Gene Expression and Regulation

Hoofdstuk 10

2010/2011

GENEXPRESSIEDeel 1

2

Waar coderen genen voor?

• Hoe codeert DNA voor cellen & lichamen?

3

eiwit cel lichaamDNA

Het “Centrale Dogma”

• Stroom van genetische informatie in een cel

– Hoe vervoeren we informatie van DNA naar eiwitten?

4

replicatie

proteinRNADNA eigenschap

Metabolisme geeft het antwoord

• Erfelijkheid van stofwisselingsziekten

– suggereert dat genen coderen voor enzymen

– elke ziekte (fenotype) wordt veroorzaakt door een niet-functioneel genprodukt• gebrek aan een enzym

• Tay-Sachs

• PKU (phenylketonuria)

• albinisme

5

A B C D E

ziekte ziekte ziekte ziekte

enzym 1 enzym 2 enzym 3 enzym 4

metabole pathway

Beadle & Tatum

6

George Beadle

Edward Tatum

"for their discovery that genes act by regulating definite chemical events"

één gen : één enzym hypothese

Wild-typeNeurospora

Minimaalmedium

Selecteer eenspore

Groeien op eencompleet medium

Minimalecontrole

Nucleicacid

CholinePyridoxine RiboflavinArginine

Minimaal medium verrijkt met

ThiamineFolicacid

NiacinInositolp-Aminobenzoic acid

Testen op een minimaalmedium om de mutatieaan te tonen

Groeien op eencompleet medium

Röntgenstraling

asexuelesporen

sporen

Beadle & Tatum

creëer een mutatie

positieve controle

negatieve controle

experimenten

supplementen7

mRNA

Van gen tot eiwit

DNAtranscriptie

kern cytoplasma

aa

aa

aaa

a

aa

aa

a

a

aaa

eiwittranslatie

ribosoom

eigenschap8

Transcriptie

9

RNA

• ribose suiker

• N-basen

– uracil in plaats van thymine

– U : A

– C : G

• enkele streng

• verschillende soorten RNAs

– mRNA, tRNA, rRNA, siRNA…

10RNADNA

transcriptie

Transcriptie

• mRNA maken– gekopieerde DNA streng = template streng

– niet- gekopieerde DNA streng = coderende streng• zelfde basenvolgorde als RNA

– synthese van een complementaire RNA streng

– enzym• RNA polymerase

11template streng

opwinden

mRNA RNA polymerase

ontwinden

coderende streng

DNAC C

C

C

C

C

C

C

C CC

G

GG

G

G G

G G

G

G

GA

A

AA A

A

A

A

A

A A

A

AT

T T

T

T

T

T

T

T T

T

T

U U

5

3

5

3

3

5RNA bouwen 53

Welk gen wordt gelezen?

• Promoter regio

– bindingsplaats vlak voor de start van het gen

– TATA box bindingsplaats

– bindingsplaats voor RNA polymerase

12

Paren van DNA & RNA basen

• Paar RNA basen aan DNA basen op een van de DNA strengen

13

U

A G GGGGGT T A C A C T T T T TC C C CA A

U

UU

U

U

G

G

A

A

A C CRNA

polymerase

C

C

C

C

C

G

G

G

G

A

A

A

AA

5' 3'

Eukaryotische genen hebben junk!

• Eukaryotische genen bestaan uit exonen en intronen

– exon = het echte gen• DNA wat tot expressie komt

– intron = “rotzooi”• ligt tussen exonen in

14

eukaryotische DNA

exon = coderend

intron = niet-coderend

mRNA splicing

• Eukaryotisch mRNA moet nog verder bewerktworden

– primaire transcript = pre-mRNA

– mRNA splicing• intronen verwijderen

15

DNA

exon = coderend

intron = niet-coderend

pre-mRNA

mRNA

~10,000 basen

~1,000 basen

Alternatieve splicing

• Alternatieve mRNA’s geproduceeerd uit hetzelfde gen

– wanneer is een intron een intron…

16

AmRNA

5'

3'

G PPP

Een laatste bewerking…

• mRNA moet beschermd worden tegen het milieu in het cytoplasma– enzymen in cytoplasma vallen mRNA aan

• bescherm de uiteinden van het molecuul

• toevoeging 5 GTP cap

• toevoeging poly-A staart

17

mRNA

Van gen tot eiwit

DNAtranscriptie

kern cytoplasma

aa

aa

aaa

a

aa

aa

a

a

aaa

eiwittranslatie

ribosoom

eigenschap18

Translatie

19

Hoe codeert mRNA voor eiwitten?

20

TACGCACATTTACGTACGCGGDNA

AUGCGUGUAAAUGCAUGCGCCmRNA

MetArgValAsnAlaCysAlaeiwit

?

4

4

20

ATCG

AUCG

AUGCGUGUAAAUGCAUGCGCCmRNA

mRNA codeert in tripletten

21

TACGCACATTTACGTACGCGGDNA

AUGCGUGUAAAUGCAUGCGCCmRNA

Met Arg Val Asn Ala Cys Alaeiwit

?

codon

Kraken van de code

• Crick

– beschreef het 3-letter (triplet) codon systeem

• Nirenberg & Khorana

– beschreven de RNA–aminozuur koppeling

– voegden kunstmatig mRNA toe aan een reageerbuis met ribosomen, tRNA & aminozuren

• er werd UUUUUUU… mRNA gevormd

• dit leidde tot de vorming van phenylalanine

22

WHYDIDTHEREDBATEATTHEFATRATWHYDIDTHEREDBATEATTHEFATRAT

De code

• Code voor al het leven!

23

Start codon

• AUG

• methionine

Stop codons

• UGA, UAA, UAG

Koppeling codon - aminozuur?

24

TACGCACATTTACGTACGCGGDNA

AUGCGUGUAAAUGCAUGCGCCmRNA

aminozuur

tRNA anti-codon

codon

5 3

3 5

3 5

UAC

MetGCA

Arg

CAU

Val

mRNA

Van gen tot eiwit

DNAtranscriptie

kern cytoplasma

aa

aa

aaa

a

aa

aa

a

a

aaa

eiwittranslatie

ribosoom

eigenschap25

Structuur Transfer RNA

• “Klaverblad” structuur

– anticodon op het uiteinde van het “klaverblad”

– aminozuur op 3

26

Ribosomen

• Maken koppeling tussentRNA anticodon en het mRNA codon mogelijk

– organel of enzym?

• Structuur

– ribosomaal RNA (rRNA) & eiwitten

– 2 subunits• groot

• klein

E P A

27

• A site (aminoacyl-tRNA site)

– tRNA met nieuwe aminozuur

• P site (peptidyl-tRNA site)

– tRNA met groeiende polypeptide (eiwit) keten

• E site (exit site)

– lege tRNA verlaat het ribosoomvanaf de exit site

Ribosomen

Met

5'

3'

UUA C

A G

APE28

Een eiwit bouwen• Initiatie

– samenbrengen van mRNA, rRNA en tRNA

• Elongatie– aminozuren toevoegen, gebaseerd

op de codon volgorde

• Terminatie– stop codon 123

Leu

Leu Leu Leu

tRNA

Met MetMet Met

PE A

mRNA5' 5' 5' 5'

3' 3' 3'3'

U UA AAAC

CC

AU UG GGU

UA

AAAC

CC

AU UG GGU

UA

AAAC

CC

AU UG GGU U

AAAC

CA U UG G

ValSer

AlaTrp

releasefactor

AA A

CCU UGG 3'

29

DNA

pre-mRNA

ribosoom

tRNA

aminozuren

polypeptide

mRNA

5' GTP cap

poly-A tail

grote subunit

kleine subunitE P A

5'

3'

RNA polymerase

exon introntRNA

30

Eiwitsynthesein

prokaryoten

Bacterial chromosome

mRNA

Cell wall

Cellmembrane

Transcription

Prokaryoten vs. Eukaryoten• Prokaryoten

– DNA in cytoplasma

– circulair chromosoom

– “naakt” DNA

– geen intron

• Eukaryoten

– DNA in kern

– lineair chromosoom

– DNA gewonden omhistonen

– intron vs. exon

eukaryotischDNA

exon = coderend

intron = niet-coderend

32

• Transcriptie & translatie gelijktijdig in bacteriën

– DNA in cytoplasma

– geen mRNA bewerking

– ribosomenlezen mRNA terwijl transcriptienog bezig is

Translatie in Prokaryoten

33

Translatie: prokaryoten vs. eukaryoten

34

MUTATIESDeel 2

35

Mutaties

• Puntmutaties– 1 base verandert

– substitutie• silent mutatie

– hetzelfde aminozuur

• missense mutatie– ander aminozuur

• nonsense mutatie– verandering in stop codon

36

Sikkelcelanemie

37

Sikkelcelanemie

38

Mutaties

• Frameshift– insertie

• toevoeging base(n)

– deletie• verlies base(n)

39

Cystic fibrosis

• Meest voorkomende autosomaalrecessieve aandoening in W-Europa

– 1 op 2500

– normale allel codeert voor een membraaneiwit dat Cl-

over het membraan transporteert• defect of afwezig kanaal beperkt het transport van Cl- (& H2O)

over het membraan

• dik en plakkerig slijm rondom cellen

– met name in alvleesklier, longen, maag-darmstelsel

– leidt tot bacteriële infecties

– zonder behandeling <5 jaarmet behandeling >20 jaar

40

Deletie leidt tot CF

delta F508

41

GENREGULATIE PROKARYOTENDeel 3

42

Bacterieel metabolisme

• Bacteriën moeten snel reageren op veranderingen in hun omgeving

– als ze genoeg van een bepaald product hebben moeten ze de productie stoppen• waarom? zonde van de energie om meer te maken

• hoe? productie stoppen van het product

– als ze een nieuwe voedselbron vinden moeten ze die snel benutten• waarom? metabolisme, groei, reproductie

• hoe? productie starten van de benodigde enzymen

UIT

AAN

43

Reguleren metabolisme?

• Feedback inhibitie

– product werkt als eenrem op 1e enzym in de tryptofaan productie

– maar waarom überhauptenzymen produceren?

44

= inhibitie-

-

Andere manier van regulatie

• Genregulatie

– in plaats van het enzymblokkeren kan ook de transcriptie van de enzymen geblokkeerdworden• kost minder energie

45

= inhibitie-

-

-

Genregulatie in bacteriën

• Cellen variëren de hoeveelheid enzymen door gentranscriptie te reguleren

– schakel genen aan of schakel genen uit• Voorbeeld 1

als bacteriën genoeg tryptofaan hebben stoppen ze met het maken van enzymen die tryptofaan maken

• Voorbeeld 2als een bacterie een nieuwe suiker tegenkomt (bv. lactose), dan zal het enzymen moeten maken om lactose te verteren

46

STOP

GO

Bacteriën groeperen genen

• Operon– genen met vergelijkbare functie gegroepeerd

• bijvoorbeeld: all enzymen in een metabolic pathway

– promoter = RNA polymerase bindingsplaats• één promoter bepaalt de transcriptie van allen genen in het

operon

– operator = DNA bindingsplaats voor een repressoreiwit

47

Uitschakelen van genen?

• Repressoreiwit

– bindt aan de operator

– blokkeert RNA polymerase

– blokkeert transcriptie

48

operatorpromoter

Operon model

Operon: operator, promoter & genen die zij reguleren

een model voor genregulatie

49

DNATATA

RNApolymerase

repressor

repressor = repressoreiwit

gen1 gen2 gen3 gen4RNA

polymerase

1 2 3 4mRNA

enzym1 enzym2 enzym3 enzym4

Wanneer er een overmaat van tryptofaan is bindt dit aan het tryprepressor eiwit : repressor bindt aan DNA

– blokkeert transcriptie

mRNA

enzym1 enzym2 enzym3 enzym4

operatorpromoter

Repressible operon: tryptofaan

50

DNATATA

RNApolymerase

tryptofaan

repressor repressoreiwit

repressortryptofaan – repressoreiwitcomplex

gen1 gen2 gen3 gen4

vormverandering in het repressoreiwit!

1 2 3 4

repressortrpRNApolymerase

trp

trp

trp trp

trp trp

trptrp

trp

trp

trp

Tryptofaan operon

51Tryptofaan is een allosterische regulator van het repressoreiwit

Als lactose aanwezig is bindt et aan het lac repressoreiwit & zorgt ervoordat de respressor loskoppelt van het DNA

– start transcriptie

mRNA

enzym1 enzym2 enzym3 enzym4

operatorpromoter

Inducible operon: lactose

52

DNATATARNApolymerase

repressor repressoreiwit

repressor lactose – repressoreiwit complex

lactose

lac repressor gen1 gen2 gen3 gen4

RNApolymerase

1 2 3 4

lac lac

laclac

lac

lac

lac

lac

lacvormverandering in het

repressoreiwit!

Lactose operon

53

Lactose is een allosterische regulator van het repressoreiwit

Samenvatting operon

• Repressible operon

– doorgaans betrokken bij anabolisme

• maken van producten

– als het product voldoende aanwezig is gebruikt de cel

zijn energie voor andere processen

• Inducible operon

– doorgaans betrokken bij katabolisme

• afbreken van voedingsstoffen tot kleinere moleculen

– enzymen worden alleen geproduceerd als de

voedingsstof aanwezig is

• voorkomt dat enzymen gemaakt worden die niets te doen

hebben 54

Einde

Opdracht

A. Verzin zelf een nucleotidenvolgorde van een stuk dubbelstrengs DNA waarin een start- en stopcodon

zit. Neem in je DNA sequentie ook een promoter en een terminator op. De term ‘sequentie’ betekent

nucleotidenvolgorde.

i Op de coderende streng vind je het startcodon terug als ATG

ii Gebruik TAA als stopcodon op de coderende streng

iii Zorg dat het stuk tussen start- en stopcodon voor zes aminozuren codeert.

iv Gebruik als promotorsequentie op de coderende streng: TAATAT. De transcriptie start 10

nucleotiden na deze sequentie.

v Gebruik als terminatorsequentie op de coderende streng: CTGGCGGC. De transcriptie stopt 2

nucleotiden na deze sequentie.

vi Let op: vanaf de plek waar transcriptie start volgen eerst een aantal willekeurige nucleotiden

voordat je het startcodon tegenkomt. Hetzelfde geldt voor aan het einde van het gen. Na het

stopcodon volgen een aantal willekeurige nucleotiden, voordat de terminator het einde van

transcriptie aangeeft.

B. Schrijf onder de DNA sequentie de mRNA volgorde.

C. Geef met pijltjes aan waar de translatie begint en eindigt.

56