruikt. Op bepaalde

tijdstippen werd 100 µL neutralizer (1 g/L natriumthioglycolaat en 1,46 g/L

natriumthiosulfaat) toegevoegd.

Bij een tweede batchtest werd in tweevoud aan 150 mL Spa blauw 1,5 mL van faagstock 9

toegevoegd. De Ag+-concentraties bedroegen 1 mg/L en 0,1 mg/L. Op geregelde tijdstippen

werd 3 mL van deze oplossing toegevoegd aan 1 ml neutralizer (1 g/L natriumthioglycolaat

en 1,46 g/L natriumthiosulfaat). Het doel van deze test is eveneens de virusverwijdering na

te gaan in functie van de tijd en de zilverconcentratie. Deze test werd herhaald met

gedestilleerd water, ter vervanging van Spa blauw.

3.10. VASTZETTEN BIOGEEN ZILVER OP ZEOLIET

3.10.1. Batchtest

De mogelijkheid van zeoliet (Zeolith N, Evers, Hopsten, Duitsland) om biogeen zilver vast

te houden, werd onderzocht op twee soorten: zeoliet met een diameter tussen 1 en 2,5 mm

en zeoliet met een diameter van 2,5 tot 5 mm. Twee batchtesten werden opgezet. Een

eerste reeks bevatte ter controle enkel zeoliet. Door het adsorberend vermogen van zeoliet

was het immers mogelijk dat de fagen op het zeoliet adsorbeerden. Aan 1 g zeoliet werd 100

mL Spa blauw toegevoegd en 100 µL UZ1 fagen (faagstock 6). Bij de tweede reeks werd per

gram zeoliet 5 mL bio-Ag0-suspensie toegevoegd met een concentratie van 5 g/L. Dit werd

gedroogd bij 100°C gedurende 4 uur, zodat het solvent verdampte en het bio-Ag0 op het

zeoliet adsorbeerde. Na toevoeging van 100 mL Spa blauw en 100 µL UZ1 fagen (faagstock 6)

aan 1 g zeoliet, werden stalen genomen bij de start van het experiment (= moment van


26

toevoeging van de bacteriofagen) en na 2 en 24 uur. Aan 3 mL staal voor UZ1 analyse werd 1

mL neutralizer (1g/L natriumthioglycolaat en 1,46 g/L natriumthiosulfaat) toegevoegd.

3.10.2. Opstroom vast bed filter

90 g zeolietkorrels met een diameter tussen 2,5 en 5 mm werden vast gepakt in een

verticaal opgestelde buis. Influent, langs onder in de buis gepompt, bevatte 9 L Spa blauw en

9,63 x 105 pfu/mL UZ1 fagen (faagstock 7). Het influent liep doorheen het compartiment met

zeolieten met een debiet van 0,125 L/uur. Het actief volume van de reactor bedroeg 40 mL,

wat overeenkomt met een HRT van 20 min. Op geregelde tijdstippen werden effluentstalen

genomen.

Tevens werd een reactor opgezet, waarbij op het zeoliet 2,5 wt% biogeen zilver zat, zoals

afgebeeld in Figuur 3.3. Hiertoe werd 450 mL bio-Ag0-suspensie met een concentratie van 5

g/L aan 90 g zeoliet toegevoegd. Dit werd gedroogd bij 100°C, zodat het solvent verdampt en

het bio-Ag0 op het zeoliet adsorbeert. Net zoals bij de reactor zonder zilver bedroeg het

debiet 0,125 ml/uur. 12 L Spa blauw met 9,63 x 105 pfu/ml UZ1 fagen (faagstock 7) werd

doorheen de reactor gestuurd. De test werd herhaald met een debiet van 500 mL/uur (HRT =

5 min). Stalen van het effluent werden op geregelde tijdstippen genomen. Als neutralizer

werd 1 g/L natriumthioglycolaat en 1,46 g/L natriumthiosulfaat gebruikt. Per 3 mL staal voor

UZ1 analyse werd 1 mL neutralizer gebruikt.

FIGUUR 3.3.: OPSTELLING VAN DE REACTOR MET ZEOLIET EN 2,5 wt% BIO-Ag0.


27

3.11. VERWERKING VAN DE DATA

Bij batchtesten werd log (Ct/C0) uitgedrukt in functie van de (contact)tijd. Ct stelt hierbij

de concentratie van de UZ1 bacteriofagen voor op tijdstip t. C0 is de concentratie van de

fagen, aanwezig bij de start van de test, die niet in contact zijn geweest met zilver. De

resultaten van de reactor experimenten werden uitgedrukt in log (Ceff/Cinf) in functie van het

bedvolume. Ceff en Cinf stellen respectievelijk de concentratie van de UZ1 bacteriofagen voor

in het effluent en het influent. Het bedvolume is de verhouding van het volume gefilterd

water op het actief volume in de reactor en wordt uitgedrukt in L/L. Zowel van Ct/C0 als

Ceff/Cinf werd de log10-waarde bepaald, om het resultaat te kunnen vergelijken met de

streefwaarde van 4 log verwijdering. Een daling van de concentratie fagen ten opzichte van

Cinf of C0, wordt dus door een negatieve log-waarde van de verhouding uitgedrukt, ofwel

door een positieve logvermindering of virusinactivatie. Bovendien laat de log-schaal toe om

de virusverwijdering overzichtelijk voor te stellen in een grafiek. Stalen werden in drievoud

uitgeplaat en de standaarddeviatie werd bepaald. De negatieve en positieve foutwaarden

van de standaarddeviatie zijn aan elkaar gelijk, maar op logaritmische schaal geeft dit

asymmetrische foutbalken. In bepaalde figuren (Figuur 4.9 en Figuur 4.12) kon de negatieve

foutwaarde niet worden getekend, doordat de standaardafwijking iets groter was dan het

gemiddelde. Dit kan verklaard worden door het feit dat een kleine afwijking na omzetting

naar de log-schaal groot wordt.

De LOD werd op dezelfde manier bepaald, waarbij Ceff gelijk gesteld werd aan 100 pfu/ml

indien geen neutralizer werd toegevoegd en 133 (=100/0,75) pfu/ml indien wel een

neutralizer (1 mL per 3 mL staal) werd toegevoegd aan de stalen.

Hoofdstuk 4: Resultaten

28

4. RESULTATEN

4.1. NEUTRALIZER

De virusinactivatie bij het gebruik van natriumthiosulfaat, natriumthioglycolaat en de

combinatie van beide bedroeg respectievelijk - 0,70 log [-0,72; -0,67], - 0,01 log [-0,12; 0,15]

en 0,20 log [0,10; 0,32]. Geen enkele neutralizer heeft dus een significante vermindering van

de UZ1 bacteriofagen tot gevolg. In volgende experimenten wordt daarom de combinatie

van natriumthiosulfaat en natriumthioglycolaat gebruikt, zoals voorgeschreven door Tilton &

Rosenberg (1978). De neutralizer bindt Ag+ via een thiolfunctie en verhindert zo z’n werking.


4.2.1. Doelstelling

Om het effect van biogeen zilver na vastlegging op een NanoCeram filter te onderzoeken

werd 10 L water doorheen de filter gefilterd met een debiet van 18,46 L/uur. Aan het

influent werden fagen toegevoegd tot een beginconcentratie van 8,85 x 104 pfu/ml.

4.2.2. Virusverwijdering

Door inwerking van de NanoCeram filter was er minstens 2,57 log [2,52; 2,63]

vermindering (=LOD) bij toevoeging van de neutralizer aan de stalen, onmiddellijk na

staalname.

FIGUUR 4.1.: VIRUSINACTIVATIE DOOR NANOCERAM FILTER (46,875 mg BIO-Ag0/m² FILTER)

IN FUNCTIE VAN HET BEDVOLUME (LOD MET NEUTRALIZER = -2,57 LOG [-2,63; -2,52]; LOD

ZONDER NEUTRALIZER = -2,98 LOG [-3,01; -2,95]).


29

Wanneer echter geen neutralizer werd toegevoegd, werd een 2,98 log [2,95; 3,01]

vermindering (=LOD) gevonden. De resultaten werden weergegeven vanaf het moment dat

steady state omstandigheden in de reactor bereikt werden (Figuur 4.1).

4.2.3. Zilverconcentratie

De zilverconcentratie in het effluent was maximaal bij de start van het experiment en

bedroeg 0,22 mg/L (Figuur 4.2). Na filtering van 2 L per liter reactor viel de concentratie

zilver onder de vooropgestelde drinkwaterlimiet van 0,1 mg/L.

FIGUUR 4.2.: ZILVERCONCENTRATIE IN HET EFFLUENT IN FUNCTIE VAN HET BEDVOLUME,

DOOR VRIJSTELLING UIT DE NANOCERAM FILTER (46,875 mg BIO-Ag0/m² FILTER), BEPAALD

VIA ICP-OES.


4.3.1. Doelstelling

Het effect van PVDF membranen met ingekapseld bio-Ag0 werd onderzocht in batch

experimenten en in een reactor opstelling.

4.3.2. Karakterisering membraan

De morfologie van het membraan en de lokalisatie van de zilvernanopartikels werd

bestudeerd met de SEM. Figuur 4.3 geeft de dwarsdoorsnede weer van het gehele

membraan. Analyse van het membraan met de SEM toonde aan dat de bovenlaag met bio-


30

Ag0 bovenaan microporeus was. Dit is de zogenaamde toplaag, met poriën van 60,9 tot

338,0 nm. Dichter naar de steunlaag toe, in de cellulaire laag, was de bovenlaag

macroporeus, aangezien de poriën enkele micrometers groot waren. Dit is duidelijk te zien in

Figuur 4.4.

FIGUUR 4.3.: DWARSDOORSNEDE VAN HET MEMBRAAN (2500 mg/m²), BEKEKEN MET SEM

IN DE BSE-MODUS.

FIGUUR 4.4.: DWARSDOORSNEDE VAN HET 2500 mg/m² MEMBRAAN, BEKEKEN MET SEM IN

DE SE-MODUS (SECUNDAIRE ELEKTRONEN). ENKEL DE PVDF BOVENLAAG IS TE ZIEN,

BESTAANDE UIT DE TOPLAAG DIE MICROPOREUS IS EN DE CELLULAIRE LAAG DIE

MACROPOREUS IS.

Met de SEM is het niet mogelijk om nanopartikels te zien, maar wel aggregaten op micro-

schaal. In Figuur 4.5. zijn enkele aggregaten van zilvernanopartikels te zien in de toplaag in

PVDF bovenlaag met bio-Ag0

Polyethyleen-polypropyleen

steunlaag

toplaag

cellulaire laag


31

de BSE (back scattered elektronen) modus. Via deze detectiemethode worden zware

metalen helder gezien. De aanwezigheid van zilver in deze aggregaten werd nagegaan via

EDX. Figuur 4.6 geeft de EDX weer van de porie in Figuur 4.5.

FIGUUR 4.5.: DWARSDOORSNEDE VAN HET 2500 mg/m² MEMBRAAN, BEKEKEN MET SEM IN

DE BSE-MODUS. ENKELE AGGREGATEN VAN ZILVERNANOPARTIKELS ZIJN AANGEDUID.

ENKEL DE BOVENLAAG MET BIO-Ag0 IS AFGEBEELD, MET EEN PORIE MEER IN DETAIL.

FIGUUR 4.6.: EDX, HOREND BIJ HET DETAIL VAN FIGUUR 4.5. OP DE X-AS IS DE ENERGIE

UITGEDRUKT IN keV, DE PIEKEN STELLEN RELATIEVE INTENSITEITEN VOOR.


32

Op het bovenoppervlak van het membraan werden slechts weinig aggregaten van de

zilvernanopartikels terug gevonden. Figuur 4.7 stelt het bovenoppervlak voor in de BSE-

modus. Heldere deeltjes en dus zware metalen werden niet terug gevonden. Een EDX van de

toplaag toonde aan dat er weinig zilver aanwezig was op de toplaag (niet weergegeven).

FIGUUR 4.7.: BOVENOPPERVLAK VAN HET MEMBRAAN (2500 mg/m²), BEKEKEN MET SEM IN

DE BSE-MODUS.

4.3.3. Batchtest

Om de desinfecterende eigenschappen van de PVDF membranen met ingekapseld bio-Ag0

te onderzoeken werd een batch experiment opgezet met de 3 volgende membranen: 250

mg bio-Ag0/m² (25,92 cm²), 2500 mg bio-Ag0/m² (2,592 cm²) en 2500 mg bio-Ag0/m² (25,92

cm²).

4.3.3.1. Virusverwijdering

Er is nagenoeg geen verschil in virusverwijdering door de 3 verschillende membranen die

werden gebruikt in de batchtest (Tabel 4.1). Beide membranen van 25,92 cm² groot

resulteerden in volledig dezelfde verwijdering, waarbij er na 2 uur minstens 4,26 log [4,17;

4,35] (= LOD) virusverwijdering was. Het membraan dat 2,592 cm² groot is, leidde tot

minstens 4,26 log [4,17; 4,35] verwijdering na 4 uur. De membranen met 250 mg/m² (25,92

cm²) en 2500 mg/m² (2,592 cm²) bevatten beiden 0,648 mg bio-Ag0. Het membraan met

2500 mg/m² (25,92 cm²) bevatte 6,48 mg bio-Ag0.


33

TABEL 4.1.: DE LOG VERWIJDERING VAN UZ1 BACTERIOFAGEN IN FUNCTIE VAN DE TIJD,

VOOR DE 3 MEMBRANEN (LOD= 4,26 LOG [4,17; 4,35] VERWIJDERING).

membraan 0 h 2 h 4 h 24 h

250 mg/m² 25,92 cm²

1,11 [1,03;1,20] > 4,26 [4,17;4,35] > 4,26 [4,17;4,35] > 4,26 [4,17;4,35]

2500 mg/m² 2,592 cm²

0,42 [0,33;0,54] 3,69 [3,33;3,69] > 4,26 [4,17;4,35] > 4,26 [4,17;4,35]

2500 mg/m² 25,92 cm²

1,19 [1,11;1,28] > 4,26 [4,17;4,35] > 4,26 [4,17;4,35] > 4,26 [4,17;4,35]

4.3.3.2. Zilverconcentratie

Zoals te zien is in Figuur 4.8 werd de hoogste concentratie zilver terug gevonden bij het

membraan met 2500 mg bio-Ag0/m² met een grootte van 25,92 cm². Het membraan met

2500 mg bio-Ag0/m² dat 2,592 cm² groot is stelde de minste hoeveelheid zilver vrij in

vergelijking met de andere twee membranen. Gemiddeld gezien verhouden de concentraties

van het vrijgesteld Ag+ bij het 250 mg/m² membraan (25,92 cm²), het 2500 mg/m²

membraan (2,592 cm²) en het 2500 mg/m² membraan (25,92 cm²) zich tussen 2 en 24 uur na

de start als 2,34: 1: 8,22, respectievelijk. Om tot deze verhouding te komen werd bij 2 en 24

uur de verhouding bepaald van de Ag+-concentraties tussen de verschillende membranen.

Van deze 2 waarden werd het gemiddelde bepaald en aan het membraan met de laagste

zilvervrijstelling werd de waarde 1 toegekend.

FIGUUR 4.8.: ZILVERVRIJSTELLING IN FUNCTIE VAN DE TIJD, IN DE BATCHTEST MET DE

VOLGENDE MEMBRANEN: MEMBRAAN MET 250 mg bio-Ag0/m² (25,92 cm²), MEMBRAAN

MET 2500 mg bio-Ag0/m², ZOWEL 2,592 cm² ALS 25,92 cm².


34

4.3.4. Single membrane unit for reusable filtrate

De membranen met 0, 250 en 2500 mg bio-Ag0/m² werden in de SMURF ingebouwd, om

de continue desinfectie van viraal gecontamineerd water onder invloed van deze

membranen te evalueren.


Na fixatie op een membraanhouder, werd het membraan met 250 mg bio-Ag0/m²

toegepast in de SMURF reactor. 30 L influent met een beginconcentratie van 8,85 x 104

pfu/mL werd met een debiet van 375 mL/uur gefilterd. Onmiddellijk na opstart van de

reactor was een vermindering van 1,43 log [1,10; 1,43] te zien, maar na 3 L/L was dit nog

slechts 0,20 log [-0,12; 0,20] (Figuur 4.9). Het verschil met het membraan zonder zilver (0

mg/m²) was gering. Tijdens de reactorrun (Cinf= 7,50 x 105 pfu/mL) was een gemiddelde

verwijdering van 0,57 log waar te nemen door dit membraan en dit was meer dan het

membraan met 250 mg/m². Het verschil was echter niet significant.

FIGUUR 4.9.: VIRUSINACTIVATIE DOOR HET 0 mg BIO-Ag0/m² EN 250 mg BIO-Ag0/m²

MEMBRAAN IN FUNCTIE VAN HET BEDVOLUME (LOD 0 mg/m² = -3,68 LOG [-3,91; -3,52] ;

LOD 250 mg/m² = -3,56 LOG [-3,56; -3,25]).

Vervolgens werd het membraan met 2500 mg bio-Ag0/m² toegepast in de reactor. De

initiële concentratie van de bacteriofagen in het influent bedroeg 3,14 x 104 pfu/ml.

Onmiddellijk na de opstart van de reactor werden geen fagen gedetecteerd, wat resulteerde

in minstens 2,37 log [2,13; 2,98] vermindering (=LOD) bij een debiet van 375 mL/uur. Na


35

verhogen van het debiet tot 9 L/uur bedroeg de virusverwijdering minstens 3,87 log [3,72;

4,10] (=LOD) na 0,33 L/L (Figuur 4.10).

FIGUUR 4.10.: VIRUSINACTIVATIE DOOR HET 2500 mg BIO-Ag0/m² MEMBRAAN IN FUNCTIE

VAN HET BEDVOLUME EN HET DEBIET (LOD HRT 1 DAG = -2,37 LOG [-2,98; -2,13]; LOD HRT 1

UUR = -3,87 LOG [-4,10; -3,72]).


Bij toepassing van het 250 mg bio-Ag0/m² membraan in de SMURF kon met de

zilverelektrode geen zilver gedetecteerd worden in de stalen van het effluent. De Ag+-

concentratie lag dus lager dan de LOD (0,01 mg/L). Bij de reactorrun met het membraan met

2500 mg bio-Ag0/m² en een debiet van 375 mL/uur, werd in de effluentstalen door middel

van ICP-OES een Ag+-concentratie gedetecteerd van maximum 0,27 mg/L bij de start van het

experiment. Bij een debiet van 9 L/h was het gehalte van Ag+ in de effluentstalen beduidend

hoger bij de opstart, met een concentratie van 2,38 mg/L (Figuur 4.11).


36

FIGUUR 4.11.: ZILVERCONCENTRATIE IN HET EFFLUENT IN FUNCTIE VAN HET BEDVOLUME

EN HET DEBIET, DOOR VRIJSTELLING UIT HET MEMBRAAN (2500 mg BIO-Ag0/m²), BEPAALD

VIA ICP-OES.

4.4. BATCHTEST AG+

Deze test heeft als doel de contacttijd na te gaan die nodig is voor 4 log verwijdering in

functie van de concentratie Ag+. In Tabel 4.2 is de log verwijdering van de UZ1 bacteriofagen

uitgedrukt in functie van de Ag+-concentratie en de inwerkingstijd van de zilverionen in

gedestilleerd water. De log verwijderingen aangeduid in het rood benaderen het streefdoel

van 4 log verwijdering. Na 1 uur resulteert 5,4 mg Ag+/L reeds in 3,91 log [3,00; 4,18]

verwijdering. Na 3 uur is er 4,01 log [3,77; 4,16] verwijdering bij een concentratie van 1

mg/L. Concentraties lager dan 1 mg/L leiden niet tot een 4 log daling van de

faagconcentratie binnen de 24 uur. Bij gebruik van Spa als matrix was er geen verwijdering

van de UZ1 bacteriofagen (resultaten niet weergegeven).

TABEL 4.2.: DE LOG VERWIJDERING VAN UZ1 BACTERIOFAGEN IN FUNCTIE VAN DE Ag+-

CONCENTRATIE EN DE INWERKINGSTIJD VAN Ag+ IN GEDESTILLEERD WATER.

0 h 0,5 h 1 h 2 h 3 h 4 h 24 h

5,4 mg/L -0,29

[-0,35;-0,23] NB

3,91 [3,00;4,18]

NB NB NB NB

1 mg/L 0,00

[-0,28;0,17] 0,44

[0,25;0,57] NB

1,59 [1,40;1,72]

4,01 [3,77;4,16]

4,99 [4,81;5,11]

3,49 [3,07;3,70]

0,1 mg/L 0,00

[-0,30;0,18] - 0,07

[-0,26;0,07] NB

- 1,45 [-1,66;-1,31]

- 0,79 [-0,99;-0,66]

0,93 [0,71;1,07]

- 1,45 [-1,67;-0,31]

0,05 mg/L - 0,01

[-0,08;0,05] NB NB NB NB NB

0,30 [0,23;0,36]

0,01 mg/L - 0,01

[-0,08;0,05] NB NB NB NB NB 0,00

0 mg/L 0,00

[-0,09;0,08] NB NB NB NB NB 0,00

NB: niet bepaald.


37


4.5.1. Doelstelling

Bij deze test werd geprobeerd om biogeen zilver op zeoliet vast te zetten om zo continue

desinfectie van viraal gecontamineerd water mogelijk te maken.

4.5.2. Batchtest

Zeoliet met en zonder bio-Ag0 werd toegevoegd aan 100 mL Spa dat 8,85 x 105 pfu/mL

bevatte. De batchtest met zeoliet toonde aan dat er geen virusverwijdering is door het

zeoliet zelf. Bij 1-2,5 mm zeoliet met 2,5 wt% bio-Ag0 werd na 24 uur minstens 2,68 log

[2,53; 2,90] vermindering gezien (=LOD) en bij 2,5-5 mm zeoliet met 2,5 wt% bio-Ag0 werd

een log vermindering van minimum 3,49 [3,18; 3,50] teruggevonden (=LOD). De resultaten

van de test met zeoliet alleen en met zeoliet waarop bio-Ag0 zit, zijn te vinden in Figuur 4.12.

FIGUUR 4.12.: VIRUSINACTIVATIE DOOR DE 2 SOORTEN ZEOLIET (1-2,5 mm EN 2,5-5 mm) IN

BATCHTEST, IN FUNCTIE VAN DE TIJD, ZOWEL MET ALS ZONDER BIO-Ag0 OP GEADSORBEERD

(LOD ZEOLIET 1-2,5 mm = -2,80 [-3,02; -2,66]; LOD ZEOLIET 2,5-5 mm = -3,62 LOG [-3,62; -

3,30]; LOD BIO-Ag0 + ZEOLIET 1-2,5 mm = -2,68 LOG [-2,90; -2,53]; LOD BIO-Ag0 + ZEOLIET 2,5

– 5 mm = -3,49 LOG [-3,50; -3,18]).

4.5.3. Opstroom vast bed filter

Doorheen de reactor met enkel zeoliet werd 9 L influent gestuurd dat 9,63 x 105 pfu/mL

bevatte, met een debiet van 125 mL/uur. Het influent van de reactor met zeoliet en 2,5 wt%


38

bio-Ag0 bevatte dezelfde hoeveelheid fagen. In eerste inst antie was het debiet 125 mL/uur

en werd 12 L doorheen de reactor gestuurd. De test werd herhaald met 9 L influent bij een

debiet van 500 mL/uur.


In de reactor was er geen virusinactivatie door het zeoliet zelf, zoals te zien is in Figuur

4.13. Bij de reactor met zeoliet en 2,5 wt% bio-Ag0 bedroeg het debiet bij de start 125

mL/uur en was de virusinactivatie onregelmatig (Figuur 4.14). Na verhoging van het debiet

tot 500 mL/uur steeg de virusverwijdering tot minstens 4,19 log [4,08; 4,35] (= LOD) (Figuur

4.15).

FIGUUR 4.13.: VIRUSINACTIVATIE DOOR ZEOLIET (2,5-5 mm) IN DE OPSTROOM VAST BED

FILTER (LOD = -2,69 LOG [-2,90; -2,54]).

FIGUUR 4.14.: VIRUSINACTIVATIE DOOR DE OPSTROOM VAST BED FILTER MET ZEOLIET (2,5 –

5 mm) EN BIOGEEN ZILVER (25 mg BIO-Ag0/g ZEOLIET) IN FUNCTIE VAN HET BEDVOLUME.

HET DEBIET BEDROEG 125 mL/uur (LOD = -4,19 LOG [-4,35; -4,08]).


39

FIGUUR 4.15.: VIRUSINACTIVATIE DOOR DE OPSTROOM VAST BED FILTER MET ZEOLIET (2,5 -

5 mm) EN BIOGEEN ZILVER (25 mg BIO-Ag0/g ZEOLIET) IN FUNCTIE VAN HET BEDVOLUME.

HET DEBIET BEDROEG 500 mL/uur (LOD = -4,19 LOG [-4,35; -4,08]).


De zilverionen kwamen in hoge concentratie voor in het effluent. Onmiddellijk na de start

bedroeg de concentratie reeds 39,4 mg Ag+/L (Figuur 4.16). Na 2481,25 L/L filteren bedroeg

de concentratie Ag+ 0,91 mg/L, wat dus nog ruim boven de drinkwaterlimiet van 0,1 mg/L

lag. Naar het einde van de metingen steeg de concentratie Ag+ nog matig.

FIGUUR 4.16.: ZILVERCONCENTRATIE IN HET EFFLUENT IN FUNCTIE VAN HET BEDVOLUME,

DOOR VRIJSTELLING VAN HET ZEOLIET (25 mg BIO-Ag0/g ZEOLIET; 2,5-5 mm ZEOLIET).

Hoofdstuk 5: Discussie

40

5. DISCUSSIE

Om de continue desinfectie van viraal gecontamineerd water met biogeen zilver te

onderzoeken werd het biogeen zilver op 3 manieren vastgelegd, namelijk op een filter, in

een membraan en op zeoliet.


De Gusseme et al. (2010) gebruikten de NanoCeram filter reeds voor de continue

desinfectie van water, dat gecontamineerd was met UZ1 bacteriofagen. De filter was in staat

tot een virusverwijdering van 1,5 log, wat kon verklaard worden door het feit dat de positief

geladen filter de negatief geladen virussen kon binden. Door vervolgens 10 mg bio-Ag0 aan

te brengen op de filter nam de virusverwijdering toe tot 3,8 log. Bij deze test werd echter

geen neutralizer toegevoegd, met het gevolg dat de contacttijd tussen de virussen en het

vrijgekomen Ag+ verlengd werd. De NanoCeram filter die gebruikt werd door De Gusseme et

al. (2010) stelde bijna geen Ag+ vrij. Na filtering van 2,4 L/L lag de Ag+-concentratie immers

lager dan 3 µg/L. De sterke retentie van het nanozilver werd onder andere verklaard door

interactie tussen het AlOOH, aanwezig in de filter en de carbonzuren, aanwezig op het

oppervlak van L. fermentum waarop het zilver gebonden zit (Landry et al., 1995). Daarnaast

is er ook de elektrostatische aantrekking tussen de positief geladen filter en de negatief

geladen bacteriën. Men verklaarde de goede retentie eveneens doordat het nanozilver

gebonden zat op een bacteriematrix van maximaal enkele micrometers groot, die goed werd

vastgehouden door de microporeuze filter.

In deze scriptie werd het experiment herhaald om nawerking van Ag+ uit te sluiten.

Hiertoe werd een filter waarop 15 mg bio-Ag0 gebonden zat, gebruikt en werden stalen

genomen zowel met als zonder toevoeging van de neutralizer

(natriumthiosulfaat/natriumthioglycolaat). De virusinactivatie bij de stalen zonder

toevoeging van de neutralizer was tijdens de volledige reactorrun groter dan bij de stalen

met neutralizer (Figuur 4.1). Hoewel dit verschil klein was, was er toch duidelijk nawerking

van Ag+. Dit heeft als gevolg dat de 3,8 log vermindering, gezien door De Gusseme et al., een

overschatting was van het effect van de NanoCeram met zilver. Deze overschatting kon

echter niet groot zijn, aangezien slechts een minimale hoeveelheid Ag+ in de effluentstalen

werd teruggevonden.


41

De grotere hoeveelheid bio-Ag0 op de filter (15 mg), vergeleken met de filter gebruikt

door De Gusseme et al. (2010) (10 mg), verklaart mogelijks de grotere concentratie Ag+ in

het effluent. De filter met 10 mg bio-Ag0 stelde bij een bedvolume van 2,4 L/L minder dan

3 µg Ag+/L vrij, terwijl de concentratie 86 µg/L bedroeg bij gebruik van de filter met 15 mg

bio-Ag0. Het zou mogelijk kunnen zijn dat de filter verzadigd was met bio-Ag0 en dat de

overmaat aan bio-Ag0 vrijkwam in het water, waarvan een deel onder de vorm van Ag+. In de

toekomst moet dus zeker rekening gehouden worden met de hoeveelheid bio-Ag0 die

aangebracht wordt op de filter, om de drinkwaterlimiet van zilver van 0,1 mg/L niet te

overschrijden. Uit de resultaten blijkt dat de Ag+-concentratie na filtering van 2 L/L terugvalt

onder die limiet. De zilverconcentratie is dus enkel te hoog bij de start van het filteren. Zo

nodig moet de filter dus een voorbehandeling krijgen, waarbij water doorheen de filter

gestuurd wordt en het effluent opgevangen wordt. Vanaf het moment dat de concentratie

van Ag+ lager is dan 0,1 mg/L kan de voorbehandeling stop worden gezet en kan gestart

worden met het filteren van het gecontamineerde (afval)water.

Omwille van de lage concentratie Ag+ in het effluent, kan de 3,8 log verwijdering gezien

door De Gusseme et al. (2010), niet te wijten zijn aan het vrijgestelde Ag+ en zou het biogeen

zilver dat op de filter zit dus verantwoordelijk moeten zijn voor de virusinactivatie. Dit werd

bevestigd door het nieuwe experiment. Toen de concentratie van Ag+ 0,01 mg/L bedroeg,

was de concentratie van de UZ1 bacteriofagen gedaald met minstens 2,57 log. Rekening

houdend met de 1,5 log verwijdering door het filtermateriaal zelf, is er dus nog 1,07 log

extra verwijdering, die onmogelijk te wijten kan zijn aan 0,01 mg Ag+/L, zoals blijkt uit Tabel

4.2. Algemeen kan worden gesteld dat de virusverwijdering toenam in functie van de tijd,

terwijl de Ag+-concentratie in het effluent daalde tot te lage waarden voor virusinactivatie.

In de toekomst moet gezocht worden naar aanpassingen van de NanoCeram filter, zodat

de filtratie resulteert in een 4 log daling van de virusconcentratie. Hiertoe moet de optimale

dosis aan bio-Ag0 bepaald worden voor de filter. Bovendien moet hierbij onderzocht worden

welke contacttijd nodig is voor de optimale virusinactivatie. Daarnaast moet ook de

antivirale werking op lange termijn onderzocht worden. Om de locatie van het bio-Ag0 te

bestuderen en zo meer inzicht te krijgen in de opbouw van de filter zou deze onderzocht

kunnen worden met SEM.


42


5.2.1. Virusinactivatie door membranen in batchtest

De batchtest met de 3 membranen toont aan dat de PVDF membranen met bio-Ag0

antivirale eigenschappen hebben (-4,26 log). Hoewel het membraan met 250 mg bio-Ag0/m²

(25,92 cm²) en het membraan met 2500 mg bio-Ag0/m² (2,592 cm²) dezelfde absolute

hoeveelheid bio-Ag0 bevatten (0,648 mg) resulteerden ze in een verschillende

virusinactivatie en Ag+-vrijstelling. Het groter oppervlak bleek immers meer Ag+ vrij te

stellen, wat vermoedelijk de reden was voor de grotere virusverwijdering. Toch is de door de

membranen vrijgestelde concentratie Ag+ (Figuur 4.8) kleiner dan de minimale concentratie

nodig voor 4 log verwijdering in minstens 4 uur (= bijna 1 mg/L, zoals weergegeven in Tabel

4.2). Naast de inwerking van Ag+, is het dus mogelijk dat direct contact tussen de fagen en

het bio-Ag0 aan het oppervlak en in de poriën van de membranen de virusinactivatie

versterkt. Dit kan wederom in verband gebracht worden met de oppervlakte van de

membranen, aangezien het kleinste membraan (2500 mg bio-Ag0/m², 2,592 cm²) later dan

het 250 mg bio-Ag0/m² membraan (25,92 cm²) 4,26 log vermindering veroorzaakte. Dit is

niet te wijten aan sorptie van de fagen op de membranen, aangezien een PVDF membraan

zelf geen virussen verwijdert of adsorbeert. Dit blijkt uit het reactor experiment met het

membraan met 0 mg bio-Ag0. Dit zou dus betekenen dat het bio-Ag0 aan het oppervlak en in

de poriën van de membranen mee instaat tot de virusinactivatie.

5.2.2. Virusinactivatie door continue desinfectie met de SMURF

Ter controle werd de virusinactivatie door het PVDF membraan zelf nagegaan. Bij een

HRT van 1 dag bleek het membraan geen desinfecterende werking te hebben. Dit wordt

verklaard door het feit dat net als de fagen het membraan negatief is geladen, zoals blijkt uit

de negatieve zètapotentiaal, bepaald door het meten van de doorstroompotentiaal (ir. Bart

De Gusseme, LabMET Universiteit Gent, 2010, persoonlijke communicatie). De

virusinactivatie en zilvervrijstelling door het 250 mg bio-Ag0/m² membraan waren gering.

Toepassing van het 2500 mg bio-Ag0/m² membraan bij een flux van 72,5 L/m²uur (= Q/

oppervlak membraan) resulteerde wel in een duidelijke virusverwijdering van minstens

3,87 log. Deze flux is nog groter dan de flux die verwacht mag worden van microporeuze

Kubota plaatmembranen (20,8 L/m²uur) (De Gusseme et al., 2009). Bovendien was de Ag+-


43

concentratie in het effluent bij de start hoog genoeg (2,38 mg/L) om invloed te hebben op

de virusinactivatie. Maar zoals blijkt uit Tabel 4.2 kan het vrijgestelde Ag+ alleen niet leiden

tot 3,87 log verwijdering bij een contacttijd van amper 1 uur (=HRT). Bovendien was de log

verwijdering nooit kleiner dan 3,30, ook wanneer de concentratie Ag+ in het filtraat al

minder dan 0,1 mg/L bedroeg. Dit zou er dus kunnen op wijzen dat de zilvernanopartikels die

in het membraan zitten zelf ook bacteriofagen afdoden, zoals eerder ook bleek uit het batch

experiment. Chemisch aangemaakte zilvernanopartikels hebben een bewezen antivirale

werking, dit was gebaseerd op het verhinderen van de adhesie van het virus op een

gastheercel (Elechiguerra et al., 2005; Rogers et al., 2008). Bij dit experiment is dit echter

uitgesloten, aangezien de zilvernanopartikels vastliggen in het PVDF membraan.

5.2.3. Ag+-vrijstelling uit het PVDF membraan met bio-Ag0

De vrijstelling van Ag+ wordt toch verondersteld als het belangrijkste antivirale

werkingsmechanisme van deze membranen. De gevonden concentratie van Ag+ kan immers

lager zijn dan de werkelijke vrijgestelde hoeveelheid zilver. Een deel van het Ag+ kan namelijk

binden met thiolfuncties van eiwitten of fosfaatgroepen van nucleïnezuren van de fagen,

waardoor dit gebonden zilver niet wordt meebepaald, terwijl het wel een antivirale werking

uitvoert. Het Ag+ dat neerslaat met Cl-, aanwezig in Spa en het LB medium van de faagstock,

wordt niet mee bepaald, terwijl Ag+ dat complexeert met Cl- maar wel in oplossing is wel

wordt bepaald. Bovendien is het mogelijk dat de Ag+-concentratie lokaal hoger is ter hoogte

van het membraan. De werkelijke hoeveelheid Ag+ die inwerkt op de bacteriofagen is dus

mogelijks groter dan de concentratie bepaald via ICP-OES. Dit blijkt eveneens uit de

batchtest met Ag+, waar slechts 0,77 mg Ag+/L teruggevonden werd, terwijl er 1 mg Ag+/L

werd toegevoegd aan Spa. Spa bevat 5 mg/L Cl-, dus het oplosbaarheidsproduct is gelijk aan

1,31 x 10-9, wat groter is dan de Ks van AgCl (1,56 x 10-10). De matrix heeft dus invloed op de

Ag+-concentratie. Dit sluit echter nog niet uit dat de zilvernanopartikels die ingebed zitten in

het membraan ook hun aandeel kunnen hebben in de virusverwijdering, net als de vorming

van reactieve zuurstofradicalen. Dit zou in de toekomst kunnen nagegaan worden door RZR

te detecteren via fluorescentie-analyse (Crow, 1997).

De controle van de Ag+ vrijstelling is van essentieel belang, gezien de drinkwaterlimiet

0,1 mg/L bedraagt. Daarnaast is een gecontroleerde vrijstelling ook vanuit economisch

standpunt van belang, aangezien de vrijstelling van Ag+ rechtstreeks in verband staat met de


44

levensduur van de membranen. Als Ag+ snel zou vrijgesteld worden uit het membraan, zou

de antivirale werking snel afnemen en zou het membraan snel aan vervanging toe zijn. Dit

blijkt ook zo te zijn in de praktijk. Volgens Zodrow et al. (2008) nam de antivirale eigenschap

van het polysulfon membraan met ingebedde zilvernanopartikels snel af, toen de vrijstelling

van Ag+ uit het oppervlak van het membraan stopte. Hoewel het membraan nog 90 % van de

beginconcentratie aan zilvernanopartikels bevatte, was de antivirale werking van het

membraan sterk gereduceerd. Dit was bovendien het bewijs dat de vrijstelling van Ag+ aan

de basis lag van de virusinactivatie. De antibacteriële werking van een cellulose acetaat

membraan met zilver nam ook af na verlies van zilver uit het membraan (Chou et al., 2005).

Het voordeel van het PVDF membraan met de gesproeidroogde zilvernanopartikels is dat

de partikels ook te vinden zijn in de poriën van het membraan en minder aan het oppervlak

van de toplaag, wat bij Zodrow et al. het geval was. Volgens Hennebel et al. (2010) waren de

biogene Pd-partikels enkel te vinden in de toplaag van hun PVDF membranen. In deze

scriptie werden de membranen echter op een licht gewijzigde manier aangemaakt,

aangezien het polymeermengsel gesoniceerd werd vooraleer het uitgegoten werd op de

polyethyleen-polypropyleen steunlaag. Dit kan de gewijzigde verspreiding van de

nanopartikels verklaren. De homogene spreiding van de zilvernanopartikels in de toplaag

ondersteunt de hypothese dat ook de zilvernanopartikels in het membraan een aandeel

hebben in de virusinactivatie. Zo zou er ook minder verlies zijn van Ag+ dan bij het polysulfon

membraan gebruikt door Zodrow et al., waar de partikels vooral aan het oppervlak terug te

vinden waren. Dit zou betekenen dat de levensduur van het membraan niet volledig

afhankelijk is van de Ag+-vrijstelling. Ook de bacteriematrix, waarop de zilvernanopartikels

vastzitten, draagt bij tot retentie van de nanodeeltjes. Zo wordt het verlies van nanodeeltjes

uit het membraan beperkt. Economisch is dit meegenomen, maar daarnaast is het ook

belangrijk dat nanodeeltjes niet terecht komen in het effluent, aangezien hun gevaar voor de

mens en het milieu nog niet achterhaald is.

Naast de virusinactivatie heeft de vrijstelling van Ag+ uit het membraan nog een

bijkomend voordeel. Zodrow et al. (2008) toonden aan dat door de vrijstelling van Ag+ uit

het membraan de vorming van een biofilm op het membraan werd voorkomen. De vorming

van een biofilm heeft het voordeel dat het bijdraagt tot de virusinactivatie, maar

tegelijkertijd heeft het ook zijn nadelen (Wu et al., 2009). De biofilm leidt tot verstopping

van het membraan en dus hogere energiekosten om water te filteren. Bovendien moet het


45

membraan vaak gereinigd worden en zo heeft deze een kortere levensduur (Zodrow et al.,

2009). Door vrijstelling van Ag+ zijn deze aspecten dus niet van toepassing op het PVDF

membraan, terwijl een goede virusverwijdering toch kan worden gewaarborgd.

Aangezien Ag+ in de effluentstalen meteen geneutraliseerd werd, is de virusinactivatie

volledig te wijten aan de werking van de reactor en niet aan nawerking van Ag+. Dit heeft als

gevolg dat de verblijftijd van het water in de reactor invloed heeft op de virusverwijdering.

Bij het experiment met het membraan met 2500 mg bio-Ag0/m² en een debiet van 9 L/uur

duurde de reactorrun slechts 1 uur, wat resulteerde in een afname van de faagconcentratie

met 3,87 log, terwijl de Ag+-concentratie minstens 0,1 mg/L bedroeg . Bij het debiet van 375

mL/uur daalde de faagconcentratie met minstens 2,37 log, terwijl de Ag+-concentratie niet

lager zakte dan 0,02 mg/L. De levensduur en dus de werkzaamheid van het membraan op

lange termijn is een belangrijk aspect dat in de toekomst zeker onderzocht moet worden. Er

moet ook gezocht worden naar de optimale combinatie van de Ag+-concentratie en de

hydraulische retentietijd, zodat dit kan resulteren in een efficiënte virusverwijdering.

Bij de start van dit experiment bedroeg de Ag+-concentratie 2,38 mg/L. Aangezien dit

gehalte hoger ligt dan de toegelaten 0,1 mg/L is een voorbehandeling van het membraan

nodig, zoals beschreven bij de NanoCeram filter, of moet het Ag+ verwijderd worden uit het

effluent met bijvoorbeeld een kationuitwisselaar. Deze laatste oplossing geniet de voorkeur,

aangezien uit het experiment blijkt dat bij een daling van de Ag+-concentratie onder 0,1

mg/L, ook de virusverwijdering afneemt. Indien geopteerd wordt voor de voorbehandeling

van het membraan, zou pas gestart worden met het filteren van het gecontamineerd

(afval)water wanneer de Ag+-concentratie voldoende gezakt is.


Omdat zeoliet een kationuitwisselaar is en een groot specifiek oppervlak heeft, werd

geprobeerd het biogeen zilver vast te zetten op zeoliet. In tegenstelling tot de NanoCeram

filter adsorbeert het zeoliet zelf geen bacteriofagen. Dit is eenvoudig te verklaren, aangezien

zowel het zeoliet als de fagen in het water een negatieve lading dragen. Uit de batchtest

bleek dat de virusverwijdering, na aanbrengen van bio-Ag0, groter was bij het zeoliet met

een diameter van 2,5 tot 5 mm dan bij het zeoliet met de kleinere diameter. Het

buitenoppervlak van dit zeoliet is kleiner dan van het zeoliet met kleinere diameter. Dit kan

er op wijzen dat niet het buitenoppervlak van belang is, maar wel de poriëngrootte van het


46

zeoliet, die mogelijks groter is bij het zeoliet met de grotere diameter. Omwille van deze

reden werd in de opstroom vast bed filter het zeoliet gebruikt met de grootste diameter.

Terwijl hoge Ag+-concentraties in het effluent werden teruggevonden, bleek de

virusverwijdering bij een debiet van 125 mL/uur (HRT= 20 min) te fluctueren rond 2 log, met

een maximale verwijdering van 3,07 log. Hoge Ag+-concentraties werden teruggevonden in

het filtraat, met de hoogste Ag+-concentratie van 39,4 mg/L. Deze hoge Ag+ vrijstelling kan

mogelijks worden gerelateerd aan het hoge debiet en de bijgevolg grote schuifkracht aan het

oppervlak van het zeoliet. Ondanks deze hoge gehalten aan Ag+, bleek een contacttijd van 20

min toch onvoldoende voor een 4 log verwijdering. Om de verblijftijd nog te verkorten, werd

het debiet verhoogt tot 500 mL/uur, wat resulteerde in een HRT van 5 minuten. Omwille van

de kortere contacttijd werd verwacht dat de virusverwijdering minder efficiënt zou verlopen.

Het tegengestelde was waar, aangezien de concentratie van de UZ1 bacteriofagen daalde

met minstens 4,19 log, terwijl de Ag+-concentratie in het effluent nauwelijks veranderde. Het

is mogelijk dat de productie van reactieve zuurstofradicalen de virusinactivatie versterkte

want er werden luchtbellen waargenomen die ontsnapten uit de opstroom vast bed filter.

Tussen de laatste meting bij het debiet van 125 mL/uur en de eerste meting bij het debiet

van 500 mL/uur werd de reactor stilgelegd. In deze periode konden dus veel RZR gevormd

worden onder invloed van het Ag+ dat nog in de reactor aanwezig was. Misschien kan dit de

toename in virusverwijdering verklaren na opstart bij het hogere debiet. In de toekomst zou

de vorming van RZR gedetecteerd kunnen worden via fluorescentie-analyse (Crow, 1997).

De opstroom vast bed filter (HRT = 20 min) resulteerde niet in de gehoopte 4 log daling

van de faagconcentratie, ondanks de hoge Ag+-concentratie in het effluent. Mogelijks was

het verlies aan zilverionen uit de vast bed filter te groot, waardoor de hoeveelheid zilver in

het filterbed te klein werd om de virale vector in het water af te doden. Bovendien was de

contacttijd tussen het zilver en de fagen te kort. Er zou dus gezocht moeten worden naar

een manier om het bio-Ag0 beter vast te hechten op het zeoliet, zodat voldaan wordt aan de

drinkwaterlimiet van 0,1 mg Ag+/L en het verlies van nanopartikels in het effluent zo beperkt

mogelijk is. Een mogelijke piste is om eerst L. fermentum op te kweken op het zeoliet en pas

daarna het zilver-diamine complex toe te voegen, bij pH 11,5. Een andere mogelijkheid

omvat het toevoegen van polyvinylamine actieve kool (positief geladen) (Pelton & Hong,

2002) aan het zeoliet vooraleer het biogeen zilver toe te voegen. Zo zal L. fermentum onder

invloed van elektrostatische krachten binden met het positief geladen actieve kool.

Hoofdstuk 6: Conclusie

47

6. CONCLUSIE

In het kader van deze scriptie werd onderzocht of biogeen zilver kan worden gebruikt

voor de continue desinfectie van viraal gecontamineerd water. Hiervoor werden UZ1

bacteriofagen gebruikt als modelorganisme voor enterische virussen. Het biogeen zilver

werd op 3 manieren vastgelegd, met als doel een continue virusverwijdering en tegelijkertijd

een beperkt verlies van nanopartikels en zilverionen in het filtraat.

In eerste instantie werd het biogeen zilver verankerd op een NanoCeram filter. Uit de

resultaten bleek er nawerking te zijn van het Ag+, vrijgesteld door biogeen zilver. Gezien de

lage Ag+-concentratie moeten echter ook de biogene zilvernanopartikels in de filter zelf een

aandeel hebben gehad in de virusverwijdering.

In een tweede fase werd het biogeen zilver ingebed in PVDF membranen, die toegepast

werden in een membraanreactor (de SMURF). Gebruik van het membraan met 2500 mg bio-

Ag0/m² leidde tot een goede desinfectie bij een flux van 72,5 L/m²uur en een HRT van 1 uur.

De concentratie van UZ1 bacteriofagen daalde met minstens 3,87 log. De vrijstelling van Ag+

uit het membraan werd verondersteld als het belangrijkste antivirale werkingsmechanisme,

maar de zilvernanopartikels die ingebed zaten in het membraan en de vorming van reactieve

zuurstofradicalen hebben mogelijks de virusinactivatie versterkt. De vrijstelling van Ag+

droeg tevens bij tot het voorkomen van biofilmvorming. Verder onderzoek dient echter

verricht te worden om de duurzaamheid van deze reactortechnologie op lange termijn te

kennen.

Tot slot werden biogene zilvernanopartikels vastgelegd op zeoliet, wat werd gebruikt als

vast bed in een opstroomkolom. Dit resulteerde evenwel niet in een efficiënte of veilige

desinfectie. De concentratie van Ag+ was tijdens het experiment nooit lager dan de

drinkwaterlimiet van 0,1 mg/L, zonder te resulteren in de verwachte virusverwijdering. Dit

kon te wijten zijn aan de korte HRT van 20 minuten. Na verkorting van de HRT tot slechts 5

minuten bleek de virusverwijdering tegenstrijdig genoeg toe te nemen tot 4,19 log. Dit kon

mogelijks verklaard worden door vorming van RZR tijdens de stillegging van de reactor

gedurende enkele dagen, waardoor dit bij opstart de virusinactivatie versterkte. Dit kan een

veel belovende manier zijn van desinfectie, als een manier gevonden wordt om de

zilvervrijstelling te beperken.

Hoofdstuk 6: Conclusie

48

Uit dit onderzoek bleken zowel de Ag+-concentratie als de contacttijd (HRT) van belang te

zijn voor de virusverwijdering. In de toekomst moet dan ook gezocht worden naar de

optimale combinatie van beide met een gecontroleerde Ag+ vrijstelling onder de

drinkwaterlimiet. Het zou bovendien interessant zijn om de werkelijke hoeveelheid van

zilverionen te kennen, die kan inwerken op de virussen. Deze scriptie draagt ook de

uitnodiging met zich mee naar verdere exploratie van het juiste antivirale

werkingsmechanisme van (biogene) zilvernanopartikels. De efficiëntie tegen verschillende

soorten humane virussen (norwalkvirus, norovirus, adenovirus, rotavirus, hepatitis A en E)

dient verder geëvalueerd te worden, rekening houdend met de matrix. Na verder onderzoek

kan de toepassing van biogene zilvernanopartikels een innovatieve techniek zijn voor de

veilige productie van drinkwater.

Hoofdstuk 7: Literatuurlijst

49

7. LITERATUURLIJST

http://www.lenntech.com/processes/disinfection/chemical/disinfectants-copper-silver-

ionization.htm. (6/03/2010)

http://www.newpharma.be/upload/img/medecines/0042150-nl-500.jpg. (20/04/2010)

http://www.who.int/water_sanitation_health/publications/facts2004/en/index.html.

(8/03/2010)

http://www.aquafin.be/nl/indexb.php?n=9&e=43&s=48. (17/03/2010)

http://www.drinking-water.org/html/en/Treatment/Coagulation-Flocculation-

technologies.html#tech0. (18/03/2010)

http://www.webanstrich.de/rosemary/silverfraud.html. (20/04/2010)

http://home.fnv.nl/02werkgeld/arbo/themas/gevaarlijke-stoffen/Nanotechnologie.htm.

(14/04/2010)

http://www.vacature.com/scripts/Actueel/displayarticle.asp?ID=9650&artCount=7&startPos

=1&artsLoaded=1. (14/04/2010)

http://www.trosradar.nl/index.php?id=nieuws_detail&tx_ttnews[tt_news]=27921&cHash=2

7921142. (15/04/2010)

http://www.bondbeterleefmilieu.be/page.php/30/412/11030. (16/04/2010)

ftp://ftp.cordis.europa.eu/pub/fp7/docs/nanocode-recommendation.pdf. (16/04/2010)

http://www.zeomic.co.jp/english/04_01_zeomic.html. (16/04/2010)

Adams, M. H. (1959). Bacteriophages. Interscience, New York, USA, 450.

Atiyeh, B. S.; Costagliola, M.; Hayek, S. N.; Dibo, S. A. (2007). Effect of silver on burn wound

infection control and healing: Review of the literature. Burns, 33(2), 139-148.

Balayan, M. S. (1997). Epidemiology of hepatitis E virus infection. Journal of Viral Hepatitis,

4(3), 155-165.

Boccia, D.; Tozzi, A. E.; Cotter, B.; Rizzo, C.; Russo, T.; Buttinelli, G.; Caprioli, A.; Marziano, M.

L.; Ruggeri, F. M. (2002). Waterborne outbreak of Norwalk-like virus gastroenteritis at a

tourist resort, Italy. Emerging Infectious Diseases, 8(6), 563-568.

Boussu, K.; Vandecasteele, C.; Van der Bruggen, B. (2006). Study of the characteristics and

the performance of self-made nanoporous polyethersulfone membranes. Polymer,

47(10), 3464-3476.



http://www.newpharma.be/upload/img/medecines/0042150-nl-500.jpg

http://www.who.int/water_sanitation_health/publications/facts2004/en/index.html

http://www.aquafin.be/nl/indexb.php?n=9&e=43&s=48

http://www.drinking-water.org/html/en/Treatment/Coagulation-Flocculation-technologies.html#tech0

http://www.drinking-water.org/html/en/Treatment/Coagulation-Flocculation-technologies.html#tech0

http://home.fnv.nl/02werkgeld/arbo/themas/gevaarlijke-stoffen/Nanotechnologie.htm

http://www.vacature.com/scripts/Actueel/displayarticle.asp?ID=9650&artCount=7&startPos=1&artsLoaded=1

http://www.vacature.com/scripts/Actueel/displayarticle.asp?ID=9650&artCount=7&startPos=1&artsLoaded=1

http://www.bondbeterleefmilieu.be/page.php/30/412/11030

ftp://ftp.cordis.europa.eu/pub/fp7/docs/nanocode-recommendation.pdf

http://www.zeomic.co.jp/english/04_01_zeomic.html


50

Cao, L.; Chan, K. M.; Chen, D. L.; Vanittanakom, N.; Lee, C.; Chan, C. M.; Sirisanthana, T.;

Tsang, D. N. C.; Yuen, K. Y. (1999). Detection of cell wall mannoprotein Mp1p in culture

supernatants of Penicillium marneffei and in sera of penicilliosis patients. Journal of

Clinical Microbiology, 37(4), 981-986.

Chang, Q. Y.; He, H.; Ma, Z. C. (2008). Efficient disinfection of Escherichia coli in water by

silver loaded alumina. Journal of Inorganic Biochemistry, 102(9), 1736-1742.

Chopra, I. (2007). The increasing use of silver-based products as antimicrobial agents: a

useful development or a cause for concern? Journal of Antimicrobial Chemotherapy,

59(4), 587-590.

Chou, W. L.; Yu, D. G.; Yang, M. C. (2005). The preparation and characterization of silver-

loading cellulose acetate hollow fiber membrane for water treatment. Polymers for

Advanced Technologies, 16(8), 600-607.

Christiaens, T.; De Loof, G.; Maloteaux, J. M. (2010a). Sulfamiden. J.M.Maloteaux, Les Bons

Villers, Begië, 421.

Christiaens, T.; De Loof, G.; Maloteaux, J. M. (2010b). Zilververbanden. J.M.Maloteaux, Les

Bons Villers, België, 456.

Cramer, E. H.; Blanton, C. J.; Blanton, L. H.; Vaughan, G. H.; Bopp, C. A.; Forney, D. L.; Vessel

Sanitation Program, E. (2006). Epidemiology of gastroenteritis on cruise ships, 2001-2004.

American Journal of Preventive Medicine, 30(3), 252-257.

Crow, J. P. (1997). Dichlorodihydrofluorescein and dihydrorhodamine 123 are sensitive

indicators of peroxynitrite in vitro: Implications for intracellular measurement of reactive

nitrogen and oxygen species. Nitric Oxide-Biology and Chemistry, 1(2), 145-157.

De Gusseme, B.; Pycke, B.; Hennebel, T.; Marcoen, A.; Vlaeminck, S. E.; Noppe, H.; Boon, N.;

Verstraete, W. (2009). Biological removal of 17 alpha-ethinylestradiol by a nitrifier

enrichment culture in a membrane bioreactor. Water Research, 43(9), 2493-2503.

De Gusseme, B.; Sintubin, L.; Baert, L.; Thibo, E.; Hennebel, T.; Vermeulen, G.; Uyttendaele,

M.; Verstraete, W.; Boon, N. (2010). Biogenic Silver for Disinfection of Water

Contaminated with Viruses. Applied and Environmental Microbiology, 76(4), 1082-1087.

de Wit, M. A. S.; Koopmans, M. P. G.; Kortbeek, L. M.; Wannet, W. J. B.; Vinje, J.; van

Leusden, F.; Bartelds, A. I. M.; van Duynhoven, Y. (2001). Sensor, a population-based

cohort study on gastroenteritis in the Netherlands: Incidence and etiology. American

Journal of Epidemiology, 154(7), 666-674.


51

Dibrov, P.; Dzioba, J.; Gosink, K. K.; Hase, C. C. (2002). Chemiosmotic mechanism of

antimicrobial activity of Ag+ in Vibrio cholerae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,

46(8), 2668-2670.

Edwards-Jones, V. (2009). The benefits of silver in hygiene, personal care and healthcare.

Letters in Applied Microbiology, 49(2), 147-152.

Elechiguerra, J. L.; Burt, J. L.; Morones, J. R.; Camacho-Bragado, A.; Gao, X.; Lara, H. H.;

Yacaman, M. J. (2005). Interaction of silver nanoparticles with HIV-1. J

Nanobiotechnology, 3, 6.

EPA. (2006). National Primary Drinking Water Regulations: Long Term 2 Enhanced Surface

Water Treatment Rule; Final Rule. Federal Register, 71(3), 658.

EUR-lex. (1998). Richtlijn 98/83/EG van de raad van 3 november 1998 betreffende de

kwaliteit van voor menselijke consumptie bestemd water. Publicatieblad van de Europese

Gemeenschappen, 32-54.

Feng, Q. L.; Wu, J.; Chen, G. Q.; Cui, F. Z.; Kim, T. N.; Kim, J. O. (2000). A mechanistic study of

the antibacterial effect of silver ions on Escherichia coli and Staphylococcus aureus.

Journal of Biomedical Materials Research, 52(4), 662-668.

Fox, C. L.; Modak, S. M. (1974). Mechanism of silver sulfadiazine action on burn wound

infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 5(6), 582-588.

Fuller, F. W. M. D. (2009). The Side Effects of Silver Sulfadiazine. Journal of Burn Care &

Research May/June, 30(3), 464-470.

Glass, R. I.; Parashar, U. D.; Estes, M. K. (2009). Norovirus gastroenteritis. N Engl J Med,

361(18), 1776-1785.

Grabow, W. O. K. (2001). Bacteriophages: Update on application as models for viruses in

water. Water Sa, 27(2), 251-268.

Greene, R. M.; Su, W. P. D. (1987). Argyria. American Family Physician, 36(6), 151-154.

Hedberg, C. W.; Osterholm, M. T. (1993). Outbreaks of food-borne and waterborne viral

gastroenteritis. Clinical Microbiology Reviews, 6(3), 199-210.

Hennebel, T.; De Corte, S.; Vanhaecke, L.; Vanherck, K.; Forrez, I.; De Gusseme, B.; Verhagen,

P.; Verbeken, K.; Van der Bruggen, B.; Vankelecom, I.; Boon, N.; Verstraete, W. (2010).

Removal of diatrizoate with catalytically active membranes incorporating microbially

produced palladium nanoparticles. Water Research, 44(5), 1498-1506.


52

Hennebel, T.; Verhagen, P.; Simoen, H.; De Gusseme, B.; Vlaeminck, S. E.; Boon, N.;

Verstraete, W. (2009). Remediation of trichloroethylene by bio-precipitated and

encapsulated palladium nanoparticles in a fixed bed reactor. Chemosphere, 76(9), 1221-

1225.

Hoebe, C.; Vennema, H.; Husman, A. M. D.; van Duynhoven, Y. (2004). Norovirus outbreak

among primary schoolchildren who had played in a recreational water fountain. Journal

of Infectious Diseases, 189(4), 699-705.

Klasen, H. J. (2000a). Historical review of the use of silver in the treatment of burns. I. Early

uses. Burns, 26(2), 117-130.

Klasen, H. J. (2000b). A historical review of the use of silver in the treatment of burns. II.

Renewed interest for silver. Burns, 26(2), 131-138.

Krasner, S. W.; Weinberg, H. S.; Richardson, S. D.; Pastor, S. J.; Chinn, R.; Sclimenti, M. J.;

Onstad, G. D.; Thruston, A. D. (2006). Occurrence of a new generation of disinfection

byproducts. Environmental Science & Technology, 40(23), 7175-7185.

Landry, C. C.; Pappe, N.; Mason, M. R.; Apblett, A. W.; Tyler, A. N.; Macinnes, A. N.; Barron,

A. R. (1995). From minerals to materials - synthesis of alumoxanes from the reaction of

boehmite with carboxylic-acids. Journal of Materials Chemistry, 5(2), 331-341.

Leclerc, H.; Schwartzbrod, L.; Dei-Cas, E. (2002). Microbial agents associated with

waterborne diseases. Critical Reviews in Microbiology, 28(4), 371-409.

Liau, S. Y.; Read, D. C.; Pugh, W. J.; Furr, J. R.; Russell, A. D. (1997). Interaction of silver

nitrate with readily identifiable groups: relationship to the antibacterial action of silver

ions. Letters in Applied Microbiology, 25(4), 279-283.

Mastrolorenzo, A.; Scozzafava, A.; Supuran, C. T. (2000). Antifungal activity of Ag(I) and Zn(II)

complexes of aminobenzolamide (5-sulfanilylamido-1,3,4-thiadiazole-2-sulfonamide)

derivatives. Journal of Enzyme Inhibition, 15(6), 517-531.

Matsui, Y.; Matsushita, T.; Sakuma, S.; Gojo, T.; Mamiya, T.; Suzuoki, H.; Inoue, T. (2003).

Virus inactivation in aluminum and polyaluminum coagulation. Environmental Science &

Technology, 37(22), 5175-5180.

Matsumura, Y.; Yoshikata, K.; Kunisaki, S.; Tsuchido, T. (2003). Mode of bactericidal action of

silver zeolite and its comparison with that of silver nitrate. Applied and Environmental

Microbiology, 69(7), 4278-4281.


53

Maunula, L.; Miettinen, I. T.; von Bonsdorff, C. H. (2005). Norovirus outbreaks from drinking

water. Emerging Infectious Diseases, 11(11), 1716-1721.

Meyers, F. H.; Jawetz, E.; Goldfien, A. (1980). Review of the Medical Pharmacology 7th

Edition. Lange Medical Publications, California, USA, 572-573.

Mitch, W. A.; Sedlak, D. L. (2002). Formation of N-nitrosodimethylamine (NDMA) from

dimethylamine during chlorination. Environmental Science & Technology, 36(4), 588-595.

Modak, S. M.; Fox, C. L. (1973). Binding of silver sulfadiazine to cellular components of

pseudomonas-aeruginosa. Biochemical Pharmacology, 22(19), 2391-2404.

Morgan, I. J.; Henry, R. P.; Wood, C. M. (1997). The mechanism of acute silver nitrate toxicity

in freshwater rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) is inhibition of gill Na+ and Cl-

transport. Aquatic Toxicology, 38(1-3), 145-163.

Morones, J. R.; Elechiguerra, J. L.; Camacho, A.; Holt, K.; Kouri, J. B.; Ramirez, J. T.; Yacaman,

M. J. (2005). The bactericidal effect of silver nanoparticles. Nanotechnology, 16(10), 2346-

2353.

Moyer, C. A.; Brentano, L.; Gravens, D. L.; Margraf, H. W.; Monafo, W. W. (1965). Treatment

of large human burns with 0,5% silver nitrate solution. Archives of Surgery, 90(6), 812-

867.

Nwachcuku, N.; Gerba, C. P. (2004). Emerging waterborne pathogens: can we kill them all?

Current Opinion in Biotechnology, 15(3), 175-180.

Panacek, A.; Kolar, M.; Vecerova, R.; Prucek, R.; Soukupova, J.; Krystof, V.; Hamal, P.; Zboril,

R.; Kvitek, L. (2009). Antifungal activity of silver nanoparticles against Candida spp.

Biomaterials, 30(31), 6333-6340.

Panyala, N. R.; Pena-Mendez, E. M.; Havel, J. (2008). Silver or silver nanoparticles: a

hazardous threat to the environment and human health? Journal of Applied Biomedicine,

6(3), 117-129.

Parashar, U. D.; Gibson, C. J.; Bresee, J. S.; Glass, R. I. (2006). Rotavirus and severe childhood

diarrhea. Emerging Infectious Diseases, 12(2), 304-306.

Pariser, R. J. (1978). generalized argyria - clinicopathologic features and histochemical

studies. Archives of Dermatology, 114(3), 373-377.

Park, H. J.; Kim, J. Y.; Kim, J.; Lee, J. H.; Hahn, J. S.; Gu, M. B.; Yoon, J. (2009). Silver-ion-

mediated reactive oxygen species generation affecting bactericidal activity. Water

Research, 43(4), 1027-1032.


54

Payne, C.; Bladin, C.; Colchester, A. C. F.; Bland, J.; Lapworth, R.; Lane, D. (1992). Argyria from

excessive use of topical silver sufladiazine. Lancet, 340(8811), 126-126.

Pelton, R.; Hong, J. (2002). Some properties of newsprint impregnated with polyvinylamine.

Tappi Journal, 1(10), 21-26.

Richardson, S. D. (2003). Disinfection by-products and other emerging contaminants in

drinking water. Trac-Trends in Analytical Chemistry, 22(10), 666-684.

Rogers, J. V.; Parkinson, C. V.; Choi, Y. W.; Speshock, J. L.; Hussain, S. M. (2008). A preliminary

assessment of silver nanoparticle inhibition of monkeypox virus plaque formation.

Nanoscale Research Letters, 3(4), 129-133.

Santti, J.; Vainionpaa, R.; Hyypia, T. (1999). Molecular detection and typing of human

picornaviruses. Virus Research, 62(2), 177-183.

Schreurs, W. J. A.; Rosenberg, H. (1982). Effect of silver ions on transport and retention of

phosphate by Escherichia coli. Journal of Bacteriology, 152(1), 7-13.

Shannon, M. A.; Bohn, P. W.; Elimelech, M.; Georgiadis, J. G.; Marinas, B. J.; Mayes, A. M.

(2008). Science and technology for water purification in the coming decades. Nature,

452(7185), 301-310.

Shin, G. A.; Sobsey, M. D. (2008). Inactivation of norovirus by chlorine disinfection of water.

Water Research, 42(17), 4562-4568.

Sintubin, L.; De Windt, W.; Dick, J.; Mast, J.; van der Ha, D.; Verstraete, W.; Boon, N. (2009).

Lactic acid bacteria as reducing and capping agent for the fast and efficient production of

silver nanoparticles. Applied Microbiology and Biotechnology, 84(4), 741-749.

Smith, D. J.; Payton, M. A. (1994). Hyphal tip extension in aspergillus-nidulans requires the

mana gene, which encodes phosphomannose isomerase. Molecular and Cellular Biology,

14(9), 6030-6038.

Sondi, I.; Salopek-Sondi, B. (2004). Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study

on E-coli as a model for Gram-negative bacteria. Journal of Colloid and Interface Science,

275(1), 177-182.

Symonds, E. M.; Griffin, D. W.; Breitbart, M. (2009). Eukaryotic Viruses in Wastewater

Samples from the United States. Applied and Environmental Microbiology, 75(5), 1402-

1409.


55

Teunis, P. F. M.; Moe, C. L.; Liu, P.; Miller, S. E.; Lindesmith, L.; Baric, R. S.; Le Pendu, J.;

Calderon, R. L. (2008). Norwalk virus: How infectious is it? Journal of Medical Virology,

80(8), 1468-1476.

Tilton, R. C.; Rosenberg, B. (1978). Reversal of silver inhibtion of microorganisms by agar.

Applied and Environmental Microbiology, 35(6), 1116-1120.

Tsai, T. C.; Peng, S. K.; Shih, Y. R.; Luk, H. N. (2005). Sulfadiazine-induced

methemoglobinemia in a boy with thalassemia. Canadian Journal of Anaesthesia-Journal

Canadien D Anesthesie, 52(9), 1002-1003.

UNICEF/WHO. (2009). Diarrhoea: Why children are still dying and what can be done. 1-68.

USEPA. (1999). Drinking Water Treatment - EPA 810-F-99-013.

USEPA. (2009). National primary drinking water regulations - EPA 816-F-09-004.

Verthe, K.; Possemiers, S.; Boon, N.; Vaneechoutte, M.; Verstraete, W. (2004). Stability and

activity of an Enterobacter aerogenes-specific bacteriophage under simulated gastro-

intestinal conditions. Applied Microbiology and Biotechnology, 65(4), 465-472.

Wang, S. B.; Peng, Y. L. (2009). Natural zeolites as effective adsorbents in water and

wastewater treatment. Chemical Engineering Journal, 156(1), 11-24.

Wood, C. M.; Playle, R. C.; Hogstrand, C. (1999). Physiology and modeling of mechanisms of

silver uptake and toxicity in fish. Environmental Toxicology and Chemistry, 18(1), 71-83.

Wu, J. L.; Li, H. T.; Huang, X. (2009). Indigenous somatic coliphage removal from a real

municipal wastewater by a submerged membrane bioreactor. Water Research, 44(6),

1853-1862.

Ziffren, S. E. (1968). Results of treatment of burns with silver nitrate. Annals of the New York

Academy of Sciences, 150(A3), 946-949.

Zodrow, K.; Brunet, L.; Mahendra, S.; Li, D.; Zhang, A.; Li, Q. L.; Alvarez, P. J. J. (2009).

Polysulfone ultrafiltration membranes impregnated with silver nanoparticles show

improved biofouling resistance and virus removal. Water Research, 43(3), 715-723.

CONTINUE DESINFECTIE VAN VIRAAL GECONTAMINEERD … · ontdekte als één van de eerste dat...

Documents

Transcript of CONTINUE DESINFECTIE VAN VIRAAL GECONTAMINEERD … · ontdekte als één van de eerste dat...