Chromosomen en ploïdie: basisbegrippen voor de ... · Chromosomen en ploïdie: basisbegrippen voor...

ILVO – Plant

http://www.ilvo.vlaanderen.be

Beleidsdomein Landbouw en Visserij

Chromosomen en ploïdie: basisbegrippen voor de plantenveredelaar

• Ploïdie: veroorzaakt soms problemen in

kruisingsveredeling

• Ploïdie: biedt mogelijkheden voor

ILVO – Plant



• Ploïdie: biedt mogelijkheden voor

veredelaars

2

Overzicht• Basisbegrippen

• Kwantificeren:

– Chromosoomaantal

– Ploïdiegetal

– Genoomgrootte

ILVO – Plant



3

• Veredeling:

– Chromosoomstudies

– Ploïdie

– Genoomgrootte

• Praktijkvoorbeelden

Basisbegrippen

ILVO – Plant



4

Basisbegrippen

Somatische

cel

Gameten:

eicel en pollen

ILVO – Plant



5

cel


• Kwantificeren:


– Ploïdiegetal

– Genoomgrootte

ILVO – Plant



6

• Veredeling:


– Ploïdie

– Genoomgrootte


Kwantificeren

1. Chromosoomaantal: totale aantal

chromosomen in een celkern

2. Ploïdiegetal: aantal chromosoomsets in een

ILVO – Plant



2. Ploïdiegetal: aantal chromosoomsets in een

celkern

3. Genoomgrootte: totale hoeveelheid DNA

in een celkern

7

1. Chromosoomaantal

• Wat? Totale aantal chromosomen in een

celkern

• Bepaling: microscopische telling

ILVO – Plant



• Bepaling: microscopische telling

• Notatie: bv. x=24; 2x=48

8

Chromosoomtelling

• Microscopie

• Worteltip

• Metafase

ILVO – Plant



• Arbeidsintensief

2. Ploïdiegetal

• Wat? Aantal chromosoomsets in een

celkern

• Bepaling: microscopisch tellen of afgeleid

ILVO – Plant



• Bepaling: microscopisch tellen of afgeleid

via flow cytometrie

• Notatie: bv. 2n=4x

10

Ploïdiegetal

Monoploïd= 1 set van chromosomenMonoploïd= 1 set van chromosomen Diploïd= 2 sets van 7 chromosomenDiploïd= 2 sets van 7 chromosomen

Kleinste DNA-

inhoud

ILVO – Plant



11

Monoploïd= 1 set van chromosomenMonoploïd= 1 set van chromosomen Diploïd= 2 sets van 7 chromosomenDiploïd= 2 sets van 7 chromosomen

Triploïd= 3 sets van 7 chromosomenTriploïd= 3 sets van 7 chromosomen Tetraploïd= 4 sets van 7 chromosomenTetraploïd= 4 sets van 7 chromosomen

Grootste DNA-

inhoud

Terminologie polyploïden

• Autopolyploïden: hebben éénzelfde basisstel

chromosomen meer dan tweemaal (bv.AAAA); homo- of

homeologe chromosomen kunnen paren bij de meiose (ook

bij ‘verwante’ interspecies kruisingen) = polysomische

overerving

ILVO – Plant



overerving

• Allopolyploïden: hebben minstens 2 verschillende

genomen (bv. AABB) enkel paring tussen homologe

chromosomen van hetzelfde genoom bij de reductiedeling

(gameten vorming) = disomische overerving

12

Voorbeeld aardbei

• Octoploïde aardbei:

AAA’A’BBBB: chromosomen van het A en A’

genoom erven disomisch over, die van B

polysomisch

ILVO – Plant



polysomisch

• Disomisch: uitsplitsing zoals bij diploïden

• Polysomisch: uitsplitsing is in meer combinaties

mogelijk (ook vorming aneuploïden mogelijk)

13

Terminologie

• Aneuploïd: afwijking in chromosoomaantal

bv. 1 chromosoom ontbreekt

• Haploïd: het ploïdiegetal in de gameten = de

ILVO – Plant



• Haploïd: het ploïdiegetal in de gameten = de

helft van het ploïdiegetal in de somatische

cel (haploïd ≠ monoploïd)

14

Bepaling ploïdiegetal

• Microscopie:

– Telling aantal chromosomen, exacte bepaling

– Bepaling basisgetal: omrekening uit

ILVO – Plant



– Bepaling basisgetal: omrekening uit

voorkomende hoeveelheden bv. 12, 18, 24, 36:

basisgetal 6

– Niet altijd een eenduidig basisgetal bv.

Begonia: x=11, 13 of 14

15

Bepaling ploïdiegetal

• Flow cytometrie: relatieve bepaling van de

DNA-inhoud

ILVO – Plant



16

Flow cytometrie

• Cellen worden gekleurd een fluorescente

kleurstof (DAPI) die bindt op het DNA

• Meer fluorescentie = meer DNA inhoud

ILVO – Plant



• Meer fluorescentie = meer DNA inhoud

• Metingen zijn relatief tegenover een

gekende referentie van dezelfde

plantensoort!!!

17

Principe

ILVO – Plant



18

ILVO – Plant



19

Aan

tal

dee

ltje

s

Ruis

Piek

Histogram

ILVO – Plant



20

fluorescentie

Aan

tal

dee

ltje

s

Voorbeeld metingen:

diploïd triploïd

ILVO – Plant



tetraploïd

Staal voorbereiding

• staal: <1 cm² jong blad materiaal

• buffer 1: 400 µl (citroenzuur + tween)

• choppen

• filter 100 µm

ILVO – Plant



• filter 100 µm

• buffer 2: 700 µl (DAPI + Na2HPO4)

• Voorbereidingstijd: 3 min.

3. Genoomgrootte

• Wat? Totale hoeveelheid DNA in een

celkern (DNA-inhoud, C-waarde)

• Bepaling: flow cytometrisch

ILVO – Plant



• Bepaling: flow cytometrisch

• Notatie: bv. 2C = 2,5 pg

1 pg = 986,9 Mbp = 0.9869 x 109 bp

23

DNA-inhoud

Verschillen in DNA-inhoud/genoomgrootte

binnen een soort:

– Grote verschillen: ploïdie verschil?

– Kleine verschillen:

• Aneuploïdie?

ILVO – Plant



24

• Aneuploïdie?

• Verschil in chromosoomgrootte?

• Aanwezigheid sexchromosoom bij tweehuizigen

• Aanwezigheid van verschillende genomen bij

allopolyploïden bv. triploïde banaan AAB en ABB

onderscheiden

Flow cytometrie: DNA-inhoud

• Ploïdie:

Bepaling met DAPI Binding op A en T in het

genoom

Dapi

PI

ILVO – Plant



25

• Genoomgrootte: Bepaling

met propidium iodide

Binding op C T A en G in het

genoom

File: staal_001_014 Date: 03-02-2006 Time: 13:57:48 Particles: 2015 Acq.-Time: 271 s

80

100

80

100

partec PAS

Meting gebaseerd op

propidium iodide

ILVO – Plant



26

0 50 100 150 200 25 00

20

40

60

FL1

co

un

ts

0 50 100 150 200 25 00

20

40

60

FL1

co

un

ts

Fluorescentie: DNA-inhoud

Aantal

deeltjes

propidium iodide

kleuring (A-T C-G)

eventueel baseverhouding

met DAPI (A-T)

Genoomgroottes

Verhouding tot referentieplanten:

totale genoomgrootte uitgedrukt in

pg of Mbpstaal

ILVO – Plant



Fluorescentie: DNA-inhoud

Aantal

deeltjes

Referentie plant

Referentieplant:

bv. erwt 2C=9,39 pg

piek op 280;

staal piek op 210 =>

2C=(210/280)*9,39=7,04 pg

Ter vergelijking

• Mens: x=23; 1C=3,5 pg

• Fruitvlieg: x=4; 1C=0,2 pg

• Hond: x=39; 1C=2,88 pg

ILVO – Plant



• Hond: x=39; 1C=2,88 pg

• Buddleja davidii: x=19; 1C=1,34 pg

• Lelie: x=12; 1C=35,20 pg

Bij de angiospermae: 1C=0,1 pg Fragaria

viridis tot 127,4 pg Fritillaria assyriaca

28

Notaties

Bv. een tetraploide plant met

genoomgrootte 4,2 pg en 76 chromosomen

in een celkern

In een somatische cel:

ILVO – Plant



In een somatische cel:

2n=4x=76, 2C=4Cx=4,2 pg

In een gameet:

n=2x=38, 1C=2Cx=2,1 pg

Opmerking: triploïden fictieve waarde

29

http://data.kew.org/cvalues/

ILVO – Plant



30

ILVO – Plant



31

ILVO – Plant



32


• Kwantificeren:


– Ploïdiegetal

– Genoomgrootte

ILVO – Plant



33

• Veredeling:


– Ploïdie

– Genoomgroottes


Chromosoomstudies in de veredeling

Voorbeeld interspecies kruising: verschillend

chromosoomaantal

Paard x Ezel Ezel x Paard

2n=64 2n=62 2n=62 2n=64

ILVO – Plant



34

2n=64 2n=62 2n=62 2n=64

Muilezel / Muildier

2n=63

n=? (steriliteit door aneuploïdie)

Hibiscus paramutabilisHibiscus syriacus

X‘Oiseau Blue’ Red Heart CV

H. syr. ‘Oiseau Blue’ x H. syr. ‘Red Heart CV’

Fenotypering

ILVO – Plant



35

1 2 3 4

H. syr. ‘Oiseau Blue’ x

H. paramutabilis

H. syr. ‘Red Heart CV’

x H. paramutabilis

Genotypering:

Chromosoomstudies

GISH: Genomische In Situ Hybridisatie: bekijken van de

introgressie van chromosoomfragmenten

ILVO – Plant



Ploïdie in de veredelingWijzigen van het ploïdiegetal

• Verlagen

ILVO – Plant



• Verlagen

• Verhogen

• Naar een oneven aantal

37

Verlagen van het ploïdiegetal

• Halveren van het ploïdiegetal: haploïden uit

geslachtscellen

• Opnieuw verdubbelen van haploïden:

ILVO – Plant



• Opnieuw verdubbelen van haploïden:

dihaploïden (homozygotie, snelle inteeltlijn)

38

Oneven ploïdiegetal

• Vaak steriliteit

• Langere houdbaarheid van bloemen is soms

mogelijk (geen zaadvorming)

• Kwekersrechter beter beschermd bij

steriliteit

ILVO – Plant



steriliteit

• Geen ongewilde verspreiding (invasieve

plant)

• Vruchten: geen ongewilde zaden

(watermeloen, banaan)

39

Onven ploïdiegetal

• Via kruising bv. 2x X 4x

Gameten: x X 2x = 3x

• Triploid block: verhinderd vorming van

ILVO – Plant



• Triploid block: verhinderd vorming van

triploïden komt vaak voor

• Triploïden vaak steriel of verlaagde

fertiliteit, maar niet altijd en overal!

40

50 µm

‘The Fairy’ 2n=2x

‘Bingo Meidiland’ 2n=3x1200

1600

pollen opp. (µm²)

Pollen van triploïde rozen

ILVO – Plant



41

2n=2x

R. chinensis2n=2x

‘Heidetraum’ 2n=3x

‘Bonica’ 2n=4x ‘Maria

Mathilda’ 2n=4x

0

400

800

pollen opp. (µm²)

Lage kieming: 1-2 %

maar voldoende voor

geslaagde kruisingen

Optioneel: sorteren

ILVO – Plant



42

Verhogen van het ploïdiegetal

• Polyploïde planten komen in de natuur zeer frequent voor

(35% van de angiospermen), ontstaan via 2n-gameten

• Gewijzigde eigenschappen bij tri- of tetraploïden bv. grotere

bloemen, kortere, stevigere bloemstengel, dikker

(bloem)blad, inhoudsstoffen, opbrengst (DS), …

• Herkenning: meer huidmondjes, groter pollen, grotere

ILVO – Plant



• Herkenning: meer huidmondjes, groter pollen, grotere

cellen, …

• Effect van polyploïdie op bepaalde eigenschappen is vaak

weinig onderzocht bv. ziekteresistentie

• Herstellen van fertiliteit

• Ploïdie-optimum

43

• Mitotische polyploïdisatie:

– Somatische chromosoom verdubbeling

– Colchicine, trifluraline, oryzaline, …

– Geen homeologe recombinatie

Verhogen van het ploïdiegetal

ILVO – Plant



– Geen homeologe recombinatie

• Meiotische polyploïdisatie:

– 2n-gameten

– FDR of SDR

44

Polyploïdiseren

diploïd diploïd diploïd diploïdtetraploïd

tetraploïdtriploïd

Voorbeeld: cichorei

ILVO – Plant



45

Naar specifieke voordelen van tri- of tetraploïden

Behandelingen met mitose-inhibitoren:

colchicine

oryzalin

trifluralin

…

meristeembehandeling

Polyploïdiseren

ILVO – Plant



zaadbehandeling

Polyploïdiseren

ILVO – Plant



47

scheutbehandeling

Polyploïdiseren

ILVO – Plant



48

Voorbeeld: in vitro polyploïdiseren

Buddleja

ILVO – Plant



49

2x

4x

Resultaten• Flow cytometrische analyse op jonge (in vitro) scheuten

• Mogelijkheid tot ploïdiechimeren

of mixoploïden

ILVO – Plant



• Vaak nemen de cellen met het originele ploïdiegetal weer de

overhand

50

Polyploïdiseren: ongereduceerd pollen

ILVO – Plant



51

Opmerking

Bij het mitotisch wijzigen van het ploïdiegetal

van een kwekersrechterlijk beschermde cultivar

(zonder het uitvoeren van een kruising) valt deze

ILVO – Plant



(zonder het uitvoeren van een kruising) valt deze

gewijzigde cultivar onder het kwekersrecht van

de oorspronkelijke cultivar = Essentialy Derived

Variety (EDV)

52

Genoomgroottes in de veredeling

• Interspecieskruisingen:

– Genoomgrootte verschillen mogelijk

– Herkenning interspecifieke hybriden

ILVO – Plant



– Herkenning interspecifieke hybriden

– Incompatibiliteit?

53

Voorbeeld:

interspecies kruisingen Buddleja - genoomgroottes

ILVO – Plant



54

Buddleia davidii

2n=4x=76 chromosomen: 2C=2,76 pg

B. x weyeriana:

Voorbeeld:


ILVO – Plant



B. x weyeriana:

2n=4x=76 chromosomen: 2C=3,50 pg

B. x weyeriana x B. davidii: 2C=3,04 pg

55

Buddleia davidii

2n=4x=76 chromosomen: 2,76 pg

B. x weyeriana:

Voorbeeld:


ILVO – Plant



B. x weyeriana:


B. davidii x B. x weyeriana: 2,39 tot 2,76 pg

56

Buddleia davidii


B. lindleyana:

Voorbeeld:


ILVO – Plant



57

B. lindleyana:


B. davidii x B. lindleyana: 2,94 tot 3,32 pg

Met 76 chromosomen !!! (ongereduceerde gameten)


• Kwantificeren:


– Ploïdiegetal

– Genoomgrootte

ILVO – Plant



58

• Veredeling:


– Ploïdie

– Genoomgroottes


Merkwaardige mozaiek

2n=2x

2n=2x

ILVO – Plant



59

Midden 2n=2x

Rand 2n=4x 2n=4x

Uitgebreid praktijkvoorbeeld: Triticale

ILVO – Plant



60

Triticum monococcum (AA) x Aegilops speltoides (BB)

2n=2x=14 2n=2x=14

Steriel hybride (AB)

Fertiel hybride

Triticum turgidum var. durum (AABB)

2n=4x=28

T. turgidum var. durum (AABB) x T. tauchii (DD)

2n=4x=28 2n=2x=14

Spontane verdubbeling

T. turgidum var. durum x Secale cereale

2n=4x=28 (AABB) 2n=2x=14 (RR)

ILVO – Plant



2n=4x=28 2n=2x=14

Steriel hybride (ABD)

Fertiel hybride (AABBDD) x Secale cereale (RR)

2n=6x=42 2n=2x=14

Triticale (AABBDDRR) allo-octaploïd 2n=8x=56

61


2n=4x=28 (AABB) 2n=2x=14 (RR)

Triticale (AABBRR)

allohexaploïd 2n=6x=42



Samenvatting: gebruik van flow

cytometrie in de veredeling

• Haploïden: bv. uit antheren cultuur

• Ploïdiebepaling ouderplanten

• Nakomelingen uit interploïdiekruisingen

• Ploïdieverdubbeling

ILVO – Plant



• Ploïdieverdubbeling

• Herkenning interspecifieke hybriden

• Zuiverheid zaadloten

• Moeilijker: aneuploïden, sex chromosoom bij

tweehuizigen, verschillende genomen

62

Later deze avond

Demo flow cytometrie

ILVO – Plant



63

Chromosomen en ploïdie: basisbegrippen voor de ... · Chromosomen en ploïdie: basisbegrippen voor...

Documents

Transcript of Chromosomen en ploïdie: basisbegrippen voor de ... · Chromosomen en ploïdie: basisbegrippen voor...