BC 2010 Aula 2 microsocpia

8/7/2019 BC 2010 Aula 2 microsocpia

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Métodos de Estudo das

CélulasParte 1 - Visualização

Aula 2Biologia Celular LGN 114Antonio Figueira

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Tecnologias de AnáliseMÉTODOS DE OBSERVAÇÃO (visualização)• Microscopia Óptica• Microscopia EletrônicaMÉTODOS DE DETECÇÃO

– Citoquímica– Imunocitoquímica– Radioautografia,...

MÉTODOS DE SEPARAÇÃO (fracionamentoe isolamento de componentes)

• Fracionamento Celular – centrifugação• Cromatografia, Eletroforese,...



Escala



Tecnologias de Análise• Objeto de estudo com tamanhoreduzido– Célula eucariótica: 5 a 20 μm

• Requer técnicas especiais

• Desenvolvimento de novastecnologias e equipamentos– ex. microscopia eletrônica, fluorescência,

microscópio confocal, .....



Uso da Microscopia

Primeiros instrumentos ópticos

Microscópioóptico

Lupa

binocular

M. eletrônico de varredura M. eletrônico de transmissão



•1665: 1as células observadaspor Robert Hooke•1838: descrição de célulasDoutrina celular (Schleiden &Schwann) – célula é unidadefundamental dos seres vivos•1860: geração espontânea porPasteur•

1882: coloração por anilina debacilos

Breve Histórico



•1930s – desenvolvimento demicroscopia eletrônica detransmissão (MET), e óptico decontraste de fase einterferência (células vivas)•1965 – microscópio eletrônico

de varredura (MEV)•1968 – 1º microscópio confocal

Breve Histórico



Métodos de Observação

1.Preparação de amostra– Células vivas ou fixadas?

2.Coloração: componentestransparentes

3.VisualizaçãoMicroscopia óptica

Microscopia eletrônica– Transmissão (MET) e de varredura (MEV)



Preparação de amostras paraestudo ao microscópio

Espécimens: células vivas ou fixadas• Amostras fixadas - preservação doscomponentes

• Evitar alterações pela técnica = artefatos• Etapas do processo:

1. Fixação2. Microtomia3. Coloração

Específicos para microscopia óptica ou eletrônica



Preparação de amostras para

estudo ao microscópioFIXAÇÃO

• evitar a autólise (degradação) das amostras• impedir a contaminação por bactérias

• endurecer células para o corte pelomicrótomo• aumentar afinidade dos componentes por

corantes• tratamento com:

– Microscopia óptica -> formol e glutaraldeído– Microscopia eletrônica -> tetróxido de ósmio e

glutaraldeído



MICROTOMIA• Corte em fatias finas pelo MICRÓTOMO• Amostra incluída e protegida por matriz ou resina

– facilitar o corte e proteger tecido• Microscopia óptica: parafina ou resina plástica

– espessura 1 a 6 micrômetro (μm)– micrótomo com navalha de aço

• Microscopia eletrônica: resina dura tipo epóxi– espessura 0,02 a 0,1 micrômetro (μm)– micrótomo com navalha de vidro ou diamante


estudo ao microscópio



Micrótomo

Corte manual



COLORAÇÃO• constituintes celulares transparentes e incolores• uso de corantes básicos ou ácidos específicos• corante básico (cromóforo catiônico)

– colore componentes ácidos (aniônicos)– componentes-alvo: DNA, RNA– ex. azul de toluidina, azul de metileno, hematoxilina

• corante ácido (cromóforo aniônico)– colore componentes básicos (catiônicos)– componentes-alvo: algumas proteínas

– ex. orange-G, fuchsina, eosina


estudo ao microscópio



Microscopia Óptica

Básica com coloração

Célula vegetal Célula animal



Microscopia Óptica

Partes ÓpticasCONDENSADOR

OBJETIVAOCULAR

Parte MecânicaPlatina



Microscopia Óptica



Microscopia Óptica• Ampliação total

= aumento da objetiva x aumento da ocular

• Poder resolução = capacidade separar detalhes

– exemplo: .. Ou ..

• Limite de Resolução (LR) = função da objetiva,ocular apenas aumenta imagem

– Imposto por restrição física – comprimento de ondalimite 200 nm



Microscopia Óptica



Tipos de microscopia ópticaem função da luz

1. Microscopia de Contraste de Fase

2. Microscopia Confocal

3. Microscopia Fluorescente

4. Microscopia de Polarização




Microscopia de Contraste de Fase• transforma diferenças de fase do feixe de luz emdiferenças de intensidade

• velocidade da luz e índice de refração afetados peladensidade de corpo– > densidade = < velocidade e < índice de refração

• estruturas celulares com densidade diferentes• diferença de fase -> dif. amplitude e intensidade• uso em células vivas



Coloração x Contraste de Fase

Campo claro Contraste de fase

Contraste de interferênciadiferencial de Nomanski

Campo escuro – luz lateral




Microscopia de FluorescênciaCompostos fluorescentes:• excitados por luz de certo comprimento de onda

• emitem luz de determinado comprimento de onda• Constituintes celulares: vitamina A, riboflavina

• Corantes – associação a anticorpos– Ex. Fluoresceína e Rodamina



Microscopia por Fluorescência




Microscopia Confocal• tecidos/células tem > espessura que plano de foco• focalização no micrométrico

• imagem de plano focalizado com menor nitidez,causada por interferência do plano não focalizado• Laser=fonte intensa e focada!

• Confocal -> iluminação a laser focada (varredura)• = CORTE ÓPTICO!

• Utiliza compostos fluorescentes



Microscopia Confocal




Microscopia de Polarização• usa feixe de luz polarizado• estruturas celulares separam feixe de luz em

planos perpendiculares– cristalinas ou moléculas alongadas– anisotrópicas (bi-refringentes) ou isotrópicas

• microscópio comum com dois prismas polarizadores– condensador - polarizador– ocular - analisador

• visível apenas um plano (anisotrópico)



Comum

Contrastefase positiva

Contrastefase negativa

Interferência



Microscopia Eletrônica• Capacidade de resolução limitada pelo

comprimento de onda empregado• Óptico - limite = 200 nm• Eletrônico - feixe de elétrons acelerados por

diferença de potencial 60 a 100.000 V• Resolução teórica = 0,002 nm

• Resolução real = 2 nm• Dois tipos básicos:

Microscopia Eletrônica de TransmissãoMicroscopia Eletrônica de Varredura



Microscopia EletrônicaMicroscopia Eletrônica de Transmissão

Microscopia Eletrônica de Varredura



Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)• Geração de elétrons - cátodo de tungstênioComponentes similares ao microscópio óptico1. Bobina ou lente magnética (~condensador)

– Feixe de elétrons passa por objeto2. Bobina objetiva3. Bobina projetora: tela fluorescente (ZnS) e filme

fotográfico• Trajeto de elétrons - vácuo (sem células vivas!)• Desvio de elétrons geram imagem

• Componentes elétron-densos -> escuros

Microscopia Eletrônica Transmissão



Coloração com sais de metais pesados – elétron-densos



Suporte domicrótomo

Tecido incluídoem plástico

Fitas de corteflutuando em água

Faca devidro

Aresta cortante

Cortes retiradosda água com tela e

secos

Aspectos dos

cortes, prontos paraserem corados


Preparação de amostras

Fixação: tetróxido de ósmio e glutaraldeído

Impregnação de sais de urânio ou chumboInclusão em resina de epóxiFaca do micrótomo de vidro ou diamante

Amostras com espessura de 20 a 100 nm – baixa penetração dos elétrons



Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)• Fornece imagens tridimensionais mas < resolução• Imagens de superfícies• Sistema análogo ao MET

• Feixe delgado de elétrons com controle de diâmetro• Conjunto de bobinas defletoras controlam foco -varredura

• Emissão de elétrons secundários• Colhidos por coletor e amplificados• Densidade de luz em monitor – fotografado

• Resolução de 10 nm• MAIS SIMPLES E BARATO

Microscopia Eletrônica Varredura



MEV

MET

MO



Organismos

Procariontes e Eucariontes



Evolução dos organismos vivos

vertebradoscélulas aeróbicasfotossintetizantes

Rápido acúmulode O2

Níveisde O2 na

atmosfera

Tempo:bilhõesde anos

aerobiose

produção de O2por fotossíntese

célulasfotossintetizantes

célulasvivas

oceanos e

continentes

plantas e animais

multicelulares

formação daTerra



mitocôndrias

cloroplastos

ArchaebacteriaOutras

Eubactérias

Bactériasfotossintetizantes e não

fotossintetizantesCianobactérias Plantas Animais Fungos

Tempo

Eucarioto ancestral

Procarioto ancestral

Origem e evolução dos seres vivos



- E os vírus?

- E as ricketsias, clamídeas

(procariotos incompletos)



- E os vírus?

- E as ricketsias, clamídeas

(procariotos incompletos)distinções de DNA/RNA

membrana, e maquinaria



Receptor demembranavírus

Vírus

Membrana da célulahospedeira

DNA

Membrana



FORMAS VIRAIS

SV 40FORMAS VIRAIS



SV 40

Phi X 174.

Herpesvirus

Vírus do mosaico do feijão

Vírus do mosaico dacouve-flor Vírus do mosaico do pepino

Bacteriófago

FORMAS VIRAIS



Tipos básicos de célulasProcariótica• carência de sistemas de membranas

– membrana plasmática, parede extracelular– nucleóide, polirribossomos

Eucariótica• compartimentalizadas• membrana plasmática, núcleo, citossol

– cromatina e nucléolo– mitocôndrias, retículo endoplasmático (rugoso e

liso), aparelho de Golgi, lisossomos,

peroxissomos, endossomos, citoesqueleto,depósitos citoplasmáticos (reserva e pigmentos)



Células Procariontes

Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa



algas unicelulares, coloniais e pluricelulares

Complexidade da organização celular



Célula Eucarionte

MembranaPlasmática

Mitocôndria

Centríolos

Vacúolo

LisossomoCarioteca

NucléoloCromatina

Núcleo

Ribossomos

Complexo deGolgi

Microtúbulos

Retículoendoplasmático

rugoso

Retículoendoplasmático liso Citoplasma

Microtúbulos

Poro nuclear



Núcleo

C i l



Compartimentos organelares





RetículoEndoplasmático

Aparelho deGolgi

Mitocôndria



Mitocôndria

Cloroplasto



Cloroplasto



Células eucaróticasAnimais x Vegetais



Células eucaróticasAnimais x Vegetais

Células Vegetais:• presença de parede celular - rigidez

– celulose, pectina• presença de plastos

– cloroplastos, cromoplastos,

leucoplastos,• vacúolos citoplasmáticos• presença de amido x glicogênio• presença de plasmodesmos



Cél l V t l



Célula Vegetal

CloroplastoVacúolo Cloroplasto

MitocôndriaNúcleo

Retículoendoplasmático

rugoso

Complexode Golgi

Mitocôndria

Vacúolo

Núcleo



Cianobactérias e a teoria da simbioseCianobactériaCélula hospedeira

Invaginação paradivisão celular



mitocôndrias

cloroplastos

ArchaebacteriaOutras

Eubactérias

Bactériasfotossintetizantes e não

fotossintetizantesCianobactérias Plantas Animais Fungos

Tempo

Eucarioto ancestral

Procarioto ancestral

Origem e evolução dos seres vivos



Evolução da

célula eucariótica

Teoria daendossimbiose

-> membrana dupla

mitocôndria e cloroplastos

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