24

(c). Các sensor huỳnh quang Hg2L2 và AMC đều có thể phát

hiện Cys trong dung dịch với lượng nhỏ dung môi hữu cơ, thời gian

của phản ứng xảy ra nhanh, có thể phát hiện được Cys với nồng độ

thấp hơn trong nội bào và thấp hơn so với các sensor đã công bố.

5. Đã sử dụng phương pháp TD-DFT để nghiên cứu đặc tính

huỳnh quang của các chất dựa trên hình học tối ưu tại trạng thái cơ

bản và các trạng thái kích thích; kết hợp với sử dụng phương pháp

phân tích NBO để xem xét sự biến đổi đặc tính huỳnh quang của các

chất dựa trên nghiên cứu bản chất các liên kết. Kết quả tính toán cho

thấy, ion Hg(II) gây nên phản ứng tạo phức với L dẫn đến làm giảm

khoảng cách năng lượng giữa HOMO và LUMO, đồng thời làm thay

đổi hệ liên hợp electron π, là nguyên nhân dẫn đến sự dập tắt huỳnh

quang trong phức Hg2L2. Sự phát xạ huỳnh quang của AMC, AMC-

Cys, AMC-Hcy và AMC-GSH đều xuất phát từ các trạng thái kích

thích electron ở mức cao (S2, S4) về trạng thái cơ bản S0. Đây là một

trường hợp ngoại lệ của quy tắc Kasha.

1

MỞ ĐẦU

Glutathione (GSH), Cysteine (Cys) và Homocysteine (Hcy) là

là những hợp chất thiol, đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh

học. Mức độ bất thường của các biothiol có liên quan đến nhiều loại

bệnh. Thủy ngân là một trong những chất gây ô nhiễm nguy hiểm và

phổ biến, ảnh hưởng nghiêm trọng về sức khỏe con người. Vì vậy,

việc xác định biothiol trong tế bào, hàm lượng thủy ngân trong các

nguồn nước là rất quan trọng trong sự chẩn đoán sớm các bệnh liên

quan, bảo vệ môi trường sống và hiện đang thu hút sự quan tâm của

các nhà khoa học trong và ngoài nước.

Có nhiều phương pháp đã được áp dụng phát hiện các

biothiol và ion Hg(II) như phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

(HPLC), phương pháp phổ khối lượng (MS),…,và phương pháp

huỳnh quang. Trong đó, phương pháp huỳnh quang có nhiều ưu điểm

hơn, đó là không đòi hỏi thiết bị máy móc đắt tiền, dễ thực hiện, ít

tốn kém, và áp dụng phân tích cho nhiều đối tượng, đặc biệt có thể

phân tích các chất trong tế bào sống.

Phương pháp huỳnh quang được Giáo sư Anthony W.

Czarnik ở Đại học Quốc gia Ohio nghiên cứu và đề xuất cách tiếp

cận mới trong lĩnh vực sensor quang học vào năm 1992. Với những

ưu thế của phương pháp huỳnh quang, nên trong nhiều năm qua, các

nghiên cứu về sensor huỳnh quang nhằm phát hiện các ion kim loại,

anion, đặc biệt các phân tử sinh học luôn thu hút sự quan tâm của

các nhà khoa học trong và ngoài nước với số lượng các sensor

huỳnh quang mới được công bố ngày càng nhiều trên thế giới. Ở

Việt Nam, việc nghiên cứu sensor huỳnh quang bắt đầu từ năm 2007

bởi tác giả Dương Tuấn Quang.

Để xác định các biothiol, các nghiên cứu đã thiết kế sensor

huỳnh quang dựa trên các phản ứng đặc trưng của biothiol, phản ứng

trao đổi phức (phức của chất huỳnh quang với ion Cu(II)…). Các

nghiên cứu về sensor huỳnh quang phát hiện ion Hg(II) đã dựa trên

các phản ứng đặc trưng của ion Hg(II) và dựa trên phản ứng tạo phức

giữa ion Hg(II) với các phối tử -O, -N, -S trong vòng hoặc ở mạch hở.

2

Tuy nhiên, đa phần các sensor này vẫn tồn tại một số hạn chế như sử

dụng một lượng lớn dung môi hữu cơ, giới hạn phát hiện còn cao, có

bước sóng phát xạ ngắn gây ảnh hưởng đến tế bào, và phản ứng giữa

sensor với chất phân tích xảy ra chậm. Hiện nay, các nhà khoa học trên

thế giới vẫn đang tiếp tục nghiên cứu thiết kế các sensor huỳnh quang có

độ nhạy và độ chọn lọc cao để phát hiện các biothiol và ion Hg(II).

Hiện nay, hoá tính toán đã trở thành công cụ quan trọng

trong nghiên cứu hoá học nói chung và nghiên cứu sensor huỳnh

quang nói riêng. Sự kết hợp hóa tính toán với nghiên cứu thực

nghiệm là hướng nghiên cứu hiện đại. Tuy nhiên, hiện vẫn còn rất ít

sensor huỳnh quang nghiên cứu theo hướng này được công bố.

Trước những thực trạng trên, chúng tôi thực hiện đề tài:

"Thiết kế, tổng hợp một số sensor huỳnh quang từ dẫn xuất của

cyanine và coumarin để xác định biothiol và Hg(II) ".

Những đóng góp mới của luận án:

- Sensor L mới được thiết kế từ dẫn xuất cyanine đã được

công bố, phát hiện chọn lọc ion Hg(II) dựa trên phản ứng tạo

phức, hoạt động theo kiểu ON-OFF; phức chất của Hg(II) với L

(Hg2L2) phát hiện chọn lọc Cys dựa trên phản ứng trao đổi phức,

hoạt động theo kiểu tắt-bật (OFF-ON). Giới hạn phát hiện và giới

hạn định lượng ion Hg(II) bằng L tương ứng là 11,8 μg/L và 39,3

μg/L hay 0,059 μM và 0,19 μM; giới hạn phát hiện và giới hạn

định lượng Cys bằng Hg2L2 tương ứng là 0,2 μM và 0,66 μM.

- Sensor AMC mới được thiết kế từ dẫn xuất coumarin đã

được công bố, phát hiện chọn lọc Cys dựa trên phản ứng cộng

Michael, hoạt động theo kiểu dựa trên sự biến đổi tỷ lệ cường độ

huỳnh quang ở hai bước sóng. Giới hạn phát hiện và giới hạn định

lượng Cys được xác định tương ứng là 0,5 μM và 1,65 μM.

- L và AMC được nghiên cứu bằng sự kết hợp linh hoạt

nghiên cứu tính toán hóa lượng tử với nghiên cứu thực nghiệm.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan nghiên cứu về sensor huỳnh quang

1.1.1. Tình hình nghiên cứu sensor huỳnh quang

23

NHỮNG KẾT LUẬN CHÍNH CỦA LUẬN ÁN

1. Đã kết hợp linh hoạt giữa tính toán hóa học lượng tử và

nghiên cứu thực nghiệm để nghiên cứu phát triển thành công hai

sensor huỳnh quang mới là L và AMC. Sự kết hợp linh hoạt này đã

giảm đáng kể khối lượng tính toán lý thuyết và thực nghiệm, tiết

kiệm thời gian và chi phí hóa chất sử dụng, tăng khả năng thành

công, làm sáng tỏ được bản chất các quá trình, tạo cơ sở khoa học

cho các nghiên cứu tiếp theo.

2. Các phản ứng tổng hợp sensor L và sensor AMC đã được

nghiên cứu dự đoán từ tính toán và khẳng định từ kết quả tổng hợp

thực nghiệm sau đó.

3. Cấu trúc, đặc tính của sensor L và sensor AMC đã được

xác định ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ với kết quả đáng

tin cậy, thông qua kiểm tra, đối chiếu và khẳng định từ các kết

quả thực nghiệm.

4. (a). Sensor L có thể phát hiện chọn lọc ion Hg(II) trong sự

có mặt các ion kim loại khác, hoạt động theo kiểu bật-tắt huỳnh

quang. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ion Hg(II) theo

phương pháp trắc quang là 0,076 μM và 0,25 μM; theo phương pháp

huỳnh quang là 0,059 μM và 0,19 μM. Phức Hg2L2 có thể phát hiện

chọn lọc Cys trong sự hiện diện các amino acids không có nhóm

thiol, hoạt động theo kiểu tắt-bật huỳnh quang. Giới hạn phát hiện và

giới hạn định lượng Cys tương ứng là 0,2 μM và 0,66 μM. Sensor L

phát hiện ion Hg(II) và phức Hg2L2 phát hiện Cys dựa trên phản ứng

trao đổi phức giữa ion trung tâm Hg(II) với hai phối tử là L và Cys.

(b). Sensor AMC có thể phát hiện chọn lọc các biothiol (Cys,

GSH, Hcy) trong sự hiện diện các amino acids không có nhóm thiol,

hoạt động dựa trên sự biến đổi tỉ lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước

sóng. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng Cys tương ứng là 0,5

μM và 1,65 μM. Sensor AMC phản ứng với các biothiol (Cys, GSH,

Hcy) theo cơ chế phản ứng AMC cộng Michael.

22

Đối với AMC-Cys, các quá trình chuyển electron từ S1 về S0

tại cấu hình REES1 và cấu hình REES2 là bị cấm. Trong khi đó, các quá

trình chuyển electron từ S2 về S0 tại cấu hình REES1 và cấu hình REES2

của AMC-Cys là xảy ra. Thêm vào đó, do cường độ dao động (f) của

cả hai quá trình này là rất lớn, trong đó cường độ dao động (f) ở bước

sóng 340,3 nm là 0,5122, lớn hơn ở bước sóng 324,5 nm là 0,3171;

điều này dẫn đến cường độ huỳnh quang của AMC-Cys quan sát

được trong thực nghiệm là rất mạnh, và ở bước sóng dài 340,3 nm là

mạnh hơn nhiều so với ở bước sóng ngắn 324,5 nm. Ngoài ra, do quá

trình chuyển electron từ S2 về S1 tại cấu hình REES1, với cấu hình S2

tương ứng không phải là cấu hình có năng lượng cực tiểu, nên quá

trình (6) ở Hình 3.48b ít chiếm ưu thế hơn so với quá trình (4) ở Hình

3.48b. Đó có thể là một nguyên nhân khác dẫn đến cường độ huỳnh

quang ở bước sóng dài (340,3 nm) mạnh hơn rất nhiều so với ở bước

sóng ngắn (324,5 nm) như quan sát trong thực nghiệm.

Đối với AMC-Hcy và AMC-GSH (tương tự AMC-Cys).

Như đã trình bày, kết quả nghiên cứu về hình học tối ưu các

trạng thái kích thích của AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy và AMC-

GSH cho thấy, đối với sensor AMC, có sự xoắn góc mạnh giữa tiểu

phần coumarin và tiểu phần acryloxy tại cấu hình REES1 và REES2, điều

này dẫn đến sự phá vỡ hệ thống electron π liên hợp giữa hai tiểu

phần, kéo theo đó là mật độ electron giữa tiểu phần coumarin và tiểu

phần acryloxy bị phân tách mạnh. Kết quả là có sự xen phủ rất ít giữa

các MO trong các bước chuyển đổi electron ở trạng thái kích thích

của sensor AMC. Ngược lại, tại REES2 của AMC-Cys, AMC-Hcy và

AMC-GSH, tiểu phần coumarin và tiểu phần acryloxy nằm trong

cùng một mặt phẳng. Đây là một yếu tố thuận lợi cho sự xen phủ

giữa các MO trong các bước chuyển đổi trạng thái.

Những phân tích ở trên cho thấy, sự phát huỳnh quang của

sensor AMC và các sản phẩm cộng của nó với các biothiol không bắt

nguồn từ trạng thái S1. Đây là một trường hợp ngoại lệ của quy tắc

của Kasha.

3

1.1.2. Nguyên lý hoạt động của sensor huỳnh quang

1.1.3. Cấu tạo của sensor huỳnh quang

1.1.4. Nguyên tắc thiết kế các sensor huỳnh quang

1.2. Vai trò của các biothiol trong tế bào và phương pháp phát hiện

1.2.1. Các biothiol và vai trò của chúng

1.2.2. Phương pháp phát hiện các biothiol

1.3. Nguồn ô nhiễm, độc tính, phương pháp phát hiện ion Hg(II)

1.3.1. Nguồn ô nhiễm, độc tính của ion Hg(II)

1.3.2. Phương pháp phát hiện ion Hg (II)

1.4. Sensor huỳnh quang phát hiện các biothiol

1.4.1. Dựa trên phản ứng tạo vòng với các aldehyde

1.4.2. Dựa trên phản ứng cộng Michael

1.4.3. Dựa trên phản ứng ghép nối peptide

1.4.4. Dựa trên phản ứng sắp xếp lại nhóm thế ở nhân thơm

1.4.5. Dựa trên phản ứng phân tách sulfonamide ester hoặc sulfonate

ester bởi thiol

1.4.6. Dựa trên phản ứng phân tách disulfides bởi thiol

1.4.7. Dựa trên phản ứng hình thành và phân hủy phức

1.4.8. Dựa trên các cơ chế khác

1.5. Sensor huỳnh quang phát hiện ion Hg(II)

1.5.1. Dựa trên các phản ứng tạo phức với ion Hg(II)

1.5.2. Dựa trên các phản ứng đặc trưng của ion Hg(II)

1.6. Sensor huỳnh quang phát hiện biothiol và ion Hg(II) dựa

trên fluorophore là cyanine và coumarin

1.7. Tổng quan ứng dụng hóa học tính toán trong nghiên cứu

các sensor huỳnh quang

CHƯƠNG 2

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Mục tiêu nghiên cứu

2.2. Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng

sensor huỳnh quang L từ dẫn xuất của cyanine để phát hiện chọn lọc

các biothiol và ion Hg(II):

4

+ Nghiên cứu lý thuyết về thiết kế, tổng hợp và đặc trưng của

sensor L.

+ Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng

của sensor L.

+ Nghiên cứu lý thuyết về ứng dụng của sensor L phát hiện

ion Hg(II).

+ Nghiên cứu sử dụng phức (tạo bởi ion Hg(II) với sensor L)

phát hiện các biothiol. Trong đó, nghiên cứu lý thuyết được tiến hành

trước để định hướng cho việc nghiên cứu ứng dụng của phức tiếp theo.

- Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng của

sensor AMC từ dẫn xuất của coumarin để phát hiện chọn lọc

các biothiol:

+ Nghiên cứu lý thuyết về thiết kế, tổng hợp sensor AMC và

phản ứng của sensor AMC với các biothiol.

+ Nghiên cứu thực nghiệm về tổng hợp, đặc trưng và ứng

dụng của sensor AMC.

+ Nghiên cứu lý thuyết về đặc tính và ứng dụng của

sensor AMC.

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp nghiên cứu tính toán lý thuyết

- Việc xác định cấu trúc hình học bền, năng lượng điểm đơn

được thực hiện bằng phương pháp DFT tại B3LYP/LanL2DZ, sử

dụng phần mềm Gaussian 03.

- Các thông số năng lượng tương tác được hiệu chỉnh ZPE

gồm biến thiên entanpi và biến thiên năng lượng tự do Gibbs của các

phản ứng được tính toán dựa trên sự khác biệt giữa tổng năng lượng

của các sản phẩm và tổng năng lượng các chất tham gia.

- Tính toán trạng thái kích thích và các yếu tố phụ thuộc thời

gian được thực hiện bởi phương pháp TD-DFT ở cùng mức lý thuyết.

- Các phân tích AIM và NBO được tiến hành ở cùng mức lý

thuyết B3LYP/LanL2DZ.

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

21

quang của AMC là nhỏ như quan sát được trong thực nghiệm. Ngoài

ra, do quá trình kích thích từ S0→S1 (quá trình (1) ở Hình 3.48a) có

cường độ dao động lớn hơn nhiều so với quá trình kích thích từ

S0→S2 (quá trình (2) ở Hình 3.48a), nên quá trình chuyển electron từ

S1 về S0 (quá trình (3) ở Hình 3.48a) sẽ chiếm ưu thế hơn từ S2 về S0

(quá trình (4) ở Hình 3.48a). Điều này có thể là nguyên nhân dẫn đến

cường độ huỳnh quang ở bước sóng dài (469,5 nm) mạnh hơn cường

độ huỳnh quang ở bước sóng ngắn (417,4 nm) như quan sát trong

thực nghiệm.

Hình 3.48. Giản đồ năng lượng các quá trình kích thích và giải phóng

năng lượng kích thích tại hình học bền ở trạng thái cơ bản (RGS) và trạng thái kích

thích electron (REES1, REES2,...) ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ: (a) AMC;

(b) AMC-Cys; (c) AMC-Hcy; (d) AMC-GSH

(d)

(a) (b)

(c)

20

3.2.3.2. Nghiên cứu lý thuyết phổ kích thích và phổ huỳnh quang

a. Nghiên cứu lý thuyết phổ kích thích

Từ kết quả tính toán cho thấy, trong sensor AMC, bước

chuyển electron singlet từ trạng thái cơ bản S0 lên trạng thái kích

thích S1 là bước chuyển chính, với cường độ dao động (f) lớn nhất là

0,5348, tại bước sóng 320,9 nm. Bước chuyển trạng thái S0→S1 chủ

yếu là do sự đóng góp của bước chuyển electron từ HOMO→LUMO,

với tỷ lệ đóng góp lên đến 96,21%. Bên cạnh đó, sự xen phủ giữa

HOMO và LUMO là rất lớn, điều này cho thấy việc chuyển electron

từ HOMO sang LUMO là thuận lợi. Các bước chuyển trạng thái khác

đều có cường độ dao động (f) nhỏ không đáng kể.

Trong khi đó, với AMC-Cys, AMC-Hcy, và AMC-GSH, số

liệu tính toán cho thấy, bước chuyển electron singlet từ trạng thái cơ

bản S0 lên trạng thái kích thích S2 là bước chuyển chính, với cường

độ dao động (f) lần lượt là 0,3723; 0,3694 và 0,3801 (lớn hơn rất

nhiều so với các bước chuyển khác), tại các bước sóng tương ứng là

300,6; 300,4 và 300,7 nm. Trong các bước chuyển trạng thái này,

bước chuyển electron từ HOMO-1→LUMO là bước chuyển chính,

với tỷ lệ đóng góp tương ứng là 89,17; 89,05 và 89,24%. Mặt khác,

sự xen phủ giữa HOMO-1 và LUMO là rất lớn, nên việc chuyển

electron từ HOMO-1 lên LUMO là thuận lợi. Các bước chuyển trạng

thái khác đều có cường độ dao động (f) nhỏ không đáng kể.

Kết quả phân tích các MO biên cũng cho thấy, không có sự

xen phủ giữa HOMO và HOMO-1. Do đó, trong AMC, AMC-Cys,

AMC-Hcy và AMC-GSH không xảy ra quá trình PET từ HOMO đến

HOMO-1. Kết quả, các chất AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy và AMC-

GSH đều phát huỳnh quang như trình bày ở thực nghiệm.

b. Nghiên cứu lý thuyết phổ huỳnh quang

Đối với sensor AMC, tại cấu hình REES1, các quá trình

chuyển electron từ S1 và S2 về S0 là bị cấm. Tại cấu hình REES2, các

quá trình chuyển electron từ S1 và S2 về S0 là xảy ra. Thêm vào đó,

do cường độ dao động (f) của cả hai quá trình (3) và (4) ở trên là lớn

không đáng kể (0,0137 và 0,0152), điều này dẫn đến cường độ huỳnh

5

- Đặc trưng cấu trúc của các chất được khẳng định bởi các

phổ 1H -NMR, phổ 13C- NMR, phổ khối MS.

- Đặc tính, ứng dụng của các sensor được thực hiện bởi

phương pháp quang phổ huỳnh quang và UV-Vis.

- Các điều kiện tổng hợp các sensor đã được nghiên cứu dựa

trên kết quả dự đoán từ tính toán lý thuyết và kết quả thực nghiệm

công bố trước đây về các phản ứng tương tự [2], [3], [29]. Quy trình

tổng hợp các sensor được tóm tắt như sau:

a. Tổng hợp sensor L

* Tổng hợp CBZT 2-methylbenzothiazole (3,0 g, 0,02 mol) và acid bromoacetic

(4,18 g, 0,03 mol) được hòa tan trong 50 mL ethanol tuyệt đối. Hỗn hợp phản ứng được đun hồi lưu trong 8 giờ. Sau đó để nguội đến nhiệt độ phòng và thu được kết tủa. Rửa sạch kết tủa nhiều lần với ethanol trong môi trường kiềm, sau đó làm khô thu được chất rắn CBTZ (khoảng 4,0 g với hiệu suất 75%).

* Tổng hợp sensor L CBTZ (290mg,1mmol) và 4-diethylamino-2-

hydroxybenzaldehyde (190 mg, 1 mmol) được hòa tan trong 30 mL

ethanol tuyệt đối. Thêm 1 giọt piperidine, dung dịch phản ứng

chuyển sang màu đỏ. Đun hồi lưu hỗn hợp phản ứng trong 10 giờ,

sau đó làm nguôi đến nhiệt độ phòng. Lọc lấy kết tủa, rửa sạch nhiều

lần bởi diethyl ether và sau đó làm khô thu được sản phẩm L (khoảng

3,0 g, với hiệu suất khoảng 38%).

b. Tổng hợp AMC

Hòa tan 4-methyl-7-hydroxylcoumarin (1,7 g, 9,4 mmol) và

Et3N (7,9 mL, 56,4 mmol) trong CH2Cl2 (20 mL), thêm một lượng

nhỏ chất xúc tác 4-dimethylaminopyridine, thu được dung dịch. Làm

lạnh và giữ dung dịch phản ứng ở nhiệt độ 0 oC. Thêm từ từ (trong

khoảng thời gian 1 giờ) vào dung dịch phản ứng từng giọt dung dịch

acryloyl chloride (1,9 mL, 23,5 mmol) trong CH2Cl2 (20 mL). Sau

đó, khuấy dung dịch phản ứng 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Thêm nước

vào dung dịch thu được để hòa tan các muối amine. Tiếp tục rửa sạch

pha hữu cơ thu được bằng nước, sau đó làm khô pha hữu cơ bằng

6

muối MgSO4 khan. Làm bay hơi dung môi hữu cơ trên máy cô quay

chân không. Sản phẩm sau đó được tinh chế bằng cách kết tinh lại

trong ethanol, thu được chất rắn kết tinh màu trắng, khối lượng

khoảng 1 gam, hiệu suất khoảng 45%.

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng sensor L từ dẫn

xuất của cyanine phát hiện các biothiol và ion Hg(II) dựa trên

phản ứng tạo phức

3.1.1. Nghiên cứu lý thuyết về thiết kế, tổng hợp, đặc trưng của

sensor L

3.1.1.1. Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp sensor L

Mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ đã được áp dụng cho hệ

nghiên cứu.

Các dẫn xuất cyanine bao gồm R2N+=CH[CH=CH]n-NR2,

Aryl=N+=CH[CH=CH]n-NR2, Aryl=N+=CH[CH=CH]n-N=Aryl, các

dạng này đều có cấu trúc donor - hệ liên hợp π - acceptor. Trong đó,

donor (nhóm đẩy electron) là một nhóm amino; aceptor (nhóm rút

electron) là ion amoni. Chúng được biết đến là những hợp chất màu,

phát huỳnh quang mạnh [40].

Sensor L dự kiến thiết kế theo sơ đồ tổng hợp sau:

N

S N

S

-O2C

BrCH2COOH N

S

-O2C

N

HO

OHC N

HO

LCBZTBZT

(I) (II)

Hình 3.1. Sơ đồ thiết kế và tổng hợp sensor L

Trong đó fluorophore là cyanine, receptor là nhóm -COO-, là

nhóm có ái lực mạnh với ion Hg(II); các phản ứng tổng hợp L thực

hiện qua hai giai đoạn: giai đoạn (I) và giai đoạn (II).

Receptor

Fluorophore

19

huỳnh quang của các dung dịch gồm AMC + biothiol + các amino

acids với các dung dịch gồm AMC + biothiol (Hình 3.38b).

d. Khảo sát sử dụng sensor AMC phát hiện định lượng Cys

Trong khoảng nồng độ Cys từ 0 đến 10 μM, tỷ lệ cường độ

huỳnh quang ở hai bước sóng 450 và 375 nm (F450/375) có quan hệ

tuyến tính với nồng độ Cys theo phương trình: F450/375 = 1,5431 +

2,257 × [Cys], với R = 0,982. Giới hạn phát hiện và giới hạn định

lượng Cys đã được xác định tương ứng là 0,5 μM và 1,65 μM.

3.2.3. Nghiên cứu lý thuyết về đặc tính và ứng dụng của AMC

3.2.3.1. Hình học tối ưu của AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy và

AMC-GSH ở trạng thái cơ bản và trạng thái kích thích electron

Đối với sensor AMC, ở trạng thái cơ bản S0, tiểu phần

coumarin và acryloxy gần như đồng phẳng. Trong khi đó, ở trạng thái

kích thích electron S1(REES1) và S2(REES2), tiểu phần coumarin và

acryloxy gần như ở trong hai mặt phẳng vuông góc với nhau.

Đối với AMC-Cys, AMC-Hcy và AMC-GSH, trong các cấu

hình S0(RGS) và S1(REES1), có sự xoắn góc giữa tiểu phần coumarin và

acryloxy. Trong khi đó, ở cấu hình S2(REES2), tiểu phần coumarin và

acryloxy gần như đồng phẳng.

Hình 3.38. (a) Phổ huỳnh quang của AMC (10 μM, C2H5OH/HEPES, pH

=7,4, 1/4, v/v, tại 25 oC) khi thêm Cys, Hcy, GSH, các amino acids khác (bao gồm Arg,

Gly, Ala, Asp, Glu, Leu, Lys, Ile, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr and Val); (b)Phổ huỳnh quang

của AMC (10 μM, C2H5OH/HEPES, pH =7,4, 1/4, v/v, tại 25 oC) trong sự hiện diện của

hỗn hợp các amino acids (bao gồm Arg, Gly, Ala, Asp, Glu, Leu, Lys, Ile, Met, Thr, Ser,

Trp, Tyr và Val) khi thêm Cys, Hcy và GSH

18

Trong khi đó, dung dịch sensor AMC tự do hiển thị một

dải phát xạ huỳnh quang vai với hai đỉnh cực đại ở bước sóng 375

nm và 450 nm (Hình 3.33b). Hiệu suất lượng tử huỳnh quang (Φ)

của sensor AMC đã được xác định là 0,05. Khi thêm Cys vào

dung dịch sensor AMC, cường độ huỳnh quang tăng dần ở cả hai

đỉnh phát xạ. Trong đó, cường độ phát xạ huỳnh quang ở bước

sóng dài tăng mạnh hơn cường độ phát xạ huỳnh quang ở bước

sóng ngắn. Sự thay đổi cường độ huỳnh quang ở cả hai bước sóng

375 và 450 nm như trên dẫn đến một khả năng có thể sử dụng

AMC để làm sensor huỳnh quang hoạt động dựa trên sự biến đổi

tỷ lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước sóng để xác định Cys.

b. Khảo sát phản ứng giữa sensor AMC với Cys

Khi thêm Cys từ 0 đến 10 μM vào dung dịch AMC (10

μM), tỷ lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước sóng 450 và 375 nm

(F450/375) có quan hệ tuyến tính chặt chẽ với nồng độ Cys. Sau đó,

tỷ lệ này thay đổi không đáng kể nếu tiếp tục tăng nồng độ Cys.

Điều này cho thấy phản ứng giữa AMC với Cys xảy ra theo tỷ lệ

mol 1:1 (tương tự Hcy và GSH). Kết quả này phù hợp với kết quả

thu được khi xác định hệ số tỷ lượng của phản ứng giữa AMC với

Cys bằng phương pháp đồng phân tử gam và phân tích phổ khối

lượng của sản phẩm phản ứng giữa AMC và Cys.

c. Khảo sát ảnh hưởng của các amino axit cạnh tranh

Kết quả khảo sát cho thấy, khi bổ sung các amino acids có

chứa thiol, cường độ huỳnh quang của dung dịch AMC cũng tăng

lên rõ rệt ở cả hai dải phát xạ, trong đó tăng mạnh mẽ ở bước sóng

450 nm và tăng vừa phải ở bước sóng phát xạ 375 nm. Tuy nhiên,

mức độ gia tăng cường độ huỳnh quang theo thứ tự như sau: Cys>

GSH> Hcy (Hình 3.38a).

Đối với amino acids khác không có chứa nhóm thiol hầu như

không làm thay đổi cường độ huỳnh quang của dung dịch sensor

AMC (Hình 3.38a). Sự có mặt của amino acids này cũng không làm

ảnh hưởng đến phản ứng giữa các biothiol (Cys, GSH và Hcy) với

AMC, bằng chứng là không xuất hiện sự khác biệt đáng kể giữa phổ

7

Phản ứng ghép nối receptor vào fluorophore, phản ứng số (I)

dựa trên phản ứng giữa 4-metyl quinoline và dẫn xuất acid carboxylic [29], phản ứng ghép nối tạo fluorophore, phản ứng số (II) dựa trên

phản ứng phản ứng cộng andol và ngưng tụ croton [3].

a. Khảo sát các phản ứng của giai đoạn (I)

Phản ứng hình thành CBZT từ

BZT và acid bromoacetic được

trình bày ở Hình 3.2 và 3.3. Kết quả tính toán cho thấy, phản ứng

giữa BZT với acid bromoacetic để hình thành CBZT-3 và phản ứng

giữa CBZT-3 và dung dịch kiềm để hình thành CBZT là thuận lợi về

mặt nhiệt động.

b. Khảo sát các phản ứng của giai đoạn (II)

Phản ứng hình thành L từ CBZT với DHB có thể tạo ra 4 sản phẩm (Hình 3.5). Kết quả tính toán cho thấy, biến thiên năng lượng tự do Gibbs (∆G298) của phản ứng (12) là âm nhất. Theo đó, phản ứng giữa CBZT với DHB theo hướng hình thành sản phẩm L là thuận lợi về mặt nhiệt động.

S

N

BrCH2COOH Br-

S

N+

COOHCBZT-1

(1)

S

N

BrCH2COOH HBr

S

N+

COO-

BZT CBZT-2

(2)

S

N

BrCH2COOH

S

N+

COOH...Br-BZT CBZT-3

(3)

S

N

BrCH2COOH

S

N+

COOHBZT CBZT-4

(4)

Br-

S

N

BrCH2COOH

S

N

COOHBZT CBZT-5

Br

(5)

BZT

Hình 3.2. Các sản phẩm có thể có từ phản

ứng giữa BZT với acid bromoacetic

CH3CH2OH

Br-

S

N+

COO-

CBZT

S

N+

COOH...Br-

CH3CH2OH2+

H2O

Br-

S

N+

COO-

CBZT

(7)S

N+

COOH...Br-

CBZT-3

H3O+

OH-

Br-

S

N+

COO-

CBZT

(8)

S

N+

COOH...Br-

CBZT-3

H2O

(6)

CBZT-3

Hình 3.3. Các phản ứng hình thành

CBZT từ CBZT-3

N+

S

COO-

N+

S

COO-

N

HO

OHC N

HO

CBZT

(9)

N+

S

COO-

L-1

(11)

HO

N

L-3

H2O

H2O

N+

S

COO-

N (10)

L-2

H2O

HO

N+

S

COO-

(12)N

L

H2O

HO

DHB

Hình 3.5. Các sản phẩm phản ứng có thể hình thành giữa CBZT với DHB

8

3.1.1.2. Nghiên cứu lý thuyết đặc tính của L a. Cấu trúc phân tử của L

Chiều dài các liên kết, số đo các góc liên kết, góc nhị diện trong L đã được tính toán. Trong đó, các tiểu phần BZT, acid bromacetic và DHB ít thay đổi so với ban đầu. Trong L có sự hình thành liên kết mới giữa N7 và C11 và liên kết đôi giữa nguyên tử C10 và nguyên tử C12. b. Phân tích phổ UV-Vis của sensor

Phổ UV-Vis của sensor L đạt cực đại ở bước sóng 452,6 nm.

Trong một công bố trước đây, chất BZTVPA có cấu trúc tương tự

như sensor L có bước sóng hấp thụ cực đại ở 405 nm, là một chất

phát xạ huỳnh quang mạnh ở bước sóng 495 nm. Kết quả này dẫn

đến kỳ vọng đặc tính huỳnh quang của L tương tự BZTVPA.

c. Phân tích đặc tính huỳnh quang của sensor L Bảng 3.5. Năng lượng kích thích, cường độ dao động và các MO có liên

quan đến quá trình kích thích chính của L ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

Bước chuyển

MO Năng lượng (eV)

Bước sóng (nm)

f Tỷ lệ % đóng góp

S0→S1 95→97 2,53 489,8 0,2566 56,44

96→97 35,80

S0→S2 93→97 2,74 452,6 0,5626 29,22

95→97 28,63

96→97 28,66

S0→S3 92→97 2,86 432,9 0,0097 5,90

93→97 8,83

94→97 77,56

S0→S4 92→97 3,00 413,2 0,5815 5,42

93→97 49,94

Hình 3.6. Hình học bền của L ở mức lý thuyết

B3LYP/LanL2DZ

17

ester tạo bởi acid acrylic và các ancol (thường là các fluorophore),

ban đầu tạo ra các thioether, tiếp theo là hình thành các hợp chất

dị vòng đối với trường hợp của Cys và Hcy. Trong khi đó, các

thioether của GSH thường bền, không xảy ra quá trình tạo các hợp

chất vòng sau đó.

Khác với nghiên cứu trên, kết quả tính toán về mặt nhiệt

động cho thấy, các phản ứng giữa sensor AMC với các biothiol (bao

gồm Cys, Hcy và GSH) để hình thành các thioether theo tỉ lệ mol 1:1

là thuận lợi về mặt nhiệt động.

3.2.2. Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng

của AMC

3.2.2.1. Thực nghiệm tổng hợp sensor AMC

Sau khi tổng hợp, cấu trúc của sản phẩm AMC đã được khẳng định bởi phổ 1H-NMR và phổ FAB-MS. 3.2.2.2. Nghiên cứu thực nghiệm về đặc tính và ứng dụng của

sensor AMC

a. Khảo sát phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của sensor AMC

Hình 3.33a cho thấy, phổ hấp thụ của dung dịch sensor

AMC tự do đạt cực đại tại bước sóng 275 và 320 nm. Khi thêm

Cys vào dung dịch của sensor AMC, phổ hấp thụ thay đổi không

đáng kể.

Hình 3.33. Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của sensor AMC: (a) Phổ hấp thụ, AMC (10 μM)

trong C2H5OH/HEPES (pH=7,4, 1/4, v/v) tại 25C khi thêm 20 μM Cys; (b) Phổ huỳnh quang,

AMC (10 μM) khi thêm 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 μM Cys

trong C2H5OH/HEPES (pH =7,4, 1/4, v/v) tại 25C, bước sóng kích thích 320 nm

16

0,998. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng đã được xác định

tương ứng là 0,2 μM và 0,66 μM.

3.2. Thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dựng của sensor huỳnh

quang AMC từ dẫn xuất của coumarin phát hiện các biothiol dựa

trên phản ứng cộng Michael

3.2.1. Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp sensor AMC và phản ứng

giữa sensor AMC với các biothiol

3.2.1.1. Nghiên cứu lý thuyết thiết kế và tổng hợp sensor AMC

Hợp chất 4-methyl-7-hydroxycoumarin hấp thụ cực đại ở

bước sóng 359 nm và phát xạ cực đại ở bước sóng 449 nm [159].

Để thiết kế sensor huỳnh quang AMC (7- acryloyl -4-

metylcouramin) từ dẫn xuất của coumarin dùng để phát hiện các

biothiol dựa trên phản ứng cộng Michael, hợp chất 4-methyl-7-

hydroxylcoumarin được chọn làm fluorophore, còn receptor là

acryloyl chloride, vì phản ứng gắn receptor lên fluorophore dễ dàng

thực hiện thông qua phản ứng ester hóa giữa nhóm phenol với dẫn

xuất axit [2] và receptor này có thể gây ra phản ứng cộng với

các biothiol.

Sensor AMC dự kiến thiết kế theo sơ đồ tổng hợp sau:

OO OH OO O

O

AMC

O

Cl+

HCl+

(A)

(B)

Hình 3.29. Sơ đồ thiết kế và tổng hợp sensor AMC

Kết quả tính toán cho thấy, ΔG298 của phản ứng tổng hợp

sensor AMC là âm, theo đó phản ứng tổng hợp sensor AMC là thuận

lợi về mặt nhiệt động.

3.2.1.2. Nghiên cứu lý thuyết về phản ứng giữa sensor AMC với

các biothiol

Theo các kết quả nghiên cứu đã công bố trước đây, phản

ứng cộng Michael giữa các biothiol (Cys, Hcy và GSH) với các

Receptor

Fluorophore

9

Bước chuyển

MO Năng lượng (eV)

Bước sóng (nm)

f Tỷ lệ % đóng góp

94→97 10,62

95→97 9,35

96→97 11,07

S0→S5 92→97 3,05 406,0 0,0060 86,61

93→97 7,68

S0→S6 90→97 3,92 316,7 0,0051 44,35

91→97 41,32

96→97 8,40

Kết quả tính toán (Bảng 3.5) cho thấy, các trạng thái kích

thích có cường độ dao động lớn là S0→S1, S0→S2 tại các bước sóng

tương ứng lần lượt là 489,8 nm và 452,6 nm đều có sự đóng góp khá

lớn (tương ứng là 35,80% và 28,66%) của bước chuyển electron từ

MO-96 lên MO-97. Do đây là các MO liên tiếp, nên không có quá

trình PET nào can thiệp đến bước chuyển này. Kết quả này dẫn đến

một kỳ vọng rằng L là hợp chất phát huỳnh quang.

3.1.2. Nghiên cứu thực nghiệm tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng của sensor L 3.1.2.1. Thực nghiệm tổng hợp L

Sau khi tổng hợp, cấu trúc của sản phẩm CBZT và L đã được khẳng định bởi phổ 1H-NMR, 13C-NMR và phổ FAB-MS. 3.1.2.2. Khảo sát thực nghiệm ứng dụng sensor L phát hiện ion Hg(II) a. Khảo sát phổ UV-Vis và phổ huỳnh quang của sensor L

Hình 3.10. Phổ hấp thụ UV-Vis và phổ huỳnh quang của L: (a) Phổ UV-Vis, L (5,0 μM)

trong C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4; (b) Phổ huỳnh quang, L (5 μM) trong C2H5OH/H2O

(1/9, v/v), pH ~7,4, bước sóng kích thích 540 nm

10

Như dự đoán từ tính toán, L phát huỳnh quang màu đỏ, với hiệu suất lượng tử huỳnh quang là 0,175; bước sóng huỳnh quang cực đại 585 nm, bước sóng hấp thụ cực đại 540 nm. b. Khảo sát phổ chuẩn độ UV-Vis và phổ huỳnh quang của

sensor L phát hiện ion Hg(II)

Hình 3.11 cho thấy, Hg(II) phản ứng và làm thay đổi phổ

UV-Vis và phổ huỳnh quang của L. Cường độ huỳnh quang dung

dịch L giảm dần khi tăng nồng độ Hg(II).

c. Khảo sát phản ứng giữa sensor L với ion Hg(II)

Hình 3.12 cho thấy,

cường độ huỳnh quang

dung dịch L giảm mạnh

khi nồng độ ion Hg(II)

tăng từ 0 đến 5,0 M; và

sau đó giảm không đáng

kể khi tiếp tục tăng nồng

độ ion Hg(II). Điều này

cho thấy L phản ứng với

Hg(II) theo tỷ lệ mol 1:1. Hình 3.12. Đồ thị xác định quan hệ tỷ lượng phản

ứng giữa ion Hg(II) với L (L (5,0 M) trong

C2H5OH/H2O (1/9, v/v) ở pH ~7,4, bước sóng huỳnh quang 585 nm, bước sóng kích thích 540 nm

Hình 3.11. Phổ chuẩn độ UV-Vis và phổ huỳnh quang của L bởi ion Hg(II): (a) Phổ UV-Vis, L (5,0

μM) trong C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, Hg(ClO4)2 (0 -5,0 μM); (b) Phổ huỳnh quang, L (5,0 μM)

trong C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, Hg(ClO4)2 (0 -5,0 μM), bước sóng kích thích 540 nm

15

Hình 3.24 cho thấy, khi tăng dần Cys vào dung dịch phức

Hg2L2: ở phổ UV-Vis, đỉnh hấp thụ cực đại ở bước sóng 460 nm dần

dần biến mất, đồng thời xuất hiện một đỉnh hấp thụ cực đại mới với

cường độ hấp thụ rất mạnh ở bước sóng 540 nm; ở phổ huỳnh quang,

cường độ huỳnh quang tăng dần trở lại.

b. Khảo sát ảnh hưởng của các amino acids cạnh tranh và phản

ứng của Hg2L2 với các biothiol

Kết quả trình bày ở Hình 3.25a cho thấy, chỉ các amino acids

có chứa nhóm thiol mới làm thay đổi mạnh mẽ cường độ huỳnh

quang của dung dịch. Các amino acids khác không chứa nhóm thiol

hầu như không làm thay đổi tín hiệu huỳnh quang của dung dịch

phức Hg2L2. Điều này cho thấy, phức Hg2L2 như một sensor huỳnh

quang để phát hiện chọn lọc các biothiol trong sự hiện diện của các

amino acids không chứa nhóm thiol. Kết quả thí nghiệm ở Hình

3.25b cho thấy, cường độ huỳnh quang tăng mạnh nhất là Cys, tiếp

đến là GSH, Hcy.

c. Khảo sát sử dụng Hg2L2 phát hiện định lượng Cys

Trong khoảng nồng độ Cys từ 0 đến 5 μM, biến thiên cường

độ huỳnh quang (F585) quan hệ tuyến tính với nồng độ Cys, thể hiện

bởi phương trình F585 = (11,1 ± 5,9) + (133,3 ± 2,0) × [Cys], với R =

Hình 3.25. (a) Phổ huỳnh quang của Hg2L2 (2,5 μM) trong C2H5OH/HEPES (pH =7,4, 1/9, v/v)

tại 25 oC khi thêm các amino acids khác nhau (mỗi loại 10 μM), bao gồm Cys, Hcy, GSH, Ala, Asp, Arg, Gly,

Glu, ILe, Leu, Lys, Met, Thr, Ser, Tyr, Trp, Val, và His (Others: hỗn hợp gồm tất cả các amino acids kể trên

ngoại trừ Cys, Hcy và GSH). (b) Cường độ huỳnh quang (ở bước sóng phát quang 585 nm) của dung dịch

Hg2L2 (2,5 μM) với các nồng độ khác nhau của Cys, GSH, Hcy, và các amino acids khác

14

3.1.4. Nghiên cứu sử dụng phức Hg2L2 phát hiện các biothiol

3.1.4.1. Nghiên cứu tính toán lý thuyết từ các phản ứng tạo phức

Hằng số bền của phức đã được xác định bằng phương pháp chuẩn độ huỳnh quang. Kết quả tính toán đã xác định được hằng số bền của phức Hg2L2 bằng 1017,45 (M-3). Trong khi đó, hằng số cân bằng tạo phức Hg(RS)2 từ ion Hg(II) với các biothiol RSH, (2Hg(II) + 2RSH = Hg(SR)2 + 2H+, Ka) đối với Cys, GSH, Hcy tương ứng là 1020,1; 1020,2 và 1019,7. Vì vậy, phản ứng giữa Hg2L2 với các biothiol (Cys, GSH, Hcy) để tạo thành phức Hg(II) với các biothiol và giải phóng L tự do có thể xảy ra.

Kết quả nghiên cứu về mặt nhiệt động của sự tương tác giữa ion Hg(II) với Cysteine (H2Cys) cho thấy, phản ứng (14) xảy ra vì có ΔG298 là âm nhất (ΔG298 = -821,6 kcal.mol-1)

2Hg2Cys + Hg(II) + 4OH- [Hg(Cys)2]2+ + 4H2O (14)

Sự biến thiên của năng lượng tự do của phản ứng tạo Hg2L2 từ ion Hg(II) và sensor L là -410,2 kcal.mol‾1.

Do đó, phản ứng sau xảy ra (vì có ΔG298 là -1232 kcal.mol-1):

Hg2L2 + 4 H2Cys+ 80H- 2-

2 + 8 H20 + 2LHg(Cys)2 3.1.4.2. Khảo sát thực nghiệm sử dụng phức Hg2L2 làm sensor

huỳnh quang phát hiện các biothiol

a. Khảo sát phổ chuẩn độ UV-Vis và phổ huỳnh quang của Hg2L2

Hình 3.24. Phổ chuẩn độ UV-Vis (a) và phổ huỳnh quang (b) của dung dịch

Hg2L2 (2,5 μM) trong C2H5OH/HEPES (1/9, v/v), pH ~7,4, ở 25C khi thêm 0-10

μM Cys, bước sóng kích thích 540 nm, bước sóng phát huỳnh quang 585 nm

11

d. Khảo sát ảnh hưởng của các ion kim loại cạnh tranh

Hình 3.13 cho thấy, không có bất kỳ sự thay đổi đáng kể nào

trong phổ UV-Vis cũng như phổ huỳnh quang khi thêm các ion kim

loại Cd(II), Fe(II), Co(III), Cu(II), Zn(II), Pb(II), Ca(II), Na(I), K(I)

với nồng độ gấp 5 lần so với L. Như vậy, L có thể phát hiện chọn lọc

ion Hg(II) trong sự hiện diện các ion này.

e. Khảo sát sử dụng sensor L phát hiện định lượng ion Hg(II)

Trong khoảng nồng độ ion Hg(II) từ 0 đến 400 μg/L: biến

thiên mật độ quang (ΔA540) và biến thiên cường độ huỳnh quang

(∆I585 ) quan hệ tuyến tính với nồng độ ion Hg(II) bởi các phương

trình tương ứng: ΔA540= (0,01 ± 0,01) + (0,0011 ± 0,0000) × [Hg(II)],

∆I585= (-1,0 ± 0,4) + (0,3 ± 0,0) × [Hg(II)], với R=0,999. Giới hạn

phát hiện và giới hạn định lượng bằng phương pháp trắc quang tương

ứng là 15,3 μg/L và 51,2 μg/L hay

0,076 μM và 0,25 μM và phương

pháp huỳnh quang tương ứng là

11,8 μg/L và 39,3 μg/L hay 0,059

μM và 0,19 μM.

3.1.3. Nghiên cứu lý thuyết ứng

dụng sensor L phát hiện ion Hg(II)

Hình 3.13. Phổ UV-Vis (a) và phổ huỳnh quang (b) của L (1,5 μM) với sự hiện diện của các ion

kim loại Hg(II), Cd(II), Fe(II), Co(III), Cu(II), Zn(II), Pb(II), Ca(II), Na(I), K(I) (7,5 μM cho mỗi

ion kim loại) trong C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, bước sóng kích thích 540 nm

Hình 3.16. Hình học bền của phức Hg2L2

tại mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

12

a. Nghiên cứu cấu trúc phân tử phức Hg2L2

Kết quả tính toán sự hình thành phức giữa ion Hg(II) và L

theo tỷ lệ mol 1:1 ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ cho thấy, có

một cấu trúc hình học bền được tìm thấy là Hg2L2 và được thể hiện

ở Hình 3.16. Sự hình thành phức Hg2L2 là thuận lợi về mặt nhiệt

động, với giá trị ∆G298 là -410,2 kcal mol-1. Các liên kết tạo phức

gồm O25Hg93, O71Hg93, S55Hg93, và O26O71. Các liên

kết này hình thành được cho là dựa trên kết quả tính toán khoảng

cách giữa các nguyên tử nhỏ hơn đáng kể so với tổng bán kính Van

der Waals của nguyên tử tham gia liên kết.

Để khẳng định cấu trúc của phức Hg2L2, phân tích AIM đã

được tiến hành. Kết quả phân tích cho thấy: có sự tồn tại các điểm tới

hạn liên kết (BCPs) giữa các điểm tiếp xúc giữa các phối tử O, S với

Hg(II), các liên kết này là liên kết cộng hóa trị và có sự tồn tại các

điểm tới hạn vòng RCPs giữa các tiếp xúc O, S, N, Hg (phức có cấu

trúc vòng)

Nhằm giải thích tính chất huỳnh quang dựa vào bản chất

electron của các liên kết, phân tích NBO cũng được tiến hành. Kết

quả cho thấy, L tự do có cấu trúc kiểu: D-hệ liên hợp π-A (phát

huỳnh quang); L trong phức: cặp electron của N7 không còn liên hợp

vào hệ liên hợp π (cấu trúc D-hệ liên hợp π-A bị phá vỡ), nên có sự

chuyển dịch electron dẫn đến dập tắt huỳnh quang của phức.

b. Phân tích đặc tính huỳnh quang của phức Hg2L2

Kết quả tính toán ở Bảng 3.8 cho thấy, sự hình thành phức

Hg2L2 đã dẫn đến sự chuyển dịch đáng kể mật độ electron từ các phối

tử L đến các ion kim loại Hg(II) trung tâm và thu hẹp khoảng cách

năng lượng giữa HOMO và LUMO. Kết quả, ở trạng thái kích thích

chính (cường độ dao động lớn nhất và bằng 0,5913) từ S0→S2, với sự

đóng góp chủ yếu từ bước chuyển HOMO→LUMO (53,12%), có

năng lượng kích thích rất nhỏ là 1,37 eV. Điều này dẫn đến bước

sóng phát xạ huỳnh quang của phức sẽ chuyển về vùng bước sóng

dài, lớn hơn 900 nm. Vì vậy, trong thực tế không phát hiện được

huỳnh quang từ phức Hg2L2.

13

Bảng 3.8. Năng lượng kích thích, cường độ dao động và các MO có liên quan đến

quá trình kích thích chính của Hg2L2 ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ

Bước chuyển

MO Năng lượng (eV)

Bước sóng (nm)

f Tỷ lệ % đóng góp

S0→S1 201→203 1,29 961,2 0,0838 4,63

202→203 30,06

202→204 59,58

S0→S2 201→203 1,37 903,4 0,5913 2,41

201→204 3,99

202→203 53,12

202→204 24,77

S0→S3 201→203 1,57 788,7 0,1063 38,83

201→204 39,46

S0→S4 201→203 1,59 778,5 0,0647 32,24

201→204 43,20

202→204 3,52

S0→S5 197→203 1,93 642,3 0,0183 2,66

199→203 50,52

199→204 10,31

200→203 25,64

S0→S5 201→205 2,29

S0→S6 198→204 1,95 636,4 0,0121 2,30

199→203 19,80

199→204

200→204

2,57

27,67

24

(c). Sensors Hg2L2 and AMC is for the detection of Cys in a

small amount of organic solvent, the reaction time occurs fast can

detect Cys with lower concentration than that in the intracellular and

lower than that in the similar sensors of previous studies.

5. TD-DFT method is used to study the fluorescent properties

of substances based on the optimized geometry at the ground state

and the excited one in the combination with NBO analysis to

consider the the change of the fluorescent properties of substances,

based on the nature of bondings. The results of calcuations shows

that ion Hg(II) creates complexion reactions with L, leading to the

decrease in the energy distance between HOMO and LUMO in the

meantime change the conjugated π-electron system, which is the

cause for the fluorescence quenching in the complextion of Hg2L2.

All the fluorescent emission of AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy and

AMC-GSH comes from the higher-lying electron excited states (S2,

S4) to the ground state S0. This is an exceptional case of Kasha rule.

1

INTRODUCTION

Cysteine (Cys), glutathione (GSH), and homocysteine (Hcy)

are thiol compounds play vital roles in many biological processes.

Mercury is one of popular dangerous pollutants which can cause

serious effects to human’s health. Therefore, that the determination of

biothiol in living cells and water sources helps diagnose related

diseases and protect habitats and has caught much attention from local

and oversea scientists.

Many methods have been used for the detection of different

biothiols and Hg(II) ions like high-performance liquid

chromatography, mass spectrometry,…,and fluorescent method.

Among them, fluorescent method has outstanding benefits than other

optical methods in term of investment of less expensive equipments

and its simplicity. Furthermore, it can be applied to analyze many

diffrent substances especially those in living cells.

Professor Czarnik at Ohio University studied Fluorescent

method and proposed a new approach to the field of sphere optical

sensor in 1992. With advantages of fluorescent method, studies of

fluorescent sensors to detect metal ions, anion, especially

biomolecules is paid much attention by many local and oversea

scientists, that have announced more and more Fluorescent sensors

all over the world. In Vietnam, the study of the fluorescent sensors has

been conducted by Duong Tuan Quang since 2007.

To detect biothiols, the studies have designed fluorescent

sensors based on the characterized reaction of biothiol, complex

reactions (complex between fluorescence and ion Cu(II)..). The studies

of fluorescent sensors detect Hg(II) based on the characterized reaction

of ion Hg(II) and complex reactions between ion Hg(II) and legands -

O,-N,-S in closed and opened circuit. However, most of these sensors

have shortcomings like the use of a large amount of organic solvents,

the limited detection just for high concentration, short

excitation/emission wavelengths causing bad effects to living cells

and slow reaction between sensors and analytes. Now, scientists are

2

continuing to study and design fluorescent sensors with high sensitivity

and selectivity to detect biothiols and ions Hg(II).

At present, quantum chemical calculations have been become

an important tool in chemical studies in general and fluorescent

sensors in particular. The combination between quantum chemical

calculations and experimental studies is a modern trend in which, however,

the numbers of studies announced in fluorescent sensors is still limited.

From demand and situation of studies in the fluorescent sensors

in the world and Vietnam, we have conducted the project “Design,

synthesis of fluorescent sensors from cyanine and coumarin

derivatives to detect biothiol and Hg(II)”

New findings of the thesis:

- A new fluorescent sensor L designed from derivatives of

cyanine which has been reported, selective detection of Hg(II) ions,

based on complexation reaction, ON-OFF mechanism; the complex of

Hg(II) with L (Hg2L2) selective detection of Cys, based on

decomplexation reaction and OFF-ON mechanism. The limit of detection

and the limit of quantification for Hg(II) ions by L is 11,8 μg/L and 39,3

μg/L or 0,059 μM and 0,19 μM, respectively; limit of detection and limit

of quantification Cys by Hg2L2 is 0,2 μM and 0,66 μM, respectively.

- A new fluorescent sensor AMC designed from derivatives of

coumarin which has been reported, selective detection of Cys based on

Michael addition reaction, based on the change of ratiometry of

fluorescent intensity at two different wavelengths. The limit of detection

and limit of quantification Cys is 0,5 μM and 1,65 μM, respectively.

- L and AMC studyed by flexible combination quantum

chemical calculations and experimental studies.

Chapter 1. OVERVIEW

1.1. Overview of fluorescent sensors

1.1.1. Current situation of fluorescent sensors

1.1.2. Operating principles of fluorescent sensors

1.1.3. Structure of fluorescent sensors

1.1.4. Design principles of fluorescent sensors

23

CONCLUSIONS

1. Flexible combination between quantum chemical

calculations and experimental studies has been successfully applied

for research and development of two new fluorescent sensors

including L and AMC. This decreases the calculations of the theory

and experiment, saving the time and expense for the chemicals,

increase the possibility of success, clarify the nature of the proccesses

and set ground for the further study.

2. Synthesis reactions sensor L and sensor AMC are studied,

anticipated from calculations and afterwards verified from the

synthesis results.

3. The structures, characteristics of sensor L and sensor

AMC are determined at theoretical levels of B3LYP/LanL2DZ

bringing about reliable results through contrastive tests and

verification from experiment results.

4. (a). Sensor L is for selective detection of Hg(II) ions, in the

presence of ther metal ions, based on fluorescent ON-OFF mechanism.

The limit of detection and the limit of quantification for Hg(II) ions by

colorimetric method is 0,076 μM and 0,25 μM; and by fluorescent

method is 0,059 μM and 0,19 μM. Complextion of Hg2L2 is for

selective detection of Cys in the presence amino acids without thiol

groups based on decomplexation reaction and OFF-ON mechanism. The

limit of detection and the limit of quantification Cys is 0,2 μM and 0,66

μM, respectively. Sensor L for the detection of ion Hg(II) and

complextion Hg2L2 for the detection of Cys, based on complexation

reaction between core ions Hg(II) with two ligands of L and Cys.

(b). Sensor AMC is for the selective detection of biothiols

(Cys, GSH, Hcy) in the presence of amino acids without thiol groups,

based on the change of ratiometry of fluorescent intensity at two

different wavelengths. The limit of detection and limit of quantification

Cys is 0,5 μM and 1,65 μM, respectively. Sensor AMC reacts with

biothiols (Cys, GSH, Hcy) based on Michael addition reaction.

22

For AMC-Cys, electron transitions from S1 to S0 at REES1 and REES2 are forbid. Meanwhile, electron transitions from S2 to S0 at REES1 and REES2 occur. In addition, because the oscillator intensity (f) of both processes are very large, while the oscillator intensity (f) at the wavelength of 340,3 nm is 0,5122, and obviously 0,3171 larger than that at the wavelength of 324,5 nm. This leads to the fact that fluorescence intensity of AMC-Cys observed in experiment is very strong, and that at the long wavelengths of 340,3 nm is stronger than short wavelengths of 324,5 nm. Besides, because the transitions processes of electron from S2 to S1 at REES1, with the S2 respectively do not have minimum energy, so processes (6) at Fig.3.48b is less dominant than processes (4) at Fig.3.48b. That may be another cause leading to fluorescence intensity at long wavelengths (340,3 nm) which is very stronger than the fluorescence intensity at short wavelengths (324,5 nm) as observed in experiment. This may be another cause to make fluorescence intensity at long wavelengths (469,5 nm) stronger than that at short wavelengths (417,4 nm), as observed in the experiment.

For AMC-Hcy and AMC-GSH (similarly, AMC-Cys). As presented, the research results on optimum geometry with

excited states of AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy and AMC-GSH show that for AMC, there are twist angles between the coumarin moieties and acryloxy moieties at REES1 and REES2, causing the breakdown of the π-electron conjugate system between two moieties, which in turn leads to the fact that the electron density between the coumarin moieties and acryloxy moieties is strongly fragmented. As a result, there is very little overlap between the MOs in electron transfer at the excitation state of the sensor AMC. In contrast, at REES2 of AMC-Cys, AMC-Hcy and AMC-GSH, the coumarin moiety and acryloxy moiety are almost in the same plane. This is a favorable factor for the overlap between MOs in the state transitions.

The above analysis shows that the fluorescence of the sensor AMC and its additive products with the biothiolis are not derived from the S1 state. This is an exceptional case of Kasha rule.

3

1.2. Roles of biothiols in cells and methods for detection

1.2.1. Biothiol và and roles of them

1.2.2. Method for detection of biothiols

1.3. The sources of pollution, toxicities and methods for detection

of Hg(II) ions

1.3.1. The sources of pollution, toxicities of Hg(II) ions

1.3.2. Method for detection of Hg(II) ions

1.4. Fluorescent sensors for detection of biothiols

1.4.1. Based on the cyclization reactions with aldehydes

1.4.2. Based on the Michael addition reactions

1.4.3. Based on the native chemical ligation of peptide reactions

1.4.4. Based on the aromatic substitution-rearrangement reactions

1.4.5. Based on the cleavage of sulfonamide or sulfonate ester reactions

by thiols.

1.4.6. Based on the cleavage of disulfides reactions by thiols

1.4.7. Based on the reactions complexation and decomplexation

1.4.8. Based on the mechanisms

1.5. Fluorescent sensors for detection of Hg(II) ions

1.5.1. Based on the reactions complexation with Hg(II)

1.5.2. Based on the characteristic reactions of Hg(II) ions.

1.6. Fluorescent sensors for detection of biothiol and Hg(II) ions

based on the fluorophore are cyanine and coumarin

1.7. Overview of application of computational chemistry in the

study on fluorescent sensors

Chapter 2. RESEARCH CONTENTS AND METHODS

2.1. Research objectives

2.2. Research contents

- Study on the design, synthesis, characteristics, and applications

of cyanine derivatives based on sensor L for selective detection of

biothiols and Hg(II) ions:

+ Theoretical study on design, synthesis and characteristics

of sensor L.

4

+ Experimental research on characteristics and application of

sensor L.

+ Theoretical research on the application of the sensor L

detects Hg (II).

+ Study the use of complex (form by Hg(II) ions with sensor L) detection of biothiol. In particular, theoretical research is conducted first to guide the study of the application of the next complex

- Study on the design, synthesis, characteristics, and application of

coumarin derivatives based on sensor AMC for selective detection

of biothiols:

+ Study of design theory, synthesis of sensor AMC and reaction of

sensor AMC with biothiols.

+ Experimental research on the synthesis, characteristics and

applications of sensor AMC.

+ Theoretical study on characteristics and applications of sensor AMC.

2.3. Research methods

2.3.1. Theoretical calculation methods

- The determination of the structure of geometry

optimizations and single point energy was carried out by the density

functional theory (DFT) method with the software of Gaussian 03.

- The interaction energies adjusted for ZPE includesthe

variation of enthalpy and variation of Gibbs free energy were derived

as the differences between the total energy of the reaction products

and the energy of the reactant substances.

- The calculation of the excited state and the time-dependent

factors was carried out using time-dependent density functional

theory (TD-DFT) at the same theory level as the geometry

optimisation procedure.

- The analysis of AIM and NBO was executed at the

B3LYP/LanL2DZ level of theory.

2.3.2. The experimental investigation methods

- The structures of compounds were confirmed by 1H -NMR

and 13C- NMR spectrum, mass spectrometry.

21

processes (3) and (4) above is not large enough (0,0137 and 0,0152), this results leads to the fact that fluorescence intensity of AMC is as small as observed in experiment. Moreover, because the excitation process from S0→S1 (process (1) in Figure 3.48a) has much greater oscillator intensity than that from from S0→S1 (2) in Fig 3.48a), so the transfer process of electrons from S1→S0 (process (3) in Fig. 3.48a) will be more dominant than that from S2→S0 (process (4) in Fig.3.48a). This may mainly cause the fluorescence intensity at long wavelengths (469,5 nm) stronger than that at short wavelengths (417,4 nm) as observed in the experiment.

Fig.3.48. Energy diagrams of excitation processes and excitation energy release at geometry in ground state (RGS) and electron excitation states (REES1, REES2,...) at

theoretical level B3LYP/LanL2DZ: (a) AMC; (b) AMC-Cys; (c) AMC-Hcy; (d) AMC-GSH

(d) (d)

(a) (b)

(c)

20

state S1 (REES1), S2 (REES2), the coumarin moiety and acryloxy moiety are almost in two planes perpendicular to each other.

For AMC-Cys, AMC-Hcy and AMC-GSH have twist angles between the coumarin moieties and acryloxy moieties in the RGS and REES1. In REES2 and the coumarin moiety and acryloxy moiety are almost in the same plane. 3.2.3.2. Research theories of spectral excitation and fluorescence spectrum a. Theoretical study on excitation and fluorescents pectra

The calculated results show that in the sensor AMC, the singlet electronic transition from S0 ground state to S1 excited state is the main transition with the greatest oscillator strength (f) of 0,5348 at 320,9 nm wavelength. The S0→S1 transition is the main contribution to transition from HOMO→LUMO, with a percentage contribution up to 96,21%. Besides, the overlap between HOMO and LUMO is very large, which shows that the transfer of electrons from HOMO to LUMO is favorable. The transition of other states have a small unnoticeable oscillator intensity (f).

Meanwhile, with AMC-Cys, AMC-Hcy, and AMC-GSH, calculated data show that the singlet electronic transition from S0 to S2 is the main transition with oscillator intensity (f) of 0,3723; 0,3694 and 0,3801, respectively (much larger than other transfers) at the wavelength of 300,6; 300,4 and 300,7 nm, respectively. In the transition of the states, the transfer of electrons from HOMO-1→ LUMO is the main transition with a percentage contribution of 89,17; 89,05 and 89,24%, respectively. On the other hand, the overlap between HOMO-1 and LUMO is very large so the transfer of electrons from HOMO-1 to LUMO is very favorable. Other transitions of states have small, unnoticiable oscillator strength (f).

The analyzed results of the MO frontier also show that there is no overlap between HOMO and HOMO-1. Thus in AMC-Cys, AMC-Hcy and AMC-GSH do not occur in the PET process from HOMO to HOMO-1. As a result, AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy and AMC-GSH are fluorescents as presented in the experiment. b. Theoretical study on fluorescent spectra

For sensor AMC, at REES1, the electron transition from S1 and S2 to S0 are forbidden. At REES1, the lectron transition from S1 and S2

to S0 occur. In addition, because the oscillator intensity (f) of both

5

- The characteristics and applications of the sensors were

performed by fluorescence spectroscopy and UV-Vis spectroscopy.

- The conditions of sensors synthesis have been studied based on the predicted results from theoretical calculations and previous experimental results [2], [3], [29] on similar reactions. The synthesis process is summarized as follows:

a. Sensor L synthesis:

* The synthesis of CBTZ

2-methylbenzothiazole (3,0 g, 0,02 mol) and bromoacetic

acid (4,18 g, 0,03 mol) were dissolved in 50 mL absolute ethanol.

The mixture was boiled for 8 hours to, then cooled to room

temperature until the precipitation was formed. This precipitation

was washed with ethanol in alkali solution for several times, then

dried to get the solid CBTZ (4,0 g, 75% yield).

* The synthesis of L

CBTZ (290 mg, 1 mmol) and 4-diethylamino-2-

hydroxybenzaldehyde (190 mg, 1 mmol) were dissolved in 30 mL of

absolute ethanol. With the addition of one drop of piperidine, the

reaction solution turns red immediately. The reaction was kept

boiling for 10 hours to cool to room temperature. The precipitation

was formed and filtered, washed for several times with diethyl ether

and then dried for the desired product L (3,0 g, 38% yield).

b. Sensor AMC synthesis:

4-Methyl-7-hydroxylcoumarin (1,7 g, 9,4 mmol) and Et3N

(7.9 mL, 56,4 mmol) were dissolved in CH2Cl2 (20 mL) with small

addition of a catalyst amount of 4-dimethylaminopyridine to get a

solution. The solution is made cool and keep at 0 oC. Each drop of

acryloyl chloride (1,9 mL, 23,5 mmol) in CH2Cl2 (20 mL) is

gradually added to the reaction solution in an hour. Then, the

solution was stirred for 2 hours at room temperature and water was

added to dissolve the amine salt. The organic phase was washed with

aqueous solution and then dried over MgSO4. After the solvent was

6

evaporated, the product was purified by recrystallization from ethanol

to form a white crystalline solid (1,0 g, 45%, yield).

Chapter 3. RESULTS AND DISCUSSION

3.1. Design, synthesis, characteristics, and application of sensor L

from cyanine derivatives for detection of biothiols and Hg(II) ions

based on the reactions complexation

3.1.1. Theoretical study on design, synthesis, characteristics of

sensor L

3.1.1.1. Theoretical study on design, synthesis of sensor L

B3LYP/LanL2DZ levels of theory was applied for

of research.

Cyanine derivatives including R2N+=CH[CH=CH]n-

NR2,Aryl=N+=CH[CH=CH]n-NR2, Aryl=N+=CH[CH=CH]n-N=Aryl,

which all have the same structure, donor - π conjugated system -

acceptor. Here, donor (the electron of push group) is an amino group;

aceptor (the electron of withdrawal group) is amoni ions. They are

known as color compounds with strong fluorescence [40].

Sensor L the design is planned as shown in the following

synthesis diagram:

N

S N

S

-O2C

BrCH2COOH N

S

-O2C

N

HO

OHC N

HO

LCBZTBZT

(I) (II)

Fig. 3.1. Schematic design and synthesis sensor L

Here, the fluorophore is cyanine, receptor is -COO- group, a

strong affinity group with Hg(II) ion; The sensor L synthesis reaction

occurs in two phases: phase (I) and phase (II).

Reaction pairing the receptor to the fluorophore, the reaction (I) is

based on the reaction between 4-methyl quinoline and carboxylic acid

Fluorophore Receptor

19

For other amino acids without thiol groups do not change distinct fluorescence variations of sensor AMC solution (Fig.3.38a). The presence of this miscellaneous amino acids also do not have effect on the reation between AMC and biothiols (Cys, GSH and Hcy) with the clue that there is no significant difference between the fluorescence spectrum of solutions (AMC + biothiol + amino acids) with solutions (AMC + biothiol) (shown in Fig.3.38b).

d. The survey on the use of sensor AMC to detect Cys In the concentration range of Cys from 0 to 10 μM, The

ratiometric fluorescent intensity at two different wavelengths sóng 450 và 375 nm (F450/375) has a good linear relationship with Cys concentration in the equation: F450/375 = 1,5431 + 2,257 × [Cys], R = 0,982. The limit of detection and limit of quantitation for Cys are 0,5 μM and 1,65 μM, respectively. 3.2.3. Theoretical study on characteristics and application of sensor AMC 3.2.3.1. Optimized geometries (RGS, REES1, REES2) of AMC, AMC-Cys, AMC-Hcy, and AMC-GSH at electronically ground state and excited state

In the ground state (S0) of sensor AMC, the coumarin moiety and acryloxy moiety are almost in the same plane, but at the excited

Wavelength/nm

Fig.3.38. (a) Fluorescence spectra of AMC (10 μM, ethanol/HEPES, pH 7,4, 1/4, v/v, at 25 oC) upon addition of Cys, Hcy, GSH, others amino acids (including Arg, Gly,

Ala, Asp, Glu, Leu, Lys, Ile, Met, Thr, Ser, Trp, Tyr and Val). (b) Fluorescence spectra of AMC (10 μM, ethanol/HEPES, pH 7.4, 1/4, v/v, at 25 oC) in the presence of others amino acids mixture (including Arg, Gly, Ala, Asp, Glu, Leu, Lys, Ile, Met, Thr,

Ser, Trp, Tyr and Val) when upon addition of Cys, Hcy, and GSH

Wavelength/nm

Wavelength/nm

fluo

resc

ence

in

ten

sity

(a.

u)

fluor

esce

nce

inte

nsi

ty (

a.u)

18

increases more strongly than that of fluorescent emission at short

wavelength. The fluorescence intensity change at both 375 and

450 nm wavelengths above leads to an ability to use AMC as a

fluorescence sensor based on rate variation in fluorescence

intensity at two wavelengths to detect Cys.

b. Survey on reaction between sensor AMC and Cys When Cys were added from 0 to 10 μM to the sensor

AMC solution (10 μM), the fluorescent ratio (F450/375) has a good linear relationship with the concentration of Cys. Then, this ratio has unnoticeable change if the concentration of Cys continues to increase. This shows that the reaction beween AMC and Cys occurs with 1:1 stoichiometry (similar for Hcy and GSH). This result is consistent with the result when determining the ratio of the reaction between AMC and Cys ratio with Job’s plot method and mass analysis of product reation betweent AMC and Cys. c. The survey on effects of the competitive amino acids

These results of the survey reveal that when adding thiol-containing amino acids, the fluorescence intensity of AMC solution also increased markedly in both emission bands, in which the emission at 450 nm gave more fluorescent enhancement, whereas the emission at 375 nm produces a moderate increase. However, the the level of fluroescence enhancement is in this order: Cys>GSH> Hcy (Fig.3.38a).

Fig.3.33. (a) Absorbance spectra of the sensor AMC (10 μM) in C2H5OH/HEPES (pH 7.4, 1/4, v/v) at 25 C upon addition of 20 μM of Cys. (b) Fluorescence spectra of AMC (10 μM) upon addition of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 equiv of Cys

in C2H5OH/HEPES (pH 7.4, 1/4, v/v) at 25 C, excitation wavelength at 320 nm

Abs

orb

ance

fluore

scen

ce i

nte

nsi

ty (

a.u)

Wavelength/nm Wavelength/nm

7

derivative [29] while reaction pairing to form fluorophore, the reaction (II)

is based on the adol addition reaction ethanol and croton condensate [3].

a. Survey of the reactions of the phase (I)

The reaction to form CBZT

from BZT and bromoacetic

acid is shown in Figures 3.2 and 3.3. The calculated results show that

reaction between BZT and bromoacetic acid forms CBZT-3 and

reaction between CBZT-3 and alkali solution forms CBZT, which is

thermodynamically favorable.

b. Survey of the reaction of phase (II)

The reactions to form L

from CBTZ and DHB can

create four products (Fig.3.5).

The calculated results have

showed that the free energy

(∆G298) of reaction (12) is

negative. Accordingly, the

reaction between CBZT and

DHB in the trend to form L

is clearly thermodynamically

favorable.

S

N

BrCH2COOH Br-

S

N+

COOHCBZT-1

(1)

S

N

BrCH2COOH HBr

S

N+

COO-

BZT CBZT-2

(2)

S

N

BrCH2COOH

S

N+

COOH...Br-BZT CBZT-3

(3)

S

N

BrCH2COOH

S

N+

COOHBZT CBZT-4

(4)

Br-

S

N

BrCH2COOH

S

N

COOHBZT CBZT-5

Br

(5)

BZT

Fig 3.2. The possible products formed from the reaction between BZT and bromoacetic acid

CH3CH2OH

Br-

S

N+

COO-

CBZT

S

N+

COOH...Br-

CH3CH2OH2+

H2O

Br-

S

N+

COO-

CBZT

(7)S

N+

COOH...Br-

CBZT-3

H3O+

OH-

Br-

S

N+

COO-

CBZT

(8)

S

N+

COOH...Br-

CBZT-3

H2O

(6)

CBZT-3

Fig 3.3. The reactions formed CBZT

from CBZT-3

N+

S

COO-

N+

S

COO-

N

HO

OHC N

HO

CBZT

(9)

N+

S

COO-

L-1

(11)

HO

N

L-3

H2O

H2O

N+

S

COO-

N (10)

L-2

H2O

HO

N+

S

COO-

(12)N

L

H2O

HO

DHB

Fig.3.5. The possible products formed from the reaction between CBTZ and DHB

8

3.1.1.2. Theoretical study on characteristics of L a. The molecular structure of L

The bond lengths, bond angles, and dihedral angles of L were calculated. In particular, these values of BZT, bromacetic acid and DHB have little change compared with that from the beginning. In L,

there is the formation of new bond between N7 and C11 and double one of bond C10 and C12. b. UV-Vis spectral analysis of sensor L The UV-Vis spectra of L at

gains the maximum value at

452,6 nm. In a previous

announcement, BZTVPA had

the same structure as the sensor

L with a maximum absorption

wavelength of 405 nm, which is a strong fluorescent emission at 495

nm. This result led to an expectation that the fluorescent properties of

L would be similar to BZTVPA fluorescence.

c. The analysis of Fluorescent properties of sensor L Table 3.5. Calculated excitation energy (E), wavelength (λ), and oscillator strength (f) for

low-laying singlet state of L at B3LYP/LanL2DZ

State MO E (eV)

λ (nm)

f Percentage contribution(%)

S0→S1 95→97 2,53 489,8 0,2566 56,44

96→97 35,80

S0→S2 93→97 2,74 452,6 0,5626 29,22

95→97 28,63

96→97 28,66

S0→S3 92→97 2,86 432,9 0,0097 5,90

93→97 8,83

94→97 77,56

Fig. 3.6. The optimized geometry of L at the

B3LYP/LanL2DZ level of theory

17

The calculated results show that the free energy (∆298) of sensor

AMC synthesis reaction is negative. Accordingly, its reaction is

thermodynamically favorable.

3.2.1.2. Theoretical study on the reation between sensor AMC

and biothiols

According to the previously published works, the Michael

addition reactions beween biothiols (Cys, Hcy and GSH) and esters

created by acrylic acid and alcols (usually the fluorophore)

initially generates thioethers, then followed by the formation of

heterocycles compounds in the case of Cys and Hcy. Meanwhile, the

thioether of GSH is usually stable with no subsequent ring formation.

Different from the above study, the calculated results in term

of the thermodynamics show that reactions between the sensor AMC

and biothiols (including Cys, Hcy and GSH) to form thioether with

the 1: 1 molar ratio is thermodynamically advantageous.

3.2.2. Experimental study on synthesis, characterization and

application of sensor AMC

3.2.2.1. Experimental synthesis of sensor AMC

After synthesis, the structure of AMC products was obtained with 1H- NMR and FAB-MS spectra. 3.2.2.2. Experimental study on the characteristics and application

of sensor AMC

a. Absorption and the fluorescence spectrum of the AMC sensor

As shown in Fig.3.33a, the free sensor AMC shows a

characteristic absorption band peaked at 275 and 320 nm. When Cys

were added to the solution of sensor AMC, the absorption spectrum

was negligibly changed.

Meanwhile, the free sensor AMC displays fluorescence

emission band peaked at 375 nm and 450 nm (Fig.3.33b).

Fluorescence quantum yield (Φ) of sensor AMC was determined

to be 0,05. When Cys were added to the solution of sensor AMC

fluorescence tensity increases gradually at both emission bands. In

particular, the intensity of fluorescent emission at long wavelength

16

not change the signals of the Hg2L2 solution’s fluorescence. This

proves that the ensemble Hg2L2 complex is like a fluorescent sensor

for the selective detection in the presence of amino acids without the

thiol group. As shown in Fig.3.25b, fluorescence intensity gain

strongest increase is Cys, then GSH and Hcy.

c. Survey on the use of Hg2L2 for quantitative detection of Cys

In the concentration range of Cys from 0 to 5 μM, there is a good linear relationship between the variation of fluorescence intensity (F585) of Hg2L2 and Cys concentration, shown in the following equation: F585 = (11,1 ± 5,9) + (133,3 ± 2,0) × [Cys], R = 0,998. The limit of detection and limit of quantitation for Cys are 0,2 μM and 0,66 μM, respectively. 3.2. Design, synthesis, characteristics, and application of sensor

AMC from coumarin derivatives for the detection of biothiols based

on the Michael addition reactions

3.2.1. Theoretical design, synthesis sensor AMC and reaction

between AMC sensor with biothiols

3.2.1.1. Study on design, synthesis of sensor AMC

4-methyl-7-hydroxycoumarin compound gains maximum absorbance at 359 nm wavelength and maximum emission at 449 nm wavelength [159].

To design AMC fluorescence sensor (7- acryloyl -4- metylcouramin) from coumarin-based derivatives to detect biothiols based on the Michael addition reactions, 4-methyl-7-hydroxylcoumarin compounds are chosen as fluorophore and receptor as acryloyl chloride, because reaction of receptor to fluorophore is conducted easily with ester reation among phenol groups with the acid derivative [2] and this receptor can cause an addition reaction with the biothiols.

The sensor AMC is designed in the following synthesis scheme:

OO OH OO O

O

AMC

O

Cl+

HCl+

(A)

(B)

Fig. 3.29. Schematic design and synthesis sensor AMC

Receptor

Fluorophore

9

State MO E (eV)

λ (nm)

f Percentage contribution(%)

S0→S4 92→97 3,00 413,2 0,5815 5,42

93→97 49,94

94→97 10,62

95→97 9,35

96→97 11,07

S0→S5 92→97 3,05 406,0 0,0060 86,61

93→97 7,68

S0→S6 90→97 3,92 316,7 0,0051 44,35

91→97 41,32

96→97 8,40

Calculated results (Table 3.5) showed that, excited states have

great oscillator strength namely S0→S1, S0→S2 at wavelengths 489,8 nm and 452,6 nm, respectively to make a significant contribution (35,80% and 28,66%, respectively) to transition from MO-96 to MO-97. Because of continuous MOs, there is no PET to intervene this transition. This result led to an expectation that the L is fluorescence emission compound. 3.1.2. Experimental study on synthesis, characteristics and application of sensor L 3.1.2.1. Experimental study on synthesis of L

After synthesis, the structure of CBZT and L products was obtained with 1H- NMR, 13C-NMR and FAB-MS spectra. 3.1.2.2. The experiamental survey of application of L for the detection of Hg(II) ions a. The survey of UV-Vis and fluorescence spectra of

As expected from calculations, L performs red fluorescence

with a quantum yield of 0,175. The maximum fluorescence wavelength

is 585 nm and the maximum absorption wavelength is 540 nm

(Fig.3.10).

10

b. They survey of UV-Vis and fluorescence titration spectra of L for the detection Hg(II) ions

Fig.3.11 showed that Hg (II) ions reacted and changed the UV-

Vis, and fluorescence spectra of L. The fluorescence intensity of L was

decreased gradually while the concentration of Hg(II) ions is increased.

c. The survey on the reaction between L and Hg(II) ions

Fig 3.12 shows that, the fluorescence intensity of solution L

decreases noticeably when the concentration of Hg (II) ions increases from 0

to 5.0 μM; and then decrease unsignificantly when we continue to decrease

concentration of Hg (II) ions. This shows that L reacts with Hg (II) ions in a

molar ratio of 1:1

Fig.3.11. The UV-Vis and fluorescence spectra of L with Hg(II) ions: (a) UV-Vis spectra, L (5 µM)

in C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, Hg(ClO4)2 (0-5µM); (b) Fluorescence spectra, L (5 µM) in C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, Hg(ClO4)2 (0-5µM)), excitation wavelength at 540 nm

Fig.3.10. UV-Vis and fluorescence spectra of L: (a) UV-Vis spectra, L (5 µM) in C2H5OH /H2O (1/9, v/v), pH ~ 7.4; (b) fluorescence spectra, L (5 µM) in C2H5OH/H2O (1/9, v/v),

pH ~ 7.4, excitation wavelength at 540 nm.

Abso

rban

ce

flu

ore

scen

ce i

nte

nsit

y (

a.u

)

Wavelength/nm Wavelength/nm

Abs

orb

ance

flu

ore

scen

ce i

nte

nsit

y (

a.u)

Wavelength/nm Wavelength/nm

15

540 nm wavelength appears; in the fluorescence spectrum, the

intensity of the fluorescence increases gradually again

b. Survey on effects of competitive amino acids and reation

between of Hg2L2 and biothiols

The results presented in Fig.3.25a show that only the thiol-

containing amino acids make strong change to fluorescence intensity

of solution. In contrast, other amino acids without the thiol group do

Fig.3.25. (a) Emission spectra of Hg2L2 (2,5 μM) C2H5OH/HEPES (pH =7,4, 1/9, v/v) at 25 oC upon addition of different amino acids (10 equiv each) including Cys, Hcy, GSH, Ala,

Asp, Arg, Gly, Glu, ILe, Leu, Lys, Met, Thr, Ser, Tyr, Trp, and Val, respectively (Others: a mixture of miscellaneous amino acids without mercapto group). (b) Emission intensity at 585 nm of Hg2L2 (2,5 μM) vs different concentions of Cys, GSH, Hcy, and other amino acids.

Fig.3.24. Absorbance spectra (a) and emission spectra (b) of Hg2L2 (2,5 μM) in

C2H5OH/HEPES (1/9, v/v), pH ~7,4, at 25C upon addition of 0-10 equiv of Cys, excitation wavelength at 540 nm, emission wavelength at 585 nm

Abso

rban

ce

flu

ore

scen

ce i

nte

nsit

y (

a.u)

fluor

esce

nce

in

tens

ity

(a.u

)

fluor

esce

nce

in

tens

ity

(a.u

)

Wavelength/nm

Concentration (μM)

Wavelength/nm

Wavelength/nm

14

Calculated results in Table 3.8 show that the formation of Hg2L2 complex leads to the significant transfer of the electron density from L ligands to metal core Hg(II) ions and shorten the energy gap between HOMO and LUMO. As the results, at main excited states (maximum oscillator intensity is 0,5913) from S0→S2, with the main contribution of transition from HOMO to LUMO (53,12%), with a small amount of excitation energy of 1,37 eV. This leads to the fact that fluorescence emission wavelength of complex shifts to the long wavelength, greater than 900 nm. Therefore, in practice, there is no fluorescence from Hg2L2 complex to be detected. 3.1.4. Study on the use of Hg2L2 complex to detect biothiols 3.1.4.1. Study on theoretical calculations from complex reactions

Constant association of complex was calculated by fluorescence titration method. The calculated results reveal that constant association of complex Hg2L2 is 1017,45 (M-3). Meanwhile, the association constant of Hg(RS)2 from Hg(II) ions with biothiols RSH, (2Hg(II) + 2RSH = Hg(SR)2 + 2H+, Ka) for Cys, GSH, Hcy are 1020,1; 1020,2 and 1019,7, respectively. Hence, the reation between Hg2L2 with biothiols (Cys, GSH, Hcy) to format complex (Hg(II) with biothiols the freedom of L may be available.

The research results in term of thermodynamics of reation between Hg(II) ions and Cysteine (H2Cys) show that the reation (14) occurs beacause ΔG298 is negative (value ΔG298 of -821,6 kcal.mol-1). 2Hg2Cys + Hg(II) + 4OH- [Hg(Cys)2]

2+ + 4H2O (14) The free energy (ΔG298) of reaction to form Hg2L2 from

Hg(II) ions and L with a value ΔG298 of -410,2 kcal.mol‾1. Thus, the reation occurs (for the reason that the value ΔG298 is

-1232 kcal.mol-1):

Hg2L2 + 4 H2Cys+ 80H- 2-

2 + 8 H20 + 2LHg(Cys)2

3.1.4.2. Experimental study on the use of Hg2L2 complex as fluorescence sensor to detect biothiol a. Survey on UV-Vis and fluorescence titration spectra of Hg2L2

Fig.3.24 indicates that when Cys is gradually added in Hg2L2

complex solution: in the UV-Vis spectra, the maximum absorption

peak at 460 nm wavelength disappears constantly while a new

maximum absorption peak with a very strong absorption intensity at

11

d. Survey on the

effects of the

competitive metal ions

Fig.3.13 shows that there is no significant change in UV-Vis spectra as well as in fluorescence spectra when adding Cd (II), Fe (II), Co (III), Cu (II) , Zn (II), Pb (II), Ca (II), Na (I), K (I) with a 5 times higher

concentration of L. Thus, L can detect selectively Hg (II) ions in the presence of these ions.

e. The survey on the use of sensor L for quantitation detection of

Hg(II) ions

In the concentration range of Hg(II) ions from 0 to 400 μg/L: the variation of absorbance (ΔA540) and variation of fluorescence intensity (∆I585) maitain a good linear relationship with the ion concentration of Hg(II) with respective equations: ΔA540= (0,01 ± 0,01) + (0,0011 ± 0,0000) × [Hg(II)], R=0,999; ∆I585= (-1,0 ± 0,4) + (0,3 ± 0,0) ×

Fig.3.12. The graph for determination of the molar ratio

of the reaction between Hg(II) ions and L: L 5 µM in C2H5OH/H2O (1/9, v/v) pH ~7,4, emission wavelength

at 585 nm, excitation wavelength at 540 nm.

Fig.3.13. Absorbance (a) and fluorescence (b) spectra of sensor L (1,5 μM) with different metal ions Hg(II), Cd(II), Fe(II), Co(III), Cu(II), Zn(II), Pb(II), Ca(II), Na(I), K(I) (5 equiv each) in

C2H5OH/H2O (1/9, v/v), pH ~7,4, excitation wavelength at 540 nm

flu

ore

scen

ce i

nte

nsit

y (

a.u

)

Wavelength/nm

fluore

scen

ce i

nte

nsi

ty (

a.u

)

flu

ore

scen

ce i

nte

nsit

y (

a.u

)

Abs

orb

ance

Wavelength/nm

Wavelength/nm

12

[Hg(II)], R=0,999. The limit of detection and limit of quantitation for Hg(II) ions of colorimetric method are respectively 15,3 μg/L and 51,2 μg/L or 0,076 μM and 0,25 μM and the fluorescent method is 11,8 μg/L và 39,3 μg/L or 0,059 μM and 0,19 μM, respectively. 3.1.3. The theoretical study on the application of L for detection Hg(II) ions a. The study on the molecular structure of Hg2L2

The calculated results of the complex formation between Hg(II) ions and L with the molar ratio of 1: 1 at the theoretical level of B3LYP/LanL2DZ show that there is a unchanged geometrical structure found as Hg2L2, which is and shown in Fig.3.16. The formation of Hg2L2 complex is thermodynamically favorable, with a ∆G298 value of 410,2 kcal mol-1. The bonds of complexes include O25Hg93, O71Hg93, S55Hg93, and O26O71. These bonds are known to be formed based on the calculated results of the distances among atoms, significantly smaller than the sum of van der Waals radii of relevant atoms.

To confirm that the structure of the Hg2L2 complex, AIM analysis was conducted. The results of the analysis show that there are bond critical points (BCPs) between the contact points between

O, S ligands and Hg (II), which are covalent bonds with the existence of the ring critical points (RCPs) between contacts O, S, N, Hg points (complex have ring structure).

To explain fluorescence characteristics based on nature of the electrons of the bonds, NBO analysis was conducted. The results show that free L has the structure: D-π conjugated

- A (Fluorescent); L in complex: the electron pair of N7 is no longer conjugated to the conjugate π (the structure of D - π conjugated - A was broken), therefore there is an electron transfer leading to fluorescence quenching of the complex.

Fig.3.16. The optimized geometry of Hg2L2 at the

B3LYP/LanL2DZ level of theory

13

b. The analysis of fluorescent properties of Hg2L2

Table 3.8. Calculated excitation energy (E), wavelength (λ), and oscillator

strength (f) for low-laying singlet state of Hg2L2 at B3LYP/LanL2DZ

State MO E (eV)

λ (nm)

f Percentage contribution(%)

S0→S1 201→203 1,29 961,2 0,0838 4,63

202→203 30,06

202→204 59,58

S0→S2 201→203 1,37 903,4 0,5913 2,41

201→204 3,99

202→203 53,12

202→204 24,77

S0→S3 201→203 1,57 788,7 0,1063 38,83

201→204 39,46

S0→S4 201→203 1,59 778,5 0,0647 32,24

201→204 43,20

202→204 3,52

S0→S5 197→203 1,93 642,3 0,0183 2,66

199→203 50,52

199→204 10,31

200→203 25,64

S0→S5 201→205 2,29

S0→S6 198→204 1,95 636,4 0,0121 2,30

199→203 19,80

199→204

200→204

2,57

27,67