Automatisatie van immunofluorescentie op paraffinecoupes en vriescoupes van

nierbiopten met de Benchmark XT

Door Tracy Rogiers

Dienst pathologische anatomie

Dr. P. De Paepe en De heer T. Pont

Inleiding glomerulaire filter

Immuuncomplexen

Glomerulonefritis

Principe van de IF kleuring op de Benchmark XT

Methode Immunofluorescentie op vriescoupes

Immunofluorescentie op paraffinecoupes

Resultaten Staal 07B 3915

Staal 08B 1345

Staal 08B 3740

Staal 08B 4258

Conclusie1

Inleiding

De glomerulaire filter

3 compartimenten:

Subendotheliale ruimte en glomerulaire basale membraan

Subepitheliale compartiment

Mesangium

2

Inleiding

Immuuncomplexen

Met immunofluorescentie gaat men immuuncomplexen gaan opsporen die IgA,

IgG, IgM, C1q, C3, kappa- en lambdaketens bevatten

3

Inleiding

Glomerulonefritis

Casus

Patiënt, 54 jr. oud gekend voor SLE heeft veel eiwitverlies in de urine en de nierfunctie gaat achteruit.

Bij immunofluorescentie onderzoek van het nierbiopt zijn er overwegend mesangiale en hier en daar deposities t.h.v. de capillaire wand van IgA, IgG, C1q, C3, kappa en lambda zichtbaar. IgG is moeilijk interpreteerbaar.

Alles wijst op een ‘full house’ wat verwacht wordt bij SLE.

Conclusie: Lupusnefritis klasse III tot IV

4

Inleiding

Principe van de IF kleuring met de Benchmark XT

Directe immunofluorescentie

VENTANA Benchmark XT

5

Methode

Immunofluorescentie op vriescoupes

Manuele FITC kleuring

Geautomatiseerde FITC kleuring met VENTANA Benchmark XT

Dakocytomation polyklonaal FITC – gelabelde konijnen antilichamen

VENTANA polyklonaal FITC – gelabelde schapen antilichamen

6

Methode

Aangepaste incubatietijden van de verschillende VENTANA FITC –gelabelde primaire antilichamen

FITC Primaire Antilichamen

Incubatietijd

Anti-C1q 16 minuten

Anti-C3 16 minuten

Anti-IgA 16 minuten

Anti-IgG 2 minuten

Anti-IgM 16 minuten

Anti-Kappa 12 minuten

Anti-lambda 12 minuten

Immunofluorescentie op vriescoupes

7

Methode

Geautomatiseerde FITC kleuring met VENTANA Benchmark XT methode 1

Geautomatiseerde FITC kleuring met VENTANA Benchmark XT methode 2

Immunofluorescentie op paraffinecoupes

Zelfde procedure als voor de geautomatiseerde IF kleuring op vriescoupes

Met als verschil formolfixatie en paraffine-inbedding

Zelfde procedure als voor de manuele IF kleuring op paraffinecoupes

Met als verschil de IF kleuring gebeurt op de Benchmark XT

8

Methode

Geautomatiseerde FITC kleuring met VENTANA Benchmark XT methode 3

Immunofluorescentie op paraffinecoupes

Gebruik van een bestaand protocol voor op paraffinecoupes

Met als verschil aanpassing van de incubatietijd voor het enzym en de FITC – gelabelde antilichamen

9

Resultaat : Staal 07B 3915

A. Gekend resultaat voor immunofluorescentie: IgA nefropathie.

IgA Oplichtende cilinders in de tubuli

IgG Negatief

IgM Oplichtende cilinders in de tubuli

C3 Vas afferens vertoont een granulaire oplichting

C1q Negatief

Kappa/Lambda

Polyklonale oplichting in de tubuli

B. Resultaat manuele IF kleuring op vriescoupes:

IgA Granulaire neerslag 1+

IgG Niet te beoordelen

IgM Granulaire neerslag 1+

C3 Granulaire neerslag t.h.v. capillaire wand 1+

C1q Niet te beoordelen

Kappa/Lambda

Niet te beoordelen

10

Resultaten: Staal 07B 3915

C. Resultaat geautomatiseerde IF kleuring op vriescoupes met de VENTANA Benchmark XT:

Niet te beoordelen

D. Resultaat geautomatiseerde IF kleuring op paraffinecoupes met de VENTANA Benchmark XT methode 1:

Niet te beoordelen

Depositie van IgA

11

Resultaat: Staal 08B 1345

A. Gekend resultaat voor immunofluorescentie:Diffuse glomerulonefritis met tekens van focale sclerose.

B. Resultaat manuele IF kleuring op vriescoupes:

IgA Granulaire neerslag t.h.v. mesangium 2+ en capillaire wand 1+

IgG Negatief

IgM Discrete mesangiale granulaire neerslag 1+

C3 Granulaire neerslag t.h.v. glomeruli en capillaire wand 2+

C1q Negatief

Kappa/Lambda

Negatief

IgA Granulaire neerslag 1+

IgG Niet te beoordelen

IgM Granulaire neerslag 1+

C3 Granulaire neerslag 2+

C1q Negatief

Kappa/Lambda Negatief12

Resultaat: Staal 08B 1345

C. Resultaat geautomatiseerde IF kleuring op paraffinecoupes met de VENTANA Benchmark XT methode 1 en 2:

Niet te beoordelen

Depositie van C3

13

Resultaat: Staal 08B 3740

A. Gekend resultaat voor immunofluorescentie: lupusnefritis klasse III tot IV (A/C)

B. Resultaat manuele IF kleuring op vriescoupes:

IgA Granulaire neerslag t.h.v. mesangium en capillaire wand

IgG Granulaire neerslag t.h.v. mesangium en capillaire wand

IgM Granulaire neerslag t.h.v. mesangium en capillaire wand

C3 Granulaire neerslag t.h.v. mesangium en capillaire wand

C1q Granulaire neerslag t.h.v. mesangium en capillaire wand

Kappa/Lambda

Polyklonale neerslag

IgA Granulaire neerslag 2+

IgG Niet te beoordelen

IgM Granulaire neerslag 2+

C3 Granulaire neerslag 2+

C1q Granulaire neerslag 2+

Kappa/Lambda

Polyklonale neerslag 1+14

Resultaat: Staal 08B 3740

C. Resultaat geautomatiseerde IF kleuring op paraffinecoupes met de VENTANA Benchmark XT methode 1:

Niet te beoordelen

Depositie van IgM

15

Resultaat: Staal 08B 4258

A. Gekend resultaat voor immunofluorescentie: Gekende SLE klasse IIIC

B. Resultaat manuele IF kleuring op vriescoupes:

IgA Granulaire neerslag t.h.v. mesangium en capillaire wand

IgG Granulaire neerslag t.h.v. mesangium en capillaire wand

IgM Granulaire neerslag t.h.v. mesangium en capillaire wand

C3 Granulaire neerslag t.h.v. mesangium en capillaire wand

C1q Granulaire neerslag t.h.v. mesangium en capillaire wand

Kappa/Lambda

Polyklonale neerslag

IgA Granulaire neerslag 2+

IgG Niet te beoordelen

IgM Granulaire neerslag 2+

C3 Granulaire neerslag 2+

C1q Granulaire neerslag 2+

Kappa/Lambda

Polyklonale neerslag 2+16

Resultaat: Staal 08B 4258

C. Resultaat geautomatiseerde IF kleuring op paraffinecoupes met de VENTANA Benchmark XT methode 1:

Niet te beoordelen

Depositie van C1q

17

Conclusie

Naar aanleiding van de gedeeltelijke automatisatie van immunofluorescentie op paraffinecoupes en vriescoupes van nierbiopten met de Benchmark XT vertoonde de FITC kleuring op de vriescoupes het beste resultaat. Dit in tegenstelling tot de kleuring van de paraffinecoupes waarbij het weefsel volledig aankleurde of helemaal niet.

Om een geautomatiseerde immunofluorescentie op paraffinecoupes uit te voeren moet er een geschikt protocol aanwezig zijn in de software van de Benchmark XT. Aanpassingen aan bestaande protocols leverde niets op.

De poging om te automatiseren is dus niet compleet geslaagd.

18