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Rol de la ubiquitinización en la falla secretora biliar asociada a la endocitosis de transporadores hepatocelulares inducida por estrógenos La colestasis funcional es una alteración en la capacidad de los transportadores del hepatocito que afecta la formación de la bilis. Dicha anomalía es causa de varias enfermedades hepáticas, entre ellas la producida por el metabolito estrogénico estradiol 17ß-D-glucurónido en mujeres embarazadas susceptibles, quienes tienen un elevado riesgo de mortalidad fetal por esta causa. Nuestro grupo fue pionero en establecer que el principal mecanismo que lleva a esta alteración funcional es la internalización endocítica de los transportadores canaliculares responsables de la formación de la bilis, lo cual conduciría a su posterior degradación lisosomal. Los mecanismos que gobiernan la endocitosis son hasta el momento desconocidos, aunque demostramos que son regulados por varias rutas de señalización transduccional. El objetivo de este proyecto es indagar si la ubiquitinización de cadena corta de los transportadores, una modificación de tipo postraduccional regulada por señalización que favorece la endocitosis y la posterior degradación lisosomal de los mismos, es la mediadora de las alteraciones inducidas por el estrógeno. Para llevar adelante este objetivo, se realizarán estudios "in vitro" de la funcionalidad y localización subcelular de los trasportadores en condiciones de inhibición farmacológica del proceso de ubiquitinización, o el eventual "knockdown" (siRNA) de enzimas claves de este proceso. Se utilizará para ello un modelo hepatocelular polarizado y estable de función secretora biliar, como es el de "hepatocitos cultivados en sándwich de colágeno". Haremos uso de metodologías tales como inmunoprecipitación seguida de inmmunoblotting (para estudio de los cambios en el grado de ubiquitinización de los transportadores), inmunofluorescencia seguida de microscopía confocal (para estudios de localización subcelular de los mismos) y análisis en tiempo real por microscopía de fluorescencia del transporte de sustratos fluorescentes (para estudios de actividad funcional de los transportadores relevantes). Creemos que este estudio abrirá la puerta para numerosas estrategias terapéuticas superadoras de las hasta hoy existentes, muy limitadas en diversidad y empíricas en su empleo.

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Rol de la ubiquitinización en la falla secretora bi liar asociada a la endocitosis de transporadores hepatocelulares inducida por estróge nos

La colestasis funcional es una alteración en la capacidad de los transportadores del hepatocito que afecta la formación de la bilis. Dicha anomalía es causa de varias enfermedades hepáticas, entre ellas la producida por el metabolito estrogénico estradiol 17ß-D-glucurónido en mujeres embarazadas susceptibles, quienes tienen un elevado riesgo de mortalidad fetal por esta causa.

Nuestro grupo fue pionero en establecer que el principal mecanismo que lleva a esta alteración funcional es la internalización endocítica de los transportadores canaliculares responsables de la formación de la bilis, lo cual conduciría a su posterior degradación lisosomal. Los mecanismos que gobiernan la endocitosis son hasta el momento desconocidos, aunque demostramos que son regulados por varias rutas de señalización transduccional.

El objetivo de este proyecto es indagar si la ubiquitinización de cadena corta de los transportadores, una modificación de tipo postraduccional regulada por señalización que favorece la endocitosis y la posterior degradación lisosomal de los mismos, es la mediadora de las alteraciones inducidas por el estrógeno.

Para llevar adelante este objetivo, se realizarán estudios "in vitro" de la funcionalidad y localización subcelular de los trasportadores en condiciones de inhibición farmacológica del proceso de ubiquitinización, o el eventual "knockdown" (siRNA) de enzimas claves de este proceso. Se utilizará para ello un modelo hepatocelular polarizado y estable de función secretora biliar, como es el de "hepatocitos cultivados en sándwich de colágeno". Haremos uso de metodologías tales como inmunoprecipitación seguida de inmmunoblotting (para estudio de los cambios en el grado de ubiquitinización de los transportadores), inmunofluorescencia seguida de microscopía confocal (para estudios de localización subcelular de los mismos) y análisis en tiempo real por microscopía de fluorescencia del transporte de sustratos fluorescentes (para estudios de actividad funcional de los transportadores relevantes).

Creemos que este estudio abrirá la puerta para numerosas estrategias terapéuticas superadoras de las hasta hoy existentes, muy limitadas en diversidad y empíricas en su empleo.

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Instituto de Fisiología Experimental( CONICET-UNR)

Área FisiologíaFacultad de Cs. Bioq. y Farm.Universidad Nacional de Rosario

www.ifise.gov.ar

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Las temáticas de investigación que se abordan en el Área Fisiología - IFISE están incluidas en el campo de la investigación biomédica básica con especial énfasis en Fisiología y Fisiopatología, y abarcan desde estudios in vivo hasta estudios celulares y moleculares, utilizando modelos y técnicas de actualidad.

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Los estrógenos producen numerosasalteraciones en la capacidad del hígadopara producir bilis (colestasis).

El estradiol 17ß-D-glucurónido (E217G) es un metabolito endógeno del estradiol que produce colestasis aguda en animales de experimentación y ha sido involucrado como agente causal de la colestasis del embarazo en humanos.

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Nuestros modelos de trabajo:cultivo de hepatocitos en sándwich

Control E217G

Alteración en el transporte apical de sustratos fluorescentes

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Actina Bsep Merge

Control

Actina Bsep Merge

E217G

Inmunolocalización de transportadoresen cultivo en sándwich (microscopía láser confocal)

Endocitosis del transportador apical de sales biliares Bsep(flechas)

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Actina

Radixina

PDZK1/Hax1 E217G

Ubiquitina

Posibles blancos de acción del estrógeno que llevan a la endocitosis de transportadores: ubiquitinización, proteínas de andamiaje, anclaje al

citoesqueleto de actina.

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FernandoCrocenzi Cecilia

Basiglio GiselMiszczuk

AndreaBoaglio

FlaviaToledoMarcelo

Roma

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Prof. Mary Vore

Graduate Center for ToxicologyUniversity of Kentucky, USA

Prof. Juan Francisco Medina

Centro de Investigación Médica AplicadaUniversidad de Navarra, EspañaColaboración Internacional