7/27/2019 1986 Maki et al., 1986

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V o l . 5 1 , N o . SP P L I E D AND ENVIRONMENTAL M I C R O B I O L O G Y , May 1 9 8 6 . p . 1 0 4 7 - 1 0 5 50 0 9 9 - 2 2 4 0 / 8 6 / 0 5 1 0 4 7 - 0 9 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t ( C 1 9 8 6 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

R e c o v e r y a n d D i v e r s i t y o f H e t e r o t r o p h i c B a c t e r i a from C h l o r i n a t e dD r i n k i n g W a t e r s

J . S . MAKI,t S . J . LACROIX,t B . S . HOPKINS, AND J . T . STALEY*D e p a r t m e n t of M i c r o b i o l o g y and Immunology, S c h o o l o f M e d i c i n e , U n i v e r s i t y o f W a s h i n g t o n , S e a t t l e , Washington 9 8 1 9 5

R e c e i v e d 1 5 J u l y 1 9 8 5 / A c c e p t e d 2 5 F e b r u a r y 1 9 8 6H e t e r o t r o p h i c b a c t e r i a were e n u m e r a t e d f r o m t h e S e a t t l e d r i n k i n g water c a t c h m e n t b a s i n s a n d d i s t r i b u t i o n

s y s t e m . T h e h i g h e s t b a c t e r i a l r e c o v e r i e s were o b t a i n e d b y u s i n g a very d i l u t e me d i u m c o n t a i n i n g 0.01%p e p t o n e a s t h e p r i m a r y c a r b o n s o u r c e . O t h e r f a c t o r s f a v o r i n g h i g h r e c o ve r y were t h e u s e o f i n c u b a t i o nt e m p e r a t u r e s c l o s e t o t h a t o f t h e h a b i t a t a n d an e x t e n d e d i n c u b a t i o n ( 2 8 d a y s or l o n g e r p r o v i d e d t h e h i g h e s tc o u n t s ) . T o t a l b a c t e r i a l c o u n t s were d e t e r m i n e d b y u s i n g a c r i d i n e o r a n g e s t a i n i n g . With one e x c e p t i o n , a l la c r i d i n e o r a n g e c o u n t s i n c h l o r i n a t e d s a m p l e s were l o w e r t h a n t h o s e i n p r e c h l o r i n a t e d r e s e r v o i r w a t e r ,i n d i c a t i n g t h a t c h l or i n a t i o n o ft e n r e d u c e s t h e number o f a c r i d i n e o r a n g e - d e t e c t a b l e b a c t e r i a . S o u r c e watersh a d h i g h e r d i v e r s i t y i n d e x v a l u e s t h a n d i d s a m p l e s e x a m i n e d f o l l o wi n g c h l o r i n a t i on and s t o r a g e i n r e s e r v o i r s .S h a n n o n i n d e x v a l u e s b a s e d upon c o l o n y m o r p h o l o g y were i n excess o f 4 . 0 f o r p r e c h l o r i n a t e d source w a t e r s ,w h e r e a s t h e v a l u e s f o r f i n a l c h l o r i n a t e d t a p w a t e r s were l o w e r t h a n 2 . 9 . I t i s n o t k n o w n w h e t h e r t h e r e d u c t i o ni n d i v e r s i t y was d u e s o l e l y t o c h l o r i n a t i o n o r i n p a r t t o o t h e r f a c t o r s i n t h e water treatment an d d i s t r i b u t i o ns y s t e m . B a s e d upon t h e r e s u l t s o f t h i s i n v e s t i g a t i o n , we p r o v i d e a l i s t o f r e c o m m e n d a t i o n s f o r c h a n g e s i n t h ep r o c e d u r e s u s e d f o r t h e e n u m e r a t i o n o f h e t e r o t r o p h i c b a c t e r i a f r o m d r i n k i n g w a t e r s .

C u r r e n t l y , t h e b a c t e r i o l o g i c a l q u a l i t y o f d r i n k i n g w a t e r i sm o n i t o r e d b y t e s t s f o r b a c t e r i a t h a t i n d i c a t e f e c a l c o n t a m i -n a t i o n a n d b y p l a t e c o u n t s o f CFU a s a n e s t i m a t e o f t h en u m b e r o f v i a b l e h e t e r o t r o p h i c b a c t e r i a . T h e s e c o n d p a r a m -e t e r i s i m p o r t a n t b e c a u s e l a r g e n u m b e r s o f b a c t e r i a m ays u g g e s t t h e p r e s e n c e o f o p p o r t u n i s t i c p a t h o g e n s o f n o n f e ca lo r i g i n ( 8 , 1 3 ) , p o t e n t i a l i n t e r f e r e n c e w i t h t h e d e t e c t i o n o fc o l i f o r m b a c t e r i a ( 7 , 1 3 ) , a n d i n c r e a s e d p o s s i b i l i t i e s o f t a s t e ,o d o r , a n d c o r r o s i o n p r o b l e m s i n t h e d i s t r i b u t i o n s y s t e m .A l s o , f r o m a p u b l i c h e a l t h p e r s p e c t i v e i t w o u l d b e d e s i r a b l et o know t h e t y p e s a n d n u m b e r s o f b a c t e r i a t h a t a r e c o n -s u m e d i n t h e i n g e s t i o n o f t r e a t e d d r i n k i n g w a t e r .

T h e s t a n d a r d p l a t e c o u n t ( S P C ) p r o c e d u r e t h a t h a s b e e nr e c o m m e n d e d f o r t h e e n u m e r a t i o n o f h e t e r o t r o p h i c b a c t e r i ai n v o l v e s a p o u r p l a t e t e c h n i q u e w i t h a 2 - d a y i n c u b a t i o n a t3 5 C ( 1 ) . H o w e v e r , n u m e r o u s i n v e s t i g a t i o n s h a v e s h o w nt h a t t h i s s t a n d a r d m e t h o d f r e q u e n t l y p r o v i d e s l o w e r c o u n t so f b a c t e r i a f r o m d r i n k i n g w a t e r s t h a n d o o t h e r p r o c e d u r e s ( 6 ,1 5 , 2 0 ) .T h e o b j e c t i v e s o f t h i s i n v e s t i g a t i o n w e r e t w o f o l d : ( i ) t oe v a l u a t e a l t e r n a t i v e p r o c e d u r e s f o r t h e e n u m e r a t i o n o fh e t e r o t r o p h i c b a c t e r i a f r o m c h l o r i n a t e d w a t e r s u p p l i e s a n d( i i ) t o d e v e l o p a p r o c e d u r e t h a t c o u l d b e u s e d t o i d e n t i f y t h eb a c t e r i a t h a t c o m m o n l y o c c u r i n d r i n k i n g w a t e r s .W e r e p o r t h e r e t h e r e s u l t s o f u s i n g a l t e r n a t i v e m e t h o d s f o rt h e e n u m e r a t i o n o f h e t e r o t r o p h i c b a c t e r i a . T h e i d e n t i f i c a t i o no f t h e b a c t e r i a t h a t o c c u r r e d i n t h e c h l o r i n a t e d w a t e r s t h a tw e r e s a m p l e d w i l l b e p r e s e n t e d e l s e w h e r e ( S . J . L a C r o i x ,J . S . M a k i , D . J . R e a s o n e r , a n d J . T . S t a l e y , m a n u s c r i p t i np r e p a r a t i o n ) . T h e m a j o r i t y o f t h e s e w e r e g r a m - n e g a t i v e ,n o n f e r m e n t a t i v e r o d s , m an y o f w h i c h w e r e p i g m e n t e d y e l -

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .t P r e s e nt a dd r es s : L a b o r a t o r y o f M i c r o b i a l E c o l o g y , D i v i s i o n o fA p p l i e d S c i e n c e s , H a r v a r d U n i v e r s i t y , C a m b r i d g e , MA 0 2 1 3 8 .* P r e s e n t a d d r e s s : D S H S , O f f i c e o f P u b l i c H e a l t h L a b o r a t o r i e sa n d E p i d e m i o l o g y , S t a t e o f W a s h i n g t o n . S e a t t l e , WA 9 8 1 5 5 . P r e s e n t a d d r e s s : D e p a r t m e n t o f E c o l o g y , S t a t e o f W a s h i n g t o n ,O l y m p i a , WA 9 8 5 0 4 .

l o w t o b r o w n . T h e s e c o u l d n o t b e p l a c e d i n t h e p o o r l yd e f i n e d g e n u s F l a v o b a c t e r i u m w i t h o u t f u r t h e r t e s t s , s u c h a sDNA-DNA h y b r i d i z a t i o n . Kno w n g e n e r a i d e n t i f i e d i n t h i ss t u d y w e r e C a u l o b a c t e r , H y p h o m o n a s , A q i u a s p i r i l l i u m ,V i b r i o , a n d G l u c o n o b a c t e r .MATERIALS AND M E T H O D S

D e s c r i p t i o n o f t h e d i s t r i b u t i o n s y s t e m . W a t e r s a m p l e s w e r ec o l l e c t e d f r o m t h e S e a t t l e , W a s h . , m u n i c i p a l w a t e r d i s t r i b u -t i o n s y s t e m . T h i s s y s t e m r e c e i v e s w a t e r f r o m t h e C e d a r R i v e ra n d t h e s o u t h f o r k o f t h e T o l t R i v e r , b ot h o f w h i c h f u r n i s hh i g h - q u a l i t y m o u n t a i n w a t e r o f g r e a t c l a r i t y ( F i g . 1 ) . B e c a u s em o s t a n a l y s e s w e r e c o n d u c t e d o n C e d a r R i v e r s a m p l e s , t h i ss y s t e m i s c o n s i d e r e d i n more d e t a i l . T h e C e d a r R i v e r f l o w sf r o m t h e C a s c a d e M o u n t a i n s t h r o u g h C h e s t e r M o r s eR e s e r v o i r , w h i c h i s a b o u t 0 . 8 km w i d e , 8 km l o n g , a n da p p r o x i m a t e l y 2 7 m d e e p a n d h a s a 5 0 - d a y d e t e n t i o n t i m e .S u b s e q u e n t l y , t h e r i v e r i s j o i n e d b y T a y l o r C r e e k a n d f l o w st o a d i v e r s i o n dam a t L a n d s b u r g , 2 4 km b e l o w t h e r e s e r v o i r .H e r e t h e r i v e r h a s a n a v e r a g e f l o w o f 1 . 6 3 x 1 0 6 m 3 d a i l y ; 0 . 4 2X 1 0 6 m 3 i s d i v e r t e d a n d u n d e r g o e s s c r e e n i n g , c h l o r i n a t i o n ,a n d f l u o r i d a t i o n . T h e w a t e r t h e n f lo w s t h r o u g h p i p e l i n e s t oL a k e Y o u n g s ( s u r f a c e a r e a , 2 9 0 h a ) , w h i c h p r o v i d e s p r i m a r ys t o r a g e f o r S e a t t l e a n d h a s a d e t e n t i o n t i m e o f a p p r o x i m a t e l y3 0 d a y s . W a t e r f r o m L a k e Y o u n g s i s c h l o r i n a t e d when i tl e a v e s t h e l a k e a n d t r a v e l s t h r o u g h p i p e l i n e s t o r e s e r v o i r s i nd i f f e r e n t p a r t s o f t h e c i t y t h a t h a v e d e t e n t i o n t i m e s o f 2 t o 2 0d a y s . A f t e r l e a v i n g t h e o p e n - a i r r e s e r v o i r s , t h e w a t e r i sc h l o r i n a t e d f o r a t h i r d t i m e s u c h t h a t a m i n i m a l r e s i d u a l i n t a p sa t t h e e x t r e m e e n d o f t h e d i s t r i b u t i o n s y s t e m i s m a i n t a i n e d a t0 . 2 m g l - l W a t e r i n o n e r e s e r v o i r ( M y r t l e ) i s c h l o r i n a t e d f o ra f o u r t h t i m e , a s i t i s f e d w i t h w a t e r f r o m t h e West S e a t t l eR e s e r v o i r . T w o o f t h e r e s e r v o i r s ( R i v e r t o n H e i g h t s a n d V i e wR i d g e ) a r e c o v e r e d a n d a r e n o t c u r r e n t l y c h l o r i n a t e d a t h i r dt i m e .S a m p l e c o l l e c t i o n a n d p r o c e s s i n g . W a t e r s a m p l e s we r ec o l l e c t e d f r o m t h e S e a t t l e water d i s t r i b u t i o n s y s t e m i nc o l l a b o r a t i o n w i t h t h e C i t y o f S e a t t l e W a t e r D e p a r t m e n t( s a m p l e l o c a t i o n s a n d c o d e s a r e l i s t e d i n T a b l e 1 ) . C o l l e c -

1 0 4 7

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A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .

1 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 1> ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ Icc T L A ' T l TL b W A T f A R< W L~~~Y P E ; E R V ( I F RZ.0--LA 1-NL U i) W 1 K I L O M E T R E SO0 5

C M I L E SW C O N T O U R I N T E R V A L 2 0 0 F E E T

4,

L.+.

D A R S M A T T L E WAtEL R E S E V o O I* ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 1 -

F I G . 1 . M a p s h o w i n g t h e w a t e r d i s t r i b u t i o n s y s t e m o f S e a t t l e ( c o u r t e s y C i t y o f S e a t t l e ) .t i o n s w e r e made o n s e v e n o c c a s i o n s f r o m J a n u a r y 1 9 8 1 t oF e b r u a r y 1 9 8 2 p r i o r t o t h e i n t r o d u c t i o n o f t h e l i m i n g p r o c -e s s . S t e r i l e W h i r l p a k b a g s o r N a l g e n e b o t t l e s w e r e u s e d f o rt h e c o l l e c t i o n o f v i a b l e s a m p l e s . T h e c o n t a i n e r s u s e d f o r t h ec o l l e c t i o n o f c h l o r i n a t e d w a t e r a l s o h e l d p r e s c r i b e d a m o u n t so f s o d i u m t h i o s u l f a t e t o n e u t r a l i z e r e s i d u a l c h l o r i n e ( 1 ) .R e s i d u a l c h l o r i n e m e a s u r e m e n t s w e r e m a d e a t t h e s i t e s a tt h e t i m e o f c ol l e c t i o n b y u s i n g t h e N , N - d i e t h y l - p -p h e n y l e n e d i a m i n e m e t h o d ( 1 ) a n d a Hach t e s t k i t ( H a c hC h e m i c a l C o . , A m e s , I o w a ) . T e m p e r a t u r e was r e c o r d e d a tt h e t i m e o f c o l l e c t i o n , a n d pH m e a s u r e m e n t s w e r e a l s o madet h e n o r a f t e r r e t u r n i n g t o t h e l a b o r a t o r y b y L l s i n g w a t e rs a m p l e s w i t h o u t a d d e d t h i o s u l f a t e . A l l c h l o r i n a t e d s a m p l e s ,w i t h t h e e x c e p t i o n o f s a m p l e D2 ( f r o m t h e T o l t s y s t e m ) ,w e r e c o l l e c t e d f r o m f l o w t h r o u g h t a p s . F i n a l c h l o r i n a t e ds a m p l e s w e r e c o l l e c t e d a t t h e e a r l i e s t s a m p l e p o i n t f o l l o w i n gt h e i n - c i t y r e s e r v o i r t h a t w o u l d p e r m i t a 1 0 - m i n c h l o r i n ec o n t a c t t i m e a t m a x i m u m f l o w r a t e s . V i a b l e s a m p l e s w e r eh e l d o n i c e u n t i l r e a d y f o r p r o c e s s i n g , a l l o f w h i c h w a sc o m p l e t e d w i t h i n 8 h o f s a m p l e c o l l e c t i o n .

F o u r m e d i a w e r e u s e d t o r e c o v e r h e t e r o t r o p h i c b a c t e r i af r o m t h e S e a t t l e w a t e r d i s t r i b u t i o n s y s t e m ( T a b l e 2 ) . T h em e d i a w e r e s t a n d a r d m e t h o d s a g a r ( S M A ) ( 1 ) , R2 A ( 1 5 ) ,c a s e i n - p e p t o n e - s t a r c h a g a r ( C P S ) ( 1 0 ) , a n d d i l u t e p e p t o n ea g a r ( D P ) ( 1 8 ) . S p r e a d p l a t e s o f e a c h m e d i u m w e r e made i nt r i p l i c a t e a t s e v e r a l d i l u t i o n s , r o u t i n e l y i n c u b a t e d a t 2 0 C ,a n d e n u m e r a t e d a f t e r 2 8 t o 3 0 d a y s . D a t a r e p or t ed h e r e a r ef r o m n o r m a l - s i z e d p e t r i p l a t e s ( 1 0 0 - m m d i a m e t e r ) , b u t l a r g -e r - s i z e d p l a t e s ( 1 5 0 - m m d i a m e t e r ) w e r e a l s o u s e d o cc a si o n-a l l y . SMA was a l s o u s e d i n p o u r p l a t e s a s p r e v i o u s l yd e s c r i b e d ( 1 ) a n d i n c u b a t e d f o r 4 8 h a t 3 5 C .E n u m e r a t i o n s t u d i e s . I n i t i a l i n v e s t i g a t i o n s i n v o l v e d c o m -p a r i n g t h e mean n u m b e r s o f CFU r e c o v e r e d o n s p r e a d p l a t e so f t h e f o u r m e d i a i n o c u l a t e d w i t h c h l o r i n a t e d w a t e r s a m p l e s .P l a t e s w e r e i n c u b a t e d a t 2 0 C a n d e n u m e r a t e d a f t e r 2 8 t o 3 0d a y s . T h e mean n u m b e r s o f CFU w e r e a n a l y z e d n o n -p a r a m e t r i c a l l y f o r d i f f e r e n c e s b y u s i n g t h e K r u s k a l - W a l l i st e s t ( 1 1 , 2 5 ) . S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t d a t a ( P < 0 . 0 5 o r P

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H E T E R O T R OP H IC BACTE R I A FROM C H L O R I N A T E D DRINK ING WATERmade o f t h e mean n u m b e r s o f CFU r e c o v e r e d on s p r e a dp l a t e s o f DP a n d CPS i n c u b a t e d a t 2 0 C f o r 2 8 t o 3 0 d a y s a n dSMA p o u r p l a t e s i n c u b a t e d a t 3 5 C f o r 4 8 h a f t e r i n o c u l a t i o nw i t h c h l o r i n a t e d water s a m p l e s . The mean n u mbe rs o f CFUr e c o v e r e d on s p r e a d p l a t e s o f DP a n d CPS i n o c u l a t e d w i t hc h l o r i n a t e d water s a m p l e s a n d i n c u b a t e d a s d e s c r i b e d a b o v ewere c o m p a r e d w i t h e a c h o t h e r b y u s i n g t h e W i l c o x o np a i r e d - s a m p l e t e s t ( 2 5 ) . I n tw o s a m p l i n g s u r v e y s t h e e f f e c t o fi n c u b a t i o n temperature on t h e n u m b e r s o f CFU r e c o v e r e do n s p r e a d p l a t e s o f DP a n d CPS was e x a m i n e d . A f t e ri n o c u l a t i o n w i t h c h l o r i n a t e d water s a m p l e s , s p r e a d p l a t e s o fDP a n d CPS were i n c u b a t e d a t 1 0 , 2 0 , a n d 3 0 C a n de n u m e r a t e d a f t e r 2 8 t o 3 0 d a y s . F u r t h e r m o r e , some p l a t e swere i n c u b a t e d a t 2 0 C f o r 2 d a y s a n d t h e n t r a n s f e r r e d t o3 0 C f o r t h e r e m a i n d e r o f t h e t i m e . D a t a f o r e a c h mediumwere a n a l y z e d s e p a r a t e l y b y u s i n g t h e K r u s k a l - W a l l i s t e s t( 1 1 , 2 5 ) , a n d s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t d a t a ( P < 0 . 0 5 o r P

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A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .

T A B L E 3 . C o m p a r i s o n s o f t h e m e a n n u m b e r s o f CFU r e c o v e r e d o n s p r e a d p l a t e s o f t h e f o u r m e d i a i n oc u l a t ed w i t h c h l o r i n a t e d s a m p l e sC h l o r i n eD a t e S a m p l e F " ' R e s u l t ( m g l i t e r - ' )

1 / 7 / 8 1 K3 < 0 . 0 5 DP = CPS > SMA > R 2 A 0 . 2 01 / 7 / 8 1 P 1 < 0 . 1 0 SMA = DP > CPS = R 2A 0 . 5 01 / 2 8 / 8 1 D2 < 0 . 0 5 CPS = DP > R 2 A = SMA T r3 / 1 9 / 8 1 1 3 < 0 . 1 0 CPS = DP > SMA = R 2 A 0 . 4 43 / 1 9 / 8 1 K3 < 0 . 1 0 DP = R2A = CPS > SMA 0 . 4 23 / 1 9 / 8 1 L 3 < 0 . 1 0 DP > CPS = R2A = SMA 0 . 4 03 / 1 9 / 8 1 M 3 < 0 . 1 0 DP > R 2 A = SMA = CPS 0 . 5 03 / 1 9 / 8 1 P 1 < 0 . 1 0 DP > R2A = SMA = CPS 0 . 6 0

aThe d i f f e r e n c e s s h o w n w e r e d e t e r m i n e d w i t h a n o n p a r a m e t r i c m u l t i p l e - r a n g e t e s t ( P < 0 . 0 5 o r P > 0 . 1 0 ) a f t e r s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s w e r e f o u n d w i t h t h eK r u s k a l - W a l l i s t e s t ( P < 0 . 0 5 o r P < 0 . 1 0 ) .

( A O ) m i c r o s c o p i c c o u n t s , s a m p l e s were f i x e d w i t h f o r m a l -d e h y d e t o a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1% a t t h e t i m e o f c o l l e c -t i o n . T h e s t a i n i n g p r o c e d u r e o f H o b b i e e t a l . ( 9 ) was u s e d t od e t e r m i n e t h e number o f b a c t e r i a pe r m i l l i l i t e r . A Z e i s s GFLm i c r o s c o p e w i t h an e p i f l u o r e s c e n c e a t t a c h m e n t was u s e d t ov i s u a l i z e s t a i n e d c e l l s ( 1 9 ) .RESULTSR e c o v e r y s t u d i e s . The f i r s t e n u m e r a t i o n s t u d i e s i n v o l v e ds a m p l e s o f c h l o r i n a t e d d r i n k i n g w a t e r s d e r i v e d f r o m reser-v o i r s t h a t r e c e i v e d water f r o m t h e T o l t R i ve r , t h e C e d a rR i v e r , o r c o m b i n e d r i v e r s o u rc e s . C o m p a r i s o n o f t h e meann u m b e r s o f CFU r e c o v e r e d on t h e f o u r m e d i a a t 1 2 s t a t i o n sr e v e a l e d s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s a t 8 o f t h e s t a t i o n s ( P < 0 . 0 5

o r P < 0 . 1 0 , K r u s k a l - W a l l i s t e s t ) . F u r t h e r a n a l y s e s w i t h t h en o n p a r a m e t r i c m u l t i p l e - r a n g e t e s t a r e s h o w n i n T a b l e 3 .R e s u l t s i n d i c a t e d t h a t DP g e n e r a l l y r e c o v e r e d t h e h i g h e s tmean n u m b e r s o f CFU. CPS a l s o r e c o v e r e d h i g h meann u m b e r s o f CFU ( t h e r a n g e - o f CFU r e c o v e r e d on CPS was3 t o 164% o f t h e CFU r e c o v e r e d on D P , a n d t h e r a n g e o fCFU r e c o v e r e d on R2 A was 1 0 t o 120% o f t h e CFUr e c o v e r e d on D P ) , s o f u r t h e r a n a l y s e s were c o n d u c t e d w i t ht h e s e tw o m e d i a . R2A, w h i c h i s s i m i l a r i n c o m p o s i t i o n t oC P S , was f o u n d t o b e c o m p a r a b l e t o CPS a t m o st s i t e s , ar e s u l t w h i c h i s c o n s i s t e n t w i t h previ o us r e s u l t s f r o m t h i sl a b o r a t o r y ( 6 ) .T h e mean n u m b e r s o f CFU r e c o v e r e d on s p r e a d p l a t e s o fDP a n d CPS i n c u b a t e d f o r 2 8 t o 3 0 d a y s a t 2 0 C werec o m p a r e d w i t h t h e mean n u m b e r s o f CFU r e c o v e r e d on p o u r

p l a t e s o f SMA i n c u b a t e d a t 3 5 C f o r 4 8 h ( S P C p r o c e d u r e ) ( n= 1 9 ) . I n 57 % o f t h e 1 9 s a m p l e s no c o l o n i e s were o b s e r v e do n t h e SMA p o u r p l a t e s , a n d t h e mean numbers o f CFUr e c o v e r e d r a n g e d f r o m < 3 . 0 t o 2 . 2 x 1 0 5 CFU - m l - ' o n DPa n d f r o m 1 . 0 x 1 0 1 t o 1 . 7 x 1 0 5 CFU - m l - ' on CPS ( T a b l e4 ) . F o r t h e r e m a i n i n g s a m p l e s o f w h i c h CFU were f o u n d o nt h e SMA p o u r p l a t e s ( F i g . 2 ) , s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s w e r eo b s e r v e d i n f i v e o f t h e e i g h t s a m p l e s ( P < 0 . 0 5 o r P < 0 . 1 0 ,K r u s k a l - W a l l i s t e s t ) . F o r 13 , K 3 , a n d P 1 s a m p l e s c o l l e c t e do n 7 J a n u a r y 1 9 8 1 ( 1 / 7 / 8 1 ) , t h e mean n u mbe rs o f CFUr e c o v e r e d o n DP a n d CPS were s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o mt h o s e r e c o v e r e d on SMA( P < 0 . 0 5 , n o n p a r a m e t r i c m u l t i p l e -r a n g e t e s t ) . F o r 1 3 s a m p l e s c o l l e c t e d on 1 1 / 1 2 / 8 1 a n d CPTOs a m p l e s c o l l e c t e d on 2 / 2 4 / 8 2 , t h e n o n p a r a m e t r i c m u l t i p l e -r a n g e t e s t c o u l d n o t b e u s e d b e c a u s e o f u n e q u a l n u m b e r s o fd a t u m p o i n t s ( 2 5 ) . H o w e v e r , F i g . 2 s h o w s t h a t f o r t h es a m p l e s f r o m t h e s e tw o s t a t i o n s , t h e mean n u m b e r s o f CFUr e c o v e r e d o n b o t h DP a n d CPS were h i g h e r t h a n t h o s er e c o v e r e d on SMA.F o r C e d a r R i v e r d i s t r i b u t i o n system s a m p l e s , t h e meann u m b e r s o f CFU r e c o v e r e d o n DP were c o m p a r e d w i t h t h emean n u m b e r s o f CFU r e c o v e r e d o n CPS b y u s i n g t h eW i l c o x o n p a i r e d - s a m p l e t e s t . T h i s was d o n e t o c o m p a r er e c o v e r i e s on b o t h m e d i a t o d e t e r m i n e i f r e c o v e r i e s on o n ewere c o n s i s t e n t l y h i g h e r t h a n t h o s e on t h e o t h e r . D a t a werei n c l u d e d o n l y when t h e number o f r e p l i c a p l a t e s o f e a c hmedium was t h r e e ( n = 1 9 ) . DP was f o u n d t o p r o v i d es i g n i f i c a n t l y h i g h e r mean n u m b e r s o f CFU when p a i r e ds a m p l e s were c o m p a r e d ( P < 0 . 0 5 , W i l c o x o n p a i r e d - s a m p l et e s t ) .

T A B L E 4 . Mean n u m b e r s o f CFU ( + s t a n d a r d d e v i a t i o n ) r e c o v e r e d b y t h e SPC p r o c e d u r e ( n o c o l o n i e s o b s e r v e d ) a n d o n s p r e a d p l a t e so f DP a n d CPS i n c u b a t e d a t 2 0 C f o r 2 8 t o 3 0 d a y s "Mean CFU m l - ' ( S D ) r e c o v e r e d b y o r o n : R e s i d u a l c h l o r i n e

Date Samp l e SPC DP CPS ( m g l i t e r - ' )7 / 8 / 8 1 1 3 < 0 . 3 2 . 2 0 ( 0 . 4 2 ) X 1 0 5 1 . 7 0 ( 0 . 3 2 ) X 1 0 5 0 . 7 09 / 2 / 8 1 1 3 < 0 . 3 5 . 1 0 ( 0 . 9 5 ) x 1 0 2 2 . 3 0 ( 1 . 5 5 ) x 1 0 1 NDb9 / 2 / 8 1 K3 < 0 . 3 1 . 7 0 ( 0 . 2 6 ) X 1 0 3 1 . 0 0 ( 0 . 2 8 ) x 1 0 3 ND9 / 2 / 8 1 L 3 < 0 . 3 2 . 9 0 ( 0 . 1 4 ) x 1 0 3 3 . 5 0 ( 1 . 1 0 ) X 1 0 3 ND9 / 2 / 8 1 M3 < 0 . 3 1 . 5 0 ( 0 . 2 0 ) x 1 0 5 9 . 6 0 ( 2 . 0 5 ) x 1 0 4 ND1 1 / 1 2 / 8 1 K3 < 0 . 3 7 . 0 0 ( 4 . 2 5 ) x 1 0 " 6 . 0 0 ( 3 . 6 0 ) x 1 0 1 0 . 5 02 / 2 4 / 8 2 1 3 < 0 . 3 4 . 3 0 ( 0 . 6 0 ) x 1 0 1 5 . 6 0 ( 2 . 1 0 ) x 1 0 1 0 . 8 02 / 2 4 / 8 2 K3 < 0 . 3 < 3 . 0 x 1 0 ' 1 . 3 0 ( 1 . 1 0 ) x 1 0 ' 0 . 7 02 / 2 4 / 8 2 L 3 < 0 . 3 1 . 0 0 ( 0 . 7 0 ) x 1 0 1 1 . 7 0 ( 0 . 6 0 ) x 1 0 1 0 . 5 02 / 2 4 / 8 2 M 3 < 0 . 3 3 . 0 0 ( 6 . 0 0 ) x 1 0 2 < 3 . 0 x 1 0 2 0 . 8 02 / 2 4 / 8 2 Myr < 0 . 3 3 . 0 0 ( 1 . 7 5 ) x 1 0 ' 1 . 0 0 ( 1 . 0 0 ) X 1 0 1 0 . 5 0

a U n l e s s o t h e r w i s e i n d i c a t e d , r e s u l t s a r e f r o m t r i p l i c a t e p l a t e s .b ND, N o t d e t e r m i n e d .< R e s u l t s a r e f r o m d u p l i c a t e p l a t e s .

1 0 5 0 MAKI ET A L .

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H E T E R O T R OP H IC BACTE R I A FROM C H L O R I N A T E D DRINK ING WATER1 0 0 0

1 0 0

C o l o n y f o r m i n gu n i t s p e r m l1 0

* =.

I-

I,v0I iAl w W1 2 3 4 5

S t a t i o nF I G . 2 . S e m i l o g a r i t h m i c p l o t o f t h e mean n u nr e c o v e r e d o n SMA p o u r p l a t e s ( O ) , DP s p r e a d p l a t es p r e a d p l a t e s ( * ) . D a t a w e r e c o l l e c t e d a t t h r e e ss t a t i o n s 1 t o 3 ( 1 3 , K 3 , a n d P 1 ) o n 1 / 7 / 8 1 : s t a t i o n sC L T 2 , a n d 1 3 ) o n 1 1 / 1 2 / 8 1 ; s t a t i o n s 7 a n d 8 ( C P T O2 / 2 4 / 8 2 . Mean c o u n t s w e r e b a s e d o n t h r e e p l a t e s f o rm e d i a e x c e p t f o r DP a t s t a t i o n s 4 a n d 7 ( t w o p l a t e s( o n e p l a t e ) a n d f o r CPS a t s t a t i o n 6 ( t w o p l a t e s ) a n d5 ( o n e p l a t e ) . S t a n d a r d d e v i a t i o n s o f t h e m e a n s ( d ;w e r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( K r u s k a l - W a l l i s t e s t ) a ts t a t i o n s 1 , 2 , a n d 3 a n d a t P < 0 . 1 0 f o r s t a t i o n s 6 a rS a m p l e s c o l l e c t e d o n 1 1 / 1 2 / 8 1 a n d 2 / 2 4 / 8 2e x a m i n e t h e e f f e c t s o f i n c u b a t i o n t e m p e r a t u r ee r y o f CFU o n DP a n d C P S . On 1 1 / 1 2 / 8 1 r e pt r i p l i c a t e p l a t e s i n o c u l a t e d w i t h c h l o r i n a t e d ww e r e i n c u b a t e d f o r 2 8 t o 3 0 d a y s a t 2 0 o r 3 0 C

a t 2 0 C f o l l o w e d b y a t r a n s f e r t o 3 0 C f o r t h e r e m a i n d e r o ft h e t i m e . On 2 / 2 4 / 8 2 s e t s o f t r i p l i c a t e p l a t e s i n o c u l a t e d w i t hc h l o r i n a t e d w a t e r f r o m K 3 , M 3 , a n d My r w e r e i n c u b a t e ds i m i l a r l y . P l a t e s i n o c u l a t e d w i t h c h l o r i n a t e d w a t e r f r o m 1 3a n d L 3 w e r e i n c u b a t e d a s d e s c r i b e d a b o v e , a n d a n a d d i t i o n a ls e t w a s i n c u b a t e d a t 1 1 C .F o r M3 s a m p l e s c o l l e c t e d o n 1 1 / 1 2 / 8 1 ( F i g . 3 ) , s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e mean n u m b e r s o f CFU r e c o v e r e d o nDP a n d CPS w e r e f o u n d f o r t h e d i f f e r e n t i n c u b a t i o n t e m p e r -a t u r e s ( P < 0 . 0 5 , K r u s k a l - W a l l i s t e s t ) . F o r M 3 s a m p l e si n c u b a t e d a t t h e d i f f e r e n t t e m p e r a t u r e s , t h e mean n u m b e r so f CFU r e c o v e r e d o n DP w e r e a l l s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o me a c h o t h e r ( P < 0 . 0 5 , n o n p a r a m e t r i c m u l t i p l e - r a n g e t e s t ) ; t h emean n u m b e r s o f CFU r e c o v e r e d o n CPS i n c u b a t e d a t 2 0 Cw e r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h o s e r e c o v e r e d o n CPSi n c u b a t e d a t o t h e r t e m p e r a t u r e s ( P < 0 . 0 5 , n o n p a r a m e t r i cm u l t i p l e - r a n g e t e s t ) . N o s t a t i s t i c a l d i f f e r e n c e b e t w e e n t h emean n u m b e r s o f CFU r e c o v e r e d o n DP o r CPS i n c u b a t e d a t

6 7 8 t h e v a r i o u s t e m p e r a t u r e s was f o u n d f o r K 3 , L 3 , M 3 , a n dMy r s a m p l e s c o l l e c t e d o n 2 / 2 4 / 8 2 ( P > 0 . 0 5 , K r u s k a l - W a l l i st e s t ) . S i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s w e r e o b s e r v e d ( K r u s k a l - W a l l i sn b e r s o f CFU t e s t ) f o r 1 3 s a m p l e s f o r b o t h DP ( P < 0 . 1 0 ) a n d CPS ( P

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A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .

F I G . 4 . F o u r p l a t e s s h o w i n g c o l o n y t y p e s a t v a r i o u s p o i n t s i n t h eS e a t t l e w a t e r d i s t r i b u t i o n s y s t e m . ( A ) C e d a r R i v e r s o u r c e w a t e r( C P R 1 ) p r i o r t o t h e f i r s t c h l o r i n a t i o n ( 5 . 5 x 1 0 3 b a c t e r i a pe r m l o nD P ) . ( B ) L a k e Y o u n g s ( L Y ) f o l l o w i n g t h e f i r s t c h l o r i n a t i o n ( 1 . 0 x1 0 5 b a c t e r i a pe r m l o n D P ) . ( C ) W e s t S e a t t l e r e s e r v o i r ( R e s . L 3 )f o l l o w i n g t h e s e c o n d c h l o r i n a t i o n ( 1 . 5 x 1 0 5 b a c t e r i a pe r m l o n D P ) .( D ) T a p w a t e r s a m p l e r e m o v e d a t W e s t S e a t t l e R e s e r v o i r ( L 3 )f o l l o w i n g t h e t h i r d a n d f i n a l c h l o r i n a t i o n s . O f t h o s e i l l u s t r a t e d , t h i si s t h e o n l y s a m p l e t h a t h a d a c h l o r i n e r e s i d u a l ; i t c o n t a i n e d 3 . 1 x 1 0 3b a c t e r i a pe r m l o n D P . N o t e t h e h i g h d i v e r s i t y o f c o l o n y t y p e s o n t h esource w a t e r s a m p l e r e l a t i v e t o a l l t h e d o w n s t r e a m s a m p l e s a n d t h eh i g h n u m b e r s o f b a c t e r i a i n t h e r e s e r v o i r s a m p l e s r e l a t i v e t o t h es o u r c e w a t e r s a m p l e . V i r t u a l l y a l l t h e c ol on i e s f o u n d o n p l a t e sp r e p a r e d f o r t h e c h l o r i n a t e d s a m p l e s ( i . e . , L Y , R e s . L3, a n d L 3 )were p i g m e n t e d y e l l o w , o r a n g e , o r r e d .

M u l t i p l e r e g r e s s i o n a n a l y s e s w i t h t h e mean n u m b e r s o f CFUr e c o v e r e d on DP a n d CPS a n d t h e n o r m a l i z e d p e r c e n t a g e sversus t h e d i f f e r e n t c o m b i n a t i o n s o f p a r a m e t e r s d i d n o ti n d i c a t e t h e p r e s e n c e o f a n y s i g n i f i c a n t r e l a t i o n s h i p s .D i v e r s i t y . T h e r e was a l w a y s a d r a m a t i c d i f f e r e n c e b e t w e e nt h e v a r i e t y o f c o l o n y t y p e s o f h e t e r o t r o p h i c b a c t e r i a g r o w i n go n p l a t e s o f s o u r c e w a t e r s as c o m p a r e d w i t h p l a t e s o fc h l o r i n a t e d w a t e r s . A l t h o u g h a l a r g e v a r i e t y o f c o l o n y t y p e sg re w o n p l a t e s i n o c u l a t e d w i t h s o u r c e w a t e r s a m p l e s , c h l o -r i n a t e d water s a m p l e s a p p e a r e d t o have m u c h l e s s d i v e r s i t y( F i g . 4 ) . F u r t h e r m o r e , u n l i k e t h e c o l o n i e s f r o m s o u r c e waters a m p l e s , a h i g h p r o p o r t i o n o f t h e c o l o n i e s f r o m c h l o r i n a t e dwater s a m p l e s were p i g m e n t e d v a r i o u s s h a d e s o f y e l l o w ,b r o w n , o r r e d .

To as s e s s q u a n t i t a t i v e l y w h e t h e r s o u r c e w a t e r s were mored i v e r s e t h a n f i n a l c h l o r i n a t ed s a m p l e s , we t o o k a census o fc o l o n y t y p e s a n d c a l c u l a t e d t h e d i v e r s i t y i n d e x ( T a b l e 5 ) .The r e s u l t s c o n f i r m e d t h e m a c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n s . Ad i v e r s i t y i n d e x o f 4 . 1 4 was o b t a i n e d f o r s o u r c e w a t e r s ,w h e r e a s f i n a l c h l o r i n a t e d s a m p l e s h a d d i v e r s i t y i n d e x e sr a n g i n g f r o m 1 . 0 8 t o 2 . 8 1 . I n T a b l e 5 t h e d i v e r s i t y o fh e t e r o t r o p h s i n s o u r c e w a t e r s i s c a l c u l a t e d f r o m CPS p l a t e s ,w h e r e a s i n t h e f i n a l c h l o r i n a t e d s a m p l e s t h e d i v e r s i t y i sc a l c u l a t e d f r o m DP p l a t e s , b e c a u s e t h e s e m e d i a p r o v i d e d t h eh i g h e s t r e c o v e r i e s f o r t h e i r r e s p e c t i v e s a m p l i n g s i t e s . V a l u e sf o r t h r e e o f t h e f i n a l c h l o r i n a t e d s a m p l e s were i n c r e a s e d

s o m e w h a t w i t h t h e a p p e a r a n c e o f a s l o w - g r o w i n g H y p h o -m o n a s s p . t h a t o c c u r r e d i n s o me o f t h e s a m p l e s . T h u s , a f t e r4 0 d a y s t h e d i v e r s i t y i n d e x o f 1 3 s a m p l e s i n c r e a s e d t o 2 . 4 5 ,t h a t o f L 3 s a m p l e s i n c r e a s e d t o 1 . 4 5 , a n d t h a t o f M 3 s a m p l e si n c r e a s e d t o 1 . 5 5 .I t was o b v i o u s s i m p l y b y e x a m i n a t i o n o f t h e p l a t e s t h a t t h er e d u c t i o n i n d i v e r s i t y a p p e a r e d i n r e s e r v o i r s e v e n a f t e r t h ef i r s t c h l o r i n a t i o n ( F i g . 4 ) . L Y a n d a l l s u b s e q u e n t s t a t i o n ss a m p l e d s h o w e d r e d u c t i o n s i n d i v e r s i t y i n c o m p a r i s o n w i t hs o u r c e w a t e r s ( C P R 1 s a m p l e s ) .D i r e c t c o u n t s . D i r e c t c o u n t s w i t h AO r e v e a l e d t h a t t o t a lb a c t e r i a l n u m b e r s r a n g e d f r o m 1 0 5 t o 1 0 6 c e l l s * m l - ' ( s e es a m p l e s i n T a b l e 6 ) . W h e n t o t a l c o u n t s were c o m p a r e d w i t ht h e me a n n u m b e r s o f CFU o n DP a n d SMA ( b y u s i n g t h eSPC t e c h n i q u e ) , DP u s u a l l y r e c o v e r e d o n l y a s m a l l p e r c e n t -a g e o f t h e t o t a l b a c t e r i a , b u t a g r e a t e r p e r c e n t a g e t h a n d i dSMA ( T a b l e 6 ) . I t i s a l s o i n t e r e s t i n g t o n o t e t h a t t h e d i r e c tc o u n t s o f a l l b u t o n e o f t h e c h l o r i n a t e d s a m p l e s w e r er e d u c e d i n c o m p a r i s o n w i t h t h os e o f s a m p l e s f r o m t h e p o i n tp r e c e d i n g c h l o r i n a t i o n ( K 3 a n d R e s . K3 h a d t h e s a m e c o u n to n 1 1 / 1 2 / 8 1 ) .

DISCUSSIONOur f i n d i n g s t h a t m o r e o r g a n i c a l l y d i l u t e m e d i a r e c o v e rh i g h e r n u m b e r s o f h e t e r o t r o p h i c b a c t e r i a f r o m c h l o r i n a t e dw a t e r a g r e e w i t h o t h e r r e c e n t f i n d i n g s f o r p o t a b l e w a t e r ( 6 ,1 5 , 2 1 ) . Of t h e f o u r m e d i a u s e d i n t h e e n u m e r a t i o n s t u d i e s ,DP u s u a l l y r e c o v e r e d t h e h i g h e s t n u m b e r s o f CFU ( T a b l e s 3a n d 4 a n d F i g . 2 ) . B e c a u s e DP w a s t h e m o s t d i l u t e i n t e r m so f o r g a n i c c a r b o n ( T a b l e 2 ) , t h e r e s u l t s s u g g e s t e i t h e r t h a tm o r e s p e c i e s o f b a c t e r i a i n c h l o r i n a t e d w a t e r f r o m t h eS e a t t l e w a t e r d i s t r i b u t i o n s y s t e m c a n g r o w o n t h i s mediumo r t h a t d a m a g e t h a t h a s o c c u r r e d d u r i n g c h l o r i n a t i o n c a n b em o r e r e a d i l y r e p a i r e d when b a c t e r i a t h a t a r e d a m a g e d g r o wo n t h i s m e d i u m . F u r t h e r e x p e r i m e n t s b e y o n d t h e s c o p e o ft h i s s t u d y w o u l d b e n e c e s s a r y t o d e t e r m i n e w h i c h p o s s i b i l i t yi s c o r r e c t . H o w e v e r , r e p o r t s h a ve b e e n made t h a t a n u m b e ro f s p e c i e s o f b a c t e r i a a r e a b l e t o g r o w i n t a p w a t e r w i t h l o wc o n c e n t r a t i o n s o f o r g a n i c s u b s t r a t e s ( 2 1 - 2 4 ) . T h e s e r e p o r t s ,c o m b i n e d w i t h t h e d e m o n s t r a t i o n o f o l i g o t r o p h i c b a c t e r i af r o m o t h e r a q u a t i c e n v i r o n m e n t s ( 1 4 ) , a r g u e f o r t h e f i r s ta l t e r n a t i v e . F u r t h e r m o r e , we know t h a t o n e s p e c i e s o fHyphomonas g r e w o n l y o n D P .T h e s p r e a d p l a t e s o f D P , C PS , a n d u s u a l l y R 2 A r e c o v e r e dmuch h i g h e r n u m b e r s o f CFU t h a n d i d t h e p o u r p l a t e s o fSMA ( S P C p r o c e d u r e ) i n t h e c u r r e n t s t u d y , a n d t h i s r e s u l t i sT A B L E 5 . D i v e r s i t y i n d e x e s o f s o u r c e w a t e r ( C P R 1 ) a n dc h l o r i n a t e d w a t e r s a m p l e s c o l l e c t e d o n 9 / 2 / 8 1 a n d c o u n t e d a f t e r 2 8d a y s

S a m p l e N o . o f b a c t e r i a / m l D i v e r s i t y R a w d a t a bi n d e x aCPR1 3 , 6 0 0 4 . 1 4 9 ( 2 ) , 4 ( 3 ) , 2 ( 4 ) , 1 ( 1 7 )1 3 2 1 0 1 . 8 5 2 7 , 1 3 , 4 , 3 , 2 ( 2 ) , 1 ( 4 )K3 1 , 7 0 0 2 . 8 1 2 1 , 6 ( 4 ) , 2 ( 4 ) , 1 ( 2 )L 3 2 , 9 0 0 1 . 2 3 3 7 , 9 ( 2 )M 3 1 5 0 , 0 0 0 1 . 0 8 3 0 , 5 , 3 , 1 ( 2 )

" B a s e d u p o n 5 5 c o l o n i e s , e x c e p t f o r M 3 , f o r w h i c h 4 0 c o l o n i e s w e r e u s e d .CPR1 d i v e r s i t y w a s d e t e r m i n e d w i t h C P S , w h e r e a s a l l c h l o r i n a t e d w a t e rs a m p l e d i v e r s i t i e s w e r e d e t e r m i n e d w i t h D P .I Number o f c o l o n i e s o f e a c h c o l o n y t y p e . F o r e x a m p l e , f o r CPR1 2 c o l o n yt y p e s ( i . e . , s t r a i n s ) w e r e r e p r e s e n t e d b y 9 c o l o n i e s e a c h , 3 s t r a i n s w e r er e p r e s e n t e d b y 4 c o l o n i e s e a c h , 4 s t r a i n s w e r e r e p r e s e n t e d b y 2 c o l o n i e s e a c h ,a n d 1 7 s t r a i n s w e r e r e p r e s e n t e d b y u n i q u e c o l o n i e s , g i v i n g a t o t a l o f 5 5c o l o n i e s .

1 0 5 2 M A K I ET A L .

7/27/2019 1986 Maki et al., 1986

7/9

H E T E R O T R O PH I C BACTE R I A FROM CHLORINATED DRINKING WATERT A B L E 6 . C o m p a r i s o n o f d i r e c t AO m i c r o s c o p i c c o u n t s w i t h v i a b l e c o u n t s f o r s a m p l e s f r o m t h e C e d a r R i v e r w a t e r s h e d

R e s i d u a l N o . o f b a c t e r i a / m l c o u n t e d b y o r o n " : % V i a b l eD a t e S a m p l e c h l o r i n e( m g - l i t e r - 1 ) AO ( S E ) DP ( S D ) SPC ( S D ) DP/AO SPC/AO9 / 2 / 8 1 CPR1 ND6 8 . 6 x 1 0 5 ( 2 . 4 x 1 0 4 ) 3 . 6 x 1 0 3 [ 1 ] ND 0 . 4 2CPTO ND 4 . 2 x 1 0 5 ( 2 . 7 x 1 0 4 ) 1 . 2 x 1 0 4 [ 1 ] ND 2 . 8 6L Y ND 8 . 5 x 1 0 5 ( 5 . 7 x 1 0 4 ) 1 . 0 X i 0 5 ( 2 . 4 x 1 0 4 ) ND 1 1 . 8

CLT2 ND 8 . 1 x 1 0 5 ( 2 . 1 x 1 0 4 ) 6 . 0 x 1 0 1 [ 1 ] ND 0 . 0 1 9R e s . L 3 ND 5 . 3 x 1 0 5 ( 1 . 8 x 1 0 4 ) 1 . 6 x 1 0 5 ( 2 . 4 x 1 0 4 ) 7 . 4 x 1 0 1 [ 1 ] 3 0 . 2 0 . 0 1 4L 3 ND 3 . 5 x 1 0 5 ( 1 . 3 x 1 0 4 ) 3 . 1 x 1 0 3 ( 2 . 0 x 1 0 2 ) ND 0 . 8 9R e s . M 3 ND 1 . 2 x 1 0 6 ( 1 . 7 x 1 0 4 ) 4 . 0 x 1 0 5 ( 3 . 6 x 1 0 4 ) [ 2 ] 6 . 4 x 1 0 1 [ 1 ] 3 3 . 6 0 . 0 0 5 4M 3 ND 5 . 9 x 1 0 5 ( 1 . 4 x 1 0 4 ) 1 . 6 x 1 0 5 ( 9 . 2 x 1 0 3 ) [ 2 ] < 1 . 0 x 1 0 0 [ 1 ] 2 7 . 1 < 0 . 0 0 0 1 7R e s . 1 3 ND 2 . 8 x 1 0 5 ( 5 . 9 x 1 0 4 ) 1 . 1 X 1 0 3 ( 1 . 1 X 1 0 2 ) 5 . 8 x 1 0 1 [ 1 ] 0 . 3 9 0 . 2 11 3 ND 2 . 2 x 1 0 5 ( 1 . 9 X 1 0 4 ) 5 . 1 x 1 0 2 ( 9 . 3 x 1 0 1 ) < 1 . 0 x 1 0 0 [ 1 ] 0 . 2 3 < 0 . 0 0 0 4 6R e s . K3 ND 2 . 1 x 1 0 5 ( 4 . 0 x 1 0 4 ) 8 . 9 x 1 0 4 ( 1 . 2 x 1 0 4 ) 1 . 0 X 1 0 2 [ 1 ] 4 2 . 4 0 . 4 8K3 ND 1 . 8 x 1 0 5 ( 2 . 5 x 1 0 4 ) 1 . 7 x 1 0 3 ( 2 . 6 x 1 0 2 ) < 1 . 0 x 1 0 0 [ 1 ] 0 . 9 4 < 0 . 0 0 0 5 61 1 / 1 / 8 1 CRP1 ND 1 . 3 x 1 0 6 ( 1 . 4 x 1 0 4 ) 1 . 4 x 1 0 4 ( 1 . 1 X 1 0 3 ) 2 . 6 x 1 0 ' ( 1 . 2 x 1 0 ' ) 1 . 0 8 0 . 0 0 2 0CPTO ND 7 . 6 x 1 0 5 ( 3 . 6 x 1 0 4 ) 9 . 8 x 1 0 1 [ 1 ] 3 . 0 x 1 0 0 ( 3 . 0 x 1 0 0 ) 0 . 0 1 3 0 . 0 0 0 4 9L Y ND ND ND ND ND ND ND ND NDCLT2 ND 6 . 0 x 1 0 5 ( 3 . 5 x 1 0 4 ) 1 . 9 x 1 0 ' ( 7 . 2 x 1 0 0 ) [ 2 ] 0 . 3 x 1 0 0 ( 0 . 6 x 1 0 0 ) 0 . 0 0 3 2 0 . 0 0 0 0 5 0R e s . L 3 ND 9.1X 1 0 5 ( 4 . 8 x 1 0 4 ) < 0 . 3 x 1 0 3 0 . 3 x 1 0 0 ( 0 . 6 x 1 0 0 ) < 0 . 0 3 3 0 . 0 0 0 0 3 3L3 0 . 6 0 8 . 2 x 1 0 5 ( 4 . 3 x 1 0 4 ) < 0 . 3 x 1 0 1 < 0 . 3 x 1 0 0 < 0 . 0 0 3 4 < 0 . 0 0 0 0 3 7R e s . M 3 ND 1 . 2 x 1 0 6 ( 7 . 9 x 1 0 4 ) 4 . 6 x 1 0 5 ( 2 . 1 x 1 0 4 ) 2 . 3 x 1 0 0 ( 2 . 5 x 1 0 0 ) 3 8 . 3 0 . 0 0 0 2 0M 3 0 . 6 2 1 . 1 x 1 0 6 ( 7 . 4 x 1 0 4 ) 1 . 6 x 1 0 5 ( 1 . 1 X 1 0 4 ) 1 . 3 x 1 0 0 ( 1 . 2 x 1 0 0 ) 1 4 . 5 0 . 0 0 0 1 2R e s . 1 3 ND 1 . 2 x 1 0 6 ( 5 . 3 x 1 0 4 ) 1 . 5 x 1 0 2 ( 5 . 2 x 1 0 ' ) < 0 . 3 x 1 0 0 0 . 4 1 < 0 . 0 0 0 0 2 51 3 0 . 7 5 9 . 6 x 1 0 5 ( 5 . 7 x 1 0 4 ) 5 . 0 x 1 0 0 ( 1 . 4 x 1 0 0 ) [ 2 ] 2 . 0 x 1 0 0 ( 1 . 8 x 1 0 0 ) 0 . 0 0 0 5 2 0 . 0 0 0 2 1R e s . K3 ND 1 . 3 x 1 0 6 ( 1 . 8 x 1 0 5 ) 3 . 4 x 1 0 3 ( 1 . 8 x 1 0 3 ) 1 . 3 x 1 0 0 ( 1 . 6 x 1 0 0 ) 0 . 0 2 6 0 . 0 0 0 1 0K3 0 . 5 0 1 . 3 x 1 0 6 ( 9 . 1 x 1 0 4 ) 7 . 0 x 1 0 1 ( 4 . 3 x 1 0 1 ) [ 2 ] < 0 . 3 x 1 0 0 0 . 0 0 5 4 < 0 . 0 0 0 0 2 3

" T h r e e p l a t e s w e r e u s u a l l y u s e d f o r e a c h v i a b l e e n u m e r a t i o n : i f f e w e r t h a n t h r e e p l a t e s w e r e a v a i l a b l e ( d u e t o o v e r g r o w t h o r o t h e r p r o b l e m s ) , t h e n u m b e r u s e di s s h o w n i n b r a c k e t s .b ND, N o t d e t e r m i n e d .c o n s i s t e n t w i t h t h o s e o f o t h e r r e c e n t r e p o r t s ( 6 , 1 5 , 2 0 ) .F u r t h e r m o r e , t h e SPC p r o c e d u r e d o e s n o t p r o v i d e a p r o p o r -t i o n a t e l y l o w e r c o u n t f r o m s a m p l e t o s a m p l e a n d o f t e n f a i l st o r e c o v e r a n y i s o l a t e s ( T a b l e 4 ) . T h e l o w e r n u m b e r s o f CFUr e c o v e r e d b y t h e SPC p r o c e d u r e i s m o s t l i k e l y d u e t o t h et h e r m a l s e n s i t i v i t y o f t h e b a c t e r i a ( 4 ) a s w e l l a s t h e o r g a n i cr i c h n e s s o f t h e m e d i u m . T h e l o w a mou nt o f o r g a n i c m a t t e rp r o b a b l y a l s o c o n t r i b u t e d t o t h e o v e r a l l h i g h e r r e c o v e r y o nDP t h a n o n C P S . T h e m o s t r e c e n t i s s u e o f S t a n d a r d M e t h -o d s f o r t h e E x a m i n a t i o n o f W a t e r a n d W a s t e w a t e r ( 1 )d e s c r i b e s a s p r e a d p l a t e m e t h o d t h a t u s e s R2 A f o r enumer-a t i n g h e t e r o t r o p h s .I t was p r e v i o u s l y s h o w n f o r b a c t e r i a f r o m t h e S e a t t l ew a t e r d i s t r i b u t i o n s y s t e m t h a t i n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e s o f3 5 C a n d h i g h e r w e r e n o t a s f a v o r a b l e f o r t h e maximumr e c o v e r y o f CFU a s 2 0 C ( 6 ) . H o w e v e r , i t wa s n o t knownw h e t h e r a n i n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e o f 3 0 C wa s a l s o t o o h i g hf o r maximum r e c o v e r y . T h i s was a n i m p o r t a n t q u e s t i o n t oa n s w e r b e c a u s e o f t h e p r o l o n g e d p e r i o d o f i n c u b a t i o nn e e d e d t o p r o v i d e h i g h e s t r e c o v e r i e s a t 2 0 C ( 2 8 t o 3 0 d a y s ) .W e d e c i d e d a l s o t o t e s t t e m p e r a t u r e s o f 1 1 a n d 3 0 C a n d at e m p e r a t u r e s h i f t f r o m 2 0 t o 3 0 C . T h e h y p o t h e s i s b e h i n d t h et e m p e r a t u r e s h i f t e x p e r i m e n t wa s t h a t s o m e b a c t e r i a m i g h tb e a b l e t o g r o w a t 3 0 C b u t c o u l d n o t s u r v i v e a r a p i d s h i f t t o3 0 C a t t h e t i m e o f p l a t i n g , when t h e e n v i r o n m e n t a l t e m p e r -a t u r e was 1 0 t o 2 0 C . S t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t r e s u l t s o c c u r r e dw i t h M 3 a n d I 3 s a m p l e s . I n b o t h c a s e s 2 0 C wa s t h e o p t i m u mi n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e f o r b o t h DP a n d C P S , c o n f i r m i n g t h er e s u l t s o f F i k s d a l e t a l . ( 6 ) a n d a g r e e i n g w i t h t h e r e s u l t s o fR e a s o n e r a n d G e l d r e i c h ( 1 5 ) f o r R2A. T h e l a c k o f a s i g n i f i -c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e d i f f e r e n t i n c u b a t i o n t e m p e r a -t u r e s f o r t h e o t h e r c h l o r i n a t e d s a m p l e s m ay h a v e b e e n d u e t ou n u s u a l l y h i g h l e v e l s o f r e s i d u a l c h l o r i n e .The m a j o r d r a w b a c k o f u s i n g D P , a l t h o u g h i t c o n s i s t e n t l y

r e c o v e r s h i g h n u m b e r s o f h e t e r o t r o p h i c b a c t e r i a f r o m c h l o -r i n a t e d w a t e r , i s t h e l e n g t h o f i n c u b a t i o n r e q u i r e d a t 2 0 C .T h i s e x t e n s i ve t i m e m a k e s t h e medium p r o h i b i t i v e f o r rou-t i n e m o n i t o r i n g o f d i s t r i b u t i o n s y s t e m s . N o n e t h e l e s s , i t i sr e c o m m e n d e d f o r r e s e a r c h e r s wh o w i s h t o recover t h ep r e d o m i n a n t h e t e r o t r o p h s a n d s t u d y t h e i m p o r t a n t s p e c i e s i nc h l o r i n a t e d w a t e r . F u r t h e r m o r e , o ur r e s u l t s i n d i c a t e t h en e e d t o d e v e l o p a m o r e r a p i d m e t h o d o l o g y t h a n v i a b l e p l a t ec o u n t i n g f o r m o n i t o r i n g t h e t o t a l v i a b l e h e t e r o t r o p h s i nd i s t r i b u t i o n s y s t e m s .O u r i n a b i l i t y t o show p o s i t i v e or n e g a t i v e r e l a t i o n s h i p sb e t w e e n t h e mean n u m b e r s o f CFU r e c o v e r e d a n d t h ep h y s i c a l a n d c h e m i c a l p a r a m e t e r s m e a s u r e d i s n o t r e a l l ys u r p r i s i n g . J o n e s ( 1 2 ) u s e d a p r i n c i p a l c o m p o n e n t a n a l y s i sa n d m u l t i p l e r e g r e s s i o n a n a l y s e s t o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t s o fe n v i r o n m e n t a l f a c t o r s o n e s t i m a t e d v i a b l e p o p u l a t i o n s o fp l a n k t o n i c b a c t e r i a i n l a k e s a n d e x p e r i m e n t a l e n c l o s u r e s ,f o u n d t h a t t h e v a r i a t i o n i n d a t a c o u l d b e e x p l a i n e d b y f i v er e g r e s s o r v a l u e s , a n d l i s t e d a n u m b e r o f o t h e r s t h a t m a y a d df u r t h e r i n f o r m a t i o n . I n s h o r t , a t t e m p t s t o u n d e r s t a n d t h e r o l eo f e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s i n t h e r e c o v e r y o f h e t e r o t r o p h i cb a c t e r i a f r o m c h l o r i n a t e d s y s t e m s w o u l d r e q u i r e m e a s u r e -ments o f a d d i t i o n a l p a r a m e t e r s b e s i d e s t e m p e r a t u r e , p H ,a n d r e s i d u a l c h l o r i n e . I n c o n t r a s t , i t i s i n t e r e s t i n g t o n o t e t h ea p p a r e n t d i r e c t r e l a t i o n s h i p b e t w e e n a d e c r e a s e i n t o t a l AOc o u n t s a n d c h l o r i n a t i o n .T h e d i v e r s i t y d a t a o b t a i n e d i n t h i s i n v e s t i g a t i o n werec o n s i s t e n t w i t h p r e l i m i n a r y d a t a p r e v i o u s l y r e p o r t e d f o r t h eS e a t t l e d r i n k i n g water s y s t e m ( 6 ) a s w e l l a s o t h e r s u r v e y s weh a v e a n a l y z e d ( d a t a n o t s h o w n ) . The o p e r a t i o n o f t h i sd r i n k i n g water t r e a t m e n t a n d d i s t r i b u t i o n s y s t e m e v i d e n t l yr e s u l t s i n t h e s e l e c t i o n o f a l i m i t e d number o f b a c t e r i a ls p e c i e s t h a t p r e d o m i n a t e i n t h e r e s e r v o i r s a n d a r e u l t i m a t e l yf o u n d i n t h e f i n a l c h l o r i n a t e d s a m p l e s . I t i s i n t e r e s t i n g t o

V O L . 5 1 , 1 9 8 6 1 0 5 3

7/27/2019 1986 Maki et al., 1986

8/9

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .n o t e t h a t m an y o f t h e s u r v i v i n g b a c t e r i a w e r e p i g m e n t e d .R e a s o n e r a n d G e l d r e i c h ( 1 5 ) h a v e a l s o r e p or t e d h i g h p r o p o r -t i o n s o f p i g m e n t e d b a c t e r i a i n c h l o r i n a t e d t r e a t m e n t w a t e r s .T h e o b s e r v a t i o n t h a t t h e r e d u c t i o n i n d i v e r s i t y o c c u r r e d i nL a k e Y o u n g s , t h e r e s e r v o i r f o l l o w i n g t h e f i r s t c h l o r i n a t i o n ,s u g g e s t s e i t h e r o f t w o p o s s i b i l i t i e s : e i t h e r t h e p i g m e n t e df o r m s i n t h e s e s a m p l e s a r e m o r e c h l o r i n e r e s i s t a n t t h a n m o s tb a c t e r i a f r o m s o u r c e w a t e r s a n d a r e t h e r e f o r e s e l e c t e d f o r b yc h l o r i n a t i o n , s u r v i v e i n t h e r e s e r v o i r s , a n d g r o w o r t h e y a r en o t m o r e c h l o r i n e r e s i s t a n t , b u t t h e p h y s i c a l , c h e m i c a l , a n db i o l o g i c a l c o n d i t i o n s i n t h e o p e n r e s e r v o i r s f a v o r t h e i rg r o w t h , a n d t h e y h a v e b e c o m e e s t a b l i s h e d o v e r a l o n gp e r i o d o f t i m e . A d d i t i o n a l s t u d i e s w o u l d b e n e e d e d t od e t e r m i n e w h i c h o f t h e s e a l t e r n a t i v e s i s t r u e . T h e d e t e r m i -n a t i on o f w h i c h a l t e r n a t i v e i s c o r r e c t i s i m p o r t a n t , a s c h l o -r i n e - r e s i s t a n t b a c t e r i a ma y a l s o b e a n t i b i o t i c ( 2 , 3 ) - a n d m e t a l( 5 ) - r e s i s t a n t , p r o v i d i n g a p o t e n t i a l r e s e r v o i r o f r e s i s t a n c ef a c t o r s f o r n o n r e s i s t a n t p a t h o g e n i c b a c t e r i a .W i t h r e s p e c t t o t h e d i r e c t c o u n t d a t a , i t i s i n t e r e s t i n g t on o t e t h a t t h e p e r c e n t a g e s o f r e c o v e r y o f v i a b l e h e t e r o t r o p h si n t h e r e s e r v o i r s a m p l e s w e r e o f t e n h i g h , w h i c h i s c h a r a c -t e r i s t i c o f e u t r op h i c w a t e r s ( u p t o 40% w a s r e p o r t e d w h e nDP w a s u s e d ) . I n c o n t r a s t , s o u r c e w a t e r s ( C P R 1 ) a l w a y s h a dr e c o v e r i e s o f l e s s t h a n 1 % , t y p i c a l o f o l i g o t r o p h i c a n dm e s o t r o p h i c a q u a t i c h a b i t a t s i n t h e P a c i f i c N o r t h w e s t ( 1 9 ) .T h u s , i n t h i s s y s t e m , t h e p r o c e s s o f w a t e r t r e a t m e n t o f t e np r o d u c e s a n a p p a r e n t e u t r o p h i c a t i o n e f f e c t , a t l e a s t w i t hr e s p e c t t o t h e h e t e r o t r o p h i c b a c t e r i a l c o m m u n i t y . T h i s e f f e c tm a y a l s o b e r e l a t e d t o t h e c h a n g e s i n d i v e r s i t y t h a t w e r eo b s e r v e d . T h e a p p a r e n t e u t r o p h i c a t i on e f f e c t m ay b e d u e t ot h e r e l e a s e o f o r g a n i c n u t r i e n t s f r o m a l g a e a n d f r o m b a c t e r i a la n d o t h e r m i c r o b i a l b i o m a s s e s b y c h l o r i n a t i o n , m a k i n g t h i sm a t e r i a l a v a i l a b l e t o p l a n k t o n i c b a c t e r i a i n t h e d o w n s t r e a mr e s e r v o i r s .R e c o m m e n d a t i o n s . ( i ) C h o i c e o f m e d i u m . SMAw a s i n f e r i o rt o t h e o t h e r m e d i a t e s t e d i n t h i s i n v e s t i g a t i o n . W e r e c o m -mend i n t e r i m a d o p t i o n o f R 2A a s t h e m e d i u m o f c h oi c e f o rc h l o r i n a t e d d r i n k i n g w a t e r s . C P S , w h i c h i s s i m i l a r i n c o m -p o s i t i o n t o R 2 A , a p p e a r s t o b e c o m p a r a b l e t o R2A a n d c o u l db e u s e d i n p l a c e o f i t ( 6 ) . T h e b e s t m e d i u m f o r S e a t t l e ' sc h l o r i n a t e d d r i n k i n g w a t e r s was t h e m o s t d i l u t e mediumu s e d , D P . F u r t h e r t e s t i n g s h o u l d b e d o n e i n o t h e r r e g i o n s t od e t e r m i n e w h e t h e r i t i s a s e f f e c t i v e a s i t i s i n S e a t t l e .( i i ) P l a t i n g o f v i a b l e s a m p l e s . P o u r p l a t i n g s h o u l d b ea b a n d o n e d b e c a u s e i t f r e q u e n t l y c a u s e s d e a t h o fh e t e r o t r o p h i c b a c t e r i a f r o m c h l o r i n a t e d s a m p l e s d u e t ot h e r m a l s h oc k . S p r e a d p l a t i n g i s t h e p r e f e r r e d m e t h o d f o re n u m e r a t i n g h e t e r o t r o p h i c b a c t e r i a f r o m d r i n k i n g w a t e r s .A l t h o u g h m e m b r a n e f i l t r a t i o n p r o c e d u r e s h a v e b e e n u s e dw i t h s u c c e s s b y s o m e , we f o u n d t h a t t h e y d i d n ot p r o vi d e a sh i g h c o u n t s a s d i d s p r e a d p l a t i n g when s a m p l e s o f S e a t t l ed r i n k i n g w a t e r w e r e a n a l y z e d ( 6 ) . T h u s , s p r e a d p l a t i n gs h o u l d b e a d o p t e d u n l e s s s t u d i e s h a v e s h o w n i t t o b e l e s ss a t i s f a c t o r y t h a n m e m b r a n e f i l t r a t i o n p r o c e d u r e s o r o t h e rt e c h n i q u e s f o r a p a r t i c u l a r s a m p l e .( i i i ) P l a t e s i z e . L a r g e p e t r i d i s h e s ( 1 5 0 - m m d i a m e t e r )s h o u l d b e u s e d f o r s a m p l e s c o n t a i n i n g l o w c o n c e n t r a t i o n s o fb a c t e r i a , a s t h e y a l l o w o n e t o p l a c e a g r e a t e r v o l u m e o f t h es a m p l e o n t h e p l a t e ( t h e s u r f a c e a r e a i s c a . 2 . 3 t i m e s g r e a t e rt h a n t h a t o f r e g u l a r p e t r i d i s h e s [ 1 0 0 - m m d i a m e t e r ] ) . W i t hp r o p e r d r y i n g a t l e a s t 1 . 0 m l o f a s a m p l e c a n b e a b s o r b e d o nt h e m e d i u m i n a l a r g e p e t r i d i s h .( i v ) T e m p e r a t u r e o f i n c u b a t i o n . I n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e sf o r t h e S e a t t l e d r i n k i ng w a t e r s a m p l e s y i e l d e d l o w e r c o u n t swhen t h e y e x c e e d e d t h e a m b i e n t w a t e r t e m p e r a t u r e s b y1 7 C . F o r e x a m p l e , t h e d a t a s h o w n f o r M 3 s a m p l e s i n F i g .

3A w e r e o b t a i n e d when t h e w a t e r t e m p e r a t u r e was 1 3 C . F o rt h i s s y s t e m , i t i s u n d e s i r a b l e t o h a n d l e a n d i n c u b a t e s a m p l e sa t t e m p e r a t u r e s a b o v e 2 0 C . As a g e n e r a l r u l e , w e r e c o m -mend t h a t i n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e s f o r v i a b l e h e t e r o t r o p h ss h o u l d b e n o g r e a t e r t h a n 1 0 C a b o v e t h e t e m p e r a t u r e o f t h es a m p l i n g w a t e r i f one w i s h e s t o o b t a i n a maxi mum r e c o v e r yo f b a c t e r i a . Of c o u r s e , when l o w e r t e m p e r a t u r e s a r e u s e d , i ti s n e c e s s a r y t o i n c u b a t e l o n g e r f o r m a x i m u m r e c o v e r y . Wer e c o m m e n d t h a t 2 8 t o 3 0 d a y s b e u s e d f o r 2 0 C .( v ) B i o m a s s p r o c e d u r e s . I t i s e v i d e n t t h a t , f r o m a p u b l i ch e a l t h p e r s p e c t i v e , c u r r e n t a n d p r o s p e c t i v e v i a b l e p l a t i n gp r o c e d u r e s c a n n o t p r o v i d e s a t i s f a c t o r y e s t i m a t e s o f v i a b l eb a c t e r i a i n w a t e r t r e a t m e n t a n d d i s t r i b u t i o n s y s t e m s . T h eb e s t a v a i l a b l e p r o c e d u r e s r e q u i r e i n c u b a t i o n p e r i o d s t h a t a r ee x c e s s i v e f o r t h e r a p i d m o n i t o r i n g o f d r i n k i n g w a t e r q u a l i t y .T h u s , i t i s i m p e r a t i v e t h a t a l t e r n a t i v e m i c r o b i a l b i o m a s sp r o c e d u r e s , b a s e d p e r h a p s o n t h e q u a n t i f i c a t i o n o f A T P o rt e t r a z o l i u m d y e r e d u c t i o n i n c o n j u n c t i o n w i t h d i r e c t m i c r o -s c o p i c c o u n t i n g w i t h AO o r s i m i l a r l y s e n s i t i v e t e c h n i q u e s ,b e d e v e l o p e d t o p r o v i d e r a p i d e s t i m a t e s o f b a c t e r i a l c o n c e n -t r a t i o n s i n d r i n k i n g w a t e r s .( v i ) E f f e c t o f c h l o r i n a t i o n o n d i v e r s i t y . A d d i t i o n a l s t u d i e ss h o u l d b e c o n d u c t e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e r e d u c t i o n i nd i v e r s i t y t h a t we o b s e r v e d i n t h e s e s t u d i e s i s d u e s o l e l y t oc h l o r i n a t i o n o r w h e t h e r o t h e r f a c t o r s i n t h e t r e a t m e n t p r o c -e s s a r e i n p a r t r e s p on s i b l e . I f c h l o r i n a t i o n i s r e s p o n s i b l e f o rt h e r e d u c t i o n i n d i v e r s i t y a n d t h e s e l e c t i o n o f p i g m e n t e db a c t e r i a , i t ma y b e p o s s i b l e t o m o d i f y t h e t r e a t m e n t p r o c e s st o make t h e s e b a c t e r i a more s u s c e p t i b l e t o d i s i n f e c t i o n .

A C K N O W L E D G M E N T SW e t h a n k t h e C i t y o f S e a t t l e W a t e r Q u a l i t y L a b o r a t o r y , i np a r t i c u l a r , J o h n C o u r c h e n e , J a n M a r t i n , a n d L o r e t t a O r p i l l a , f o r t h e i rc o o p e r a t i o n a n d h e l p i n s a m p l e c o l l e c t i o n a n d F . E . P a l m e r f o r h i sa s s i s t a n c e i n p r o c e s s i n g s a m p l e s . D . J . R e a s o n e r a n d E . E .G el d r ei c h p r o vi d e d ma n y h e l p f u l s u g g e s t i o n s d u r i n g t h e s t u d y .T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y C o op e r a t i ve A g r e e m e n t n o .C R 8 0 7 5 7 0 0 1 0 f r o m t h e D r i n k i n g W a t e r R e s e a r c h D i v i s i o n , W a t e rE n g i n e e r i n g R e s e a r c h L a b o r a t o r y , U . S . E n v i r o n m e n t a l P r o t e c t i o n

A g e n c y .LITERATURE CITED

1 . A m e r i c a n P u b l i c H e a l t h A s s o c i a t i o n . 1 9 8 1 . S t a n d a r d m e t h o d s f o rt h e e x a m i n a t i o n o f w a t e r a n d w a s t e w a t e r , 1 5 t h e d . A m e r i c a nP u b l i c H e a l t h A s s o c i a t i o n , W a s h i n g t o n, D . C .2 . A r m s t r o n g , J . L . , J . J . C a l o m i r i s , a n d R . J . S e i d l e r . 1 9 8 2 .S e l e c t i o n o f a n t i b i o t i c - r e s i s t a n t s t a n d a r d p l a t e c o u n t b a c t e r i ad u r i n g w a t e r t r e a t m e n t . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 4 : 3 0 8 - 3 1 6 .3 . A r m s t r o n g , J . L . , D . S . S h i g e n o , J . J . C a l o m i r i s , a n d R . J .S e i d l e r . 1 9 8 1 . A n t i b i o t i c - r e s i s t a n t b a c t e r i a i n d r i n k i n g w a t e r .A p p l . E nv i r o n. M i c r o b i o l . 4 2 : 2 7 7 - 2 8 3 .4 . B u c k , J . D . 1 9 7 9 . T h e p l a t e c o u n t i n a q u a t i c m i c r o b i o l o g y , p .1 9 - 2 8 . I n J . W . C o s t e r t o n a n d R . R . C o l w e l l ( e d . ) , N a t i v ea q u a t i c b a c t e r i a : e n u m e r a t i o n , a c t i v i t y , a n d e c o l o g y . ASTMST P 6 9 5 . A m e r i c a n S o c i e t y f o r T e s t i n g a n d M a t e r i a l s , P h i l a d e l -p h i a .5 . C a l o m i r i s , J . J . , J . L . A r m s t r o n g , a n d R . J . S e i d l e r . 1 9 8 4 .A s s o c i a t i o n o f m e t a l t o l e r a n c e w i t h m u l t i p l e a n t i b i o t i c r e s i s t -a n c e o f b a c t e r i a i s o l a t e d f r o m d r i n k i n g w a t e r . A p p l . E n v i r o n .M i c r o b i o l . 4 7 : 1 2 3 8 - 1 2 4 2 .6 . F i k s d a l , L . , E . A . V i k , A . M i l l s , a n d J . T . S t a l e y . 1 9 8 2 . N o n -s t a n d a r d m e t h o d s f o r e n u m e r a t i n g b a c t e r i a i n d r i n k i n g w a t e r . J .Am . W a t e r W o r k s A s s o c . 7 4 : 3 1 3 - 3 1 8 .7 . G e l d r e i c h , E . E . , M. J . A l l e n , a n d R . H . T a y l o r . 1 9 7 8 . I n t e r f e r -e n c e s t o c o l i f o r m d e t e c t i o n i n p o t a b l e w a t e r s u p p l i e s . I n C . W.H e n d r i c k s ( e d . ) , E v a l u a t i o n o f t h e m i c r o b i o l o g y s t a n d a r d s f o rd r i n k i n g w a t e r . E P A - 5 7 0 / 9 - 7 8 - O O C . U . S . E n v i r o n m e n t a l P r o t e c -t i o n A g e n c y , W a s h i n g t o n , D . C .8 . G e l d r e i c h , E . E . , H . D . N a s h , D . J . R e a s o n e r , a n d R . H . T a y l o r .

1 0 5 4 M A K I ET AL .

7/27/2019 1986 Maki et al., 1986

9/9

H E T E R O T R OP H IC BACTE R I A FROM C H L O R I N A T E D DRINKING WATER1 9 7 2 . T h e n e c e s s i t y o f c o n t r o l l i n g b a c t e r i a l p o p u l a t i o n s i np o t a b l e w a t e r s : c o m m u n i t y w a t e r s u p p l y . J . Am . W a t e r WorksA s s o c . 6 4 : 5 9 6 - 6 0 2 .9 . H o b b i e , J . E . , R . J . D a l e y , a n d S . J a s p e r . 1 9 7 7 . U s e o fN u c l e p o r e f i l t e r s f o r c o u n t i n g b a c t e r i a b y f l u o r e s c e n c e m i c r o s -c o p y . A p p l . E n v i r o n . M i cr o b i o l. 3 3 : 1 2 2 5 - 1 2 2 8 .1 0 . J o n e s , J . G . 1 9 7 0 . S t u d i e s o n f r e s h w a t e r b a c t e r i a : e f f e c t o fm e d i u m c o m p o s i t i o n a n d m e t h o d o n e s t i m at e s o f b a c t e r i a lp o p u l a t i o n . J . A p p l . B a c t e r i o l . 3 3 : 6 7 9 - 6 8 6 .1 1 . J o n e s , J . G . 1 9 7 3 . U s e o f n o n p a r a m e t r i c t e s t s f o r t h e a n a l y s i s o fd a t a o b t a i n e d f r o m p r e l i m i n a r y s u r v e y s : a r e v i e w . J . A p p l .B a c t e r i o l . 3 6 : 1 9 7 - 2 1 0 .1 2 . J o n e s , J . G . 1 9 7 7 . T h e e f f e c t o f e n v i r o m e n t a l f a c t o r s o n e s t i -m a t e d v i a b l e a n d t o t a l p o p u l a t i o ns o f p l a n k t o n i c b a c t e r i a i nl a k e s a n d e x p e r i m e n t a l e n c l o s u r e s . F r e s h w a t . B i o l . 7 : 6 7 - 9 1 .1 3 . L a m k a , K . G . , M. W . L e C h e v a l l i e r , a n d R . J . S e i d l e r . 1 9 8 0 .B a c t e r i a l c o n t a m i n a t i o n o f d r i n k i n g w a t e r s u p p l i e s i n a m o d e r nr u r a l n e i g h b o r h o o d . A p p l . E nv i r o n . M i c r o b i o l . 3 9 : 7 3 4 - 7 3 8 .1 4 . P o i n d e x t e r , J . S . 1 9 8 1 . O l i g o t r o p h y : f a s t a n d f a m i n e e x i s t e n c e .A d v . M i c r o b . E c o l . 5 : 6 3 - 8 9 .1 5 . R e a s o n e r , D . J . , a n d E . E . G e l d r e i c h . 1 9 8 5 . A new m e d i u m f o rt h e e n u m e r a t i o n a n d s u b c u l t u r e o f b a c t e r i a f r o m p o t a b l e w a t e r .A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 9 : 1 - 7 .1 6 . S h a n n o n , C . E . , a n d W. W e a v e r . 1 9 6 3 . T h e m a t h e m a t i c a l t h e o r yo f c o m m u n i c a t i o n . U n i v e r s i t y o f I l l i n o i s P r e s s , U r b a n a .1 7 . S t a l e y , J . T . 1 9 8 0 . D i v e r s i t y o f a q u a t i c h e t e r o t r o p h i c b a c t e r i a lc o m m u n i t i e s , p . 3 2 1 - 3 2 2 . I n D . S c h l e s s i n g e r ( e d . ) , M i c r o b i o l -o g y - 1 9 8 0 . A m e r i c a n S o c i e t y f o r Mi c r o bi o l og y , W a s h i n g t o n ,

D . C .1 8 . S t a l e y , J . T . 1 9 8 1 . The g e n e r a P r o s t h e c o m i c r o b i u m a n dA n c a l o i n i c r o b i l u n , p . 4 5 6 - 4 6 0 . I n M . P . S t a r r , H . S t o l p , H . G .T r u p e r , A . B a l o ws , a n d H . G . S c h l e g e l ( e d . ) , T h e p r o k a r y o t e s .S p r i n g e r - V e r l a g . N e w Y o r k .1 9 . S t a l e y , J . T . , L . G . L e h m i c k e , F . E . P a l m e r , R . W . P e e t , a n dR . C . W i s s m a r . 1 9 8 2 . I m p a c t o f M o u n t S t . H e l e n s e r u p t i o n o nb a c t e r i o l o g y o f l a k e s i n t h e b l a s t z o n e . A p p l . E n v i r o n . M i c r o -b i o l . 4 3 : 6 6 4 - 6 7 0 .2 0 . T a y l o r , R . H . , a n d E . E . G el dr e i c h . 1 9 7 9 . A n ew membrane f i l t e rp r o c e d u r e f o r b a c t e r i a l c o u n t s i n p o t a b l e w a t e r a n d s w i m m i n gp o o l s a m p l e s . J . Am . W a t e r Works A s s o c . 7 1 : 4 0 2 - 4 0 6 .2 1 . v a n d e r K o o i j , D . 1 9 8 1 . M u l t i p l i c a t i o n o f b a c t e r i a i n d r i n k i n gw a t e r . A n t o n i e v a n L e e u w e n h o e k J . M i cr o b i ol . 4 7 : 2 8 1 - 2 8 3 .2 2 . v a n d e r K o o i j , D . , J . P . O r a n j e , a n d W . A . M. H i j n e n . 1 9 8 2 .G r o w t h o f P s e i u d o m t i o n a s a e r u ( g i n o s a i n t a p w a t e r i n r e l a t i o n t ou t i l i z a t i o n o f s u b s t r a t e s a t c o nc e n t r a t i o n s o f a f e w m i c r o g r a m sp e r l i t e r . A p p I . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 4 4 : 1 0 8 6 - 1 0 9 5 .2 3 . v a n d e r K o o i j , D . , A . V i s s e r , a n d W . A . M. H i j n e n . 1 9 8 0 .G r o w t h o f A e r o m o n a s h y d r o p h i l a a t l o w c o n c e n t r a t i o n s o fs u b s t r a t e s a d d e d t o t a p w a t e r . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l .3 9 : 1 1 9 8 - 1 2 0 4 .2 4 . v a n d e r K o o i j , D . , A . V i s s e r , a n d J . P . O r a n j e . 1 9 8 2 . M u l t i p l i -c a t i o n o f f l u o r e s c e n t p s e u d o m o n a d s a t l o w s u b s t r a t e c o n c e n t r a -t i o n s i n t a p w a t e r . A n t o n i e v a n L e e u w e n h o e k J . M i c r o b i o l .4 8 : 2 2 9 - 2 4 3 .2 5 . Z a r , J . H . 1 9 7 4 . B i o s t a t i s t i c a l a n a l y s i s . P r e n t i c e - H a l l , I n c . ,E n g l e w o o d C l i f f s , N . J .

VOL. 5 1 , 1 9 8 6 1 0 5 5