Rol de la ubiquitinizacin en la falla secretora bi liar asociada a la endocitosis de transporadores hepatocelulares inducida por estrge nos

La colestasis funcional es una alteracin en la capacidad de los transportadores del hepatocito que afecta la formacin de la bilis. Dicha anomala es causa de varias enfermedades hepticas, entre ellas la producida por el metabolito estrognico estradiol 17-D-glucurnido en mujeres embarazadas susceptibles, quienes tienen un elevado riesgo de mortalidad fetal por esta causa.

Nuestro grupo fue pionero en establecer que el principal mecanismo que lleva a esta alteracin funcional es la internalizacin endoctica de los transportadores canaliculares responsables de la formacin de la bilis, lo cual conducira a su posterior degradacin lisosomal. Los mecanismos que gobiernan la endocitosis son hasta el momento desconocidos, aunque demostramos que son regulados por varias rutas de sealizacin transduccional.

El objetivo de este proyecto es indagar si la ubiquitinizacin de cadena corta de los transportadores, una modificacin de tipo postraduccional regulada por sealizacin que favorece la endocitosis y la posterior degradacin lisosomal de los mismos, es la mediadora de las alteraciones inducidas por el estrgeno.

Para llevar adelante este objetivo, se realizarn estudios "in vitro" de la funcionalidad y localizacin subcelular de los trasportadores en condiciones de inhibicin farmacolgica del proceso de ubiquitinizacin, o el eventual "knockdown" (siRNA) de enzimas claves de este proceso. Se utilizar para ello un modelo hepatocelular polarizado y estable de funcin secretora biliar, como es el de "hepatocitos cultivados en sndwich de colgeno". Haremos uso de metodologas tales como inmunoprecipitacin seguida de inmmunoblotting (para estudio de los cambios en el grado de ubiquitinizacin de los transportadores), inmunofluorescencia seguida de microscopa confocal (para estudios de localizacin subcelular de los mismos) y anlisis en tiempo real por microscopa de fluorescencia del transporte de sustratos fluorescentes (para estudios de actividad funcional de los transportadores relevantes).

Creemos que este estudio abrir la puerta para numerosas estrategias teraputicas superadoras de las hasta hoy existentes, muy limitadas en diversidad y empricas en su empleo.

Instituto de Fisiologa Experimental( CONICET-UNR)

rea FisiologaFacultad de Cs. Bioq. y Farm.Universidad Nacional de Rosario

www.ifise.gov.ar

Las temticas de investigacin que se abordan en el rea Fisiologa - IFISE estn incluidas en el campo de la investigacin biomdica bsica con especial nfasis en Fisiologa y Fisiopatologa, y abarcan desde estudios in vivo hasta estudios celulares y moleculares, utilizando modelos y tcnicas de actualidad.

Los estrgenos producen numerosasalteraciones en la capacidad del hgadopara producir bilis (colestasis).

El estradiol 17-D-glucurnido (E217G) es un metabolito endgeno del estradiol que produce colestasis aguda en animales de experimentacin y ha sido involucrado como agente causal de la colestasis del embarazo en humanos.

Nuestros modelos de trabajo:cultivo de hepatocitos en sndwich

Control E217G

Alteracin en el transporte apical de sustratos fluorescentes

Actina Bsep Merge

Control

Actina Bsep Merge

E217G

Inmunolocalizacin de transportadoresen cultivo en sndwich (microscopa lser confocal)

Endocitosis del transportador apical de sales biliares Bsep(flechas)

Actina

Radixina

PDZK1/Hax1 E217G

Ubiquitina

Posibles blancos de accin del estrgeno que llevan a la endocitosis de transportadores: ubiquitinizacin, protenas de andamiaje, anclaje al

citoesqueleto de actina.

FernandoCrocenzi CeciliaBasiglio GiselMiszczuk

AndreaBoaglio

FlaviaToledoMarcelo Roma

Prof. Mary Vore

Graduate Center for ToxicologyUniversity of Kentucky, USA

Prof. Juan Francisco Medina

Centro de Investigacin Mdica AplicadaUniversidad de Navarra, EspaaColaboracin Internacional

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